Summary
Vi presenterar en hög genomströmning dragkraft assay fabricerade med silikon gummi (PDMS). Denna nya analys är lämplig för att studera fysiska förändringar i cell kontraktilitet under olika biologiska och biomedicinska processer och sjukdomar. Vi visar den här metodens nytta genom att mäta en TGF-β beroende ökning i kontraktilitet under epitelial-till-mesenkymala övergången.
Abstract
Cellulär kontraktilitet är viktigt i olika aspekter av biologi, drivande processer som sträcker sig från motilitet och uppdelning, till vävnadkontraktion och mekanisk stabilitet, och utgör en central del av flercelliga djurliv. I anhängare celler, acto-myosin kontraktion ses i dragkrafter som celler utövar på deras substrat. Dysreglering av cellulära kontraktilitet visas i en myriad av patologier, vilket gör kontraktilitet ett lovande mål i olika diagnostiska metoder med hjälp av biofysik som ett mått. Dessutom kan nya terapeutiska strategier baseras på korrigering av skenbara fel i cell kontraktilitet. Dessa tillämpningar kräver dock en direkt kvantifiering av dessa styrkor.
Vi har utvecklat silikon elastomer-baserade Traction Force mikroskopi (TFM) i en parallelliserad multi-well format. Vår användning av ett silikon gummi, speciellt Polydimetylsiloxan (PDMS), snarare än den vanligen använda hydrogel polyakrylamid (PAA) gör det möjligt för oss att göra robusta och inerta substrat med obestämd hylla-liv kräver inga särskilda förvaringsförhållanden. Till skillnad från pelare-PDMS baserade metoder som har en Modulus i GPa-sortimentet, de PDMS som används här är mycket kompatibel, allt från ca 0,4 kPa till 100 kPa. Vi skapar en högpresterande plattform för TFM genom att partitionera dessa stora monolitiska substrat rumsligt i biokemiskt oberoende brunnar, vilket skapar en multi-well plattform för Traction Force screening som är kompatibel med befintliga multi-well system.
I detta manuskript använder vi detta multi-well dragkraft system för att undersöka epitelial till mesenkymala övergång (EMT); Vi inducerar EMT i NMuMG-celler genom att exponera dem för TGF-β och för att kvantifiera de biofysiska förändringarna under EMT. Vi mäter kontraktilitet som en funktion av koncentrationen och varaktigheten av TGF-β exponering. Våra fynd här visar nyttan av parallelliserade TFM i samband med sjukdomsbiofysik.
Introduction
Acto-myosin kontraktilitet är en viktig del av aktiv cellmekanik, vilket påverkar cellernas beteenden från motilitet och proliferation till stamcells differentiering. I vävnader, kontraktilitet driver aktivitet från Polar separation i embryogenes, till luftvägarna sammandragning och hjärtaktivitet. Kritiskt, för att generera spänningar, celler måste först följa deras extracellulära miljö. På så sätt genererar denna kontraktilitet dragkraft krafter på sin omgivning. Traction Force mikroskopi (TFM) har dykt upp i en mängd olika former som ett sätt att kvantifiera dessa styrkor från olika celler under olika förhållanden.
Området TFM har sett en exceptionell bredd av innovation och tillämpning, och resultaten har banat väg för nya perspektiv i biologi, som införlivar mekanik och fysiska krafter. Från och med skrynkling silikon substrat1, forskare har tillämpat olika tekniker för att mäta celler dragkraft. Dessa metoder har kontinuerligt förbättrats och har nu nått en nivå av upplösning på order av flera mikrometer2. Dock har ett huvudproblem uppstått, vilket är svårigheten att skapa substrat av lämpligt låg moduli med hjälp av tillgängliga silikoner. För att kringgå detta problem antogs polyakrylamid som en ersättning på grund av hur lätt det var att skapa substrat på order av 1-20 kPa3. Vi har nyligen genomfört mycket kompatibla silikoner i TFM4, vilket gör att vi kan tillverka samma sortiment av moduli som polyakrylamid, men med fördelarna med inert och robust silikon.
TFM-metoder har möjliggjort värdefulla Mechano-biologiska upptäckter, men en ihållande brist är deras komplexitet, ofta begränsar deras användning till forskare inom teknik eller fysikaliska vetenskaper discipliner. Detta beror till stor del på de detaljerade kalibreringar och utmanande beräkningar som krävs för att kvantifiera kontraktilitet. En annan viktig utmaning är att TFM-metoder är i stort sett låg kapacitet och därför dåligt lämpade för att studera många olika villkor eller populationer samtidigt5. Detta har visat en flaskhals, vilket har hämmat överföringen av TFM från en specialist biofysik inställning till bredare biologiska och farmakologiska tillämpningar.
Vi har nyligen utvecklat en multi-well format TFM plattan, som gör det möjligt för forskare att parallellisera sina TFM mätningar för snabbare kvantifiering av kontraktilitet mätvärden, samtidigt undersöka effekterna av olika föreningar och även använda mindre reagens4 . Denna metod har bred nytta i olika Mekanobiologi studier, från att utvärdera effekterna av föreningar på cellulär aktivitet, att kvantifiera kontraktila förändringar i differentiering eller sjukdom.
Ett område av biomedicinsk forskning som kommer att dra stor nytta av TFM är studiet av hur fysiska signaler påverkar de maligna fenotyperna av cancerceller. Metastaser, ansvarig för 90% av cancerrelaterade dödsfall, kännetecknas av cancerceller lämnar sin ursprungliga tumör plats och kolonisera en sekundär plats. För celler att migrera genom vävnad och passera in och ut ur det vaskulära systemet, de måste radikalt ändra sina former för att pressa igenom dessa fysiska barriärer samtidigt generera betydande krafter för att dra sig längs extracellulära matris eller flytta mellan andra Celler. Dessa krafter överförs till underlaget genom fokala vidhäftning interaktioner2,3, och kan kvantifieras med hjälp av TFM. Medan cancer är biokemiskt exceptionellt varierande, med en expanderande repertoar av kända mutationer och protein förändringar, några vanliga fysiska förändringar har observerats; i en mängd olika cancerformer, inklusive bröst-, prostata-och lungcancer, metastatiska celler har visat sig utöva 2-3 gånger drag krafterna hos icke-metastaserande celler6,7,8. Dessa resultat tyder på att det kan finnas ett starkt samband mellan metastaserande progression och de dragkraft som utövas av celler; emellertid, de detaljerade tidsberoende förändringarna i kontraktilitet är svåra att undersöka.
Den epiteliala-till-mesenkymala övergången (EMT) är en process där celler minskar anhängare-och tätt-korsning medierad cell-cell adhesion, blir mer flyttande och invasiva. Förutom fysiologiska funktioner som inkluderar sårläkning och utvecklingsprocesser, är EMT också en process som utnyttjas under metastaser, vilket gör det till ett användbart modellsystem för att studera denna process. Med hjälp av TGF-β, kan vi inducera EMT i murina bröst epitelceller (NMuMG)9 att direkt kvantifiera de fysiska förändringarna under denna omvandling, och karakterisera tid och dos-beroende effekter av TGF-β på EMT och cell kontraktilitet. I denna artikel, vi visar nyttan av detta tillvägagångssätt genom att mäta förändringar i kontraktilitet under en inducerad EMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: följande protokoll kommer att vägleda forskare i fabricera och använda multi-well TFM skålen visas i figur 1.
1. beredning av PDMS silikon substrat
- Beredning av PDMS silikon gummiblandning baserad på en sammansatt blandning av två kommersiellt tillgängliga kit.
- Lägg till del A och del B i PDMS Kit (t. ex. GEL-8100, se material tabellen) i ett 1:1-viktförhållande i 50 ml-röret.
Anmärkning: blandningen blandas på en rotator med en hastighet tillräckligt långsam för blandningen att flöda fram och tillbaka under revolutionen för att säkerställa fullständig blandning. - Tillsätt erforderlig mängd härdningsmedel för önskad Modulus av underlaget.
Anmärkning: mängden härdningsmedel som ska tillsättas till blandningen beror på den önskade Modulus av substratet och kan vanligtvis variera från 0,1% till 1,8%. Se tabell 1 och figur 3 för en guide till specifika crosslinkerkoncentrationer och resulterande moduli. - Blanda formuleringen på rotatorn för 30-45 min; Se till att rotationen är tillräckligt långsam för noggrann blandning.
- Lägg till del A och del B i PDMS Kit (t. ex. GEL-8100, se material tabellen) i ett 1:1-viktförhållande i 50 ml-röret.
- Bottenskikt: beläggning PDMS substrat på glas bilden
- Placera den specialbyggda chucken illustrerad i figur 2 på Spin-coater. Rengör glaset med etanol eller isopropanol och torka med en luddfri torka. Placera glas bilden i chucken och slå på dammsugaren för att hålla bilden på plats.
- Applicera ohärdat PDMS ca 1 cm från kanterna och arbeta in mot centrum. Applicera tillräckligt (3-4 mL) PDMS för att säkerställa att hela ytan kommer att täckas.
Anmärkning: för att säkerställa att PDMS är jämnt fördelad på ytan av glaset, kan en pipett tips vara till hjälp för att sprida PDMS blandningen från mitten till kanterna. - Snurra glaset med PDMS blandningen på en spin-coater med följande protokoll.
- För att sprida den ohärdade PDMS på bilden, accelerera vid 50 rpm/s från 0 till 200 rpm; Håll vid 200 rpm i 1 min.
