Summary
En detaljeret instruktion er beskrevet på hvordan man opbygger en meget skrå fejet flise (HIST) mikroskop og dens skik for enkelt-molekyle imaging.
Abstract
Enkelt-molekyle imaging har meget avancerede vores forståelse af de molekylære mekanismer i biologiske undersøgelser. Det har imidlertid været udfordrende at få store field-of-view, høj kontrast billeder med tykke celler og væv. Her introducerer vi stærkt tilbøjelig fejet flise (HIST) mikroskopi, der overvinder dette problem. Et par af cylindriske linser blev implementeret for at generere en aflang excitation stråle, der blev scannet over et stort billeddiagnostiske område via en hurtig galvo spejl. En 4f konfiguration blev brugt til at placere optiske komponenter. En videnskabelig komplementær metal-oxid halvleder kamera opdaget fluorescens signal og blokeret ud af fokus baggrund med en dynamisk Konfokal slids synkroniseret med beam fejende. Vi præsenterer en trinvis instruktion om bygning HIST mikroskop med alle grundlæggende komponenter.
Introduction
Enkelt-molekyle fluorescens imaging spiller en vigtig rolle i mange biologiske undersøgelser, der afslører ultrastructures, dynamik og mængden af biomolekyler1,2,3. Dog har det udfordrende for at studere single-molekyler inde i celler eller væv. Mens konfokalmikroskopi giver høj skære kapacitet4, er det ikke egnet til enkelt-molekyle imaging på grund af alvorlige photobleaching ved høje excitation intensitet eller langsom imaging hastighed. Widefield mikroskopi bruger svagere belysning, men lider af et dårligt signal til baggrunden ratio (SBR)5. Lys-ark mikroskopi, på den anden side kunne vise god skæring og lav photobleaching6; tilgængelige numerisk blænde (NA) er dog stærkt begrænset af kravet om ortogonalt placerede mål7. Alternativt, det kræver særlige lysgivere og prøve kamre8,9.
Af disse grunde er meget hælder og laminerede optisk ark (HILO) mikroskopi almindeligt brugt til 3D enkelt-molekyle imaging10. Når en skrå strålen møder en grænseflade af to medier (glas og vand, for eksempel), brydes strålen ifølge Snells lov. Vigtigere, brydes strålen bliver tyndere, og dens tykkelse er beskrevet som dz = R/tan(θ) hvor R er tilbøjelig lysbundtets diameter og θ er brydning vinkel af den overførte stråle. Denne enkle gennemførelse resulterer i en god skæring kapacitet. Ikke desto mindre, denne relation angiver, at en tynd belysning (dvs. høj skære evne) kræver en lille R og/eller en stor θ. For eksempel, når R = 20 µm og θ = 72 grader, man kan opnå dz = 6,5 µm. Da der er en praktisk grænse til at øge brydning vinklen for at billede dybt inde i celler og undgå total interne reflection, er der en stærk kobling af belysning diameter og beam tykkelse. Af denne grund viser HILO imaging en relativt lille field-of-view (FOV) som stærkt begrænser sine programmer i flercellede billedbehandling.
For nylig har vi løse dette problem ved stærkt tilbøjelig fejet flise (HIST) mikroskopi hvor FOV er afkoblet fra beam tykkelse i en meget enkel måde11. Først, en stråle, aflange i én retning er genereret via et par af cylindriske linser. Denne stråle, betegnes som en flise, producerer en tynd belysning med dz ~ 4 µm, mens dens FOV er 130 x 12 µm2. Derefter, flisen er fejede hen over prøven ved hjælp af en roterende galvo spejl. I mellemtiden, fluorescens billedet er optaget på en videnskabelig komplementær metal-oxide semiconductor (sCMOS)-kamera, der filtrerer effektivt ud af fokus baggrund ved at operere i en rullende lukkertilstand, der tjener som afstemmelige Konfokal slids påvisning. På denne måde giver HIST mikroskopi enkelt-molekyle imaging med en større synsfelt (~ 130 x 130 µm2) og en tyndere belysning end HILO billeddannelse. Vi anvendte denne nye imaging teknik til at detektere RNA udskrifter med en enkelt sonde i celler eller med et par sonder i mus hjernen væv, som har et betydeligt potentiale for at studere genekspression og sygdomme. I modsætning til andre tilgange, HIST beskæftiger kun en enkelt høj numerisk blænde mål uden en yderligere illuminator eller sen detektion mål og er fuldt kompatibel med inverterede mikroskoper. Disse fordele sammen med en stor FOV og høj kontrast vil gøre HIST mikroskopi et fremtrædende redskab i biologi og medicin. Vi præsenterer detaljerede instruktioner om instrumentering HIST mikroskop, og hvordan man kan teste og kalibrere sin præstation som nedenfor.
