Summary
Een gedetailleerde instructies wordt beschreven op het bouwen van een sterk geneigd geveegd Tegel (HIST.) Microscoop en het gebruik ervan voor single-molecuul imaging.
Abstract
Single-molecuul beeldvorming is sterk vooruitgegaan ons begrip van de moleculaire mechanismen in biologische studies. Echter is het uitdagend om het verkrijgen van grote veld-of-view, hoog-contrast beelden in dikke cellen en weefsels. Hier, invoeren we microscopie van de zeer geneigd rondlopende Tegel (HIST.) overwint van dit probleem. Een paar van cilindrische lenzen werd geïmplementeerd voor het genereren van een lichtbundel van langwerpige excitatie die werd gescand via een grote opnamegebied via een snelle galvo spiegel. Een 4f -configuratie werd gebruikt om de positie van optische componenten. Een wetenschappelijke complementary metal-oxide semiconductor-camera ontdekt de fluorescentie-signaal en de out-of-focus-achtergrond met een dynamische confocal gleuf gesynchroniseerd met het vegen van de lichtbundel wordt geblokkeerd. Presenteren we een stapsgewijze instructie op het opbouwen van de icoon-Microscoop met alle basiscomponenten.
Introduction
Single-molecuul fluorescentie imaging speelt een belangrijke rol in vele biologische studies die ultrastructures, dynamiek en de hoeveelheid van biomoleculen1,2,3te onthullen. Echter heeft het is uitdagend om te studeren van single-moleculen binnen de cellen of weefsels. Terwijl confocale microscopie hoog vectorafbeeldingsbestanden vermogen4 biedt, is het niet geschikt voor single-molecuul imaging als gevolg van ernstige photobleaching door de hoge excitatie-intensiteit of trage imaging. Widefield microscopie zwakkere verlichting gebruikt maar lijdt aan een slecht signaal naar achtergrond verhouding (SBR)5. Licht vel microscopie, aan de andere kant kon laten zien goede segmenteren en lage photobleaching6; de beschikbare numerieke diafragma (nvt) wordt echter sterk beperkt door de eis van orthogonaal geplaatste doelstellingen7. U kunt ook vereist het speciale miniaturisten en monster chambers8,9.
Om deze redenen is zeer geneigd en gelamineerd optische blad (HILO) microscopie wijd verbeid gebruikt voor 3D-single-molecuul en imaging-10. Wanneer een geneigd lichtbundel tegenkomt een interface van twee media (glazen en water, bijvoorbeeld), wordt het licht gebroken volgens Snell de wet. Nog belangrijker is, de gebroken lichtstraal wordt dunner en de dikte wordt beschreven als dz = R/tan(θ) waarbij R is de diameter van de lichtbundel geneigd en θ de hoek van breking van het uitgezonden licht. Deze eenvoudige uitvoering resulteert in een goede vectorafbeeldingsbestanden vermogen. Deze relatie geeft echter aan dat een dunne verlichting (dat wil zeggen, hoog vectorafbeeldingsbestanden vermogen) een kleine R en/of een grote θ vereist. Bijvoorbeeld, wanneer R = 20 µm en θ = 72 graden, u kunt krijgen dz = 6.5 µm. Aangezien er een praktische limiet te verhogen op de hoek van breking oog beeld diep van binnen cellen en het vermijden van totale interne reflectie, is er een sterke koppeling van de verlichting-diameter en de dikte van de balk. Om deze reden toont HILO imaging een relatief kleine veld-of-view (FOV) die sterk zijn toepassingen in meercellige beeldbewerking beperkt.
