Summary
Подробная инструкция описано о том, как построить очень склонны прокатилась плитка (HIST) микроскопа и его использования для одной молекулы воображения.
Abstract
Одноместный молекула изображений значительно расширить наше понимание молекулярных механизмов в биологических исследованиях. Однако было сложно получить большие поля зрения, высокая контрастность изображения в толстые клеток и тканей. Здесь мы представляем очень склонны прокатилась плитка (HIST) микроскопия, который преодолевает эту проблему. Пара Цилиндрические линзы был реализован для создания удлиненные возбуждения луч, который был проверен на большой площади изображения через быстрый гальво зеркало. 4f конфигурации был использован для позиционирования оптических компонентов. Научно взаимодополняющих металло оксидных полупроводников камеры обнаружен сигнал флуоресценции и заблокировали фон из из фокус с динамической конфокальный разрезом синхронизированы с луч подметать. Мы представляем пошаговые инструкции по созданию HIST микроскоп со всеми основными компонентами.
Introduction
Одноместный молекула флуоресценции изображений играет важную роль во многих биологических исследованиях, которые показывают данное, динамика и количество биомолекул1,2,3. Однако она была сложной для изучения одного молекул внутри клетки или ткани. Хотя confocal микроскопии обеспечивает высокую секущей возможности4, это не подходит для одного молекула изображений из-за тяжелой Фотообесцвечивание возбуждения высокой интенсивности или медленной скорости визуализации. Widefield микроскопии использует более слабой освещенности, но страдает от бедных сигнала фона соотношение (SBR)5. Свет лист микроскопии, с другой стороны, может показать хороший секционирование и низкий Фотообесцвечивание6; Однако имеющиеся числовой апертуры (NA) сильно ограничены требованием ортогонально размещены цели7. Кроме того он требует специальных осветителей и образец камеры8,9.
По этим причинам весьма склонны и ламинированные оптических листа (ХИЛО) микроскопия широко используется для 3D визуализации сингл молекула10. Когда Наклонный луч встречает интерфейс раздела двух сред (стекла и воды, например), луч преломляется согласно закону Снелл. Важно отметить, что преломления луча становится тоньше, и толщина его описывается как dz = R/tan(θ), где R – диаметр Наклонный луч и θ — угол преломления передаваемого луча. Это простая реализация приводит к хорошей возможности резания. Тем не менее эта связь указывает, что тонкие освещения (то есть, высокой секущей возможности) требует небольшой R и/или большой θ. Например, когда R = 20 мкм и θ = 72 градусов, можно получить dz = 6,5 мкм. Поскольку существует практический предел для увеличения угла преломления для изображения глубоко внутри клетки и избежать полного внутреннего отражения, существует сильное сцепление освещения диаметра и толщины луча. По этой причине HILO изображений показывает сравнительно небольшой поле в зрения (FOV, существенно ограничивает ее применения в многоклеточных изображений).
Недавно мы преодолеть эту проблему путем микроскопии весьма склонен прокатилась плитка (HIST), где FOV отделяется от толщины луча в очень простой способ11. Во-первых вытянутые в одном направлении луч генерируется через пару Цилиндрические линзы. Этот луч, как плитка, производит тонкие освещения с dz ~ 4 мкм, а его ПЗ-130 x 12 мкм2. Затем плитка охватила образца с помощью вращающегося зеркала гальво. Тем временем флуоресценции изображение записывается на камеру научных взаимодополняющих металло оксидных полупроводников (sCMOS), которая фильтрует эффективно вне фокуса фон в скользящего затвора режиме, который служит перестраиваемый конфокальный щели обнаружения. Таким образом HIST микроскопии позволяет одной молекулы изображений с большей поля зрения (~ 130 x 130 мкм2) и тоньше освещение чем HILO изображений. Мы применили новые визуализации технику, чтобы обнаружить РНК стенограммы с единичного пробоотборника в клетках или в нескольких датчиков в тканях мозга мыши, который имеет значительный потенциал для изучения экспрессии генов и заболеваний. В отличие от других подходов HIST использует только один высокая числовая апертура цели без дополнительный осветитель или дистанционного обнаружения цели и полностью совместим с Перевернутый микроскопы. Эти преимущества наряду с большой угол обзора и высокий контраст будет сделать HIST микроскопии выдающийся инструмент в биологии и медицине. Мы представляем подробные инструкции относительно инструментария HIST микроскопа, и как для тестирования и калибровки его производительность, как показано ниже.
