Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Verwendung von Caenorhabditis elegans zur Untersuchung der trans- und mehrgenerationenlichen Wirkungen von Toxischen Stoffen

Published: July 29, 2019 doi: 10.3791/59367
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2, 1,2
1College of Environmental Sciences and Engineering, Tongji University, 2Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security, 3Jiaxing Tongji Institute of Environment, 4College of Ecological Technique and Engineering, Shanghai Institute of Technology

Summary

Trans- und mehrgenerationenische Wirkungen persistenter Chemikalien sind für die Beurteilung ihrer langfristigen Folgen für die Umwelt und die menschliche Gesundheit von wesentlicher Bedeutung. Wir bieten neuartige detaillierte Methoden zur Untersuchung von Trans- und Mehrgenerationeneffekten mit der freilebenden Nematode Caenorhabditis elegans.

Abstract

Informationen über Toxizitäten von Chemikalien sind für ihre Anwendung und Abfallbewirtschaftung von wesentlicher Bedeutung. Bei Chemikalien in niedrigen Konzentrationen sind die langfristigen Auswirkungen sehr wichtig, um ihre Folgen für die Umwelt und die menschliche Gesundheit zu beurteilen. Bei der Demonstration langfristiger Einflüsse liefern die Auswirkungen von Chemikalien über Generationen hinweg in neueren Studien neue Erkenntnisse. Hier beschreiben wir Protokolle zur Untersuchung der Wirkung von Chemikalien über mehrere Generationen mit frei lebenden Nematoden Caenorhabditis elegans. Zwei Aspekte werden vorgestellt: (1) trans-generationale (TG) und (2) Mehrgenerationeneffektstudien, von denen letztere durch Mehrgenerationenexposition (MGE) und Mehrgenerationen-Resteffektstudien (MGR) getrennt sind. Die TG-Effektstudie ist robust mit einem einfachen Zweck, um festzustellen, ob eine chemische Exposition gegenüber Eltern zu Restfolgen für den Nachwuchs führen kann. Nachdem die Auswirkungen auf die Eltern gemessen wurden, werden Natriumhypochlorit-Lösungen verwendet, um die Eltern zu töten und den Nachwuchs zu halten, um die Wirkungsmessung auf den Nachwuchs zu erleichtern. Die TG-Effektstudie wird verwendet, um festzustellen, ob die Nachkommen betroffen sind, wenn ihr Elternteil den Schadstoffen ausgesetzt ist. Die MGE- und MGR-Effektstudie wird systematisch verwendet, um festzustellen, ob eine kontinuierliche Generationenexposition zu adaptiven Reaktionen bei Nachkommen über Generationen führen kann. Sorgfältige Abholung und Übertragung werden verwendet, um Generationen zu unterscheiden, um die Wirkungsmessung an jeder Generation zu erleichtern. Wir haben auch Protokolle kombiniert, um Das Bewegungsverhalten, die Fortpflanzung, die Lebensdauer, die biochemischen und Genexpressionsänderungen zu messen. Einige Beispielexperimente werden auch vorgestellt, um die trans- und mehrgenerationenischen Effektstudien zu veranschaulichen.

Introduction

Die Anwendung und Abfallbewirtschaftung von Chemikalien hängt in hohem Maße von der Information ihrer Auswirkungen bei bestimmten Konzentrationen ab. Insbesondere ist die Zeit ein weiteres wesentliches Element zwischen Wirkungen und Konzentrationen. Das heißt, Chemikalien, insbesondere solche mit geringen Konzentrationen in den tatsächlichen Umgebungen, brauchen Zeit, um messbare Effekte zu provozieren1. Daher ordnen die Forscher unterschiedliche Längen der Expositionsdauer in Tierversuchen an und decken sogar den gesamten Lebenszyklus ab. Zum Beispiel waren Mäuse für 30, 90 oder 180 Tage Nikotin ausgesetzt, um seine toxischen Wirkungen zu untersuchen 2. Dennoch reichen solche Expositionsdauern immer noch nicht aus, um die langfristigen Auswirkungen von Schadstoffen (z. B. persistente organische Schadstoffe [POP]) aufzuklären, die über Generationen von Organismen in der Umwelt andauern können. Daher gewinnen Studien über Auswirkungen über Generationen immer mehr Aufmerksamkeit.

Es gibt zwei Hauptaspekte in Generationeneffektstudien. Die erste ist die transgenerationale (TG) Effektstudie, die robust testen kann, ob eine chemische Exposition gegenüber Eltern Auswirkungen auf den Nachwuchs haben kann3. Die zweite ist eine Mehrgenerationen-Effektstudie, die systematischer ist und sowohl bei der Exposition als auch bei den Resteffekten berücksichtigt wird. Einerseits werden die Multi-Generationen-Expositionseffekte (MGE) verwendet, um adaptive Reaktionen bei Tieren auf die langfristig herausfordernden Umgebungen zu veranschaulichen. Andererseits werden die Mehrgenerationen-Resteffekte (MGR) verwendet, um die langfristigen Restfolgen nach der Exposition zu demonstrieren, da die mütterliche Exposition mit einer Embryo-Exposition gegenüber den ersten Nachkommen und einer Keimbahn-Exposition gegenüber der zweiten Nachkommen, die den dritten Nachwuchs als erste Generation vollständig aus der Exposition4macht.

Obwohl Säugetiere (z. B. Mäuse) Musterorganismen in Toxizitätsstudien sind, insbesondere in Bezug auf den Menschen, ist ihre Anwendung bei der Untersuchung von Generationenwirkungen recht zeitaufwändig, teuer und ethisch in Bezug auf 5. Dementsprechend bieten Organismen wie die Krebstiere Daphnia magna6, Dasinsekt Drosophila melanogaster7 und der Zebrafisch Danio rerio8alternative Möglichkeiten. Doch diese Organismen haben entweder keine Ähnlichkeiten mit dem Menschen oder benötigen spezifische Ausrüstung in Studien.

Caenorhabditis elegans ist eine kleine freilebende Nematode (ca. 1 mm lang) mit einem kurzen Lebenszyklus (ca. 84 h bei 20 °C)9. Diese Nematode teilt viele biologische Wege konservativ für den Menschen, und daher wurde es weit verbreitet verwendet, um die Auswirkungen von verschiedenen Belastungen oder Giftstoffe zu veranschaulichen10. Insbesondere sind 99,5% der Nematoden Hermaphrodite, die diese Organismen sehr geeignet machen, um Generationeneffekte zu untersuchen, z. B. TG-Effekte von Schwermetallen und Sulfonamiden3,11, MGE-Effekte von Gold-Nanopartikeln und schweren Metalle12 und Temperatur13, MGR-Effekte von Sulfonamid14, und sowohl MGE und MGR-Effekte der Gamma-Bestrahlung15 und Lindan4. Darüber hinaus wurden vergleichbare Ergebnisse zwischen den Wirkungen von Chemikalien (z. B. Zearalenon) auf die Entwicklung und Fortpflanzung von Mäusen und C. elegans16,17gefunden, was einen Vorteil für die Extrapolatung Auswirkungen dieses kleinen Tieres auf den Menschen.

Sowohl TG- als auch MG-Effektstudien sind zeitaufwändig und benötigen sorgfältiges Design und Leistung. Insbesondere bestanden in den oben genannten Studien Unterschiede bei der Wahl des Lebensstadiums, den Expositionsbedingungen und den Methoden der Generationstrennung. Diese Unterschiede behinderten den direkten Vergleich der Ergebnisse und behinderten die weitere Interpretation der Ergebnisse. Daher ist es unerlässlich, einheitliche Protokolle zur Orientierung von TG- und MG-Effektstudien zu erstellen und auch ein größeres Bild zu liefern, um ähnliche Muster verschiedener Giftstoffe oder Schadstoffe in langfristigen Folgen aufzudecken. Das überzielige Ziel der vorliegenden Protokolle wird klare Arbeitsabläufe bei der Untersuchung von Trans- und Mehrgenerationeneffekten mit C. elegansdemonstrieren. Die Protokolle werden Forschern zugute kommen, die daran interessiert sind, die langfristigen Auswirkungen von Giftstoffen oder Schadstoffen zu untersuchen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kultur E. coli OP50

  1. 1 M Natriumhydroxidlösung vorbereiten, indem 4 g Natriumhydroxid in 100 ml Wasser gelöst werden.
  2. Bereiten Sie Lysogeny-Brühe (LB) Medium durch Auflösen von 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g Natriumchlorid mit 1 L reinem Reinstwasser in einem 1 L konischen Kolben. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M Natriumhydroxidlösung ein.
  3. Aliquot das LB flüssige Medium von Schritt1.2 in 20 konische Kolben (maximal zulässiges Volumen: 100 ml) mit jeweils 50 ml Medium. Bedecken Sie die konischen Kolben mit Kraftpapier.
  4. Sterilisieren Sie das flüssige Mittel LB bei 121 °C und 0,105 MPa für 20 min. Kühlen Sie das LB-Medium auf Raumtemperatur.
  5. Pipette 200 l aus den bakteriellen Suspensionen (siehe Schritt 1.8) oder eine kleine Kolonie von Agars (in Schritt 2.14) mit einer Impfschleife pflücken, in LB-Medium platzieren.
  6. Inkubieren Sie das LB-Medium mit Schütteln bei 150 Rpm bei 37 °C für 24-48 h. Das LB-Medium wechselt von einer braunen transparenten Flüssigkeit zu einer trüben khakifarbenen Suspension.
  7. Verwenden Sie die bakteriellen Suspensionen aus 80% der Gesamtkolben, um E. coli OP50 als Nematodenfutter bereitzustellen, das in Schritt 2.11 verwendet werden soll.
  8. Den Rest der Kolben, die die bakteriellen Suspensionen enthalten, bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahren. Pipette 200 l der LB-Aufhängungen auf der Oberseite des frischen LB-Mediums (Schritt 1.4) und Wiederholungsschritt1.6 für die nachfolgende Inkubation.