Onlangs, hebben wij dit probleem opgelost door de microscopie van de zeer geneigd rondlopende Tegel (HIST.) waar de FOV is losgekoppeld van de dikte van de balk in een zeer eenvoudige manier11. Ten eerste, een bundel langwerpige in één richting wordt gegenereerd via een paar van cilindrische lenzen. Deze bundel, genoemd als een tegel, produceert een dunne verlichting met dz ~ 4 µm, terwijl de FOV is 130 x 12 µm2. Vervolgens is de tegel geveegd over het monster met behulp van een roterende galvo spiegel. Ondertussen is de fluorescentie-afbeelding opgenomen op een wetenschappelijke complementary metal-oxide semiconductor (sCMOS) camera die efficiënt out-of-focus achtergrond filtert met het opereren in een rollende sluitertijd modus die als afstembare confocal gleuf detectie fungeert. Op deze manier kunt HIST. microscopie single-molecuul beeldbewerking met een groter gezichtsveld (~ 130 x 130 µm2) en een dunner verlichting dan HILO imaging. Pasten we dit nieuwe imaging techniek voor het detecteren van RNA afschriften met één sonde in cellen of met een paar sondes in muis hersenen weefsels, die aanzienlijke potentieel heeft voor het bestuderen van genexpressie en ziekten. In tegenstelling tot andere benaderingen, HIST. telt slechts een enkele hoge numerieke diafragma doelstelling zonder een extra hulplicht of teledetectie doelstellingen en is volledig compatibel met omgekeerde microscopen. Deze voordelen samen met een grote FOV en hoog contrast zorgt HIST. microscopie een prominente instrument in de biologie en de geneeskunde. Presenteren wij gedetailleerde instructies met betrekking tot de instrumentatie van de icoon-Microscoop, en hoe om te testen en kalibreren van de prestaties zoals hieronder.
Protocol
1. het opzetten van de Microscoop, lasers en uitlijning tools
- Vóór de bouw van de Microscoop, alle benodigde onderdelen met inbegrip van de optica, optomechanics en elektronica zoals vermeld in Tabel van materialente bereiden.
- Bereiden een Microscoop lichaam voornamelijk samengesteld uit twee delen: de houder van een objectief met een RMS-threaded poort en een piezo-podium gemonteerd op een aluminium blok(Figuur 1).
Opmerking: Het lichaam van de op maat gemaakte Microscoop wordt gebruikt voor het gemak en de flexibiliteit van instrumentatie12. Elk orgaan verkrijgbare Microscoop kan worden gebruikt voor HIST. microscopie. - Het combineren van meerdere laserlijnen en het koppelen van hen naar een enkelvoudige modus fiber
- Install 405, 561, 638 nm lasers op de optische tafel en combineren de balken door een polariserende balk splitter en een long pass dichroïde spiegel zoals weergegeven in Figuur 1B. Zorg ervoor dat alle laserstralen gaatjes op de uitlijning tool passeren. Voeg een halve golf platen voor power aanpassingen.
Opmerking: Draag veiligheidsbril voor oogbescherming en gebruik van beam-blokken op te vangen van ongewenste laserstralen. - Installeren van een glasvezel koppeling lens (f = 4.5 mm) en een fiber adapter gehouden in de z-as vertaler met een kooi-systeem.
- Een multimode-glasvezel (MMF, Ø 62,5 µm) verbinden met de glasvezel adapter. Elk paar van de stuurinrichting spiegel en de z-vertaler aanpassen totdat de efficiëntie van de koppeling van elke laser hoger dan 95%. De uitvoer lichtbundel heeft een in de omgeving van Gauss-vormige profiel met spikkel patronen.
- Kant-en klaarmaaltijden om de multimode-glasvezel en verbinding maken met een enkele mode fiber (SMF). Gelijkaardig aan MMF, verfijnen en maximaliseren van de efficiëntie van de koppeling van drie lasers.
- Install 405, 561, 638 nm lasers op de optische tafel en combineren de balken door een polariserende balk splitter en een long pass dichroïde spiegel zoals weergegeven in Figuur 1B. Zorg ervoor dat alle laserstralen gaatjes op de uitlijning tool passeren. Voeg een halve golf platen voor power aanpassingen.
- Monteren van een collimated lichtbron die zal worden gebruikt voor de uitlijning van de bundel in de excitatie en detectie paden. Dit apparaat bestaat uit een stoffelijk coherente lichtbron (561 nm) verbonden met SMF, glasvezel adapter, Achromatische lens (f = 60 mm), iris en Ø1 "spacer buis in een kooi systeem (Figuur 1C). Pas de afstand tussen de vezel-adapter en de lens met behulp van een schuintrekken interferometer om ervoor te zorgen de collimatie.
- Bereiden een lichtbundel uitlijning tool (Figuur 1D). Dit is een paar van aluminium posten met gaatjes op 2" hoogte van het oppervlak van optische tabel, die voor snelle en nauwkeurige lichtbundel uitlijning zorgt.