Protocol
1. Настройка инструментов Микроскоп, лазеры и выравнивание
- Перед началом строительства в Микроскоп, подготовьте все необходимые компоненты, включая Оптика, optomechanics и электроники, перечисленных в Таблице материалов.
- Подготовить Микроскоп тело основном состоит из двух частей: объективный держатель с пьезо стадии и RMS-продетые потоками порта установлен на алюминиевый блок (рис. 1А).
Примечание: По заказу Микроскоп тело используется для удобства и гибкости инструментирования12. Любой орган, коммерчески доступных микроскоп может использоваться для микроскопии HIST. - Объединяя несколько лазерных линий и связывая их с одномодового волокна
- Установка 405, 561, 638 нм лазеры на оптических таблице и объединить лучи через поляризационные splitter луча и Лонг перевал дихроичное зеркало, как показано на рисунке 1B. Убедитесь, что все лазерные лучи проходят через проколы на выравнивание инструмент. Добавить половину волны пластины для регулировки мощности.
Примечание: Носить защитные очки для защиты глаз и использовать брус блоки для поглощения нежелательных лазерных лучей. - Установите волокна соединительной объектив (f = 4,5 мм) и волоконно-оптических адаптеров в z-axis переводчик с системой клетки.
- Подключите многомодового волокна (MMF, Ø 62,5 мкм) к адаптеру волокна. Настройки каждой пары рулевое зеркал и z переводчик, пока муфта эффективность каждого лазерного выше 95%. Выходной луч имеет вблизи Гаусса образный профиль с спекл узорами.
- Заберите многомодового волокна и подключить одномодового волокна (SMF). Подобно ММФ, точной и максимизировать эффективность сцепления трех лазеров.
- Установка 405, 561, 638 нм лазеры на оптических таблице и объединить лучи через поляризационные splitter луча и Лонг перевал дихроичное зеркало, как показано на рисунке 1B. Убедитесь, что все лазерные лучи проходят через проколы на выравнивание инструмент. Добавить половину волны пластины для регулировки мощности.
- Соберите коллимированных источник света, который будет использоваться для выравнивания луч в пути возбуждения и обнаружения. Это устройство состоит из височно последовательной источника света (561 Нм) подключены к SMF, адаптер волокна, ахроматический объектив (f = 60 мм), Ирис и Ø1» труба прокладку в клетке системы (рис. 1C). Подрегулируйте расстояние между адаптер волокна и объектива, с помощью интерферометра стрижка для обеспечения коллимации.
- Подготовьте пучка выравнивание инструмент (рис. 1D). Это пару постов алюминия с штырька 2» высоте от поверхности таблицы оптики, которая позволяет для быстрого и точного пучка выравнивание.
- Соберите двойной обскуры системы, которая состоит из двух Ø1 «матового стекла выравнивание дисков на каждом конце и два Ø1» объектив трубки (нижний прорези), как показано на рисунке 1E.
2. Настройка обнаружения пути
- Возьмите цель и установить коллимированных источника света. Отрегулируйте ручки зеркала (M1) под объективные держатель так, чтобы выходной луч от Микроскоп примерно параллельно таблицы оптики в высоту и выровнены с резьбовыми отверстиями на столе. Для подробных позиций каждого оптического компонента обратитесь к рис .
- Вставьте Многодиапазонный дихроичное зеркало (DM) и отразить луч на 90 градусов. Использовать максимальный размер диафрагмы и убедитесь, что луч проходит через центр дихроичное зеркало без усечения.
- Используйте Дырявый луч, проходя через дихроичное зеркало для выравнивания обнаружения пути. Поместите камеру sCMOS в пучок и убедитесь, что луч хитов центр чип камеры с помощью двух зеркал (м2 и м3).
- Вставить трубку объектив (TL; f = 300 мм) примерно в 300 мм от камеры.
- Удаление коллимированных источник света и отрегулировать относительное расстояние между трубка объектива и камеры до тех пор, пока шаблон на потолке четко решен на камеру.
- Вставьте фильтр мульти полосовые (BF) перед объективом трубки для флуоресценции многоцветные изображения.
3. Настройка пути возбуждения
- Переустановите коллимированных источник света на держателе объективной. Место сгиба зеркало (М4), чтобы перенаправить вывод луча от Микроскоп на 90 градусов. Отрегулируйте ручки дихроичное зеркало и фолд зеркало многократно до тех пор, пока луч проходит через проколы в инструмент выравнивания луч.
