Summary
Apresentamos um ensaio de força de tração de alta produtividade fabricado com borracha de silicone (PDMS). Este novo ensaio é adequado para o estudo de alterações físicas na contratilidade celular durante vários processos biológicos e biomédicos e doenças. Nós demonstramos a utilidade deste método medindo um aumento dependente TGF-β na contractilidade durante a transição epithelial-à-mesenchymal.
Abstract
A contratilidade celular é essencial em diversos aspectos da biologia, conduzindo processos que vão desde a motilidade e divisão, à contração tecidual e estabilidade mecânica, e representa um elemento central da vida animal multicelular. Nas células aderentes, a contração do acto-miosina é observada nas forças de tração que as células exercem em seu substrato. A desregulação da contratilidade celular aparece em uma infinidade de patologias, tornando a contratilidade um alvo promissor em diversas abordagens diagnósticas utilizando biofísica como métrica. Além disso, as estratégias terapêuticas novas podem ser baseadas em corrigir o mau funcionamento aparente da contratilidade da pilha. Estas aplicações, no entanto, exigem a quantificação direta dessas forças.
Nós desenvolvemos o silicone elastomer-baseou a microscopia da força da tração (TFM) em um formato multi-bem paralelizado. Nosso uso de uma borracha de silicone, especificamente o polidimetilsiloxano (PDMS), um pouco do que o poliacrilamida comumente empregado do hidrogel (PAA) permite-nos de fazer carcaças robustas e inertes com prateleira-vidas indefinidas que não exigem nenhumas condições de armazenamento especializadas. Diferentemente das abordagens baseadas em Pilar-PDMS que têm um módulo na faixa GPa, o PDMS usado aqui é muito compatível, variando de aproximadamente 0,4 kPa a 100 kPa. Criamos uma plataforma de alta taxa de transferência para o TFM, Particionando esses grandes substratos monolíticos espacialmente em poços bioquimicamente independentes, criando uma plataforma multipoços para a triagem de força de tração que é compatível com sistemas de vários poços existentes.
Neste manuscrito, utilizamos este sistema de força de tração multipoços para examinar a transição epitelial para mesenquimal (EMT); Nós induzem o EMT em pilhas de NMuMG expondo os a TGF-β, e para quantificar as mudanças biofísicas durante EMT. Nós medimos a contratilidade em função da concentração e da duração da exposição ao TGF-β. Nossos achados aqui demonstram a utilidade da TFM paralelizada no contexto da doença Biofísica.
Introduction
A contratilidade do acto-miosina é um elemento essencial da mecânica celular ativa, impactando os comportamentos celulares da motilidade e proliferação para a diferenciação das células-tronco. Nos tecidos, a contratilidade impulsiona a atividade da separação polar na embriogênese, à constrição das vias aéreas e à atividade cardíaca. Criticamente, para gerar tensão, as células devem primeiro aderir ao seu ambiente extracelular. Ao fazê-lo, essa contratilidade gera forças de tração em seus arredores. A microscopia da força da tração (TFM) emergiu em uma multidão de formulários como uma maneira de quantificar estas forças das pilhas diversas circunstâncias diferentes.
O campo da TFM tem visto uma amplitude excepcional de inovação e aplicação, e os resultados têm pavimentado o caminho para novas perspectivas na biologia, que incorporam mecânica e forças físicas. Começando com enrugamento de substratos de silicone1, pesquisadores têm aplicado várias técnicas para medir as forças de tração celular. Estas abordagens têm sido continuamente melhoradas e alcançaram agora um nível de resolução na ordem de vários mícrons2. No entanto, surgiu um problema principal, que é a dificuldade em criar substratos de moduli adequadamente baixo usando os silicones disponíveis. Para contornar esse problema, a poliacrilamida foi adotada como um substituto devido à facilidade de criação de substratos na ordem de 1-20 kPa3. Recentemente implementamos silicones muito complacentes em TFM4, permitindo-nos fabricar a mesma gama de moduli como poliacrilamida, mas com as vantagens de silicone inerte e robusto.
As aproximações de TFM permitiram descobertas mechano-biológicas valiosas, entretanto, um lacuna persistente são sua complexidade, restringindo frequentemente seu uso aos investigadores nas disciplinas da engenharia ou das ciências físicas. Isto é devido em grande parte às calibrações detalhadas e cálculos desafiadores que são necessários para quantificar a contratilidade. Outro desafio significativo é que os métodos de TFM são em grande parte baixa taxa de transferência e, portanto, mal adaptados para estudar muitas condições diferentes ou populações simultaneamente5. Isso tem apresentado um gargalo, que tem dificultado a transferência de TFM a partir de um especialista em Biofísica configuração em aplicações biológicas e farmacológicas mais amplas.