- Assembleer een dubbele pinhole-systeem dat uit twee Ø1 bestaat "ingeslepen uitlijning schijven aan elk uiteinde en twee Ø1" lens buizen (de onderste is sleuven) zoals aangegeven in Figuur 1E.
2. het opzetten van het detectie-pad
- Neem de doelstelling en installeren van de collimated lichtbron. De knoppen van de spiegel (M1) onder de objectieve houder zodanig aanpassen dat de lichtbundel van de uitvoer van de Microscoop ongeveer parallel aan de optische tabel in hoogte en uitgelijnd met de schroefgaten op de tafel is. Zie Figuur 2 voor gedetailleerde standpunten van elke optische component.
- Invoegen van een multiband dichroïde spiegel (DM) en weerspiegelen de lichtbundel hoek van 90 graden. Gebruik de maximale grootte van de iris en ervoor te zorgen dat de lichtbundel door het midden van de dichroïde spiegel zonder knippen loopt.
- Gebruik de lekkende lichtbundel passeren de dichroïde spiegel om de uitlijning van detectie pad. Een sCMOS camera in de balk plaatsen en ervoor te zorgen dat de straal het midden van de camera chip raakt met behulp van de twee mirrors (M2 en M3).
- Invoegen van een buis-lens (TL; f = 300 mm) ongeveer 300 mm weg van de camera.
- Verwijder de collimated lichtbron en de relatieve afstand tussen de buis-lens en de camera aanpassen totdat een patroon op het plafond duidelijk door de camera opgelost is.
- Plaats een multi-band pasfilter (BF) voor de buis lens voor Multi-Color fluorescentie imaging.
3. het opzetten van de excitatie-pad
- Installeert de collimated lichtbron op de objectieve houder. Plaats een vouw-spiegel (M4) voor het omleiden van de uitvoer van de lichtbundel van de Microscoop door de 90 graden. Pas de knoppen van de dichroïde spiegel en de vouw-spiegel iteratief totdat de lichtbundel door gaatjes in het hulpprogramma voor het uitlijnen van beam loopt.
- Loskoppelen van de collimated lichtbron en installeer deze op de tabel, waarin de bundel naar de Microscoop lichaam wijst. Hiermee lijnt u de lichtbundel met een beam uitlijning gereedschap en een dubbele pinhole-systeem.
- Invoegen van een lens L4 (f = 400 mm; Ø = 2") om de optische weglengte van ongeveer 400 mm afstand van de objectieve houder. Installeer de objectief en pas de positie van L4 langs de optische as tot een volmaakt luchtige schijf patroon op het plafond ontstaat.
Opmerking: Bij het invoegen van de lens, de positie van de lichtbundel loopt door de lens moet blijven ongewijzigd. De lens L4 heeft een SM2 thread waarmee eenvoudig kunnen worden aangesloten/losgekoppeld van de 60 mm SM2-threaded kooi plaat. - Schroef de doelstelling en de collimated lichtbron met een open iris te installeren. Traceren van de uitvoer van de lichtbundel van de microscoop met een visitekaartje. Monteren van een spiegel M5 op de plaats waar de grootte van de lichtbundel de kleinste is en ongeveer 400 mm uit de buurt van L4, oftewel een geconjugeerd beeldvlak (cIP).
- Installeer een spiegel M6 en weerspiegelen de lichtbundel hoek van 90 graden. Aanpassen M5 en M6 iteratief met de lichtbundel uitlijning gereedschap.
- Invoegen van een lens L3 (f = 150 mm) ongeveer 150 mm uit de buurt van M5. Gebruik een schuintrekken interferometer om de collimatie van de lichtbundel van de uitvoer.
- Tijdelijk wegnemen L4- and -trace beneden de straal te vinden van de focale positie van L3. Zet een enkele as galvo spiegel op dit punt, dat is een geconjugeerd terug brandvlak (cBFP). Leveren van 0 volt tot de galvo spiegel en draaien van de houder van de galvo spiegel zodat hierin de lichtbundel hoek van 90 graden.
- Plaats een vouw-mirror M7. Goed plaats L2 (f = 100 mm) net als stap 3.6.
