La microscopia della forza di trazione ad alta velocità di throughput tramite PDMS rivela effetti dipendenti dalla dose di trasformazione del fattore di crescita , sulla transizione epitelil-to-mesenchymic
Summary
Vi presentiamo un saggio di forza di trazione ad alta velocità di trazione fabbricato con gomma in silicone (PDMS). Questo nuovo test è adatto per studiare i cambiamenti fisici nella contrattilità cellulare durante vari processi e malattie biologiche e biomediche. Dimostriamo l’utilità di questo metodo misurando un aumento dipendente dal TGF e dalla contrattilità durante la transizione epiteliale-mesenchymal.
Abstract
La contrattilità cellulare è essenziale in diversi aspetti della biologia, guidando processi che vanno dalla motilità e divisione, alla contrazione dei tessuti e alla stabilità meccanica, e rappresenta un elemento fondamentale della vita animale multicellulare. Nelle cellule aderenti, la contrazione acto-miosina è osservata nelle forze di trazione che le cellule esercitano sul loro substrato. La disregolazione della contrattilità cellulare appare in una miriade di patologie, rendendo la contrattilità un obiettivo promettente in diversi approcci diagnostici utilizzando la biofisica come metrica. Inoltre, nuove strategie terapeutiche possono essere basate sulla correzione dell’apparente malfunzionamento della contrattilità cellulare. Queste applicazioni, tuttavia, richiedono la quantificazione diretta di queste forze.
Abbiamo sviluppato la microscopia a forza di trazione basata su elastomeri in silicone (TFM) in un formato multi-well parallelizzato. Il nostro uso di gomma in silicone, in particolare polidimetilsiloxane (PDMS), piuttosto che la poliacrilammide idrogel comunemente impiegata (PAA) ci permette di fare substrati robusti e inerti con una durata di conservazione indefinita che non richiede condizioni di stoccaggio specializzate. A differenza degli approcci basati su pillar-PDMS che hanno un modulo nella gamma GPa, il PDMS qui utilizzato è molto conforme, che vanno da circa 0,4 kPa a 100 kPa. Creiamo una piattaforma ad alta velocità per TFM partizionando questi grandi substrati monolitici spazialmente in pozzi biochimicamente indipendenti, creando una piattaforma multi-bene per lo screening della forza di trazione che è compatibile con i sistemi multi-well esistenti.
In questo manoscritto, utilizziamo questo sistema di forza di trazione multi-bene per esaminare la transizione epitelica a mesenchymica (EMT); induciamo EMT nelle cellule NMuMG esponendole al TGF-z e per quantificare i cambiamenti biofisici durante EMT. Misuriamo la contrattilità in funzione della concentrazione e della durata dell’esposizione al TGF- I nostri risultati qui dimostrano l’utilità della TFM parallelizzata nel contesto della biofisica della malattia.
Introduction
La contrattilità dell’acto-miosina è un elemento essenziale della meccanica delle cellule attive, influenzando i comportamenti delle cellule dalla motilità e la proliferazione alla differenziazione delle cellule staminali. Nei tessuti, la contrattilità determina l’attività dalla separazione polare nell’embriogenesi, alla costrizione delle vie aeree e all’attività cardiaca. Fondamentalmente, per generare tensione, le cellule devono prima aderire al loro ambiente extracellulare. In questo modo, questa contrattilità genera forze di trazione sull’ambiente circostante. La microscopia a forza di trazione (TFM) è emersa in una moltitudine di forme come un modo per quantificare queste forze da diverse cellule in diverse condizioni.
Il campo della TFM ha visto un’eccezionale ampiezza di innovazione e applicazione, e i risultati hanno aperto la strada a nuove prospettive in biologia, che incorporano la meccanica e le forze fisiche. A partire da substrati di silicone rugosa1, i ricercatori hanno applicato varie tecniche per misurare le forze di trazione cellulare. Questi approcci sono stati continuamente migliorati e hanno ora raggiunto un livello di risoluzione dell’ordine di diversi micron2. Tuttavia, è emerso un problema principale, che è la difficoltà di creare substrati di moduli opportunamente bassi utilizzando i siliconi disponibili. Per aggirare questo problema, la poliacrilammide è stata adottata in sostituzione grazie alla facilità di creazione di substrati nell’ordine di 1-20 kPa3. Recentemente abbiamo implementato siliconi moltoconformi in TFM 4, permettendoci di fabbricare la stessa gamma di moduli come poliacrilammide, ma con i vantaggi di silicone inerte e robusto.