Desenvolvemos recentemente uma placa TFM de formato multi-bem, que permite aos pesquisadores paralelizar suas medições de TFM para uma quantificação mais rápida das métricas de contratilidade, explorando o impacto de diferentes compostos e também usando menos reagentes4 . Esta metodologia tem ampla utilidade em diversos estudos de mecanobiologia, desde a avaliação dos efeitos de compostos na atividade celular, até a quantificação das alterações contrátil da diferenciação ou da doença.
Uma área de pesquisa biomédica que beneficiará grandemente da TFM é o estudo de como as pistas físicas impactam os fenótipos malignos das células cancerosas. A metástase, responsável para 90% de mortes Cancer-relacionadas, é caracterizada por pilhas cancerosas que saem de seu local original do tumor e que colonizar um local secundário. Para que as células migrem através do tecido e passem dentro e fora do sistema vascular, eles devem mudar radicalmente suas formas para espremer através dessas barreiras físicas, gerando forças substanciais para puxar seu caminho ao longo da matriz extracelular ou mover-se entre outros Células. Essas forças são transmitidas ao substrato por meio de interações de adesão focal2,3, podendo ser quantificadas usando TFM. Embora os cânceres sejam bioquimicamente excepcionalmente diversificados, com um repertório em expansão de mutações conhecidas e alterações protéicas, algumas mudanças físicas comuns foram observadas; em uma variedade de cânceres, incluindo câncer de mama, próstata e pulmão, as células metastáticas têm demonstrado exercer 2-3 vezes as forças de tração das células não metastáticas6,7,8. Estes resultados sugerem que pode haver uma forte correlação entre a progressão metastática e as forças de tração exercidas pelas células; Entretanto, as mudanças tempo-dependentes detalhadas na contractilidade são difíceis de examinar.
A transição epitelial-mesenquimais (EMT) é um processo pelo qual as células reduzem aderências-e aderência da célula celular mediada pela junção apertada, tornando-se mais migratórias e invasivas. Além de funções fisiológicas que incluem cicatrização de feridas e processos de desenvolvimento, o EMT também é um processo explorado durante a metástase, tornando-se um sistema de modelo útil para estudar esse processo. Usando TGF-β, podemos induzir o EMT em células epiteliais mamárias murinas (NMuMG)9 para quantificar diretamente as alterações físicas durante essa transformação, e caracterizar o tempo e os efeitos dose-dependentes de TGF-β em EMT e contratilidade celular. Neste artigo, nós Demonstramos a utilidade desta aproximação medindo as mudanças na contractilidade durante um EMT induzido.
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Protocol
Nota: o protocolo a seguir guiará pesquisadores na fabricação e uso do prato TFM de vários poços mostrado na Figura 1.
1. preparação de substratos de silicone PDMS
- Preparação da mistura da borracha de silicone de PDMS baseada em uma mistura composta de dois jogos comercialmente disponíveis.
- Adicione a parte A e a parte B do kit PDMS (por exemplo, GEL-8100, consulte a tabela de materiais) em uma relação de peso 1:1 no tubo de 50 ml.
Nota: a mistura é misturada em um rotator em uma velocidade lenta bastante para que a mistura flua para a frente e para trás durante a volta para assegurar a mistura completa. - Adicione a quantidade necessária de agente de cura para o módulo desejado do substrato.
Nota: a quantidade de agente de cura a ser adicionada à mistura depende do módulo desejado da carcaça e pode tipicamente variar de 0,1% a 1,8%. Consulte a tabela 1 e a Figura 3 para obter um guia para as concentrações específicas do chapéu cabeado e os moduli resultantes. - Misture a formulação no rotador por 30-45 min; garantir a rotação é lenta o suficiente para a mistura completa.
- Adicione a parte A e a parte B do kit PDMS (por exemplo, GEL-8100, consulte a tabela de materiais) em uma relação de peso 1:1 no tubo de 50 ml.
- Camada inferior: revestimento de substratos PDMS na corrediça de vidro
- Coloque o mandril personalizado-construído ilustrado na Figura 2 no spin-Coater. Limpe o vidro com etanol ou isopropanol e seque com uma limpeza sem fiapos. Coloc a corrediça de vidro no mandril e gire sobre o vácuo para prender a corrediça no lugar.
- Aplique PDMS não curado aproximadamente 1 cm das bordas e trabalhe em direção ao centro. Aplique o suficiente (3-4 mL) PDMS para garantir que toda a superfície será coberta.
Nota: para garantir que o PDMS é uniformemente espalhado na superfície do vidro, uma ponta de pipeta pode ser útil para espalhar a mistura PDMS do centro para as bordas. - Gire o vidro com a mistura de PDMS em um spin-Coater com o seguinte protocolo.
- Para espalhar o PDMS não curado na corrediça, acelere em 50 rpm/s de 0 a 200 rpm; Segure em 200 rpm por 1 min.