- Verwijder de collimated lichtbron van de houder van het object. Installeren van een collimatie lens L1 (f = 100 mm), glasvezel adapter en iris. Een enkelvoudige modus vezel sluit aan op de adapter en stuur de lichtbundel via het imaging systeem.
- Opnieuw invoegen van L4 en fine-tunen van het systeem tot een volmaakt luchtige schijf patroon wordt weergegeven op het plafond.
4. het opzetten van de cilindrische lenzen
- Invoegen van een cilindrische lens (CL1, f = 400 mm) na L1 en ervoor te zorgen dat de cilindrische lens het licht langs de x-as focust.
- Invoegen van een andere cilindrische lens (CL2, f = 50 mm) op het pad van de lichtbundel. Gebruik een schuintrekken interferometer om dat de straal van de uitvoer is collimated.
Opmerking: De afstand tussen de twee cylindrische lenzen is 450 mm. De uitvoer lichtbundel heeft een compressieratio van 8 en een langwerpig ovaal gevormde luchtige schijf patroon wordt gevormd op het plafond.
5. testen tegel imaging
- 3D hydrogel monster voor te bereiden. Mix 20 nm Crimson kralen met een hydrogel-oplossing, die uit 12% acrylamide:bisacrylamide (29:1), 0,2% (v/v) TEMED en 0.2% (m/v) ammonium persulfate in 0,75 x TAE buffer bestaat. Injecteren 50 µL van de gemengde oplossing in een flow kamer zoals elders beschreven11. Na 10 min is het 3D hydrogel monster klaar om voor imaging.
- Zet het monster op de monsterhouder. 638 nm laser inschakelen en aanpassen van de kracht naar < 1 mW voor monster excitatie.
- Het uitvoeren van de software van de controle van de camera. In het deelvenster camera acquisitie-instelling Selecteer intern in de trigger-modus en klik op Neem video kostenloos gebruikersstand.
- Lichtjes de positie van de camera zo instellen dat het beeld gelegen in het midden van de camera is wanneer 0 volt wordt toegepast op de galvo spiegel.
- Draaien van de horizontale knop van de spiegel M5 tot een zeer geneigd verlichting.
Opmerking: Met de toename van de lichtinvalshoek wordt de afbeelding hydrogel duidelijker dan die van de Epi-afbeelding als de lichtbundel dunner wordt. De afbeelding blijft echter bijna dezelfde positie. - Het opnemen van de afbeelding van de tegel. Bereken de effectieve verlichting breedte11. Figuur 3 toont bijvoorbeeld de breedte van de effectieve verlichting van 12 µm.
6. HIST imaging
- Een data acquisitie board aangesloten met een aansluitblok voor te bereiden. Verbinding van gebruiker 1 BNC-connector met P0.0 door een elektrische draad. GEBRUIKER 1 gebruiken als een digitale uitgang voor de externe triggering van de camera van de sCMOS. Verbinding maken met een analoge uitgang AO0 naar een galvo spiegel-stuurprogramma.
- TTL-puls treinen genereren uit P0.0 met behulp van een op maat gemaakt programma (Figuur 4A) en stelt u de periode tijd = 400 ms en t_ON = 2 ms. de gegenereerde pulsen van gebruiker 1 BNC terminal controleren door een digitale oscilloscoop en sluit de BNC-kabel aan op de camera externe trigger poort.
Opmerking: De controle-software gebruikt in dit document is beschikbaar op aanvraag. Wanneer imaging op verschillende camera framesnelheid, moet de periode tijd dienovereenkomstig worden aangepast. - Het vegen van een spiegel galvo via de op maat gemaakte programma starten Aanpassen van V,min , naar-500 mV en Vmax 500 mV voor volledige FOV imaging. Merk op dat onder deze bewerking, 3D hydrogel monsters nog hoog achtergrond vergelijkbaar met Epi-verlichting tonen.
- Instelling de camera acquisitie.
- Selecteer externe trigger modus en naar beneden (sequentieel) in LightScan Plus waterdruppel-waas spijskaart zoals weergegeven in Figuur 4B.
Opmerking: In deze instelling, de camera neemt geen afbeeldingen tenzij een trigger signaal is ingeschakeld. - Klik op Controle van de snelheid van de Scan voor venster hoogte en regel blootstelling tijdcontrole en stel de waarden worden 180 rijen en 28 ms, respectievelijk.