2. Kultur C. elegans

HINWEIS: Kultur C. elegans nach den Schritten 2.1 bis 2.11 basierend auf Standardmethoden18.

  1. 22,8 g K2HPO4•3H2Oin 100 ml sterilem destilliertem Wasser auflösen.
  2. 6,8 g KH2PO4 in 50 ml sterilem destilliertem Wasser auflösen.
  3. Mischen Sie Lösungen aus den Schritten 2.1 und 2.2, um 1 M K2HPO4-KH2PO4 Puffer (pH 6.0, 150 ml insgesamt) vorzubereiten.
  4. 1,0 M MgSO4 vorbereiten, indem 1,232 g MgSO4•7H2 O in 5 ml sterilem destilliertem Wasser gelöst werden, und sterilisieren, indem Sie die Lösung durch einen 0,22 m sterilen Einwegmembranfilter in einen sterilen Behälter filtern.
  5. Bereiten Sie 1 M CaCl2 vor, indem Sie 0,554 g CaCl2 in 5 ml sterilem destilliertem Wasser auflösen, und sterilisieren, indem Sie die Lösungen durch einen 0,22 m sterilen Einwegmembranfilter in einen sterilen Behälter filtern.
  6. Bereiten Sie 1 M Cholesterinlösung vor, indem Sie 0,025 g Cholesterin in 5 ml absolutem Ethanol auflösen, und sterilisieren, indem Sie die Lösung durch einen 0,22 m sterilen Einwegmembranfilter in einen sterilen Behälter filtern.
  7. Bereiten Sie das Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) Agar vor, indem Sie 17 g Agarpulver, 2,5 g Pepton und 3 g Natriumchlorid zu einem 1 L konischen Kolben mit 1 L Reinstwasser hinzufügen. Fügen Sie 25 ml K2HPO4-KH2PO4 Lösung ab Schritt 2.3 hinzu.
  8. Sterilisieren Sie den NGM Agar ab Schritt 2.7 bei 121 °C mit 0,105 MPa für 20 min.
  9. Den NGM-Agar auf ca. 50 °C abkühlen, 1 ml 1 M MgSO4, 1 M CaCl2und 5 mg/ml Cholesterin-Ethanol-Lösung von den Schritten 2,4 bis 2,6 in das Medium geben und gründlich vermischen.
  10. Gießen Sie 10 ml NGM Agar Medium pro Schale in 100 sterile Petrischalen (6,0 cm Durchmesser). Kühlen Sie das Medium in den Petri-Gerichten auf Raumtemperatur, um festen Agar zu bilden.
  11. Pipette 170 l der bakteriellen Suspensionen von Schritt 1.7 auf den oben genannten NGM-Agar mit einer sterilen Spitze. Schütteln Sie den NGM-Agar leicht, um das LB-Medium gleichmäßig über die NGM-Agaroberfläche zu verteilen.
  12. Impfen Sie den NGM-Agar mit der Oberseite bei 37 °C für 8-12 h, um einen bakteriellen Rasen zu bilden.
  13. Verwenden Sie den größten Teil des Agars mit bakteriellen Rasen von Schritt 2.12 bis KulturNematoden in Schritt 2.15 oder 2.19.
  14. Lagern Sie 1 oder 2 Agars nach unten, um Verdunstung und Kontamination in Kühlschränken bei 4 °C zu vermeiden, um die Bakterien bei Kontamination zu erhalten.
  15. Wenn es weniger als 2.000 Nematoden auf dem Strumpf NGM Agars (aus früheren Experimenten oder begabt aus anderen Labors), schneiden Sie ein Sechstel der NGM Agar, die C. elegans mit einer sterilen Spitze enthält und übertragen Sie es auf neu zubereitete NGM Agars mit bakteriellen Rasen (ab Schritt 2.13). Halten Sie die NGM-Agars in einem 22 °C-Inkubator für die nachfolgende Kultur nach oben.
  16. Wenn sich mehr als 2.000 Nematoden auf dem Strumpf NGM Agar befinden, spülen Sie die Nematoden des NGM-Agars mit 2 ml sterilem Wasser in Zentrifugenrohre. Der Ein- und Ausstoß von 2 ml Wasser ergibt einen Ausgang von ca. 1,5 ml.
  17. Lassen Sie die Nematoden in den Zentrifugenrohren ab 30 min absetzen. Entsorgen Sie 1 ml der Überräube durch Pipettieren und fügen Sie 1 ml steriles Wasser in jedes Rohr, um die Pellets (d.h. die Nematoden) zu waschen.
  18. Die Nematoden in den Zentrifugenrohren 30 min absetzen. 1 ml der Überräube durch Pipettieren entsorgen. Fügen Sie 1 ml steriles Wasser in jedes Rohr, um die Nematoden wieder aufzuhängen.
  19. Verteilen Sie die Nematodensuspensionen (insgesamt ca. 1,5 ml) durch Pipettieren von 150 l auf jeden neuen NGM-Agar mit bakteriellem Rasen (ab Schritt 2.13), wodurch insgesamt 8-10 neue NGM-Agars entstehen.
  20. Halten Sie die NGM-Agars von Schritt 2.19 in einem 20 °C-Inkubator über Nacht und dann nach oben für die nachfolgende Kultur.
  21. Wiederholen Sie Schritt 2.15 oder Schritt 2.16-2.20 alle drei Tage.

3. Bereiten Sie synchronisierte Eier und L3 Larven von C. elegans

  1. Spülen Sie die Gravid-Nematoden und neu produzierten Eier aus den NGM-Agarn in sterile Zentrifugenröhrchen, wobei 2 ml steriles Wasser auf jedem NGM-Agar verwendet werden, was zu einer Leistung von ca. 1,5 ml führt.
  2. Die Nematoden in den Zentrifugenrohren 30 min absetzen und dann 85% der Überräube durch Pipettieren entsorgen.
  3. Bereiten Sie Natriumhypochlorit-Lösungen vor, indem Sie 0,6 g NaOH und 5 ml NaOCl (4-6% aktive Gradienten, siehe Tabelle der Materialien für Details) mit 25 ml Wasser auflösen, um die NaOH auf 0,5 M und NaOCl auf 1% zu bringen.
  4. Mischen Sie die Pellets aus Schritt 3.2 (das Volumen als V0markieren ) mit 7-fach V0 Natriumhypochloritlösungen ab (Schritt 3.3, d.h. Volumenverhältnis von 1:7)19.
  5. Schütteln Sie die Zentrifugenröhrchen alle 2 min für 10-15 min, um die Larven und erwachsenen Nematoden zu lyse; die Farbe der Nematodenaufhängungen wird von trüben zu klar drehen.
  6. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 700 x g für 3 min bei 20 °C, und entsorgen Sie dann die Überräube durch Pipetten.
  7. Die Pellets in 5-fach Empf. V0 sterilem Wasser wieder aufhängen, um die alterssynchronen Eier zu waschen. Zentrifugieren Sie bei 700 x g für 3 min bei 20 °C, und entsorgen Sie dann die Überräube.
  8. Wiederholen Sie Schritt 3.7 zweimal.
  9. Fügen Sie 1-fach V0 steriles Wasser in die Schläuche, um die alterssynchronen Eier wieder aufzuhängen.
  10. Verteilen Sie die Eiersuspensionen, indem Sie ab Schritt 2.13 50 L auf jede neue NGM-Agar mit bakteriellem Rasen pfeifen. Halten Sie die NGM-Agars 30 min lang in einem 20 °C-Inkubator auf der Oberseite, so dass das Wasser verdunstet oder vom bakteriellen Rasen adsorbiert wird. Dann machen Sie die NGM Agars nach oben für die nachfolgende Kultur. Markieren Sie die Zeit als die Eizeit (TEi).
  11. Bereiten Sie K-Medium vor, indem Sie 3 g NaCl und 2,36 g KCl in 1 L Wasser auflösen. Sterilisieren Sie das Medium bei 121 °C und 0,105 MPa für 20 min und kühlen Sie es auf Raumtemperatur ab.
  12. Wenn die Zeit 36 h nach TEierreicht, erreichen die Nematoden das L3-Larvenstadium (L3-Nematoden)20. Spülen Sie die Nematoden von den NGM-Agarn in Zentrifugenrohre, mit 2 ml sterilem Wasser auf jedem NGM-Agar, was zu ca. 1,5 ml Leistung führt.
  13. Nach einer Setzung für 30 min, ersetzen Sie 85% der Überstand (durch Pipettieren) mit K-Medium von 2 h, um die Nahrung im Darm zu verdauen3.
  14. Entsorgen Sie die Überräube. Verwenden Sie K-Medium (ab Schritt 3.11), um die Nematodensuspensionen für nachfolgende Experimente auf etwa 200 Nematoden pro 100 l einzustellen.