Protocol
1. opsætning af mikroskop, lasere og justering værktøjer
- Før du kan bygge microscope, forberede alle de nødvendige komponenter, herunder optik, optomechanics og elektronik som anført i Tabel af materialer.
- Forberede et mikroskop krop hovedsagelig består af to dele: en indehaver af en objektiv med en RMS-threaded port og en piezo-etape monteret på en aluminium blok (fig. 1A).
Bemærk: Selve custom-made mikroskop bruges til bekvemmelighed og fleksibilitet af instrumentering12. Ethvert kommercielt tilgængelige mikroskop organ kan bruges til HIST mikroskopi. - Kombinere flere laser linjer og kobling dem til en single-mode fiber
- Installer 405, 561, 638 nm lasere på den optiske tabel og kombinere bjælker gennem en polariserende stråledeler og en lang-pass dichroic spejl, som vist i figur 1B. Sørg for, at alle laserstråler passere gennem pinholes tilpasning værktøj. Indsæt halv bølge plader til magt justering.
Bemærk: Bære beskyttelsesbriller for øjenbeskyttelse og bruge strålen-blokke til at absorbere uønskede laserstråler. - Installere en fiber kobling linse (f = 4,5 mm) og en fiber adapter afholdt i z-aksen oversætter med et bur system.
- Tilslut en multimode fiber (MMF, Ø 62,5 µm) til fiber adapter. Justere hvert par af styretøjets spejlet og z-oversætter, indtil hver laser kobling effektivitet er højere end 95%. Output strålen har en i nærheden af Gauss-formet profil med speckle mønstre.
- Tag væk den multimode fiber og forbinde en single-mode fiber (SMF). Svarende til MMF, finjustere og maksimere kobling effektiviteten af tre lasere.
- Installer 405, 561, 638 nm lasere på den optiske tabel og kombinere bjælker gennem en polariserende stråledeler og en lang-pass dichroic spejl, som vist i figur 1B. Sørg for, at alle laserstråler passere gennem pinholes tilpasning værktøj. Indsæt halv bølge plader til magt justering.
- Samle en kollimeres lyskilde, der skal bruges til stråle justering i excitation og påvisning stier. Denne enhed er sammensat af et tidsmæssigt sammenhængende lyskilde (561 nm) tilsluttet SMF, fiber adapter, achromatic linse (f = 60 mm), iris og Ø1 "tube spacer i et bur system (figur 1C). Justere afstanden mellem fiber adapter og objektivet ved hjælp af en klipning interferometer for at sikre collimation.
- Forberede en stråle justering værktøj (figur 1D). Dette er et par af aluminium indlæg med porer på 2" højde fra overfladen af optiske tabel, der giver mulighed for hurtig og præcis lysstråle justering.
- Samle en dobbelt pinhole system, som består af to Ø1 "jorden glas justering diske i hver ende og to Ø1" linse rør (bunden ene er slidset) som vist i figur 1E.
2. opsætning af stien påvisning
- Tag målet og installere kollimeres lyskilden. Justere knopper af spejl (M1) under den objektive indehaveren, så output strålen fra mikroskop er omtrent parallel med den optiske tabel i højde og afstemt med gevindhuller på bordet. Henvises til figur 2 for detaljerede positioner af hvert optisk komponent.
- Indsæt en multiband dichroic spejl (DM) og afspejle strålen ved 90 grader. Bruge den maksimale størrelse af iris og sørg for, at strålen passerer gennem midten af den dichroic spejl uden klipning.
- Brug utætte strålen passerer gennem den dichroic spejl til at styre justeringen af påvisning sti. Læg en sCMOS kamera i strålen og sørg for, at strålen rammer i midten af kamera chippen ved hjælp af to spejle (M2 og M3).
- Indsæt en tube linse (TL; f = 300 mm) ca. 300 mm væk fra kameraet.
- Fjerne kollimeres lyskilden og justere den relative afstand mellem tube objektivet og kameraet indtil et mønster på loftet er klart løst af kameraet.
- Indsæt en multi band pass filter (BF) før røret linse til multi-farve fluorescens imaging.
3. opsætning af excitation sti
- Geninstallere kollimeres lyskilden på objektive indehaveren. Placere en fold-spejl (M4) til at omdirigere beam output fra mikroskop ved 90 grader. Justere knopper af dichroic spejle og fold-spejl iterativt indtil strålen passerer gennem pinholes i stråle justering værktøj.