Opmerking: Wanneer een tegel breedte (WEVF) 180 rijen (12 µm is) en een integratie-tijd per regel (Tint) 28 ms is, een vertragingstijd tussen lijnen (TD) wordt bepaald als TD = Tint/WEVF = 0.156 ms. voor imaging-2048 x 2048 pixels, de totale Acquisitietijd is 2048 x TD + Tint = 346 ms, overeenkomt met ~2.9 fps.
- Selecteer externe trigger modus en naar beneden (sequentieel) in LightScan Plus waterdruppel-waas spijskaart zoals weergegeven in Figuur 4B.
- Vmax en V,min , voor duidelijkere beelden iets aanpassen.
- 3D stapel afbeeldingen met behulp van de op maat gemaakte programma door overschakelen op 3D stack ON en geven het aantal stacks en de stap-grootte te verkrijgen.
Representative Results
Als voorbeeld, was de single-stranded DNA aangeduid met Atto647N beeld met een golflengte van de excitatie van 638 nm in een 3D hydrogel. DNA werd verankerd aan de hydrogel-netwerk via een acrydite groep tijdens gel polymerisatie. De beelden werden genomen op 5 µm boven het oppervlak zoals weergegeven in Figuur 5een. De afbeelding icoon toonde veel minder achtergrond in vergelijking met de Epi-afbeelding, waaruit het signaal achtergrond / als 1,9 ± 0,7 voor de afbeelding icoon terwijl de meeste van de enkel molecuul plekken kon nauwelijks worden opgespoord door Epi werd berekend.
Single-molecuul RNA fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) werd uitgevoerd met 4 sondes van vis. Figuur 5 b toont beelden van de smFISH van EEF2 (eukaryotische vertaling elongatiefactor 2) aangeduid met AlexaFluor 647 A549 cellen in een imaging buffer (verwijs naar onze vorige werkzaamheden met betrekking tot de sample voorbereiding11). Een projectie van maximale intensiteit werd uitgevoerd op 20 z-stacks overeenkomt met 5 µm dikte. Het icoon beeld toonde niet alleen veel betere SBR maar ook meer uniforme verlichting ten opzichte van Epi afbeelding. Voor Epi beeldvorming, de belichtingstijd was 400 ms terwijl voor HIST. imaging de integratie tijd per regel 32 ms, die beide hetzelfde verlichting vermogen van 7,5 hadden mW gemeten vóór de doelstelling. De imaging snelheden van Epi en HIST. waren 2,5 bps.
Figuur 1 . Gereedschappen voor het lichaam, lasers en uitlijning van Microscoop. (A) doelstelling en monsterhouder. (B) foto van lasersystemen. LP, long pass dichroïde spiegel; Λ/2, half-golf platen; PBS, polariserende beamsplitter. (C) Collimated lichtbron. (D) Beam uitlijning tool met twee inlasbare gaatjes. (E) dubbel pinhole systeem. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Gedetailleerde setup voor microscopie van de zeer geneigd rondlopende Tegel (HIST.). Foto (A) en (B) schematische van HIST. Microscoop systeem. BF, multi-band pasfilter; CL1-2, cilindrische lenzen; DM, dichroïde spiegel; GM, galvo spiegel; BF, band pass filter; M1-7, spiegels; L1-4, lenzen; SMF, glasvezel in enkelvoudige modus; TL, buis lens; cIP, geconjugeerd beeldvlak; cBFP, geconjugeerd terug brandvlak. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Tegel verlichting met een compressieverhouding van 8. (A) afbeelding van de fluorescentie van 20 nm parels in een 3D hydrogel. Schaal bar, 20 µm. (B) standaarddeviatie projectie langs de y-richting van A, gladgestreken door 10 gegevenspunten. De rode pijl geeft de breedte van een effectieve verlichting van 12 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Controle en beeldbewerkingssoftware front panelen. (A) A custom-made LabView programma synchroon regelt het scannen van de galvo spiegel, de eerste overname van sCMOS camera en het verkeer van de piëzo-fase. (B) instelling van de overname van de Camera het Configuratiescherm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. (A) beelden van Atto647N-label DNA in een 3D hydrogel met Epi en HIST. verlichting. (B) smFISH beelden van EEF2 met 4 sondes vis op A549 cellen door Epi en HIST. microscopie. DAPI vlek wordt in blauw weergegeven. Schaal van bars, 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Er zijn twee belangrijke stappen in dit protocol. De eerste is de juiste plaatsing van L4 in stap 3.3, ervoor te zorgen dat de invallende lichtbundel door het midden van de lens loopt en een perfecte luchtige schijf patroon wordt gevormd op het plafond. De positie van L4 bepaalt de plaatsing van alle andere optische componenten, met inbegrip van M5, L2, L3 en GM. De tweede belangrijke stap is het synchronisatieproces. Om te weigeren de out of focus achtergrond, moeten actieve pixel waarvan doeltreffende opsporing de breedte gelijk aan de breedte van de tegel is worden gesynchroniseerd met de lichtbundel vegen. Daarom is het noodzakelijk om de breedte van het effectieve verlichting van een tegel lichtbundel (stap 5.6) meten en stel de camera parameters dienovereenkomstig in stap 6.4.