4. C. elegans für die transgenerationale Wirkungsstudie verwenden

  1. Bereiten Sie chemische Lösungen mit 5 Konzentrationen und einem Lösungsmittel oder einer absoluten Kontrolle, d.h. insgesamt 6 Gruppen, vor.
  2. Fügen Sie 100 l Kontroll- oder chemische Lösungen mit 10 Bohrungen als Replikationen in jeder Gruppe (d. h. insgesamt 60 Brunnen) in den mittleren Bereich einer 96-gut sterilen Mikroplatte ein, um Kanteneffekte zu vermeiden.
  3. Verdünnen Sie die Nematodenaufhängungen ab Schritt 3.14 mit K-Medium ab Schritt 3.11 mal 10-fach. Fügen Sie jeder der 60 Bohrungen ab Schritt 4.2 100 L Nematodensuspensionen hinzu. Markieren Sie die Zeit als t0.
  4. Wenn die Zeit 24 h nach t0erreicht, zählen Sie die lebenden und toten Nematoden in den Brunnen. Berechnen Sie die mittlere tödliche Konzentration (LC50).
  5. Bereiten Sie eine Reihe von 5 Konzentrationen unter 10% der LC50 Werte vor.
  6. Fügen Sie 100 L Kontroll- oder chemische Lösungen (ab Schritt 4.5) mit 10 Bohrungen als Replikationen in jeder Gruppe (d. h. insgesamt 60 Brunnen) in den mittleren Bereich einer 96-well sterilen Mikroplatte ein, um Kanteneffekte zu vermeiden.
  7. Fügen Sie jeder der 60 Brunnen ab Schritt 4.6 100 L K-Medium mit ca. 200 L3 Nematoden (ab Schritt 3.14) hinzu. Markieren Sie die Zeit als T0.
  8. Führen Sie die Belichtung für 24 bis 96 h seit T0durch.
  9. Nach der Exposition nematodes aus fünf Brunnen in jeder Gruppe in 1,5 ml Zentrifugenrohre durch Pipettieren (d. h. insgesamt 6 Rohre) sammeln.
  10. Die Nematoden 30 min absetzen, die Überräube durch Pipettieren entsorgen und Nematoden am Boden mit 1 ml sterilisiertem Wasser wieder aufhängen und waschen.
  11. Begleichen Sie die Nematoden 30 min, entsorgen Sie die Überräube durch Pipetten und verwenden Sie die Nematoden unten für die Indikatormessungen (siehe Abschnitt 7) der exponierten übergeordneten Generation, die als F0 markiert ist.
  12. Sammeln, absetzen und waschen (durch Erneutaussetzung) der Nematoden aus den verbleibenden fünf Brunnen in jeder Gruppe in Schritt 4.9 nach Schritt 4.10.
  13. Die Nematoden aus Schritt 4.12 für 30 min absetzen. Die Überräube durch Pipetten entsorgen und 100 l steriles Wasser hinzufügen, um die Nematoden wieder aufzuhängen. Übertragen Sie die Nematodensuspensionen gleichmäßig auf drei neu präparierte NGM-Agars mit bakteriellem Rasen ab Schritt 2.13.
  14. Inkubieren Sie die Nematoden für 36 h gravid und führen Sie Alterssynchronisation nach den Schritten 3.1-3.9. Die synchronisierten Eier auf den jeweiligen NGM-Agarn mit bakteriellem Rasen ab Schritt 2.13 für 36 h inkubieren.
  15. Spülen Sie die Nematoden auf den NGM-Agarn von Schritt 4.14 in sechs Zentrifugenrohre.
  16. Setzen Sie die Nematoden für 30 min, und entsorgen Sie die Übersprecher durch Pipettieren. Die Pellets mit 1 ml sterilisiertem Wasser wieder aufhängen und waschen.
  17. Setzen Sie die Nematoden für 30 min, und entsorgen Sie die Übersprecher durch Pipettieren. Verwenden Sie die Nematoden unten für die Indikatormessungen (siehe Abschnitt 7) der als T1 markierten Nachkommengeneration.

5. Verwenden Sie C. elegans für Mehrgenerationen-Exposition (MGE) Wirkungsstudie

  1. Mischen Sie 99,0 ml NGM-Agars (ab Schritt 2,9) mit 1 ml Kontroll- oder chemischen Lösungen (niedrige und hohe Konzentrationen im vorliegenden Protokoll als Beispiele, d. h. insgesamt drei Gruppen).
  2. Gießen Sie die ca. 10 ml NGM Agar Medium pro Schale von Schritt 5.1 in 100 sterile Petrischalen (6,0 cm Durchmesser). Kühlen Sie das Medium in den Petri-Gerichten auf Raumtemperatur, um festen Agar zu bilden.
  3. Pipette bakterielle Suspensionen auf dem Agar nach Schritt 2.11.
  4. Die oberen Deckel der Petrischalen beiseite legen und den bakteriellen Rasen 15min im Biosicherheitsschrank UV-Licht (145 'W/cm2) aussetzen.
  5. Wählen Sie eine kleine Kolonie mit einer Impfschleife, legen Sie sie in LB Medium von Agars in Schritt 1.4. Inkubieren Sie das LB-Medium mit Schütteln bei einer Geschwindigkeit von 150 Rpm bei 37 °C für 24 h, um das negligle bakterielle Wachstum zu bestätigen, und bestätigen Sie den Tötungsschritt 5.4.
  6. Pipette die alterssynchronisierten Eier von Schritt 3.9 auf die Agars (ab Schritt 5.4). Markieren Sie den Beginn der Belichtung mit der übergeordneten Generation F0 und markieren Sie die als Tag 0 (D0).
  7. Die Agars für 3 d bei 20 °C bebrüten. Verwenden Sie dann (d. h. auf D3) die ausgereiften Nematoden, um Effekte in F0 zu messen (siehe Abschnitt 7).
  8. Auch auf D3, wählen F0 reifen Nematoden auf neue NGM Agars (ab Schritt 5.4) mit einer Glasstange, deren Ende mit einem künstlichen Faserdraht in einen Ring gebogen ausgestattet ist.
  9. Auf D4, herausholen und entsorgen Sie die reifen F0 Nematoden von NGM Agars. Markieren Sie die frisch geschlüpften Nachkommen nematoden innerhalb dieser 24 h (von D3 bis D4) als F1, um eine Exposition der zweiten Generation zu erleben.
  10. Auf D6 messen Indizes (siehe Abschnitt 7) der F1 ausgereiften Nematoden, die 3 Tage lang ausgesetzt waren.
  11. Wiederholen Sie auf D9 die Schritte 5.8-5.10, verwenden Sie F1-Nematoden, um F2-Würmer zu reproduzieren und Effekte auf F2-Nematoden zu messen.
  12. Verwenden Sie auf D12 Schritt 5.11, verwenden Sie F2-Nematoden, um F3-Würmer zu reproduzieren und Effekte auf F3-Nematoden zu messen. Auf die gleiche Weise reproduzieren Sie Nachkommen und messen Sie MGE-Effekte auf die nth Nachkommengeneration (Fn).

6. Verwenden Sie C. elegans für mehrgenerationenische Residual -(MGR)-Effektstudie

  1. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.7. Auf D3, wählen F0 reife Nematoden auf neue NGM Agars ohne zusätzliche Chemikalien (ab Schritt 2.13).
  2. Auf D4 die reifen F0-Nematoden herauspicken und entsorgen. Markieren Sie die frisch geschlüpften Nachkommen Nematoden innerhalb dieser 24 h als T1 Nematoden.
  3. Auf D6 messen Indizes (siehe Abschnitt 7) der Reifennematoden T1, die 3 Tage lang gewachsen sind.
  4. Verwenden Sie auf D9 die Schritte 6.2-6.3, verwenden Sie T1-Nematoden, um T2-Nematoden zu reproduzieren und Effekte in T1-Nematoden zu messen.
  5. Verwenden Sie auf D12 die Schritte 6.4, verwenden Sie T2-Nematoden, um T3-Nematoden zu reproduzieren und Effekte in T2-Nematoden zu messen. Auf die gleiche Weise reproduzieren Und mGR-Effekte auf die nth Nachkommengeneration (Tn) Nematoden von F0 oder die nth Nachkommen (Tn') Nematoden von Fn ab Schritt 5.12 messen.