- Frigøre kollimeres lyskilden og installere det på bordet, hvor strålen peger frem mod selve mikroskop. Juster stråle ved hjælp af en stråle alignment tool og en dobbelt pinhole system.
- Indsæt en linse L4 (f = 400 mm; Ø = 2") til den optiske transmissionslængde ca 400 mm fra den objektive indehaveren. Installere mål linse og justere placeringen af L4 langs den optiske akse, indtil en perfekt luftig disk mønster er dannet i loftet.
Bemærk: Når du indsætter linsen, positionen stråle passerer gennem objektivet bør holdes uændret. Linse L4 har en SM2 tråd, der gør det muligt at være tilknyttet/løsrevet fra 60 mm SM2-threaded bur plade let. - Skru mål og geninstallere den kollimeres lyskilde med en åben iris. Spore ned beam output fra mikroskop med et visitkort. Montere et spejl M5 på det sted, hvor størrelsen af stråle er den mindste og ca 400 mm fra L4, som er en konjugeret billedplan (cIP).
- Installere et spejl M6 og afspejle strålen ved 90 grader. Justere M5 og M6 iterativt med beam justering værktøj.
- Indsæt en linse L3 (f = 150 mm) omtrent 150 mm fra M5. Bruge en klipning interferometer for at sikre collimation i output strålen.
- Midlertidigt take away L4 og spore ned strålen til at finde den fokale holdning af L3. Sætte en enkelt akse galvo spejl på dette punkt, hvilket er en konjugeret tilbage brændplanet (cBFP). Levere 0 volt til galvo spejl og rotere indehaveren af galvo spejl, så det afspejler strålen af 90 grader.
- Placer en fold-spejl M7. Ordentligt sted L2 (f = 100 mm) på samme måde som trin 3.6.
- Fjerne den kollimeres lyskilde fra indehaveren af objekt. Installere en collimation linse L1 (f = 100 mm), fiber adapter og iris. Tilslut en single-mode fiber til adapteren og sende stråle gennem imaging systemet.
- Genindsætte L4 og finindstille systemet, indtil en perfekt luftig disk mønster vises på loftet.
4. opsætning af de cylindriske linser
- Indsæt en cylindrisk linse (CL1, f = 400 mm) efter L1 og sørg for, at den cylindrisk linse fokuserer strålen langs x-aksen.
- Indsæt en anden cylindrisk linse (CL2, f = 50 mm) til strålegangen. Brug en klipning interferometer at sikre output strålen er kollimeret.
Bemærk: Afstanden mellem de to cylindriske linser er 450 mm. Output strålen har et kompressionsforhold på 8 og en aflang oval formet Airy disk mønster er dannet i loftet.
5. prøvning flise imaging
- Forberede 3D hydrogel prøve. Mix 20 nm Crimson perler med en hydrogel løsning, som består af 12% acrylamide:bisacrylamide (29: 1), 0,2% (v/v) TEMED og 0,2% (w/v) ammonium persulfat i 0,75 x TAE buffer. Tilføre en flow kammeret som beskrevet andetsteds1150 µL af den blandede opløsning. Efter 10 min er 3D hydrogel prøven klar til til billedbehandling.
- Sætte prøven på prøveholderen. Tænd 638 nm laser og justere magt til < 1 mW for prøven excitation.
- Køre kameraet kontrol software. I panelet kamera erhvervelse-indstillingen Vælg intern i trigger tilstand og klik derefter på tage video gratis kører tilstand.
- Lidt justere placeringen af kameraet, så billedet er beliggende i centrum af kameraet når 0 volt påføres galvo spejl.
- Rotere den vandrette knop af spejl M5 at opnå en meget skrå belysning.
Bemærk: Med stigning af indfaldsvinklen hydrogel billedet bliver klarere end Epi billede som strålen bliver tyndere. Men billedet holder næsten den samme holdning. - Optage flise billede. Beregne effektiv belysning bredde11. Figur 3 viser f.eks effektiv belysning bredde af 12 µm.
6. HISTORIS billedbehandling
- Forberede en data erhvervelse bestyrelsen forbundet med en terminal blok. Slut brugeren 1 BNC-stik med P0.0 gennem en elektrisk ledning. Brug bruger 1 som et digitalt output til den eksterne udløsning af sCMOS kamera. Tilslut en analog output AO0 til en galvo genspejle driver.