- Para alcançar uma camada de PDMS de 100 μm de espessura, acelere a 50 rpm/s para 300 rpm e segure por 1 min a 300 rpm. Diferentes espessuras desejadas que não 100 μm exigirá valores de velocidade específicos.
- Para remover, desacelere em 50 rpm/s a 0 rpm. Desactive o aspirador e retire a lâmina revestida, tomando cuidado para não tocar na superfície revestida.
Nota: é importante incluir as etapas da aceleração e da desaceleração para assegurar uma superfície contínua lisa.
Cuidado: para assegurar que a amostra não voe fora do mandril, o suporte feito-à-medida deve ser usado para prender a corrediça, e para não confiar simplesmente no vácuo e no mandril liso existente. Os detalhes e especificações deste suporte são dados na Figura 2.
- Coloque a amostra revestida com centrifugação no forno à temperatura recomendada pelo fabricante (100 ° c) durante 2 h.
Nota: a superfície do forno onde a amostra é colocada deve ser sólida (ou seja, não um rack de arame) e superfície nivelada para garantir o aquecimento uniforme e a espessura da amostra. Uma placa cerâmica ou de aço faz uma superfície ideal.
- Camada superior do grânulo
- Adicione a solução do grânulo na relação apropriada à mistura restante de PDMS.
Nota: esta relação depende da concentração da solução de talão de ações e da densidade de cordão desejada na amostra. Os valores finais típicos são 9,2 x 1011 grânulos/ml e 0.05-0.2 grânulos/μm2, e um excesso dos grânulos é geralmente preferível a uma quantidade inadequada. - Misture a solução de cordão com o PDMS não curado. Isto pode ser conseguido coloc o tubo em um rotator por aproximadamente 30 minutos, vortexing para 1-2 minutos, ou sonication por 30 minutos. Esses métodos podem ser combinados.
Nota: em nossa aplicação, nós achamos que sonication é eficaz em quebrar grânulo agregados, e rotação é eficaz na mistura. Contas fiduciárias sintetizadas podem agregar no armazenamento. Antes de usar, eles podem ser ressuscitados em hexano e sonicated. Se existirem grandes agregados significativos, pode-se filtrar a suspensão do cordão através de um filtro de seringa de 5 μm. Esta etapa da filtração é opcional; ajuda a revestir a amostra com grânulos monodispersos, mas uma fração significativa de grânulos pode ser perdida no filtro. - Retire o slide do forno, deixe esfriar a temperatura ambiente, e colocá-lo no spin-Coater.
- Adicione 3-4 mL do talão e a mistura de PDMS não curada na superfície da amostra revestida.
Nota: a mistura com grânulos adicionados é menos viscosa devido ao hexano. Certifique-se de não tocar na superfície do substrato, pois pode danificar o substrato PDMS já revestido. Adicionalmente, a mistura do grânulo não pode inicialmente molhar a superfície; Tome cuidado para que a mistura não flua imediatamente para fora da superfície de PDMS curada. - Gire o exemplo com o seguinte protocolo.
- Para espalhar o grânulo e a mistura uncured de PDMS, acelere em 100 RPM/s de 0 a 500 rpm; Segure em 500 RPM por 1 min.
- Para conseguir uma camada fina de PDMS grânulo-encaixado (~ 1 μm), acelere em 200 rpm/s de 500 a 5000 rpm; segurar a 5000 rpm por 10 s.
- Para remover, desacelere em 100 RPM/s a 0 rpm. Desabilite o vácuo e remova a corrediça revestida, tomando o cuidado para não tocar na superfície revestida.
- Coloque a amostra revestida com centrifugação no forno a 100 ° c durante 1 h.
Nota: temperaturas acima de 100 ° c ou durações maiores que 1 h podem reduzir a fluorescência do cordão. Certifique-se de que a temperatura do forno está definida para 100 ° c e não superior. - O protocolo pode ser pausado aqui. Para armazenar a amostra, cubra a superfície para evitar a exposição à poeira e à luz. Certifique-se de que nada toque na superfície. A amostra é prateleira-estábulo na temperatura ambiente indefinidamente.
- Adicione a solução do grânulo na relação apropriada à mistura restante de PDMS.
- Montagem da placa
- Adicione a parte A (base) e a parte B (agente de cura, por exemplo, Sylgard) de um kit de elastômero PDMS em uma relação de peso 10:1 no tubo de 50 mL.
- Misture a mistura no rotador por 30-45 min.
Nota: para uma placa, misture 5 mL de base com 0,5 mL de agente de cura. Pode ser adicionado até 1 mL de hexano para reduzir a viscosidade da mistura. - Aplique a mistura na parte inferior do divisor e espalhe a mistura.
Nota: o divisor deve ser colocado de cabeça para baixo. - Coloque o substrato sobre o divisor de cabeça para baixo.
- Coloque a amostra de cabeça para baixo no forno a 65 ° c durante 2 h.