7. Messindikatoren

  1. Messen Sie das Bewegungsverhalten.
    1. Spülen Sie die Nematoden mit sterilem Wasser von den NGM-Agarn ab und sammeln Sie sie in Zentrifugenröhrchen. Die Nematoden 30 min absetzen, die Überstande entsorgen und die Nematoden in den Pellets zur Effektmessung verwenden.
    2. Die Nematoden in den Pellets mit 1 ml sterilem Wasser wieder aufhängen und auf NGM-Agars ohne bakteriellen Rasen ab Schritt 2.10 pipette.
    3. Verwenden Sie ein Trennmikroskop, um die Nematoden für die (Anzahl der) Körperbiegefrequenz (BBF) zu bewerten, die sich auf die Zeiten bezieht, in denen die hintere Glühbirne des Rachens die Richtung entlang der vertikalen Richtung des Wanderwegs innerhalb eines Intervalls von 60 s ändert.
    4. Verwenden Sie das Sezieren des Mikroskops, um die Umkehrbewegung (RM) zu bewerten, die sich auf die Zeiten bezieht, in denen sich die Fahrtrichtung über 90° ändert, einschließlich Rückwärtsdrehungen und Omega-Drehung (OT) in einem Intervall von 60 s. Die OT bezieht sich auf die Bewegung, wenn der Kopf des Nematoden berührt oder fast berührt seinen Schwanz macht die Nematodenform wie der griechische Buchstabe Omega ().
      ANMERKUNG: Für jede Behandlung wurden in jeder experimentellen Replikation mindestens 6 Nematoden untersucht.
Beispiele für MGE-Effekte (F0 bis F3) auf Fortpflanzung und Lebensdauer mit 3 Gruppen (eine Kontrolle und zwei Expositionsbehandlungen).
tag NGM-Agarnummer für MGE-Studie erklärung
leben fortpflanzung
0 30 (F0-Exposition) 10 Repliken für jede Gruppe, markiert als F0-1-1-0 bis F0-3-10-0, mit der letzten Ziffer, um die Überlebenstage anzuzeigen.
1 30 (F0 überleben 1 d) F0-1-1-0 zu F0-3-10-0 sollte in F0-1-1-1 auf F0-3-10-1 geändert werden.
2 30 (F0 überleben 2 d) F0-1-1-1 zu F0-3-10-1 sollte in F0-1-1-2 auf F0-3-10-2 geändert werden.
Keine Notwendigkeit, F0 Nematoden bis 3 d zu übertragen.
3 30 (F0 überleben 3 d, nach Nematoden Transfer und Sammlung gelöscht) Nach 3 d sind F0 Nematoden ausgereift und 36 neue NGM-Agars (mit 2 Nematoden auf jedem Agar) werden verwendet, um ihr Überleben und ihre Fortpflanzung zu beobachten.
36 (F0-1-1-3 bis F0-3-12-3) Es sollten Vorversuche durchgeführt werden, um die Anzahl der F0-Nematoden zu arrangieren, um mindestens 200 Nachkommen für erfolgreiche Mehrgenerationenoperationen zu versichern.
Insbesondere sollten die F0-Nematoden, wenn MGR-Effekte untersucht werden, ohne chemische Exposition auf klare NGM-Agars übertragen werden, und es sollte als T1-Start angegeben werden.
Die meisten F0-Nematoden werden gesammelt, um chemische und genetische Indizes zu messen, und die 30 Agars in F0 werden gelöscht.
4 36 (F0-1-1-4 bis F0-3-12-4) 36 (F1-1-1-1 bis F1-3-12-1) Die Messung der Lebensdauer und Reproduktion erfordert jeden Tag eine Übertragung.
Elternnematoden auf F0-1-1-3 bis F0-3-12-3 werden auf neuen NGM-Agars mit der Aufschrift F0-1-1-4 bis F0-3-12-4 ausgewählt.
Die restlichen Nachkommennematoden (d.h. F1 in MGE oder T1 in MGR) in F0-1-1-3 bis F0-3-12-3 Agars sind für 1 d gewachsen, und die Marker werden in F1-1-1-1 auf F1-3-12-1 geändert. Diese Agars werden auch verwendet, um die Lebensdauer von F1 mit täglichem Transfer zu überwachen.
5 36 (F0-1-1-5 bis F0-3-12-5) 36 (F1-1-1-2 bis F1-3-12-2) Nematoden auf F1-1-1-1 bis F1-3-12-1 Agars sind für 2 d gewachsen und leicht beobachtbar und die Nematoden werden gezählt, und die Marker werden in F1-1-1-2 auf F1-3-12-2 geändert.
36 (F0-1-1-4 bis F0-3-12-4) Die Nachkommen nematoden in F0-1-1-4 bis F0-3-12-4 Agars sind für 1 d gewachsen.
6 36 (F0-1-1-6 bis F0-3-12-6) 36 (F0-1-1-4 bis F0-3-12-4, nach Zählung gelöscht) Nematoden auf F1-1-1-2 bis F1-3-12-2 Agars sind für 3 d gewachsen und die Marker werden in F1-1-1-3 auf F1-3-12-3 geändert. Bemerkenswert ist, dass die F1-Nematoden an diesem Tag f2 reproduzieren, F1-Nematoden sollten auf neue NGM-Agars übertragen werden, die F2-1-1-0 auf F1-3-12-0 machen. Für MGR-Studien beginnt T2 heute.
36 (F1-1-1-3 bis F1-3-12-3) 36 (F0-1-1-5 bis F0-3-12-5) Dies kann durch chemische Exposition verzögert werden, und daher sollten in jedem Experiment flexible Veränderungen durchgeführt werden, um genügend Nematoden für nachfolgende Generationen zu gewährleisten.
36 (F2-1-1-0 bis F1-3-12-0) Die Nachkommennematoden auf F0-1-1-4 bis F0-3-12-4 Agars sind für 2 d gewachsen, und die Agars werden nach der Zählung der Nematoden gerodet.
Die Nachkommen nematoden auf F0-1-1-5 bis F0-3-12-5 Agars sind für 1 d gewachsen.
7 36 (F0-1-1-7 bis F0-3-12-7) 36 (F0-1-1-5 bis F0-3-12-5, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden auf F0-1-1-5 bis F0-3-12-5 Agars sind für 2 d gewachsen, und die Agars werden nach der Zählung der Nematoden gerodet.
36 (F1-1-1-4 bis F1-3-12-4) 36 (F0-1-1-6 bis F0-3-12-6) Die Gesamtnematodenzahl in F1-1-1-1 bis F1-3-12-1 Agars, F0-1-1-4 bis F0-3-12-4 Agars und F0-1-1-5 bis F0-3-12-5 werden verwendet, um die ursprüngliche Reproduktion von F0 zu berechnen.
36 (F2-1-1-1 bis F2-3-12-1) Die Nachkommen nematoden auf F0-1-1-6 bis F0-3-12-6 Agars sind für 1 d gewachsen.
Die F2-Nematoden auf F2-1-1-0 bis F1-3-12-0 sind für 1 d gewachsen und ihre Marker werden in F2-1-1-1 in F2-3-12-1 geändert.
8 36 (F0-1-1-8 bis F0-3-12-8) 36 (F0-1-1-6 bis F0-3-12-6, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden auf F0-1-1-6 bis F0-3-12-6 Agars sind für 2 d gewachsen, und die Agars werden nach der Zählung der Nematoden gerodet.
36 (F1-1-1-5 bis F1-3-12-5) 36 (F0-1-1-7 bis F0-3-12-7) Die Nachkommen nematoden von F0 auf F0-1-1-7 bis F0-3-12-7 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F2-1-1-2 bis F2-3-12-2) 36 (F1-1-1-4 bis F1-3-12-4) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-4 bis F1-3-12-4 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F2-1-1-1 zu F2-3-12-1, nach Zählung in F2-1-1-2 zu F2-3-12-2 geändert) Die F2-Nematoden auf F2-1-1-1 bis F2-3-12-1 sind für 2 d gewachsen, die Nematoden werden gezählt und ihre Marker werden in F2-1-1-2 auf F2-3-12-2 geändert.
9 36 (F0-1-1-9 bis F0-3-12-9) 36 (F0-1-1-7 bis F0-3-12-7, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F0 auf F0-1-1-7 bis F0-3-12-7 Agars sind für 2 d gewachsen, und die Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F1-1-1-6 bis F1-3-12-6) 36 (F1-1-1-4 bis F1-3-12-4, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-4 bis F1-3-12-4 Agars sind für 2 d gewachsen, und die Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F2-1-1-3 bis F2-3-12-3) 36 (F0-1-1-8 bis F0-3-12-8) Die Nachkommennematoden von F0 auf F0-1-1-8 bis F0-3-12-8 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F3-1-1-0 bis F3-3-12-0) 36 (F1-1-1-5 bis F1-3-12-5) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-5 bis F1-3-12-5 Agars sind für 1 d gewachsen.
Die F2-Nematoden auf F2-1-1-2 bis F2-3-12-2 sind seit 3 Tagen gewachsen und ihre Marker werden in F2-1-1-3 auf F2-3-12-3 geändert. Die F2-Nematoden beginnen sich heute zu reproduzieren und werden auf 36 neue NGM-Agars übertragen und als F3-1-1-0 auf F3-3-12-0 markiert. Für MGR-Studien beginnt T3 heute.
10 36 (F0-1-1-10 bis F0-3-12-10) 36 (F0-1-1-8 bis F0-3-12-8, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F0 auf F0-1-1-8 bis F0-3-12-8 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F1-1-1-7 bis F1-3-12-7) 36 (F1-1-1-5 bis F1-3-12-5, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-5 bis F1-3-12-5 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F2-1-1-4 bis F2-3-12-4) 36 (F0-1-1-9 bis F0-3-12-9) Die Gesamtnematodenzahl in F2-1-1-1 bis F2-3-12-1, F1-1-1-4 bis F1-3-12-4 Agars und F1-1-1-5 bis F1-3-12-5 werden verwendet, um die ursprüngliche Reproduktion von F1 zu berechnen.
36 (F3-1-1-1 bis F3-3-12-1) 36 (F1-1-1-6 bis F1-3-12-6) Die Nachkommen nematoden von F0 auf F0-1-1-9 bis F0-3-12-9 Agars sind für 1 d gewachsen.
Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-6 bis F1-3-12-6 Agars sind für 1 d gewachsen.