- Frembringe TTL puls tog fra P0.0 ved hjælp af en skræddersyet program (figur 4A) og placere den periode tid = 400 ms og t_ON = 2 ms. kontrollere de genererede pulser fra bruger 1 BNC terminal ved et digitalt oscilloskop og derefter forbinde BNC-kablet til kameraet eksterne udløserport.
Bemærk: Kontrol software anvendes i dette papir er tilgængelige efter anmodning. Når imaging på forskellige kamera billedhastigheder, bør den periode tid justeres i overensstemmelse hermed. - Begynde at feje et galvo spejl via den skræddersyede program. Justere Vmin til-500 mV og Vmax 500 mV for fuld FOV billeddannelse. Bemærk, at under denne operation, 3D hydrogel prøver stadig vise høj baggrund svarende til Epi belysning.
- Hvis du ændrer indstillingen kamera erhvervelse.
- Vælg eksterne udløse mode og ned (sekventiel) i LightScan Plus drop-down menuen som vist i figur 4B.
Bemærk: I denne indstilling, kameraet tager ikke billeder medmindre et trigger signal er tændt. - Klik på Skan hastighedskontrol vindue højde og line eksponering tid kontrol og indstille værdier til 180 rækker og 28 ms, henholdsvis.
Bemærk: Når en flise bredde (Weff) er 180 rækker (12 µm) og en integration tid per linie (Tint) er 28 ms, en forsinkelsestid mellem linjer (TD) bestemmes som TD = Tint/weff = 0.156 ms. For imaging 2048 x 2048 pixels, den samlede anskaffelsessum er 2.048 x TD + Tint = 346 ms, svarende til ~2.9 fps.
- Vælg eksterne udløse mode og ned (sekventiel) i LightScan Plus drop-down menuen som vist i figur 4B.
- Lidt justere Vmax og Vmin at opnå klarere billeder.
- Få 3D-stak billeder ved hjælp af den skræddersyede program ved at skifte på 3D-stak ON og angiver antallet af stakke og trin størrelse.
Representative Results
Som et eksempel, enkeltstrenget DNA mærket med Atto647N var afbildet med en excitation boelgelaengden 638 nm i en 3D hydrogel. DNA blev forankret til hydrogel netværk via en acrydite gruppe under gel polymerisering. Billederne blev taget på 5 µm over overfladen som vist i figur 5en. HIST billedet viste langt mindre baggrund i forhold til Epi billedet, hvorfra signalet til baggrunden forholdet blev beregnet til 1.9 ± 0,7 for HIST billede mens de fleste af de enkelte molekyle steder kunne næppe være opdaget af Epi.
Enkelt-molekyle RNA fluorescens i situ hybridisering (smFISH) blev udført med 4 fisk sonder. Figur 5 b viser smFISH billeder af EEF2 (eukaryote oversættelse strækningsfaktor 2) mærket med AlexaFluor 647 på A549 cellerne i en billeddannelse buffer (Se vores tidligere arbejde vedrørende prøve forberedelse11). En maksimal intensitet projektion blev udført på 20 z-stakke svarende til 5 µm tykkelse. HIST billedet viste ikke kun meget forbedret SBR men også mere ensartet belysning i forhold til Epi billede. For Epi imaging, eksponeringstiden var 400 ms mens for HIST imaging integration tid pr. linje var 32 ms, som begge havde samme belysning magt 7,5 mW målt før målet. De billeddiagnostiske hastigheder af Epi og HIST var 2,5 fps.