- Retire as amostras do forno e limpe a parte inferior do vidro com 70% de etanol ou isopropanol para remover qualquer resíduo PDMS.
Observação: o protocolo pode ser pausado aqui. Para armazenar a amostra, coloque uma tampa no substrato e enrole o dispositivo em folha de alumínio para evitar a exposição à luz. A amostra é prateleira-estábulo na temperatura ambiente indefinidamente. O divisor utilizado neste método está em um formato 96-well; no entanto, os pesquisadores podem empregar outros formatos (384-bem, 2-bem, 4-bem, 8-bem, etc.) dependendo das configurações de experimento desejadas e disponibilidade de estruturas divisórias. Algumas outras otimizações podem ser necessárias.
2. funcionalização de superfície
- Dissolver 80 μL de uma alíquota de sulfo-SANPAH em 40 mL de tampão HEPES de 0,1 M (pH 7-9).
Nota: prepare alíquotas de sulfo-SANPAH dissolvendo 100 mg de sulfo-SANPAH em pó em 2 mL de dimetil sulfóxido estéril (DMSO). Prepare 0,1 M tampão HEPES diluindo 50 mL de HEPES em 450 mL de água desionizada estéril e filtre através de um filtro de poros de 0,22 μm. - Adicionar 200 μL de solução diluída de sulfo-SANPAH a cada poço da placa de 96 poços.
- Expor a placa à luz UV (300-460nm) na distância e na duração apropriadas.
Nota: após a exposição UV, a cor da solução deve ser mais escura. A distância e a duração UV da exposição dependem do poder da lâmpada UV. Em nossa aplicação, exporemos para 10-15 min a uma distância de 5 cm. - Retire a solução de sulfo-SANPAH dos poços e adicione 200 μL de solução de fibronectina de 5 μg/mL a cada poço.
Nota: a proteína especific investigador pode ser usada para o revestimento de superfície. Algumas proteínas comumente usadas são colágeno, fibronectina e laminina. Nós encontramos sulfo-SANPAH para ser o método o mais eficaz, e a limpeza do plasma quando empregando às vezes em PDMS é desencorajado porque cria uma camada do dióxido de silicone e danifica visivelmente a superfície. - Incubar a placa a 4 ° c durante a noite.
Nota: diferentes métodos de incubação podem ser aplicados dependendo da proteína utilizada para o revestimento. - Retire a solução de fibronectina e lave cada poço com soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS) duas vezes.
- Coloque uma tampa na amostra.
- Adicionar 200 μL de PBS a cada poço.
Observação: o protocolo pode ser pausado aqui. As amostras revestidas com fibronectina podem ser armazenadas a 4 ° c por até 2 semanas.
3. esterilização UV
- Esterilize a amostra a luz UV em um armário de segurança biológico por 30 minutos.
Nota: os tempos de exposição UV mais longos podem impactar negativamente a fluorescência do grânulo. Todas as etapas subsequentes devem ser executadas em condições estéreis.
4. cultura de células
- Remova PBS de cada poço e adicione 200 μL das pilhas suspendidas nos meios de cultura a cada poço.
- Placa as células na densidade da célula desejada. A densidade da célula depende do experimento desejado. Para estudos de célula única, as células devem ser mínimas de 50 μm de distância e as células próximas às bordas da janela de imagem não devem ser incluídas na medição de TFM. Para células monocamada, a janela de imagem deve ter o campo de visualização coberto com uma camada confluente de células.
- Prepare os meios de cultura de crescimento completo para células NMuMG completando DMEM com 5% FBS, 10 mM HEPES, 10 μg/mL de insulina, 1% de penicilina-estreptomicina, 1 mM L-glutamina, e 0,5 μg/mL de anfotericina B.
- Prepare o caldo de insulina reconstituindo-se em água acidificada (2,5 mL de ácido acético glacial em 130 mL de água desionizada) para uma concentração de 10 mg/mL. Armazene a solução de estoque a 4 ° c. Aguarde até que a solução esteja limpa e, em seguida, filtre por um filtro de poros de 0,22 μm.
- Adição de TGF-β
- Para preparar o estoque de TGF-β, dissolver 2 μg de TGF-β em 100 μL de ácido cítrico de 10 mM (pH 3,0) e esterilizar filtro com 0,22 μm de poros. Vórtice do tubo e alíquota para os volumes desejados. Guarde as alíquotas em-80 ° c.
- Adicionar 1,5 μL de solução de TGF-β para 10 mL do meio de cultura celular completo para constituir o meio de cultura celular com a concentração final de TGF-β de 3 ng/mL.
Nota: para fazer 10 mM pH 3,0 ácido cítrico, diluir o ácido na água e ajustar o pH para 3,0, adicionando HCl.
5. aquisição de dados
- Para cada posição, adquira pelo menos uma imagem de partículas e células fiduciárias. Concentre-se na camada de talão.