Die Nachkommen Nematode auf F3-1-1-0 bis F3-3-12-0 Agars sind für 1 d gewachsen und die Marker werden in F3-1-1-1 zu F3-3-12-1 geändert.
Bemerkenswert ist, dass die Reproduktion von F0-Nematoden nach den ersten Tagen deutlich abnehmen wird. Daher ist der Nematodentransfer nicht unbedingt erforderlich, um täglich nach D10 zu sein und kann alle 2 Tage durchgeführt werden. Dennoch erfordert das Überleben noch tägliche Beobachtung.
Die gleiche Regel gilt auch in F1 (T1, T1'), F2 (T2, T2') und F3 (T3, T3').
11 36 (F0-1-1-11 bis F0-3-12-11) 36 (F0-1-1-9 bis F0-3-12-9, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F0 auf F0-1-1-9 bis F0-3-12-9 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F1-1-1-8 bis F1-3-12-8) 36 (F1-1-1-6 bis F1-3-12-6, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-6 bis F1-3-12-6 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F2-1-1-5 bis F2-3-12-5) 36 (F0-1-1-10 bis F0-3-12-10) Die Nachkommen nematoden von F0 auf F0-1-1-10 bis F0-3-12-10 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F3-1-1-2 bis F3-3-12-2) 36 (F1-1-1-7 bis F1-3-12-7) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-7 bis F1-3-12-7 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F2-1-1-4 bis F2-3-12-4) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-4 bis F2-3-12-4 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F3-1-1-1 zu F3-3-12-1, nach Zählung in F3-1-1-2 zu F3-3-12-2 geändert) Die Nematoden auf F3-1-1-1 bis F3-3-12-1 Agars sind für 2 d gewachsen, die Nematoden werden gezählt und die Marker werden in F3-1-1-2 zu F3-3-12-2 geändert.
12 36 (F0-1-1-12 bis F0-3-12-12) 36 (F0-1-1-10 bis F0-3-12-10, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F0 auf F0-1-1-10 bis F0-3-12-10 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F1-1-1-9 bis F1-3-12-9) 36 (F1-1-1-7 bis F1-3-12-7, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-7 bis F1-3-12-7 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F2-1-1-6 bis F2-3-12-6) 36 (F2-1-1-4 bis F2-3-12-4, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-4 bis F2-3-12-4 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-3 bis F3-3-12-3) 36 (F0-1-1-11 bis F0-3-12-11) Die Nachkommennematoden von F0 auf F0-1-1-11 bis F0-3-12-11 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F4-1-1-0 bis F4-3-12-0) 36 (F1-1-1-8 bis F1-3-12-8) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-8 bis F1-3-12-8 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F2-1-1-5 bis F2-3-12-5) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-5 bis F2-3-12-5 Agars sind für 1 d gewachsen.
Die Nematoden auf F3-1-1-2 bis F3-3-12-2 Agars sind für 3 d gewachsen und die Marker werden in F3-1-1-3 zu F3-3-12-3 geändert. Die F3-Nematoden beginnen sich heute zu reproduzieren und werden auf 36 neue NGM-Agars übertragen und als F4-1-1-0 auf F4-3-12-0 markiert. Für MGR-Studien beginnen heute die Nachkommen von F3 (d.h. T1').
13 36 (F0-1-1-13 bis F0-3-12-13) 36 (F0-1-1-11 bis F0-3-12-11, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F0 auf F0-1-1-11 bis F0-3-12-11 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F1-1-1-10 bis F1-3-12-10) 36 (F1-1-1-8 bis F1-3-12-8, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-8 bis F1-3-12-8 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F2-1-1-7 bis F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-5 bis F2-3-12-5, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-5 bis F2-3-12-5 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-4 bis F3-3-12-4) 36 (F0-1-1-12 bis F0-3-12-12) Die Gesamtnematodenzahl in F3-1-1-1 bis F3-3-12-1, F2-1-1-4 bis F2-3-12-4 Agars und F2-1-1-5 bis F2-3-12-5 werden verwendet, um die ursprüngliche Reproduktion von F2 zu berechnen.
36 (F4-1-1-1 bis F4-3-12-1) 36 (F1-1-1-9 bis F1-3-12-9) Die Nachkommen nematoden von F0 auf F0-1-1-12 bis F0-3-12-12 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F2-1-1-6 bis F2-3-12-6) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-9 bis F1-3-12-9 Agars sind für 1 d gewachsen.
Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-6 bis F2-3-12-6 Agars sind für 1 d gewachsen.
Die Nachkommennematoden von F3 auf F4-1-1-0 bis F4-3-12-0 sind für 1 d gewachsen, und die Marker werden in F4-1-1-1 in F4-3-12-1 geändert.
14 36 (F0-1-1-14 bis F0-3-12-14) 36 (F0-1-1-12 bis F0-3-12-12, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F0 auf F0-1-1-12 bis F0-3-12-12 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F1-1-1-11 bis F1-3-12-11) 36 (F1-1-1-9 bis F1-3-12-9, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-9 bis F1-3-12-9 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F2-1-1-8 bis F2-3-12-8) 36 (F2-1-1-6 bis F2-3-12-6, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-6 bis F2-3-12-6 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-5 bis F3-3-12-5) 36 (F4-1-1-1 bis F4-3-12-1, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F3 auf F4-1-1-1 bis F4-3-12-1 sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden. Für MGR-Studien sind die Nematoden von T1 um 2 d gewachsen und werden am nächsten Tag (D15) mit der Reproduktion von T2 beginnen, und T2' wird beginnen, T3' auf D18 zu reproduzieren. Die Lebensdauer des wilden Typs C. elegans wird als 15 Tage bezeichnet. Dann wird das Ende der Lebensdauer von T3 auf D33 sein.
36 (F0-1-1-13 bis F0-3-12-13) Die Nachkommennematoden von F0 auf F0-1-1-13 bis F0-3-12-13 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F1-1-1-10 bis F1-3-12-10) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-10 bis F1-3-12-10 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F2-1-1-7 bis F2-3-12-7) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-7 bis F2-3-12-7 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F3-1-1-4 bis F3-3-12-4) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-4 bis F2-3-12-4 Agars sind für 1 d gewachsen.
15 36 (F0-1-1-15 bis F0-3-12-15) 36 (F0-1-1-13 bis F0-3-12-13, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F0 auf F0-1-1-13 bis F0-3-12-13 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F1-1-1-12 bis F1-3-12-12) 36 (F1-1-1-10 bis F1-3-12-10, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-10 bis F1-3-12-10 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F2-1-1-9 bis F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-7 bis F2-3-12-7, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-7 bis F2-3-12-7 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-6 bis F3-3-12-6) 36 (F3-1-1-4 bis F3-3-12-4, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-4 bis F3-3-12-4 Agars sind für 2d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F0-1-1-14 bis F0-3-12-14) Die Nachkommennematoden von F0 auf F0-1-1-14 bis F0-3-12-14 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F1-1-1-11 bis F1-3-12-11) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-11 bis F1-3-12-11 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F2-1-1-8 bis F2-3-12-8) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-8 bis F2-3-12-8 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F3-1-1-5 bis F3-3-12-5) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-5 bis F2-3-12-5 Agars sind für 1 d gewachsen.
16 36 (F0-1-1-15 bis F0-3-12-15, über) 36 (F0-1-1-14 bis F0-3-12-14, nach Zählung gelöscht) Die Lebensdauer des wilden Typs C. elegans wird als 15 Tage bezeichnet. Daher hätte F0 alle vor Tag 16 seit der Exposition sterben müssen.