- Отсоединить коллимированных источник света и установить его на таблице, в которой луч указывает на Микроскоп тела. Совместите луча, используя инструмент выравнивания луч и двойной обскуры системы.
- Вставить объектив L4 (f = 400 мм; Ø = 2») для оптического пути примерно 400 мм от объективного держателя. Установка объектива и отрегулировать положение L4 вдоль оптической оси до тех пор, пока шаблон идеальный диск Эйри формируется на потолке.
Примечание: При вставке объектива, позиция луч, проходя через объектив следует сохранить без изменений. Объектив L4 имеет см2 поток, что позволяет ему быть придает/отделен от 60 мм Кейдж см2 резьбовые пластины легко. - Отвинтить цель и переустановить коллимированных источник света с открытой диафрагмой. Отслеживать вниз выходного пучка от микроскоп с визитной карточки. Смонтировать зеркало M5 на месте, где размер луча является самым маленьким, и приблизительно в 400 мм от L4, которая представляет собой плоскость, конъюгированных изображения (cIP).
- Установить зеркало M6 и отразить луч на 90 градусов. Отрегулируйте M5 и M6 итеративно с пучка выравнивание инструмент.
- Вставить линзы L3 (f = 150 мм) примерно 150 мм от M5. Используйте режа интерферометра для обеспечения коллимации луча вывода.
- Временно забрать L4 и отслеживать вниз луч, чтобы найти положение фокуса L3. Положите зеркало гальво одной оси в этот момент, который является конъюгированных обратно фокальной плоскости (cBFP). Снабжения 0 вольт гальво зеркало и вращайте держатель зеркала гальво так, что он отражает луч на 90 градусов.
- Место сгиба зеркало M7. Правильно разместить L2 (f = 100 мм) так же, как шаг 3,6.
- Удаление коллимированных источник света от владельца объекта. Установите объектив коллимации L1 (f = 100 мм), адаптер волокна и диафрагмой. Подключите к адаптеру одномодового волокна и отправить луча через систему обработки изображений.
- Снова вставьте L4 и тонкой настройки системы, до тех пор, пока шаблон идеальный диск Эйри появляется на потолке.
4. Настройка Цилиндрические линзы
- Вставить цилиндрические линзы (CL1, f = 400 мм) после L1 и убедитесь, что Цилиндрическая Линза фокусирует луч вдоль оси x.
- Вставьте другой Цилиндрические линзы (CL2, f = 50 мм) на пути луча. Используйте режа интерферометра для обеспечения коллимированного пучка вывода.
Примечание: Расстояние между двумя Цилиндрические линзы составляет 450 мм. Выходной луч имеет степень сжатия 8 и формируется удлиненной овальной формы диска Эйри модель на потолке.
5. Тестирование плитка изображений
- Подготовьте образец 3D гидрогеля. Микс 20 Нм малиновый бисер с раствором гидрогеля, который состоит из 12% acrylamide:bisacrylamide (29: 1), 0,2% (v/v) TEMED и 0,2% (w/v) Аммония пероксодисульфат 0,75 x TAE буфера. Придать 50 мкл раствора смешанного потока камеру, как описано в других разделах11. После 10 минут образец 3D гидрогеля готова для обработки изображений.
- Поместите образец на держатель образца. Включите 638 Нм лазер и отрегулировать мощность для < 1 МВт для возбуждения образца.
- Запустите программное обеспечение управления камерой. В панели камеры приобретение параметр выберите внутренний в режиме триггер и нажмите кнопку взять видео бесплатно работает режим.
- Слегка отрегулируйте положение камеры, так что изображение расположен в центре камеры, когда 0 вольт применяется к гальво зеркало.
- Поверните ручку горизонтальное зеркало M5 для достижения весьма склонен освещения.
Примечание: С увеличением угла освещения, гидрогеля изображение становится яснее, чем Epi изображения, как луч становится тоньше. Однако изображение сохраняет почти такую же позицию. - Запишите изображение плитки. Рассчитайте ширину эффективного освещения11. Например Рисунок 3 показывает ширину эффективного освещения 12 мкм.
6. HIST изображений
- Подготовьте доску приобретение данных, связанных с терминала блок. Подключите разъем BNC 1 пользователя с P0.0 через электрические провода. Пользователь 1 можно используйте в качестве цифрового выхода для внешнего запуска камеры sCMOS. Подключение аналогового вывода AO0 гальво зеркало водителя.
- Генерировать TTL импульсов поезда из P0.0 с помощью заказной программы (рис. 4A) и задайте период времени = 400 мс и t_ON = 2 г-жа проверить сгенерированный импульсов от пользователя 1 BNC терминал цифровой осциллограф и затем подключите BNC кабель к камере порт внешнего запуска.
Примечание: Программное обеспечение управления, используемые в этой бумаге доступен по запросу. При визуализации в разные камеры кадров, период времени следует скорректировать соответствующим образом. - Начните радикальные гальво зеркало через программу по индивидуальному заказу. Отрегулируйте Vмин -500 м и VМакс 500 мВ для полного ПЗ воображения. Следует отметить, что в рамках этой операции, образцы 3D гидрогеля по-прежнему высокий фон аналогичны Epi освещения.
- Изменение параметра приобретения камеры.
- Выберите внешний в режиме триггера и вниз (последовательный) в раскрывающемся меню LightScan плюс как показано на рисунке 4B.
Примечание: В этот параметр, камеры не принимать изображения если сигнал включен. - Нажмите кнопку Управление скоростью сканирования для окна высоту и линии контроля времени экспозиции и задайте значения быть 180 строк и 28 МС, соответственно.
Примечание: Когда плитки ширина (Weff) составляет 180 строк (12 мкм) и время интеграции в строке (intT) 28 МС, время задержки между линиями (TD) определяется как TD = Tint/wэфф = 0,156 г-жа для визуализации 2048 x 2048 пикселей, Общая приобретение время — 2048 x TD + Tint = 346 МС, соответствующий ~2.9 fps.
- Выберите внешний в режиме триггера и вниз (последовательный) в раскрывающемся меню LightScan плюс как показано на рисунке 4B.
- Слегка корректировать VМакс имин V для получения четкого изображения.
- Получите изображения 3D стека, используя программу по индивидуальному заказу, переключившись на 3D стека в и указав количество стеков и размер шага.
Representative Results
В качестве примера, одноцепочечной ДНК с Atto647N был воспроизведен образ с возбуждения волны 638 Нм в 3D гидрогеля. ДНК была привязана к гидрогеля сети через группу acrydite во время полимеризации геля. Изображения были взяты на 5 мкм на поверхности, как показано на рисунке 5. HIST изображения показали значительно меньше по сравнению с Epi изображение, из которого был рассчитан фон соотношение сигнал что 1.9 ± 0,7 для изображения HIST, хотя большинство пятен одной молекулы едва могут быть обнаружены с помощью РПИ фона.
Сингл молекула РНК флуоресценции в гибридизации situ (smFISH) была выполнена с 4 штырями рыбы. Рисунок 5 b отображает smFISH образы EEF2 (эукариот перевод удлинение фактор 2) помечены 647 AlexaFluor на A549 клетки в визуализации буфера (см. наши предыдущие работы относительно подготовки образца11). Максимальная интенсивность проекция была выполнена на 20 z стеки, соответствующий 5 микрон толщины. Изображение HIST, показал не только значительно улучшен SBR, но также более равномерное освещение, по сравнению с Epi изображения. Для РПИ изображений, время экспозиции было 400 мс в то время как для визуализации интеграции HIST время в строке было 32 МС, оба из которых были же освещение мощность 7,5 МВт измеряется до цели. Визуализации скорости РПИ и HIST были 2,5 fps.
Рисунок 1 . Микроскоп тела, лазеры и выравнивание инструменты. (A) задача и держатель образца. (B) Фото лазерных систем. LP, Лонг перевал дихроичное зеркало; Λ/2, Полуволновые пластинки; PBS, поляризационный светоделитель. (C) источник Collimated света. (D) пучка выравнивание инструмент с двумя вставным проколов. (E) двойной обскуры системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Подробная настройка для микроскопии весьма склонен прокатилась плитка (HIST). Фото (А) и схема (Б) HIST Микроскоп системы. БФ, мульти полосовой фильтр; CL1-2, Цилиндрические линзы; DM дихроичным зеркало; ГМ, гальво зеркало; BF, полосовой фильтр; M1-7, зеркала; L1-4, линзы; SMF, одномодового волокна; TL, трубка объектива; cIP, конъюгированных плоскости; cBFP, конъюгированных обратно фокальной плоскости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Плитки освещения с сжатия 8. (A) изображение флуоресценции 20 Нм бисера в 3D гидрогеля. Линейки, 20 мкм. (B) стандартное отклонение проекции вдоль оси y a, сглаженный по 10 данных точек. Красная стрелка указывает ширину эффективного освещения 12 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Управления и визуализации программного обеспечения передних панелей. (A) A на заказ LabView программы синхронно управляет сканирование гальво зеркало, начиная приобретение sCMOS камеры и движение piezo стадии. (B) панель управления настройки приобретения камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. (A) изображения Atto647N-меченых ДНК в 3D гидрогеля с Epi и HIST освещения. (B) smFISH образы EEF2 с помощью 4 рыбы зонды на A549 клетки, РПИ и HIST микроскопии. Пятно DAPI показаны синим цветом. Масштаб баров, 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Существует два важных шага в настоящем Протоколе. Первый из них является надлежащее размещение L4 в шаге 3.3, обеспечивая инцидента луч проходит через центр объектива и формируется идеальный диск Эйри модель на потолке. Положение L4 определяет размещение всех других оптических компонентов, включая M5, L2, L3 и ГМ. Вторым важным шагом является процесс синхронизации. Чтобы отклонить вне фокуса фона, активных пикселов, эффективного обнаружения, ширина которого равна ширине плитки должны быть синхронизированы с луч подметать. Таким образом необходимо измерить ширину эффективного освещения пучка плитка (шаг 5.6) и параметры установить камеры соответственно в шаге 6.4.
При визуализации с очень большими ПЗ, представленный метод показывает увеличение фон с одной стороны, по сравнению с другой стороны. Это объясняется слегка изменены углы освещения позиции различных изображений. Реализация второй гальво зеркало вместо M5 снимает эту проблему, как продемонстрировал перед синхронно регулируя позицию и сканирования угол11. Вместо того, чтобы готовый ахроматические Дуплеты телецентрическим объективом сканирования будет также полезно. Однако, для визуализации области < 8,080 µm2, единый гальво подметать зеркало было достаточно. Микроскопия HIST имеет предел глубины изображения, однако, это возможность получить хороший SBR, при визуализации до ~ 15 мкм с лучом плитка 12 мкм и NA 1,45 масло погружения объектива11.
В этом протоколе мы использовали луч сжатия 8 сделать пучок плитки. Тонкие освещения может использоваться в HIST микроскопии для достижения более высоких SBR, который может быть мощным для одной молекулы тканей изображений11. Однако в данном случае, Фотообесцвечивание эффект должен быть рассмотрен интенсивность увеличения возбуждения в то время как текущий коэффициент сжатия луч показал снижение Фотообесцвечивание в 3D визуализации, по сравнению с Epi11. По сравнению с свет лист Микроскопы с двух ортогонально размещены целей, HIST микроскопии прост в реализации и совместимы с обычными образец препаратов. Расширение SBR и большой ПЗ HIST микроскопии подходит для изучения взаимодействия и динамику одного биомолекул в несколько ячеек и может быть использован далее в супер-резолюции изображений и одной молекулы отслеживания.
Disclosures
Университет Центральной Флориды подал заявку на патент, охватывающий работу, описанных в данном документе.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана обороны передовых исследовательских проектов агентства (DARPA) (HR00111720066) и Национальный фонд науки (NSF) (1805200). Мы благодарим Майкла Serge в Andor технологии за щедро кредитование sCMOS камеры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
| 1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
| 1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
| 1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
| 1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
| 1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
| 2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
| 2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
| 2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
| 2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
| 2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
| 20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
| 30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
| 30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
| 3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
| 405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
| 50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
| 561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
| 638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
| Beam alignment tool | custom made | ||
| BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
| Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
| Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
| Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
| Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
| Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
| Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
| Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
| Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
| long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
| Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
| Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
| Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
| Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
| Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
| Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
| N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
| NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
| Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
| Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
| Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
| Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
| Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
| Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
| RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
| Rod holder | custom made | ||
| Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
| sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
| Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
| SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
| SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
| Stage mount | custom made | ||
| threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |
References
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361, 880-887 (2018).
- Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer. Science. 359, (2018).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression. Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).
- Wilson, T. Resolution and optical sectioning in the confocal microscope. Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).
- Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope. Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nature Methods. 8, 1047 (2011).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12, 641 (2015).
- Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. 3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet. Nature Communications. 9, 123 (2018).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5, 159-161 (2008).
- Tang, J., Han, K. Y. Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination. Optica. 5, 1063-1069 (2018).
- Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution. Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).
- Sinkó, J., Szabó, G., Erdélyi, M. Ray tracing analysis of inclined illumination techniques. Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).