Gli approcci TFM hanno permesso preziose scoperte meccano-biologiche, tuttavia, una persistente carenza è la loro complessità, spesso limitandone l’uso ai ricercatori nelle discipline ingegneristiche o scienze fisiche. Ciò è dovuto in gran parte alle calibrazioni dettagliate e ai calcoli impegnativi necessari per quantificare la contrattilità. Un’altra sfida significativa è che i metodi TFM sono in gran parte a bassa velocità effettiva e quindi inadatti a studiare molte condizioni diverse o popolazioni contemporaneamente5. Ciò ha presentato un collo di bottiglia, che ha ostacolato il trasferimento di TFM da un’impostazione di biofisica specialistica in applicazioni biologiche e farmacologiche più ampie.
Recentemente abbiamo sviluppato una piastra TFM multi-bene, che consente ai ricercatori di parallelizzare le loro misurazioni TFM per una più rapida quantificazione delle metriche di contrattilità, esplorando l’impatto di diversi composti e utilizzando anche meno reagenti4 . Questa metodologia ha un’ampia utilità in diversi studi di meccanobiologia, dalla valutazione degli effetti dei composti sull’attività cellulare, alla quantificazione dei cambiamenti contrattuali nella differenziazione o nella malattia.
Un’area di ricerca biomedica che trarrà grande beneficio dalla TFM è lo studio di come i segnali fisici influenzano i fenotipi maligni delle cellule tumorali. La metastasi, responsabile del 90% dei decessi correlati al cancro, è caratterizzata da cellule cancerose che lasciano il loro sito tumorale originale e colonizzano un sito secondario. Affinché le cellule migrano attraverso i tessuti e passino dentro e fuori dal sistema vascolare, devono cambiare radicalmente le loro forme per spremere attraverso queste barriere fisiche, generando forze sostanziali per muoversi lungo la matrice extracellulare o spostarsi tra gli altri Cellule. Queste forze vengono trasmesse al substrato attraverso interazioni di adesione focale2,3e possono essere quantificate utilizzando TFM. Mentre i tumori sono biochimicamente eccezionalmente diversi, con un repertorio in espansione di mutazioni note e cambiamenti proteici, sono stati osservati alcuni cambiamenti fisici comuni; in una varietà di tumori, tra cui il seno, la prostata e i tumori polmonari, le cellule metastatiche hanno dimostrato di esercitare 2-3 volte le forze di trazione delle cellule non metastatiche6,7,8. Questi risultati suggeriscono che ci può essere una forte correlazione tra la progressione metastatica e le forze di trazione esercitate dalle cellule; tuttavia, i cambiamenti dettagliati dipendente dal tempo nella contrattilità sono difficili da esaminare.
La transizione epiteliale-mesenchica (EMT) è un processo attraverso il quale le cellule riducono l’adesione mediata cellulare-aderente e a giunzione stretta, diventando più migratoria e invasiva. Oltre alle funzioni fisiologiche che includono la guarigione delle ferite e i processi di sviluppo, EMT è anche un processo sfruttato durante la metastasi, rendendolo un utile sistema modello per studiare questo processo. Utilizzando il TGF-z, possiamo indurre l’EMT nelle cellule epiteliali mammarie murine (NMuMG)9 a quantificare direttamente i cambiamenti fisici durante questa trasformazione e a caratterizzare gli effetti dipendenti dal tempo e dalla dose del TGF- su EMT e sulla contratcietà cellulare. In questo articolo viene illustrata l’utilità di questo approccio misurando i cambiamenti nella contrattilità durante un EMT indotto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per il successo di questo metodo, è fondamentale avere un campione uniformemente rivestito con uno spessore costante di circa 100 m. Il modulo deve essere scelto con attenzione per esaminare il significato fisico del sistema biologico di interesse. Quando si fabbrica uno strato superiore, la concentrazione delle particelle fluorescenti fiduciarie deve essere ottimizzata per un’analisi accurata dello spostamento e dello stress da trazione. L’analisi di singole cellule isolate richiede uno strato fiduciario più denso ris…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Tom Kodger, Michael Landry e Christopher J. Barrett per l’assistenza con la sintesi di perline. A.J.E. riconosce le sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council fecondazione RGPIN/05843-2014 e EQPEQ/472339-2015, Canadian Institutes of Health Research grant n. 143327, Canadian Cancer Society grant no. 703930 e Canadian Foundation for Innovation #32749 del progetto. R. Krishnan riconosce la sovvenzione dei National Institutes of Health no. R21HL123522 e R01HL136209. H.Y. è stato supportato da Fonds de recherche Santé Québec e Fonds de recherche Nature et Technologies Québec. Gli autori ringraziano Johanan Idicula per l’assistenza con il video e il manoscritto e per l’assistenza nella preparazione del video.
Materials
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP | |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. Traction forces in locomoting cells. Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