36 (F1-1-1-13 bis F1-3-12-13) 36 (F1-1-1-11 bis F1-3-12-11, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F0 auf F0-1-1-14 bis F0-3-12-14 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F2-1-1-10 bis F2-3-12-10) 36 (F2-1-1-8 bis F2-3-12-8, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-11 bis F1-3-12-11 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-7 bis F3-3-12-7) 36 (F3-1-1-5 bis F3-3-12-5, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-8 bis F2-3-12-8 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F0-1-1-15 bis F0-3-12-15) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-5 bis F3-3-12-5 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F1-1-1-12 bis F1-3-12-12) Die Gesamtnematodenzahl in F4-1-1-1 bis F4-3-12-1, F3-1-1-4 bis F3-3-12-4 Agars und F3-1-1-5 bis F3-3-12-5 werden verwendet, um die ursprüngliche Reproduktion von F3 zu berechnen.
36 (F2-1-1-9 bis F2-3-12-9) Die Nachkommen nematoden von F0 auf F0-1-1-15 bis F0-3-12-15 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F3-1-1-6 bis F3-3-12-6) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-12 bis F1-3-12-12 Agars sind für 1 d gewachsen.
Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-9 bis F2-3-12-9 Agars sind für 1 d gewachsen.
Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-6 bis F2-3-12-6 Agars sind für 1 d gewachsen.
17 36 (F1-1-1-14 bis F1-3-12-14) 36 (F0-1-1-15 bis F0-3-12-15, nach Zählung gelöscht, über) Die Nachkommennematoden von F0 auf F0-1-1-15 bis F0-3-12-15 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden. Es wird keine F0-Nachkommen mehr geben.
36 (F2-1-1-11 bis F2-3-12-11) 36 (F1-1-1-12 bis F1-3-12-12, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-12 bis F1-3-12-12 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-8 bis F3-3-12-8) 36 (F2-1-1-9 bis F2-3-12-9, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-9 bis F2-3-12-9 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-6 bis F3-3-12-6, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-6 bis F3-3-12-6 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F1-1-1-13 bis F1-3-12-13) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-13 bis F1-3-12-13 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F2-1-1-10 bis F2-3-12-10) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-10 bis F2-3-12-10 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F3-1-1-7 bis F3-3-12-7) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-7 bis F2-3-12-7 Agars sind für 1 d gewachsen.
18 36 (F1-1-1-15 bis F1-3-12-15) 36 (F1-1-1-13 bis F1-3-12-13, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-13 bis F1-3-12-13 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F2-1-1-12 bis F2-3-12-12) 36 (F2-1-1-10 bis F2-3-12-10, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-10 bis F2-3-12-10 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-9 bis F3-3-12-9) 36 (F3-1-1-7 bis F3-3-12-7, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-7 bis F3-3-12-7 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F1-1-1-14 bis F1-3-12-14) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-14 bis F1-3-12-14 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F2-1-1-11 bis F2-3-12-11) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-11 bis F2-3-12-11 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F3-1-1-8 bis F3-3-12-8) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-8 bis F2-3-12-8 Agars sind für 1 d gewachsen.
In MGR-Studien wird T2' heute damit beginnen, T3' zu reproduzieren. Die Lebensdauer des wilden Typs C. elegans wird als 15 Tage bezeichnet. Dann wird das Ende der Lebensdauer von T3 auf D33 sein.
19 36 (F1-1-1-15 bis F1-3-12-15, über) 36 (F1-1-1-14 bis F1-3-12-14, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-14 bis F1-3-12-14 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F2-1-1-13 bis F2-3-12-13) 36 (F2-1-1-11 bis F2-3-12-11, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-11 bis F2-3-12-11 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-10 bis F3-3-12-10) 36 (F3-1-1-8 bis F3-3-12-8, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-8 bis F3-3-12-8 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F1-1-1-15 bis F1-3-12-15) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-15 bis F1-3-12-15 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F2-1-1-12 bis F2-3-12-12) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-12 bis F2-3-12-12 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F3-1-1-9 bis F3-3-12-9) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-9 bis F2-3-12-9 Agars sind für 1 d gewachsen.
20 36 (F2-1-1-14 bis F2-3-12-14) 36 (F1-1-1-15 bis F1-3-12-15, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F1 auf F1-1-1-14 bis F1-3-12-14 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden. Es wird keinen F1-Nachwuchs mehr gibt.
36 (F3-1-1-11 bis F3-3-12-11) 36 (F2-1-1-12 bis F2-3-12-12, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-12 bis F2-3-12-12 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-9 bis F3-3-12-9, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-9 bis F3-3-12-9 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F2-1-1-13 bis F2-3-12-13) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-13 bis F2-3-12-13 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F3-1-1-10 bis F3-3-12-10) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-10 bis F2-3-12-10 Agars sind für 1 d gewachsen.
21 36 (F2-1-1-15 bis F2-3-12-15) 36 (F2-1-1-13 bis F2-3-12-13, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-13 bis F2-3-12-13 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-12 bis F3-3-12-12) 36 (F3-1-1-10 bis F3-3-12-10, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-10 bis F3-3-12-10 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F2-1-1-14 bis F2-3-12-14) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-14 bis F2-3-12-14 Agars sind für 1 d gewachsen.
36 (F3-1-1-11 bis F3-3-12-11) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-11 bis F2-3-12-11 Agars sind für 1 d gewachsen.
22 36 (F2-1-1-15 bis F2-3-12-15, über) 36 (F2-1-1-14 bis F2-3-12-14, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-14 bis F2-3-12-14 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-13 bis F3-3-12-13) 36 (F3-1-1-11 bis F3-3-12-11, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-11 bis F3-3-12-11 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-12 bis F3-3-12-12) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-12 bis F2-3-12-12 Agars sind für 1 d gewachsen.
23 36 (F3-1-1-14 bis F3-3-12-14) 36 (F2-1-1-15 bis F2-3-12-15, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F2 auf F2-1-1-15 bis F2-3-12-15 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden. Es wird keinen F2-Nachwuchs mehr geben.
36 (F3-1-1-12 bis F3-3-12-12, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-12 bis F3-3-12-12 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-13 bis F3-3-12-13) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-13 bis F2-3-12-13 Agars sind für 1 d gewachsen.
24 36 (F3-1-1-15 bis F3-3-12-15) 36 (F3-1-1-13 bis F3-3-12-13, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-13 bis F3-3-12-13 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-14 bis F3-3-12-14) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-14 bis F2-3-12-14 Agars sind für 1 d gewachsen.
25 36 (F3-1-1-15 bis F3-3-12-15, über) 36 (F3-1-1-14 bis F3-3-12-14, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-14 bis F3-3-12-14 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
36 (F3-1-1-15 bis F3-3-12-15) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-15 bis F2-3-12-15 Agars sind für 1 d gewachsen.
26 36 (F3-1-1-15 bis F3-3-12-15, nach Zählung gelöscht) Die Nachkommennematoden von F3 auf F3-1-1-15 bis F3-3-12-15 Agars sind für 2 d gewachsen, und Agars werden gelöscht, nachdem die Nematoden gezählt wurden.
In MGR-Studien würden die ersten nicht exponierten Nachkommen von F3 (d. h. T3') auf D18 geboren. Die Lebensdauer des wilden Typs C. elegans wird als 15 Tage bezeichnet. Dann wird das Ende der Lebensdauer von T3 auf D33 sein.
Sowohl MGE- als auch MGR-Studien werden mehr Tage abdecken, an denen die Nematodenlebensdauer länger ist.