Nota: o tamanho do pixel deve ser otimizado com base no tamanho das partículas fiduciárias e do método de processamento de imagem que está sendo usado. Nesta aplicação, os autores usam um objetivo de 10x 0,4 NA, e as imagens são adquiridas com 1024 x 1024 de resolução, com 455 nm/pixel. Em geral, é útil manter uma resolução de pelo menos aproximadamente 1-5 pixels por talão; aqui, os grânulos são altamente e têm um tamanho individual de 300-500 nanômetro. É crítico que os grânulos fiduciários fluorescentes estejam no foco para que as imagens sejam usadas para cálculos de TFM. A qualidade do foco e da imagem latente dos grânulos deve ser priorizada sobre a imagem latente as pilhas elas mesmas. Não deve haver nenhum cross-talk entre os canais diferentes, particularmente toda a fluorescência não das contas fiduciário que aparece nos espectros da imagem latente dos grânulos. - Uma vez que todas as posições do interesse foram gravadas, adicione a solução do destacamento a cada poço para adquirir imagens Force-Free da referência das partículas fiduciário.
- Para preparar a solução de descolamento celular, misture uma solução aquosa contendo 2% de TritonX-100, azida sódica de 50 mM e hidróxido de potássio de 500 mM.
Nota: o acima é fornecido como um exemplo de uma solução eficaz do destacamento. Diferentes soluções de descolamento a critério dos pesquisadores podem ser usadas para separar as células da superfície do substrato.
- Para preparar a solução de descolamento celular, misture uma solução aquosa contendo 2% de TritonX-100, azida sódica de 50 mM e hidróxido de potássio de 500 mM.
6. análise de imagem
- Realize a análise de imagem apropriada conforme desejado.
Nota: o software de análise foi desenvolvido em casa. A análise da imagem pode ser feita com software ou software feito-à-medida disponível em linha.
7. síntese do grânulo
Nota: o protocolo a seguir é baseado no método de síntese descrito por Klein et al.10.
- uma capa de fumaça, prepare o balão de três-pescoço com um condensador de refluxo refrigerado a água.
Cuidado: Configure uma síntese em uma capa de fumaça química bem ventilada. - Adicionar 0,5 mL de estabilizador PDMS e fluoróforo ao balão.
- Equipar um pescoço com um septo de borracha com uma agulha de entrada de nitrogênio e uma agulha de saída e equipar o outro pescoço com um septo de borracha para adicionar Reagente com uma seringa.
- Adicionar 100 mL de hexano anidro em 250 mL ao balão e adicionar uma pequena barra de agitação magnética.
- Colocar o balão no banho de óleo mineral a 75 ° c e limpá-lo com gás nitrogenado durante 1 h.
- Adicione 6 mL de metilmetacrilato a um balão de fundo redondo de 25 mL.
- Adicionar 0,100 g de 2, 2 '-azobisisobutyronitrila (AIBN) para o balão de fundo redondo e purgar a mistura com gás nitrogênio para 1 h.
Nota: o methylamethacrylate nivelado através da coluna pré-embalada para remover nervos inibidores antes de usar. Adicione o methylamethacrylate e a mistura de AIBN ao balão do três-garganta. - A solução inicialmente fica turva e vira leitosa. Deixe a reacção funcionar durante 3 h após a solução ficar turva.
- Depois de 3 h, coloque o balão num banho de água gelada.
- Vácuo-filtre a solução com papel de filtro grosseiro.
- Centrifugue o filtrado e Resuspenda as partículas em hexano.
Nota: o volume do hexano a ser adicionado depende da concentração desejada da solução de cordão. Sonication facilita a re-dispersão das partículas de cordão em solução de hexano. Os grânulos produzidos pelos autores têm diâmetros do altamente de aproximadamente 300-500nm. Devido ao uso de cross-correlação padrão de rastreamento para determinar deslocamentos, monodispersas grânulos não são necessários.
8. protocolo de medição de reologia
Nota: a reologia não é necessária para cada pesquisador ou experimento, mas é necessária para quantificar os moduli para novas formulações de PDMS. Neste protocolo, nós empregamos um Reômetro da tesoura para medir os efeitos do crosslinker, da freqüência, e da tensão em moduli de amostras de PDMS. Dependendo das ferramentas e da perícia disponíveis, os moduli podem igualmente ser medidos usando muitas outras aproximações mecânicas da análise. Adicionalmente, os pesquisadores que utilizam este protocolo podem optar por usar nossos moduli publicados apresentados na tabela 1, Figura 3 e Figura 4.
- Use um Reômetro com uma geometria de placa paralela de 25 mm de diâmetro. Outras geometrias podem ser usadas.
- Inicializar o sistema e calibrar o dispositivo e sistema de medição (placa paralela, d = 25 mm). Depois de medir a lacuna zero, comece a carregar a amostra PDMS.
- Assim que o elastômero PDMS e o agente de reticulação foram misturados, Pipet a mistura na placa inferior do Reômetro.
- Mova o eixo para baixo para entrar em contato completamente com a parte superior da amostra PDMS.
- Cuidadosamente aparar o excesso de amostra carregada da placa de fundo.
- Em um teste de varredura de deformação, aplique tensões crescentes para cada composição com diferentes densidades de reticulação para garantir que a estrutura do polímero permaneça no regime viscoelástico linear durante todas as medições de cisalhamento.
Nota: os valores de deformação relevantes para estudos de células são tipicamente na faixa de 0,1-10%. Nós encontramos PDMS para ser linear até aproximadamente 100% estirpe. - Meça o módulo de armazenamento dinâmico de cisalhamento (G ') e o módulo de perda (G ′ ′) da rede PDMS em um teste de varredura de tempo com frequência de 1 Hz e tensão de cisalhamento oscilatória de 0,5% a 100 ° c.
- Para determinar a dependência de viscoelasticidade e tempo da rede PDMS final, aplique um teste de varredura de frequência com frequência variando de 0,1-100 Hz e deformação oscilatória de cisalhamento de 0,5%.
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Representative Results
Antes da adição de TGF-β, um monocamada confluente das pilhas tem um paralelepípedos como a forma e é embalado firmemente. Em cima do tratamento de TGF-β, as pilhas tornam-se mais alongadas na morfologia, ampliando a área da pilha e adquirindo um phenotype mais mesenquimais. Utilizando o dispositivo do multi-poço fabricado com os elastômeros macios de PDMS, as propriedades físicas das pilhas em um total 17 circunstâncias diferentes foram estudadas. As células foram tratadas com quatro diferentes concentrações de TGF-β (0,5, 1, 2 e 4 ng/mL) e quatro épocas de incubação diferentes (12, 24, 48, 96 h), e estes resultados estão resumidos na Figura 5. As células tratadas com TGF-β aplicaram tensões de tração maiores e energias de deformação do que as células cultivadas sem TGF-β. As células incubadas com TGF-β para 96 h mostraram as maiores tensões de tração e energias de deformação. As células aplicaram tensões maiores e energias de deformação quando tratadas com maior concentração de TGF-β. A diferença em trações e em energias da tensão era mais distinta em uns tempos mais longos da incubação.
A superfície do substrato precisa ser lisa e uniformemente revestida com ligantes, tais como fibronectina ou colágeno. A superfície riscada e/ou o revestimento não uniforme dos ligantes podem conduzir ao acessório impróprio da pilha, tendo por resultado a medida imprecisa da tração. A Figura 6 mostra as tensões de tração localizadas devido à superfície de substrato não uniforme.
Figura 1 : Vista geral da fabricação da placa do multi-poço. (A) um slide de vidro de corte personalizado é o ponto de partida. (B) a corrediça de vidro é revestida com uma camada grossa (~ 100 ΜM de PDMS). (C) uma camada de contas fiduciárias (mostradas em verde) são então revestidas em uma camada de ~ 1 μm de espessura em cima da camada anterior. (D) o divisor do multi-poço é coloc com cuidado sobre a camada fiduciária do grânulo. (E) a placa multi-well completa é montada e pronta para o uso ou o armazenamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Mandril personalizado para spin-Coater. Para impedir o vidro inferior (onde o PDMS é revestido) do vôo fora do mandril padrão do girar-Coater, um suporte feito-à-medida é coloc no mandril. (A) um suporte feito-à-medida para o mandril do girar-Coater. B) desenho de engenharia do titular com todas as dimensões. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Rigidez da carcaça com mudança da concentração do chapéu cabeado (WT%). As misturas de PDMS são preparadas como descrito, com a porcentagem adicional do chapéu cabeado que aumenta o módulo elástico até um máximo de 100 kPa em 1,8 pesos por cento (WT%) chapéu cabeado. Como um guia, o módulo como uma função do chapéu cabeado é cabido linearmente, que pode ser usado por investigadores para formular sua própria mistura em um módulo desejado particular dentro desta escala. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Reologia do elastômero PDMS contendo 0, 0,15, 0,36 e 1 WT% de agentes de ligação cruzada a uma temperatura de 100 ° c. Os símbolos do triângulo indicam o módulo de perda (G ' ') e os símbolos quadrados indicam o módulo de armazenamento (G '). (A) varredura do tempo oscillatory na freqüência de 1 hertz e da tensão de tesoura de 0,5% durante a gelação. (B) varredura oscilatória da freqüência da rede de PDMS na tensão de cisalhamento de 0,5%. (C) deformação de varredura da rede PDMS em frequência de 1 Hz. Todos os pontos de dados foram adquiridos em triplicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Resultados representativos utilizando dispositivo de tensão de tração com formato multi-bem. Monocamada de células em diferentes condições foram cultivadas em um dispositivo de multi-bem para medir a contratilidade e tensão de energia. (A) gráfico de tensões de tração com aumento do tempo de incubação TGF-β para diferentes concentrações de TGF-β. As tensões de tração aumentaram com o aumento das concentrações de TGF-β e tempo de incubação. Todos os dados são estatisticamente significativos em relação ao controle (ou seja, não TGF-β), exceto o seguinte: 12 h-0,5 ng, 12 h-1 ng, 48 h-1 ng. (B) gráfico de energia de deformação com aumento do tempo de incubação TGF-β para diferentes concentrações de TGF-β. As energias de deformação aumentaram com o aumento das concentrações de TGF-β e tempo de incubação. Os tamanhos amostrais variam de n = 7 a n = 15. Todos os dados são estatisticamente significativos em relação ao controle (ou seja, não TGF-β), exceto o seguinte: 12 h-0,5 ng, 12 h-1 ng, 24 h-0,5 ng, 24 h-1 ng, 48 h-1 ng. A significância estatística foi determinada por meio do teste de Kruskal Wallis, que não assume distribuição normal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : O representante resulta de um experimento subótimo (a, B) e satisfatório (C, D). (A) imagem de reflexão da superfície do substrato. Contaminantes indesejados, que podem incluir poeira ou fibras, ou defeitos materiais, como arranhões, estão presentes na superfície do substrato. B Mapa de stress da contratilidade celular: devido à superfície não uniforme, tensões irregulares e imprecisas de tração são observadas em torno dos objetos. C Imagem de reflexão da superfície do substrato. Nenhum contaminadores aparentes são visíveis. D Mapa de stress da contratilidade celular: não há descontinuidades artefato são visíveis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Concentração de crosslinker (WT%) | G ' (PA) | Desvio padrão | E (kPa) | Desvio padrão |
| 0 | 0,135 | 0, 14 | 0,405 | 0, 43 |
| 0,15 | 1 | 0,1 | 3 | 0,35 |
| 0,36 | 4, 27 | 0,245 | 12, 81 | 0,73 |
| 0,75 | 16, 1 | 0,49 | 48, 3 | 1,2 |
| 1 | 18,44 | 0,989 | 55,32 | 1,94 |
| 1,5 | 27,638 | 0,93 | 82,91 | 1,64 |
| 1,8 | 33,986 | 0,88 | 101,94 | 1, 88 |
| 2 | 33,36 | 0,67 | 100, 8 | 1,1 |
Tabela 1: Rigidez da carcaça com mudança da concentração do chapéu cabeado (WT%). Alterando as concentrações adicionais do chapéu cabeado, os substratos de PDMS dos moduli de Young desejados são fabricados. Os moduli da tesoura de PDMS foram medidos com um Reômetro e os moduli de Young foram determinados. Para cada ponto de dados, 3 preparações independentes foram feitas e o desvio padrão é dado.
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Discussion
Para o sucesso deste método, é crítico ter uma amostra uniformemente revestida com uma espessura constante de aproximadamente 100 μm. O módulo deve ser cuidadosamente escolhido para examinar o significado físico do sistema biológico de interesse. Ao fabricar uma camada superior, a concentração das partículas fluorescentes de autenticação deve ser otimizada para uma análise precisa do esforço de deslocamento e tração. A análise de células isoladas únicas requer uma camada fiduciária mais densa do que a medição de monolamadas confluentes. Adicionalmente, a superfície da carcaça deve ter o revestimento estável e uniforme de moléculas da adesão tais como o colagénio, o fibronectin, e o laminina para assegurar a ligação apropriada das pilhas à superfície da carcaça. Deve ter-se cuidado especial ao fixar o divisor multipoços; deve ser coloc sem deslizar para impedir que a colagem do PDMS da selagem esteja manchada na superfície da cultura, e a borda exterior deve com cuidado ser alinhada com as dimensões de vidro para impedir todas as fugas nos poços da beira.
Para impedir que os poços estejam gotejando, uma quantidade adequada de colagem de PDMS precisa de ser aplicada ao bem-divisor para segurá-la no lugar. No entanto, o uso de quantidades excessivas cobrirá a superfície da cultura celular.
O volume suficiente de PDMS precisa de ser adicionado durante o procedimento do spin-Coating. Ao curar, o forno e as cremalheiras precisam de ser nivelados. O PDMS inadequado ou um forno não nivelado podem levar à espessura irregular do PDMS.
A densidade do grânulo precisa de ser aperfeiçoada para a análise apropriada. Quando a densidade do grânulo não é adequada, a concentração dos grânulos na mistura fiduciária de PDMS precisa de ser aumentada. Adicionalmente, uma quantidade adequada da mistura precisa de ser adicionada para o revestimento da rotação. Para assegurar sinais fluorescentes apropriados das partículas fiduciárias do grânulo, a condição de cura deve cuidadosamente ser monitorada. Os tempos mais longos e as temperaturas mais elevadas do que aquelas especificadas neste protocolo podem degradar a fluorescência. O revestimento impróprio da proteína na superfície da amostra pode conduzir à adesão deficiente da pilha. Para evitar isso, a superfície precisa ser limpa e a expiração de reagentes como sulfo-SANPAH e ligantes precisa ser verificada. O tempo e a força UV da exposição devem ser otimizados. A imunofluorescência ou a outra construção da proteína fluorescente podem ser testadas para assegurar o revestimento uniforme do ligante.
O dispositivo fabricado com este método e conjunto de formulações PDMS só é aplicável a substratos com moduli Young variando de 0,4 kPa a 100 kPa. Outros moduli podem ser possíveis usando formulações alternativas, no entanto, a faixa atual abrange um grande conjunto de valores fisiologicamente relevantes. Embora esse método seja especificamente para a fabricação de vários poços, ele também pode ser usado para preparar slides individuais ou outras geometrias de slides e, nessas instâncias, uma solução de problemas adicional do usuário pode ser necessária. Nesta personificação, uma corrediça de vidro relativamente grossa (de 1 milímetro) é empregada, impedindo objetivos numéricos elevados comuns da abertura (NA) em um microscópio invertido. Embora seja tecnicamente viável para construir estes multi-bem TFM pratos usando vidro mais fino, a fragilidade destes em processamento e montagem pode resultar em uma alta taxa de ruptura, e pode correr ao contrário da abordagem de maior rendimento. Além disso, o revestimento de superfície pode ser investigado mais para aplicações mais largas do dispositivo.
Utilizando um formato de vários poços, experimentos de alta produtividade são possíveis. O formato multi-well permitiu-nos de examinar as mudanças físicas de pilhas de NMuMG durante EMT com tratamento de TGF-β com combinações de concentrações diferentes e épocas diferentes da incubação em um único prato. A fabricação de dispositivos do esforço da tração com hidrogéis tais como o gel do poliacrilamida tem diversas limitações. Com o ingrediente dominante sendo água, os hidrogéis são sensíveis às concentrações de sal (osmolaridade), temperatura, umidade e alterações de pH. Alterações em qualquer uma dessas propriedades podem levar à mudança nas propriedades mecânicas do material, exigindo cuidados extras no uso de amostras e interpretação de resultados. Além disso, ter água, hidrogéis são mais suscetíveis a infecções, exigindo cuidados extras. Em contraste com hidrogéis à base de água, o PDMS à base de silicone é estável e inerte. Uma vez fabricado, ele pode ser armazenado em temperatura ambiente indefinidamente sem a necessidade de qualquer manipulação especial ou condições de armazenamento.
A natureza impermeável do PDMS nos permite fabricar um substrato monolítico, assegurando que todos os poços sejam verdadeiramente idênticos na espessura e composição do substrato, ao mesmo tempo que permite a aplicação de bioquímica única na mídia, ou células diferentes a serem utilizadas em cada Bem. Uma superfície hidrogel-baseada permite que os fatores difusivo permeiam e viaje com ele, necessitando a adição do hidrogel aos poços que são de outra maneira particionados para impedir a contaminação cruzada.
Este método permite que os pesquisadores estudem a contratilidade celular, um aspecto básico e onipresente da biologia celular, de uma forma de alta produtividade, possibilitando uma aquisição de dados mais eficiente e reprodutível. Isso ajuda a traduzir a microscopia de força de tração em triagem de força contrátil, permitindo que os pesquisadores usem realmente a contratilidade como uma métrica para a atividade celular ou a eficácia de um composto. Como metodologia, isso tem amplas aplicações em Ciências biofísicas e biomédicas, desde a compreensão da física das células, até a caracterização e teste de compostos farmacêuticos contra tipos de células padronizados, ou talvez altamente especializados células individuais para a medicina personalizada.
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Disclosures
A AJE e a RK têm interesse em Live Cell Technologies, empresa que fabrica materiais descritos neste artigo.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Tom Kodger, Michael Landry, e Christopher J. Barrett para obter assistência com a síntese do cordão. A.J.E. reconhece as bolsas do Conselho de pesquisa de ciências naturais e engenharia RGPIN/05843-2014 e EQPEQ/472339-2015, Instituto canadense de pesquisa em saúde conceder n º 143327, sociedade canadense de câncer conceder n º 703930, e Fundação Canadense para a inovação #32749 do projeto. R. Denilson reconhece os institutos nacionais de saúde não conceder. R21HL123522 e R01HL136209. H.Y. foi apoiado por Fonds de Recherche Santé Québec, e Fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. Os autores agradecem a Johanan Idicula pela ajuda com o vídeo e o manuscrito e Zixin ele para obter ajuda na preparação do vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. Traction forces in locomoting cells. Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. Physical Sciences - Oncology Centers Network. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