- För att uppnå ett 100 μm tjockt PDMS-skikt, accelerera vid 50 rpm/s till 300 rpm och håll i 1 min vid 300 rpm. Olika önskade tjocklekar andra än 100 μm kommer att kräva specifika hastighetsvärden.
- För att ta bort, avta vid 50 rpm/s till 0 RPM. Avaktivera vakuum och ta bort den belagda bilden, noga med att inte röra den belagda ytan.
Obs: det är viktigt att inkludera accelerations-och retardation steg för att säkerställa en slät kontinuerlig yta.
FÖRSIKTIGHET: för att säkerställa att provet inte flyger av chucken, bör den skräddarsydda hållaren användas för att hålla bilden, och inte förlita sig helt enkelt på vakuum och den befintliga platta chucken. Innehavarens uppgifter och specifikationer anges i figur 2.
- Placera det spinn-belagda provet i ugnen hos tillverkaren Rekommenderad temperatur (100 ° c) för 2 h.
Obs: ytan på ugnen där provet placeras bör vara fast (dvs. inte ett tråd rack) och nivå yta för att säkerställa en jämn uppvärmning och tjocklek av provet. En keramisk eller stålplåt gör en idealisk yta.
- Översta pärlskiktet
- Tillsätt pärla lösning i lämpligt förhållande till den återstående PDMS blandningen.
Anmärkning: detta förhållande beror på koncentrationen av beståndet pärla lösning och önskad granulum densitet på provet. Typiska slutliga värden är 9,2 x 1011 pärlor/ml och 0,05-0,2 pärlor/μm2, och ett överskott av pärlor är i allmänhet att föredra framför en otillräcklig mängd. - Blanda pärllösningen med de ohärdade PDMS. Detta kan åstadkommas genom att placera röret på en rotator för cirka 30 min, vortexa för 1-2 min, eller ultraljudsbehandling för 30 min. Dessa metoder kan kombineras.
Notera: i vår ansökan finner vi att ultraljudsbehandling är effektiv i att bryta pärla aggregat, och rotation är effektiv i blandning. Syntetiserade förvaltnings pärlor kan aggregera i lagring. Före användning, de kan återsuspenderas i hexan och sonicated. Om det finns betydande stora aggregat, kan man filtrera pärlfjädringen genom ett 5 μm spruta filter. Detta filtrerings steg är valfritt; den hjälper till att belägga provet med monodispergerade pärlor, men en betydande del av pärlorna kan gå förlorade i filtret. - Ta ut bilden från ugnen, låt svalna till rumstemperatur, och placera den på Spin-coater.
- Tillsätt 3-4 mL av pärlan och ohärdat PDMS-blandning på ytan av det belagda provet.
Anmärkning: blandningen med pärlor tillsätts är mindre trögflytande på grund av hexan. Se till att inte röra ytan av underlaget eftersom det kan skada den redan belagda PDMS substrat. Dessutom kan pärlblandningen inledningsvis inte blöta ytan; var försiktig så att blandningen inte omedelbart rinner av den härdade PDMS ytan. - Snurra provet med följande protokoll.
- Att sprida pärla och ohärdat PDMS blandning, påskynda vid 100 rpm/s från 0 till 500 rpm; Håll vid 500 rpm i 1 min.
- För att uppnå ett tunt lager av pärla-inbäddade PDMS (~ 1 μm), påskynda vid 200 rpm/s från 500 till 5000 rpm; Håll vid 5000 rpm i 10 s.
- För att ta bort, avta vid 100 rpm/s till 0 RPM. Inaktivera vakuum och ta bort belagda Slide, noga med att inte röra den belagda ytan.
- Placera det spinn-belagda provet i ugnen vid 100 ° c i 1 h.
Obs: temperaturer över 100 ° c eller varaktigheter längre än 1 h kan minska pärlfluorescens. Se till att ugnstemperaturen är inställd på 100 ° c och inte högre. - Protokollet kan pausas här. För att förvara provet, täck över ytan för att undvika damm och ljus exponering. Se till att ingenting vidrör ytan. Provet är hylla-stabil vid rumstemperatur på obestämd tid.
- Tillsätt pärla lösning i lämpligt förhållande till den återstående PDMS blandningen.
- Montering av plattan
- Lägg till del A (bas) och del B (härdningsmedel, t. ex. Sylgard) i ett PDMS elastomerkit i ett 10:1-viktförhållande i 50 mL-röret.
- Blanda blandningen på rotatorn för 30-45 min.
Obs: för en tallrik, blanda 5 mL bas med 0,5 mL härdningsmedel. Upp till 1 mL hexan kan tillsättas för att reducera viskositeten hos blandningen. - Applicera blandningen på botten av avdelaren och sprida blandningen.