Figur 1 . Mikroskop krop, lasere og justering værktøjer. (A) mål og prøveholderen. (B) foto af laser-systemer. LP, lang-pass dichroic spejl; Λ/2, halvt-bølge plader; PBS, polariserende beamsplitter. (C) Collimated lyskilde. (D) stråle justering værktøj med to insertable pinholes. (E) dobbelt pinhole system. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Detaljeret opsætning for stærkt tilbøjelig fejet flise (HIST) mikroskopi. Foto (A) og skematisk (B) af HIST mikroskop system. BF, multi band pass filter; CL1-2, cylindriske linser; DM, dichroic spejl; GM, galvo spejl; BF, sporgruppe-pass filter. M1-7, spejle; L1-4, linser; SMF, single-mode fiber; TL, tube linse; cIP, konjugeret billedplan; cBFP, konjugeret tilbage fokalplan. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Flise belysning med et kompressionsforhold af 8. (A) Fluorescens billede af 20 nm perler i en 3D hydrogel. Skalalinjen, 20 µm. (B) standardafvigelsen projektion langs y-retningen af A, glattes af 10 datapunkter. Den røde pil angiver en effektiv belysning bredde af 12 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Kontrol og tænkelig programmel front paneler. (A) A custom-made LabView program synkront styrer scanning af galvo spejl, start erhvervelse af sCMOS kamera og bevægelse af piezo-etape. (B) erhvervelse kameraindstilling Kontrolpanel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. (A) billeder af Atto647N-mærket DNA i en 3D hydrogel med Epi og HIST belysning. (B) smFISH billeder af EEF2 ved hjælp af 4 fisk sonder på A549 celler af Epi og HIST mikroskopi. DAPI pletten er vist med blåt. Skalere barer, 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Der er to vigtige skridt i denne protokol. Den første er den korrekt placering af L4 i trin 3.3, sikre, at det indfaldende strålebundt passerer gennem centrum af linsen og en perfekt luftig disk mønster er dannet i loftet. Placeringen af L4 bestemmer placeringen af alle de andre optiske komponenter, herunder M5, L3, GM og L2. Det andet vigtige skridt er synkroniseringsprocessen. For at afvise ude af fokus baggrund, skal aktive pixel hvis effektiv påvisning bredde er lig med den flise bredde synkroniseres med beam fejende. Derfor er det nødvendigt at måle effektiv belysning bredden af en flise stråle (trin 5.6) og sæt kameraet parametre i overensstemmelse hermed i trin 6.4.
Når imaging med meget store FOV, viser den præsenterede metode en øget baggrunden på en side i forhold til anden siden. Dette tilskrives lidt ændrede vinkler af belysning på forskellige imaging positioner. Gennemføre en anden galvo spejl i stedet for M5 lindrer problemet som påvist før af synkront justere holdning og den scanning vinkel11. Off-the-shelf akromatisk dubletter, vil en telecentrisk scan linse være også nyttigt. Men for billedbehandling et område af < 8,080 µm2, enkelt galvo spejl fejende var tilstrækkelig. HIST mikroskopi har en grænse på imaging dybden, men det er stand til at opnå en god SBR når imaging op til ~ 15 µm med en 12 µm flise stråle og en NA 1,45 olie fordybelse mål linse11.
I denne protokol brugte vi en stråle kompressionsforhold af 8 til at gøre en flise stråle. En tyndere belysning kan bruges i HIST mikroskopi til at opnå højere SBR, hvilket kan være kraftfuld for enkelt-molekyle væv imaging11. Men i dette tilfælde photobleaching virkning bør overvejes ved en øget excitation intensitet mens den nuværende beam kompressionsforhold viste reduceret photobleaching i 3D imaging sammenlignet med Epi11. I forhold til lys-ark mikroskoper med to retvinklet placerede mål, er HIST mikroskopi enkelt at implementere og kompatibel med konventionelle prøve præparater. Forbedret SBR og store FOV HIST mikroskopi er velegnet til at undersøge interaktioner og dynamikken i enkelt biomolekyler i flere celler og kan anvendes yderligere i Super-resolution imaging og enkelt-molekyle tracking.
Disclosures
University of Central Florida har indgivet en patentansøgning, der dækker det arbejde, der er beskrevet i denne hvidbog.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (HR00111720066) og National Science Foundation (NSF) (1805200). Vi takker Michael Serge i Andor Technology for generøst udlåner sCMOS kamera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
| 1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
| 1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
| 1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
| 1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
| 1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
| 2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
| 2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
| 2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
| 2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
| 2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
| 20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
| 30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
| 30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
| 3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
| 405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
| 50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
| 561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
| 638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
| Beam alignment tool | custom made | ||
| BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
| Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
| Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
| Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
| Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
| Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
| Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
| Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
| Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
| long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
| Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
| Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
| Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
| Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
| Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
| Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
| N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
| NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
| Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
| Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
| Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
| Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
| Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
| Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
| RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
| Rod holder | custom made | ||
| Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
| sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
| Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
| SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
| SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
| Stage mount | custom made | ||
| threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |
References
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361, 880-887 (2018).
- Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer. Science. 359, (2018).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression. Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).
- Wilson, T. Resolution and optical sectioning in the confocal microscope. Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).
- Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope. Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nature Methods. 8, 1047 (2011).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12, 641 (2015).
- Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. 3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet. Nature Communications. 9, 123 (2018).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5, 159-161 (2008).
- Tang, J., Han, K. Y. Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination. Optica. 5, 1063-1069 (2018).
- Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution. Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).
- Sinkó, J., Szabó, G., Erdélyi, M. Ray tracing analysis of inclined illumination techniques. Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).