Tabelle 1: Liste der Marker und deren Definitionen.

  1. Messung der Reproduktion und Lebensdauer in MGE-Effektstudien.
    1. Wiederholen Sie auf D0 Schritt 5.6. Markieren Sie die Agars (3 Gruppen mit jeweils 10 Replikationen) als Fx-a-b-c, wobei x auf die Erzeugungsnummer verweist, a bezieht sich auf die Gruppennummer (1 für die Kontrolle, 2 für die niedrige Konzentration und 3 für die hohe Konzentration ); b bezieht sich auf die Replikation von 1 bis 10; und c bezieht sich auf die Belichtungsdauer (0 gibt den Start an). Für D0 markiert die Agars als F0-1-1-0 bis F0-3-10-0. Ausführliche Informationen finden Sie in Tabelle 1.
    2. Überprüfen Sie auf D1 das Nematodenwachstum auf den Agarn, und ändern Sie die Markierungen von F0-1-1-0 auf F0-3-10-0 auf F0-1-1-1 auf F0-3-10-1.
    3. Überprüfen Sie auf D2 das Nematodenwachstum auf den Agarn, und ändern Sie die Markierungen F0-1-1-2 in F0-3-10-2.
    4. Wählen Sie auf D3 24 F0-Nematoden aus jeder Gruppe auf 12 neue NGM-Agars mit zwei NGM-Agarn ab Schritt 5.4. Markieren Sie die Agars als F0-1-1-3 bis F0-3-12-3.
    5. Übertragen Sie auf D4 die beiden Mutternematoden von F0-1-1-3 auf F0-3-12-3, indem Sie sich auf neue NGM-Agars ab Schritt 5.4 begeben. Markieren Sie die neuen NGM-Agars als F0-1-1-4 bis F0-3-12-4. Ändern Sie die Marker von F0-1-1-3 in F0-3-12-3 in F1-1-1-1 zu F1-3-12-1, um die Nachkommen von F0 (d. h. F1) innerhalb des ersten Tages seit F0 zu reproduzieren.
    6. Verwenden Sie auf D5 ein Sezieren von Mikroskop, um die Nematoden auf F1-1-1-1 bis F1-3-12-1 Agars zu zählen, wo die Nematoden 2 Tage gewachsen sind. Lassen Sie F1-1-1-1 bis F1-3-12-1 Agars F2 für nachfolgende Generationen reproduzieren.
    7. Übertragen Sie die beiden Mutternematoden von F0-1-1-4 auf F0-3-12-4 Agars, indem Sie auf neue NGM-Agars ab Schritt 5.4 pflücken. Mark NGM Agars als F0-1-1-5 bis F0-3-12-5. Ändern Sie die Markierungen von F0-1-1-4 in F0-3-12-4 in F1-1-1-2 zu F1-3-12-2, um die Nachkommen von F0 (d. h. F1) innerhalb des zweiten Tages zu repräsentieren, da F0 mit der Reproduktion beginnt.
    8. Zählen Sie auf D6 die Nematoden auf F1-1-1-2 bis F1-3-12-2 Agars. Übertragen Sie die Elternnematoden von F0-1-1-5 auf F0-3-12-5 Agars auf F0-1-1-6 auf F0-3-12-6. Ändern Sie die Marker von F0-1-1-5 in F0-3-12-5 in F1-1-1-3 zu F1-3-12-3, um die Nachkommen von F0 (d. h. F1) innerhalb des dritten Tages darzustellen, seit F0 mit der Reproduktion beginnt.
    9. Die Nematoden auf F1-1-1-1 bis F1-3-12-1 Agars sind seit 3 Tagen gewachsen. Verwenden Sie sie, um F2 in nachfolgenden MGE-Effektstudien zu reproduzieren. Verwenden Sie auf die gleiche Weise F2-Nematoden, um F3 zu reproduzieren, um die MGE-Effektstudien fortzusetzen.
    10. Auf die gleiche Weise übertragen Sie die beiden Elternnematoden täglich und zählen Sie die Nachkommen nematoden am nächsten Tag, bis die Elternnematoden in 6 NGM-Agarn (d.h. die Hälfte der gesamten Agars in jeder Gruppe) die Fortpflanzung stoppen.
    11. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Nachkommen über die gesamte Fortpflanzungsdauer als Gesamtbrutgröße. Verwenden Sie die Anzahl der Nachkommen innerhalb der ersten 3 Tage, um die ursprüngliche Reproduktion der Eltern darzustellen.
    12. Verwenden Sie den Tag, an dem die Reproduktion der Elternnematoden in 6 NGM-Agarn endet, um die Reproduktionsdauer zu schätzen. Verwenden Sie die Tage, die jeder einzelne Elternteil überlebt hat, als seine Lebensdauer.
    13. Erhalten Sie die anfängliche Reproduktion, Reproduktionsdauer, Gesamtbrutgröße und Lebensdauer von F1 auf die gleiche Weise wie für F0. Ebenso können durch die Wiederholung des vorgenannten Verfahrens Reproduktions- und Lebensdauerinformationen von F2 (bis Fn) erhalten werden.
  2. Messung der Reproduktion und Lebensdauer in MGR-Effektstudien.
    1. Führen Sie Schritt 7.2.4 mit den NGM-Agarn von Schritt 5.4 aus, der von Schritt 2.13 geändert wurde.
  3. Messen Sie biochemische Indizes.
    1. Spülen Sie die Nematoden von den NGM-Agarn mit sterilem Wasser und sammeln Sie sie in Zentrifugenröhrchen. Die Nematoden 30 min absetzen und die Überräube entsorgen. Verwenden Sie die Nematoden in den Pellets für die Effektmessung.
    2. 1 ml eiskalte Phosphatgepufferte Salzsäure (PBS, pH 7,0) in die Nematoden (Pellets) in den 1,5 ml Zentrifugenrohren geben, um die Nematoden zu waschen.
    3. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 5 min bei 4 °C, und entsorgen Sie die Überräube sorgfältig mit einer Pipette.
    4. Die Pellets mit flüssigem Stickstoff oder in einem Gefrierschrank von -80 °C einfrieren.
    5. Homogenisieren Sie die Pellets mit Stößen in einem Eisbad. Waschen Sie die Restflüssigkeiten auf dem Stößel vor dem Herausnehmen des Stößels mit 200 l eiskaltem PBS in das Zentrifugenrohr.
    6. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 5 min bei 4 °C wieder, und verwenden Sie die Überwältmittel, um die Aktivitäten oder Mengen von Biochemikalien mit den kommerziellen Kits zu bestimmen (siehe Tabelle der Materialien für Details).
    7. Messen Sie die Mengen des gesamten Proteins (TP) in Proben und verwenden Sie die Ergebnisse als Nenner bei der Darstellung anderer biochemischer Indikatoren, so dass die Differenz zwischen den Nematodenzahlen zwischen den Proben beseitigt werden kann.
  4. Messen Sie die Genexpression.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 7.4.1 bis 7.4.4. Isolieren Sie die gesamte RNA aus den Nematodenproben mit einem kommerziellen RNA-Extraktionskit (Details finden Sie in der Materialtabelle) gemäß herstelleranweisungen21.
    2. Verwenden Sie die RNA, um cDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu synthetisieren21.
    3. Analysieren Sie die cDNA-Probe in der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) mit SYBR Green RT-PCR-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien)21.
    4. Quantifizieren Sie die relativen Expressionsniveaus der ausgewählten Gene nach der 2-CT-Methode22, und behandeln Sie die Expressionsniveaus von gdp-2 (oder einem anderen Referenzgen) als negativen Bezug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier beschreiben wir Protokolle zur Untersuchung der Wirkung von Chemikalien über Generationen hinweg mit C. elegans in transgenerationalen (TG), Mehrgenerationenexpositionen (MGE) und Mehrgenerationen-Resteffektstudien (MGR). Als Beispiele werden unsere eigenen Forschungsergebnisse vorgestellt. Eine Studie präsentiert die TG-Effekte von Schwermetallen auf das Bewegungsverhalten3. Die beiden anderen Studien zeigen MGE- und MGR-Wirkungen von Sulfomethoxazol und Lindan auf die Reproduktions- und biochemischen und genetischen Indizes Messungen4,14.

TG-Effekte von Schwermetallen auf das Fortbewegungsverhalten von C. elegans

Die TG-Effekte von Cadmium (Cd), Kupfer (Cu), Blei (Pb) und Zink (Zn) auf die Körperbiegefrequenz (BBF) wurden im Nematodenelternteil (F0) nach mütterlicher Exposition und deren Nachkommen (T1)3untersucht. Die Auswirkungen von Metallen auf BBF zeigten, dass die Hemmungen in T1 größer waren als bei F0, was eine stärkere Toxizität von Schwermetallen auf das Fortbewegungsverhalten bei den embryoexponierten Nachkommen zeigte als bei den direkt exponierten Eltern. Die TG-Effekte von Schwermetallen bei umweltverträglichen Konzentrationen zeigten, dass die Exposition von Müttern die Gefahren der Schwermetallverschmutzung in nachfolgenden Generationen vervielfachen kann. Siehe Abbildung 1.

Figure 1
Abbildung 1 : Die Auswirkungen von Cadmium (Cd), Kupfer (Cu), Blei (Pb) und Zink (Zn) auf die Körperbiegefrequenz des Nematodenelternteils (F0, leer) nach pränataler Exposition und deren Nachkommen (T1, schattiert). Fehlerleiste = Standardfehler; * = deutlich anders als das Steuerelement, p < 0,05; • = deutlich anders als die niedrigere Konzentration, p < 0,05; + impliziert deutlich andere Effekte in F1 als in F0, p < 0,05. Diese Zahl wurde von Yu et al.3 mit Genehmigung geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

MGR-Effekte von Sulfamethoxazol (SMX) auf die Nematodenlebensdauer und Fortpflanzung

Die MGR-Effekte von Sulfamethoxazol (SMX) auf die Nematodenlebensdauer und Fortpflanzung14 wurden an dem getoten Elternteil (F0), embryoexponierten Nachkommen (T1), keimlinenexponierten Nachkommen (T2), den ersten nicht exponierten Nachkommen (T3) und den drei nachfolgenden Generationen (T4-T6). Die Ergebnisse zeigten, dass die Fortpflanzung (eine Gesamtbrutgröße von 49 % der Kontrolle) bei der Keimbahnexposition (T2) signifikant beeinträchtigt wurde und die Toxizitäten in nicht exponierten Generationen von T3 bis T6-Generationen fortbestehen (Abbildung 2). Unsere Ergebnisse weckten neue Bedenken hinsichtlich der langfristigen Einflüsse von Antibiotika selbst neben ihren Auswirkungen auf die Antibiotikaresistenz.