Wanneer imaging met zeer grote FOV, toont de onderhavige methode een verhoogde achtergrond aan één zijde ten opzichte van de andere kant. Dit wordt toegeschreven aan enigszins anders hoeken van verlichting op verschillende posities van de beeldvorming. Uitvoering van een tweede galvo spiegel in plaats van M5 vermindert dit probleem zoals aangetoond voordat door de positie en het scannen hoek11synchroon aan te passen. In plaats van off-the-shelf Achromatische paren zal een telecentrische scan lens ook nuttig zijn. Echter, voor een opnamegebied van < 8,080 µm2, één galvo spiegel vegen volstond. HIST. microscopie heeft een limiet van de beeldvorming diepte is echter het kunnen verkrijgen van een goede SBR wanneer imaging tot ~ 15 µm met een straal van 12 µm tegel en een nb 1.45 olie immersie objectief11.
In dit protocol gebruikten we een lichtbundel compressie-ratio van 8 om de straal van een tegel te maken. Een dunnere verlichting kan worden gebruikt in HIST. microscopie om hogere SBR, die misschien wel krachtig voor single-molecuul weefsel imaging11. Echter, in dit geval photobleaching effect moet worden beschouwd door een verhoogde excitatie-intensiteit terwijl de huidige lichtbundel compressieverhouding verminderde photobleaching in 3D imaging in vergelijking met de Epi-11 toonde. In vergelijking met licht vel microscopen met twee orthogonaal geplaatste doelstellingen, is HIST. microscopie eenvoudig te implementeren en compatibel met conventionele staalvoorbereiding. De verbeterde SBR en grote FOV van HIST. microscopie is geschikt voor het bestuderen van de interacties en de dynamiek van één biomoleculen in meerdere cellen en verder kan worden gebruikt in super resolutie beeldvorming en het bijhouden van de single-molecuul.
Disclosures
Universiteit van Centraal Florida heeft ingediend een octrooiaanvraag die betrekking hebben op het werk zoals beschreven in dit document.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (HR00111720066) en de National Science Foundation (NSF) (1805200). Wij danken Michael Serge in Andor technologie voor royaal lenen van de sCMOS camera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
| 1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
| 1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
| 1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
| 1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
| 1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
| 2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
| 2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
| 2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
| 2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
| 2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
| 20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
| 30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
| 30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
| 3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
| 405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
| 50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
| 561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
| 638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
| Beam alignment tool | custom made | ||
| BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
| Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
| Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
| Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
| Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
| Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
| Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
| Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
| Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
| long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
| Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
| Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
| Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
| Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
| Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
| Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
| N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
| NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
| Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
| Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
| Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
| Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
| Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
| Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
| RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
| Rod holder | custom made | ||
| Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
| sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
| Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
| SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
| SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
| Stage mount | custom made | ||
| threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |
References
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361, 880-887 (2018).
- Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer. Science. 359, (2018).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression. Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).
- Wilson, T. Resolution and optical sectioning in the confocal microscope. Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).
- Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope. Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nature Methods. 8, 1047 (2011).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12, 641 (2015).
- Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. 3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet. Nature Communications. 9, 123 (2018).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5, 159-161 (2008).
- Tang, J., Han, K. Y. Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination. Optica. 5, 1063-1069 (2018).
- Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution. Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).
- Sinkó, J., Szabó, G., Erdélyi, M. Ray tracing analysis of inclined illumination techniques. Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).