Obs: avdelaren ska placeras upp och ner. - Lägg underlaget på avdelaren upp och ner.
- Placera provet upp och ned i ugnen vid 65 ° c i 2 timmar.
- Ta ut prover från ugnen och rengör botten av glaset med 70% etanol eller isopropanol att ta bort alla PDMS rester.
Obs: protokollet kan pausas här. För att lagra provet, placera ett lock på underlaget och Linda in enheten i aluminiumfolie för att undvika exponering för ljuset. Provet är hylla-stabil vid rumstemperatur på obestämd tid. Den avdelare utnyttjas i denna metod är i en 96-väl format; men forskare kan använda andra format (384-Tja, 2-Ja, 4-Ja, 8-Ja, etc.) beroende på önskade experiment uppställningar och tillgång till uppdelning av strukturer. Ytterligare optimering kan krävas.
2. ytfunktionalisering
- Lös upp 80 μL av en sulfo-SANPAH-alikvot i 40 mL 0,1 M HEPES-buffert (pH 7-9).
Anmärkning: Bered sulfo-SANPAH-alikvoter genom upplösning av 100 mg sulfo-SANPAH-pulver i 2 mL steril dimetylsulfoxid (DMSO). Bered 0,1 M HEPES buffert genom att späda 50 mL HEPES i 450 mL sterilt avjoniserat vatten och filtrera genom ett pore-filter på 0,22 μm. - Tillsätt 200 μL utspädd sulfo-SANPAH-lösning till varje brunn på 96-brunnen plattan.
- Utsätt plattan för UV-ljus (300-460Nm) på lämpligt avstånd och längd.
Anmärkning: efter UV-exponering bör färgen på lösningen vara mörkare. UV-exponeringens avstånd och varaktighet beror på UV-lampans effekt. I vår applikation utsätter vi för 10-15 min på ett avstånd av 5 cm. - Ta bort sulfo-sanpah-lösningen från brunnarna och tillsätt 200 μl av 5 μg/ml Fibronektin-lösning till varje brunn.
Anmärkning: forskarens specificerade protein kan användas för ytbeläggning. Vissa vanligt förekommande proteiner är kollagen, fibronectin och laminin. Vi har funnit sulfo-SANPAH vara den mest effektiva metoden, och plasma rengöring medan ibland sysselsätter i PDMS avskräcks eftersom det skapar en kiseldioxid skikt och synligt skadar ytan. - Inkubera plattan vid 4 ° c över natten.
Obs: olika inkubering metoder kan tillämpas beroende på det protein som används för beläggning. - Ta bort Fibronektin-lösningen och tvätta varje brunn med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) två gånger.
- Placera ett lock på provet.
- Tillsätt 200 μL PBS till varje brunn.
Obs: protokollet kan pausas här. De fibronectin-belagda proverna kan förvaras vid 4 ° c i upp till 2 veckor.
3. UV-sterilisering
- Sterilisera provet under UV-ljus i ett biologiskt säkerhetsskåp i 30 min.
Obs: längre UV-exponeringstider kan påverka pärlfluorescensen negativt. Alla efterföljande steg måste utföras under sterila förhållanden.
4. cell odling
- Ta bort PBS från varje brunn och tillsätt 200 μL av celler suspenderade i odlingsmedier till varje brunn.
- Platta cellerna vid önskad celltäthet. Cell tätheten beror på önskat experiment. För singelcellsstudier ska cellerna vara minst 50 μm mellanrum och celler nära kanterna på bildfönstret ska inte inkluderas i TFM-mätningen. För enskiktslager-celler bör bildfönstret ha ett visningsfält som täcks med ett konflytande cellskikt.
- Förbered den kompletta tillväxt kulturen media för NMuMG celler genom att komplettera DMEM med 5% FBS, 10 mM HEPES, 10 μg/mL insulin, 1% penicillin-streptomycin, 1 mM L-glutamin, och 0,5 μg/mL amfotericin B.
- Bered insulin beståndet genom beredning i Surat vatten (2,5 mL isättika i 130 mL avjoniserat vatten) till en koncentration på 10 mg/mL. Förvara stamlösningen vid 4 ° c. Vänta tills lösningen är klar och filtrera sedan genom ett pore-filter på 0,22 μm.
- TGF-β tillägg
- För beredning av TGF-β lager, lös 2 μg TGF-β i 100 μL 10 mM citronsyra (pH 3,0) och filtersterilisera med 0,22 μm porer. Vortexblanda röret och alikvoten i önskade volymer. Förvara alikvoter vid-80 ° c.
- Tillsätt 1,5 μL TGF-β-lagerlösning till 10 mL av det kompletta cell odlingsmediet för att utgöra cell odlingsmediet med den slutliga TGF-β-koncentrationen på 3 ng/mL.
Anmärkning: för att göra 10 mM pH 3,0 citronsyra, späd syran i vatten och justera pH till 3,0 genom att tillsätta HCl.
5. data insamling
- För varje position, förvärva minst en bild av förvaltnings partiklar och celler. Fokusera på pärlskiktet.
Obs: pixel storleken bör optimeras baserat på storleken på de förvaltnings partiklar och bild bearbetningsmetod som används. I denna ansökan, författarna använder en 10X 0,4 NA mål, och bilder förvärvas med 1024 x 1024 upplösning, med 455 nm/pixel. I allmänhet är det bra att behålla en upplösning på minst cirka 1-5 pixlar per pärla; Här är pärlor polydisperse och har en individuell storlek på 300-500 Nm. Det är viktigt att den fluorescerande förvaltnings pärlor vara i fokus för bilder som ska användas för TFM beräkningar. Fokus och bildkvalitet av pärlorna bör prioriteras framför avbildning cellerna själva. Det bör inte finnas någon Cross-Talk mellan olika kanaler, särskilt någon fluorescens inte från förvaltnings pärlor som visas i Imaging Spectra av pärlorna. - När alla positioner av intresse har registrerats, lägga avlossning lösning till varje brunn att förvärva kraft-fria referensbilder av förvaltnings partiklarna.
- För att bereda cell avskiljande lösning, blanda en vattenlösning som innehåller 2% TritonX-100, 50 mM natriumazid och 500 mM kaliumhydroxid.
Anmärkning: ovanstående tillhandahålls som ett exempel på en effektiv lösning för avlossning. Olika lösningslösningar på forskares diskretion kan användas för att lösgöra cellerna från substrat ytan.
- För att bereda cell avskiljande lösning, blanda en vattenlösning som innehåller 2% TritonX-100, 50 mM natriumazid och 500 mM kaliumhydroxid.
6. bildanalys
- Utför lämplig bildanalys efter behov.
Anmärkning: analysprogram utvecklades i egen. Bildanalys kan göras med skräddarsydd programvara eller programvara tillgänglig online.
7. pärlsyntes
Anmärkning: följande protokoll är baserat på den syntesmetod som beskrivs av Klein et al.10.
- Förbered den trehalsad kolven med en vattenkyld återloppskylare under ett draghuv.
Varning: Ställ in en syntes i ett väl ventilerat kemiskt draghuv. - Tillsätt 0,5 mL PDMS-stabilisator och fluorophore till kolven.
- Utrusta en hals med en gummi septum med en kväve inlopp nål och en utlopps nål och utrusta den andra halsen med ett gummi septum för tillsats av reagens med en spruta.
- Tillsätt 100 mL vattenfri hexan i 250 mL till kolven och tillsätt en liten magnetisk rör bar.
- Placera kolven i mineral olje badet vid 75 ° c och Töm den med kvävgas i 1 h.
- Tillsätt 6 mL metylmetakrylat till en 25 mL rund botten kolv.
- Tillsätt 0,100 g 2, 2 '-azobisisobutyronitril (AIBN) till den runda botten kolven och Töm blandningen med kvävgas i 1 h.
Anmärkning: Skölj metylamethakrylat genom färdigförpackade kolonnen för att avlägsna inhibitorer före användning. Tillsätt metylamethakrylat och AIBN-blandningen i den trehalta kolven. - Lösningen initialt blir grumlig och blir mjölkig. Låt reaktionen löpa i 3 h efter att lösningen blir grumlig.
- Efter 3 h, Placera kolven i ett isvatten bad.
- Vakuum-filtrera lösningen med grovt filterpapper.
- Centrifugera filtratet och återsuspendera partiklarna i hexan.
Obs: volymen av hexan som ska tillsättas beror på den önskade koncentrationen av pärllösningen. Ultraljudsbehandling underlättar åter spridningen av pärlpartiklar i hexan lösning. Pärlor som produceras av författarna har polydisperse diametrar på cirka 300-500nm. På grund av användningen av Cross-korrelation mönster spårning för att bestämma förskjutningar, monodisperse pärlor krävs inte.
8. reologi mätning protokoll
Anmärkning: Rheologi krävs inte för varje forskare eller experiment, men är nödvändigt att kvantifiera moduli för nya formuleringar av PDMS. I detta protokoll använder vi en skjuvning skjuvreometer för att mäta effekterna av crosslinker, frekvens, och påfrestningar på moduli av PDMS prover. Beroende på tillgängliga verktyg och expertis kan moduli också mätas med många andra mekaniska analysmetoder. Dessutom kan forskare som använder detta protokoll välja att använda vår publicerade moduli som presenteras i tabell 1, figur 3 och figur 4.
- Använd en skjuvreometer med en parallellplattgeometri på 25 mm diameter. Andra geometrier kan användas.
- Initiera systemet och kalibrera enheten och mätsystemet (parallell platta, d = 25 mm). När du har mätat nollgapet börjar du ladda PDMS-provet.
- Så snart PDMS elastomer och crosslinking agent har blandats, Pipettera blandningen på bottenplattan av rheometer.
- Flytta spindeln nedåt för att helt kontakta PDMS-provets ovansida.
- Försiktigt trimma det laddade provet överskott från bottenplattan.
- I en stam svep test, tillämpa ökande stammar för varje komposition med olika tvärbindningstäthet för att säkerställa polymerstrukturen kvar i den linjära viskoelastiska regimen under alla skjuvning mätningar.
Anmärkning: stam värden som är relevanta för cellstudier är vanligtvis i intervallet 0,1-10%. Vi har funnit PDMS vara linjär upp till cirka 100% stam. - Mät den dynamiska skjuvlagringsmodul (G) och resultatmodulus (G ′ ′) i PDMS-nätet i ett tids svep test med frekvensen 1 Hz och oscillerande skjuvstam på 0,5% vid 100 ° c.
- För att bestämma viskoelasticiteten och tids beroendet för det slutliga PDMS-nätet, applicera ett frekvens svep test med frekvens som sträcker sig 0,1-100 Hz och oscillerande skjuvstam på 0,5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innan tillsats av TGF-β, en konfluenta enskiktslager av celler har en kullersten som form och är tätt packad. Vid TGF-β behandling, celler blir mer långsträckt i morfologi, utvidga cellområdet och förvärva en mer mesenkymala fenotyp. Utnyttja multi-well enhet fabricerade med mjuka PDMS elastomerer, de fysikaliska egenskaperna hos celler i totalt 17 olika villkor studerades. Cellerna behandlades med fyra olika TGF-β-koncentrationer (0,5, 1, 2 och 4 ng/mL) och fyra olika inkubationstider (12, 24, 48, 96 h), och dessa resultat sammanfattas i figur 5. De celler som behandlades med TGF-β applicerade större dragkrafts spänningar och ansträngnings energier än de celler odlade utan TGF-β. Celler inkuberas med TGF-β för 96 h visade den största dragkraft spänningar och påfrestningar energier. Cellerna applicerade större spänningar och ansträngnings energier vid behandling med högre koncentration av TGF-β. Skillnaden i Tractions och sila energier var mer distinkt på längre inkubationstider.
Substratets yta måste vara slät och jämnt belagd med ligander, såsom Fibronektin eller kollagen. Repad yta och/eller icke-enhetlig beläggning av ligander kan leda till felaktig cell infästning, vilket resulterar i felaktig dragning mätning. Figur 6 visar de lokaliserade dragkrafts påfrestningarna på grund av den icke-enhetliga substrat ytan.
Figur 1 : Översikt över multi-well plåt tillverkning. Aen specialskuren glasfiber bild är utgångspunkten. (B) glas bilden är belagd med ett tjockt (~ 100 μm skikt av PDMS). (C) ett skikt av förvaltnings pärlor (visas i grönt) är sedan spin-belagda i ett ~ 1 μm tjockt skikt ovanpå det föregående lagret. (D) Multi-brunn avdelare är noggrant placerad ovanpå förvaltnings pärla skiktet. Eden kompletta multi-well plattan är monterad och klar för användning eller förvaring. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Custom Chuck för spin-coater. För att förhindra botten glaset (där PDMS är belagt) från att flyga iväg av standard spin-coater Chuck, en skräddarsydd hållare placeras på chucken. (A) en specialtillverkad hållare för spin-coater Chuck. B) konstruktionsritning av hållaren med alla mått. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Substrat stelhet med förändrade tvär Linkers koncentration (WT%). PDMS blandningar bereds enligt beskrivningen, med ytterligare crosslinker procent öka elasticitetsmodulus tills en max på 100 kPa på 1,8 vikt procent (WT%) crosslinker. Som en guide, Modulus som en funktion av crosslinker passar linjärt, som kan användas av forskare för att formulera sin egen blandning vid en viss önskad Modulus inom detta intervall. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Reologi av PDMS elastomer som innehåller 0, 0,15, 0,36 och 1 WT% av Crosslink-medel vid en temperatur på 100 ° c. Triangel symboler indikerar förlust modulus (G ' ') och kvadrera symboler indikerar lagermodulus (G '). (A) oscillerande tid svep vid frekvensen 1 Hz och skjuvstam på 0,5% under gelering. B) oscillerande frekvens svep av PDMS-nät vid skjuvstam på 0,5%. C) stamsvep av PDMS-nät med en frekvens av 1 Hz. Alla datapunkter förvärvades i tre exemplar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativa resultat med hjälp av Traction stress enhet med multi-well format. Monolayer av celler i olika förhållanden var odlade i en multi-well enhet för att mäta kontraktilitet och stam energi. (A) Graf över dragkrafts spänningar med ökande TGF-β inkubationstid för olika TGF-β-koncentrationer. Dragkrafts spänningar ökade med ökande TGF-β-koncentrationer och inkubationstid. Alla data är statistiskt signifikanta med avseende på kontroll (dvs. ingen TGF-β) utom följande: 12 h-0,5 ng, 12 h-1 ng, 48 h-1 ng. (B) diagram av stam energi med ökande TGF-β inkubationstid för olika TGF-β koncentrationer. Sila energier ökade med ökande TGF-β koncentrationer och inkubationstid. Urvalsstorlekarna varierar från n = 7 till n = 15. Alla data är statistiskt signifikanta med avseende på kontroll (dvs. ingen TGF-β) utom följande: 12 h-0,5 ng, 12 h-1 ng, 24 h-0,5 ng, 24 h-1 ng, 48 h-1 ng. Statistisk signifikans fastställdes med hjälp av Kruskal Wallis-testet, som inte förutsätter en normalfördelning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Representativa resultat från en suboptimal (a, B) och ett tillfredsställande (C, D) experiment. (A) reflektions bild av substrat ytan. Oönskade föroreningar, som kan innefatta damm eller fibrer, eller material defekter såsom repor finns på underlaget ytan. B Stress karta över cell kontraktilitet: på grund av den icke-enhetliga ytan, oregelbundna och felaktiga dragkraft spänningar observeras runt objekten. C Reflektions bild av substrat ytan. Inga uppenbara föroreningar är synliga. D Stress karta över cell kontraktilitet: inga artefakt diskontinuitet är synliga. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Koncentration av crosslinker (WT%) | G (PA) | Standardavvikelsen | E (kPa) | Standardavvikelsen |
| 0 | 0,135 | 0,014 | 0,405 | 0,043 |
| 0,15 | 1 | 0,1 | 3 | 0,35 |
| 0,36 | 4,027 | 0,245 | 12,081 | 0,73 |
| 0,75 | 16,01 | 0,49 | 48,03 | 1,2 |
| 1 | 18,44 | 0,989 | 55,32 | 1,94 |
| 1,5 | 27,638 | 0,93 | 82,91 | 1,64 |
| 1,8 | 33,986 | 0,88 | 101,94 | 1,088 |
| 2 | 33,36 | 0,67 | 100,08 | 1,1 |
Tabell 1: Substrat stelhet med förändrade tvär Linkers koncentration (WT%). Genom att ändra ytterligare crosslinker koncentrationer, PDMS substrat för den önskade Youngs moduli är fabricerade. PDMS skjuvning moduli mättes med en skjuvreometer och Youngs moduli bestämdes. För varje datapunkt gjordes 3 oberoende förberedelser och standardavvikelsen ges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att denna metod ska lyckas är det viktigt att ha ett jämnt belagt prov med en konstant tjocklek på cirka 100 μm. Modulus bör noga väljas för att undersöka den fysiska betydelsen av det biologiska systemet av intresse. När fabricera ett toppskikt, koncentrationen av relaterat fluorescerande partiklar bör optimeras för noggrann analys av förskjutning och dragkraft stress. Analysera isolerade enskilda celler kräver en tätare förvaltnings skikt än att mäta konfluenta monolayers. Dessutom bör ytan av underlaget ha stabila och enhetliga beläggning av adhesionsmolekyler som kollagen, fibronectin och laminin för att säkerställa korrekt fastsättning av cellerna till substrat ytan. Särskild försiktighet måste iakttas vid montering av multibrunn avdelare; Det bör placeras utan att glida för att förhindra tätning PDMS lim från att vara utsmetad på kulturen ytan, och den yttre kanten måste noggrant anpassas till glaset dimensioner för att förhindra läckage på gränsbrunnar.
För att förhindra brunnar från att vara läckande, en tillräcklig mängd PDMS lim måste appliceras på väl avdelare att hålla den på plats. Användning av överdrivna belopp kommer dock att täcka cellkultur ytan.
Tillräcklig volym PDMS måste läggas till under centrifugering förfarandet. När härdning, ugnen och rack måste vara nivå. Otillräcklig PDMS eller en utjämnade ugn kan leda till ojämn PDMS tjocklek.
Pärldensitet måste optimeras för korrekt analys. När pärltätheten inte är tillräcklig, koncentration av pärlorna i förvaltnings PDMS blandningen måste ökas. Dessutom måste en tillräcklig mängd av blandningen läggas till för spinn beläggning. För att säkerställa korrekt fluorescerande signaler av förvaltnings pärla partiklar, härdning tillstånd bör övervakas noggrant. Längre tider och högre temperaturer än de som anges i detta protokoll kan försämra fluorescensen. Felaktig protein beläggning på ytan av provet kan leda till dålig celladhesion. För att förhindra detta måste ytan rengöras och utgångstiden för reagenser som sulfo-SANPAH och ligander måste kontrolleras. UV-exponering tid och styrka bör optimeras. Immunofluorescens eller annan fluorescerande protein konstruktion kan testas för att säkerställa enhetlig ligand beläggning.
Anordningen fabricerade med denna metod och uppsättning PDMS formuleringar är endast tillämplig på substrat med Youngs moduli mellan 0,4 kPa till 100 kPa. Andra moduli kan vara möjligt med hjälp av alternativa formuleringar, men det nuvarande intervallet spänner över en stor uppsättning av fysiologiskt relevanta värden. Även om denna metod är speciellt för multi-well Fabrication, det kan också användas för att förbereda enskilda bilder eller andra bild geometrier, och i dessa fall ytterligare användarfel sökning kan vara nödvändigt. I detta utförande används en relativt tjock (1 mm) glasfiber, vilket utesluter gemensamma höga numeriska bländarmål (NA) på ett inverterat Mikroskop. Även om det är tekniskt möjligt att konstruera dessa multi-well TFM rätter med tunnare glas, kan bräcklighet av dessa i bearbetning och montering resultera i en hög grad av brott, och kan köra i strid med högre genomströmning strategi. Dessutom kan ytbeläggning undersökas ytterligare för bredare tillämpningar av anordningen.
Med hjälp av en multi-well format, hög-genomflöde experiment är möjliga. Multi-well format gjorde det möjligt för oss att undersöka de fysiska förändringarna av NMuMG celler under EMT med TGF-β behandling med kombinationer av olika koncentrationer och olika inkubationstider i en enda maträtt. Tillverkning av dragkraft spännings enheter med hydrogeler såsom polyakrylamidgel har flera begränsningar. Med den dominerande ingrediensen är vatten, hydrogeler är känsliga för saltkoncentrationer (osmolaritet), temperatur, fuktighet, och pH-förändringar. Förändringar i någon av dessa egenskaper kan leda till förändring i mekaniska egenskaper av materialet, kräver extra omsorg i att använda prover och tolka resultat. Dessutom, med vatten, hydrogeler är mer mottagliga för infektioner, kräver extra försiktighet. I motsats till vattenbaserade hydrogels är silikonbaserade PDMS stabila och inerta. När fabricerade, det kan lagras i rumstemperatur på obestämd tid utan att kräva någon särskild hantering eller lagringsförhållanden.
Den ogenomträngliga karaktären av PDMS tillåter oss att tillverka en monolitisk substrat, se till att alla brunnar är verkligen identiska i substrat tjocklek och sammansättning, samtidigt som unik biokemi som skall tillämpas i medierna, eller olika celler som skall utnyttjas i varje Väl. En hydrogel-baserad yta tillåter diffus faktorer att genomtränga och färdas genom den, vilket nödvändiggör tillsats av hydrogel till brunnar som annars är partitionerade för att förhindra korskontaminering.
Denna metod gör det möjligt för forskare att studera cell kontraktilitet, en grundläggande och allestädes närvarande aspekt av cellbiologi, i en hög genomströmning sätt, möjliggör effektivare och reproducerbara datainsamling. Detta bidrar till att översätta dragkraft mikroskopi till kontraktila kraft screening, gör det möjligt för forskare att verkligen använda kontraktilitet som ett mått för cell aktivitet, eller effekten av en förening. Som metodik har detta en bred tillämpning inom biofysiska och biomedicinska vetenskaper, från att förstå cellernas fysik, till att karakterisera och testa farmaceutiska substanser mot standardiserade celltyper, eller kanske mycket specialiserade enskilda celler för personlig medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AJE och RK har intresse av Live cell Technologies, ett företag som fabricerar material som beskrivs i denna artikel.
Acknowledgments
Författarna tackar tom Kodger, Michael Landry, och Christopher J. Barrett för hjälp med Bead syntes. A.J.E. erkänner naturvetenskap och teknik Forskningsrådet beviljar RGPIN/05843-2014 och EQPEQ/472339-2015, kanadensiska institut för hälsoforskning Grant nr 143327, Canadian Cancer Society Grant nr 703930, och kanadensiska Stiftelsen för innovation Projekt #32749. R. Ulrica erkänner National Institutes of Health Grant No. R21HL123522 och R01HL136209. H.Y. stöddes av fonds de Recherche Santé Québec, och fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. Författarna tackar Johanan Idicula för hjälp med video och manuskript och Zixin han för hjälp med att förbereda videon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. Traction forces in locomoting cells. Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. Physical Sciences - Oncology Centers Network. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