Figure 2
Abbildung 2 : Brutgröße (in (A), ausgedrückt in Kontrollprozentsatz) und Erstreproduktion (in (B)) C. Elegane im exponierten Elternteil und seinen Nachkommen (F0, T1 bis T6, von links nach rechts bei jeder Konzentration). Fehlerleiste = Standardfehler; a = deutlich anders als die Steuerung durch ANOVA (p < 0,05); b = deutlich anders als die Kontrolle und von der früheren Erzeugung bei gleicher Konzentration (p < 0,05); c = deutlich anders als die Kontrolle und von der niedrigeren Konzentration in der gleichen Generation (p < 0,05); d = deutlich anders als die Kontrolle und von der früheren Generation bei gleicher Konzentration und niedrigerer Konzentration in derselben Generation (p < 0,05); e = deutlich anders als die frühere Generation bei gleicher Konzentration und niedrigerer Konzentration in derselben Generation (p < 0,05); f = deutlich anders als die frühere Generation bei gleicher Konzentration (p < 0,05). Diese Zahl wurde von Yu et al.14 mit Genehmigung geändert.

MGE- und MGR-Effekte von Lindan auf die biochemischen und genetischen Nematodenindizes

Die MGE- und MGR-Effekte von Lindan (ein persistenter organischer Schadstoff [POP]) wurden auf wichtige Biochemikalien im Fettstoffwechsel und genetische Expressionsänderungen im zugehörigen Insulin-ähnlichen Weg4untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass Lindan obessogene Wirkungen mit Störungen in der Insulinsignalregulation zeigte (Abbildung 3). Darüber hinaus deuteten die Änderungen zwischen sgk-1 (F0, F3, T1' und T3') und akt-1 (T1 und T3) Signalisierung darauf hin, dass Nematoden aus verschiedenen Expositionsgenerationen unterschiedliche Reaktionsstrategien für Toleranz und Vermeidung aufwiesen.

Figure 3
Abbildung 3 : Veränderungen der Expressionsniveaus von Schlüsselgenen im Insulin-ähnlichen Signalweg in Nematoden mit unterschiedlichen Expositionserfahrungen. • positive Regulierung; symbol : negative Regulierung; •: Ausdrucks-Up-Regulierung; •: Ausdruck Down-Regulierung. Diese Zahl wurde von Chen um4 mit Genehmigung geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Um das beschriebene Protokoll erfolgreich durchführen zu können, sollten die folgenden Vorschläge berücksichtigt werden. Führen Sie die gesamten experimentellen Operationen in einer sterilen Umgebung durch. Unsachgemäße Bedienung kann zu einer Kontamination der E. coli-Stämme führen, z. B. Pilze und Milben können das normale Wachstum von C. elegans behindern und somit die experimentellen Ergebnisse beeinflussen. Beobachten Sie im Abschnitt, der die Kultivierung von C. elegans beschreibt, die Wachstumsskala von C. elegans auf den NGM-Agars mit bloßen Augen oder Mikroskopen. Wenn die Skala von C. elegans auf dem Agar über75% in der Fläche übersteigt, oder die Kulturzeit eine Woche überschreitet, führen Sie eine neue Impfrunde durch, um über das Wachstum oder den Bevölkerungsrückgang von C. eleganszu vermeiden. Vor dem Prozess der Synchronisation, verwenden Sie ein Mikroskop, um das Wachstum von C. eleganszu beobachten, und setzen Sie den Prozess fort, wenn Nematodeneier weit auf dem Agar verteilt sind. Wenn Lösungsmittel (z. B. Dimethylsulfoxid [DMSO]) verwendet werden, sollten ihre Konzentrationen in den Stammlösungen außerdem unter 1 % liegen, um sicherzustellen, dass ihre Endkonzentrationen 0,5 % (v/v) nicht überschreiten, um die nachteiligen Auswirkungen der Lösungsmittel selbst zu vermeiden. In TG-Effektstudien ist die Dauer der Exposition über 24 h erforderlich, um sicherzustellen, dass die Expositionszeit die Embryobildung der nächsten Generation abdeckt, und die Dauer sollte innerhalb von 96 h liegen, um die spätere Erzeugungstrennung zu erleichtern. Verwenden Sie kleine Mengen von Nematoden (in der Regel innerhalb von 20) für die Messung der Lebensdauer und Reproduktion. Auf der anderen Seite verwenden Sie große Mengen von Nematoden (in der Regel mehr als 500) für die Messung biochemischer und genetischer Regulierungsindizes. Um eine ausreichende Anzahl von Proben zu gewährleisten, führen Sie daher Vorversuche durch, um grob abzuschätzen, wie viele Nachkommen sich die reifen F0-Nematoden innerhalb der ersten 24 h seit Beginn der Fortpflanzung fortpflanzen können. Bestimmen Sie dann die Anzahl der F0-Nematoden, die erforderlich sind, um sicherzustellen, dass es mindestens 200 Nachkommen für die folgenden Mehrgenerationenstudien gibt.

Im Vergleich zu früheren Berichten über TG-Studien mit C. eleganswar das vorliegende experimentelle Protokoll der Wahl des Lebensstadiums eher zu berücksichtigen. In C. eleganswerden Spermien im L4-Stadium gebildet, um die später gebildeten Eizellen zu befruchten23. Dementsprechend wird die Exposition, die die Spermiogenese und Dieoozytogenese periode abdeckt, ein besonderes Fenster bieten, um die TG-Effekte auf die Nachkommen zu untersuchen. Die alterssynchronisierten Eier werden für Mehrgenerationen-Effektstudien verwendet, um sicherzustellen, dass die Exposition den gesamten Zeitraum vom Beginn jedes Lebenszyklus abdeckt. Im Vergleich zu früheren Mehrgenerationenstudien erleichterte das vorliegende Experimentelle Protokoll die Messung von Effekten über mehrere Generationen statt nur 1-2 Generationen. Darüber hinaus berücksichtigte das vorliegende Protokoll sowohl MGE- als auch MGR-Effekte, was systematischer ist als frühere Studien, in denen nur MGE- oder MGR-Effekte gemessen wurden.

Insbesondere gibt es noch einige Fragen, die im vorliegenden Versuchsprotokoll behandelt werden müssen. Das vorliegende Protokoll verwendet Wildtyp C. elegans, deren Erzeugungszeit etwa 60 h und die Lebensdauer 20 Tage beträgt. Dies macht die Gesamtdauer des Experiments ziemlich lang (z.B. mGE-Effekte Studie über Lebensdauer über 3 Generationen dauert mindestens 30 Tage). Um die Zeit zu verkürzen, können Forscher mutierte C. elegane wählen, wie die kurzlebigen mutierten Nematoden. Ein weiteres Problem ist die Tötungsbehandlung der Bakterien, deren Lebender Status notwendig ist, um Nematoden gesund zu halten 24. Auch der UV-Tötungsprozess könnte Veränderungen in den Chemikalien25einführen. Daher sollten andere Behandlungen an den Bakterien in Betracht gezogen werden, und eine sorgfältige Überwachung der chemischen Veränderungen während des Herstellungs- oder Expositionsprozesses kann notwendig sein, insbesondere bei instabilen Verbindungen. Gleichzeitig gibt es Einschränkungen bei der Untersuchung der Geschlechtsunterschiede in toxischen Wirkungen, weil die meisten der Tatsache, dass C. elegans ist Hermaphrodit. Weitere Verbesserungen zur Untersuchung des Geschlechtsbeitrags in den TG-, MGE- oder MGR-Effekten sind erforderlich. Zusammenfassend gehen wir davon aus, dass das vorgeschlagene Protokoll eine große Bedeutung für die Verwendung von C. elegans zur Untersuchung der Auswirkungen von Toxizitäten auf TG, MGE und MGR haben wird.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch das National Science and Technology Major Project for Water Pollution Control and Treatment (2017ZX07201004) und das International Science & Technology Cooperation Program of China (Nr. 2016YFE0123700).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar?Corning?America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
  2. Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
  3. Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
  4. Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
  5. Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
  6. Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
  7. Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
  8. Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
  9. Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
  10. Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
  11. Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
  12. Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
  13. Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
  14. Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
  15. Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
  16. Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
  17. Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
  20. Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
  21. Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
  22. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  23. Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
  24. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
  25. Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).

Tags

Umweltwissenschaften Ausgabe 149 Generationswechseleffekt Mehrgenerationen-Expositionseffekt Mehrgenerationen-Resteffekt Experimentierprotokoll caenorhabditis elegans persistenter Schadstoff
Verwendung von <em>Caenorhabditis elegans </em>zur Untersuchung der trans- und mehrgenerationenlichen Wirkungen von Toxischen Stoffen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z.,… More

Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter