Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Brug af Caenorhabditis elegans til at studere Trans-og multi generations effekter af giftstoffer

Published: July 29, 2019 doi: 10.3791/59367
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2, 1,2
1College of Environmental Sciences and Engineering, Tongji University, 2Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security, 3Jiaxing Tongji Institute of Environment, 4College of Ecological Technique and Engineering, Shanghai Institute of Technology

Summary

Trans-og multi generations effekter af persistente kemikalier er afgørende for at bedømme deres langsigtede konsekvenser i miljøet og på menneskers sundhed. Vi leverer nye detaljerede metoder til at studere Trans-og multi generations effekter ved hjælp af Free-Living fyrretræsnematoden Caenorhabditis elegans.

Abstract

Oplysninger om toksiciteter af kemikalier er afgørende for deres anvendelse og affaldshåndtering. For kemikalier med lave koncentrationer er de langsigtede virkninger meget vigtige for at bedømme deres konsekvenser i miljøet og på menneskers sundhed. Ved at demonstrere langsigtede påvirkninger giver virkningerne af kemikalier i generationer i nylige undersøgelser ny indsigt. Her beskriver vi protokoller for at studere virkningerne af kemikalier over flere generationer ved hjælp af gratis-levende fyrretræsnematoden Caenorhabditis elegans. To aspekter er præsenteret: (1) Trans generations-(TG) og (2) multi generations Effektstudier, hvoraf sidstnævnte er adskilt fra multi generations eksponering (MGE) og multi generations rest (MGR)-effektundersøgelser. TG-effekt studiet er robust med et simpelt formål for at afgøre, om kemisk eksponering for forældre kan resultere i eventuelle resterende konsekvenser for afkom. Eftervirkningerne måles på forældrene, natrium natriumhypochlorit opløsninger bruges til at dræbe forældrene og holde afkommet for at lette effekten måling på afkommet. TG-effekt studiet anvendes til at afgøre, om afkommet påvirkes, når deres forælder udsættes for de forurenende stoffer. MGE-og mgr-effekt studiet er systematiske, der anvendes til at afgøre, om kontinuerlig generations eksponering kan resultere i adaptiv respons hos afkom i generationer. Omhyggelig afhentning og overførsel bruges til at skelne mellem generationer for at lette effektmålingen på hver generation. Vi kombinerede også protokoller til at måle bevægelsesadfærd, reproduktion, levetid, biokemiske og genekspression ændringer. Nogle eksempler på eksperimenter er også præsenteret for at illustrere de Trans-og multi generations effektundersøgelser.

Introduction

Anvendelsen og affaldshåndteringen af kemikalier afhænger i høj grad af oplysningerne om deres virkninger i visse koncentrationer. Især er tiden et andet væsentligt element mellem virkninger og koncentrationer. Det vil sige, kemikalier, især dem ved lave koncentrationer i de faktiske miljøer, har brug for tid til at fremprovokere målbare effekter1. Derfor, forskere arrangere forskellige længder af eksponeringen varighed i dyreforsøg, og endda dække hele livscyklus. For eksempel blev mus udsat for nikotin i 30, 90 eller 180 dage for at studere dens toksiske virkninger 2. Men sådanne eksponeringsvarigheder er stadig ikke nok til at belyse de langsigtede virkninger af forurenende stoffer (f. eks. persistente organiske miljøgifte [pop]), der kan vare generationer af organismer i miljøet. Derfor er undersøgelser af virkninger over generationer vinder mere og mere opmærksomhed.

Der er to hovedaspekter i undersøgelser af generations effekten. Den første er den Trans generations-(TG) effektundersøgelse, som kan robust teste, om kemisk eksponering for forældre kan resultere i nogen konsekvenser for afkommet3. Den anden er en multi generations effektundersøgelse, som er mere systematisk med overvejelser i både eksponering og restvirkninger. På den ene side anvendes multi generations eksponeringen (MGE) til at illustrere adaptiv respons hos dyrene til de langsigtede udfordrende miljøer. På den anden side anvendes de multi generations residualeffekter (MGR) til at påvise de langsigtede restvirkninger efter eksponering, da maternel eksponering ledsages af embryo eksponering for første afkom og Kim-line-eksponering til den anden afkom, der gør den tredje afkom som den første generation helt ud af eksponering4.

Selv om pattedyr (f. eks. mus) er modelorganismer i toksicitetsstudier, især i relation til mennesker, er deres anvendelse i studiet af generations effekter ret tidskrævende, dyr og etisk omkring 5. Derfor giver organismer, herunder krebsdyr Daphnia magna6, insekt Drosophila melanogaster7 og Zebra Danio rerio8, alternative valgmuligheder. Men disse organismer mangler enten ligheder med mennesker, eller kræver specifikt udstyr i undersøgelser.

Caenorhabditis elegans er en lille fri-levende fyrretræsnematoden (ca. 1 mm i længden) med en kort livscyklus (ca. 84 h ved 20 °c)9. Denne fyrretræsnematoden deler mange biologiske veje konservative til mennesker, og derfor er det blevet bredt anvendt til at illustrere virkningerne af forskellige belastninger eller giftstoffer10. Især 99,5% af Nematoderne er er gør disse organismer yderst velegnede til at studere generationer effekter, f. eks, TG effekter af tungmetaller og sulfonamider3,11, MGE effekter af guld nanopartikler og tunge metaller12 og temperatur13, mgr effekter af sulfonamid14, og både MGE og mgr effekter af gammabestråling15 og lindan4. Der blev desuden fundet sammenlignelige resultater mellem virkningerne af kemikalier (f. eks. zearalenon) på udvikling og reproduktion af mus og C. elegans16,17, hvilket ville give en fordel at ekstrapolere virkninger fra dette lille dyr til mennesker.

Både TG og MG effektundersøgelser er tidskrævende og har brug for omhyggelig design og ydeevne. Navnlig fandtes forskelle i valg af livstrin, eksponeringsbetingelser og metoder til adskillelse af generationer i ovennævnte undersøgelser. Sådanne forskelle hindrede den direkte sammenligning mellem resultaterne og hæmmede en yderligere fortolkning af resultaterne. Derfor er det bydende nødvendigt at etablere ensartede protokoller til at vejlede TG og MG virkninger undersøgelser, og også at give et større billede til at afsløre lignende mønstre af forskellige giftstoffer eller forurenende stof i langsigtede konsekvenser. Over målet med de nuværende protokoller vil demonstrere klare driftsprocesser i at studere Trans-og multi generations effekter med C. elegans. Protokollerne vil gavne forskere, der er interesseret i at studere de langsigtede virkninger af giftstoffer eller forurenende stoffers vedkommende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kultur E. coli OP50

  1. Forbered 1 M natriumhydroxidopløsning ved at opløse 4 g natriumhydroxid i 100 mL vand.
  2. Forbered lysogeny bouillon (lb) medium ved at opløse 10 g tryptone, 5 g gærekstrakt og 10 g natriumchlorid med 1 l ultrarent vand i en 1 l konisk kolbe. PH-værdien justeres til 7,0 med 1 M natriumhydroxidopløsning.
  3. Aliquot LB flydende medium fra trin 1.2 til 20 koniske kolber (maksimalt tilladt volumen: 100 mL) med 50 mL medium i hver. Dæk de koniske kolber med kraftpapir.
  4. LB-væskemediet steriliseres ved 121 °C og 0,105 MPa i 20 min. afkøle LB-mediet ned til stuetemperatur.
  5. Pipetten 200 μl fra de bakterielle suspensioner (Se trin 1,8) eller Vælg en lille koloni fra agarer (i trin 2,14) ved hjælp af en inokulerende løkke, Placer den i lb-medium.
  6. LB-mediet inkubates med omrystning ved 150 rpm ved 37 °C i 24-48 h. LB-mediet skifter fra en brun gennemsigtig væske til en uklar khaki-farvet suspension.
  7. Brug de bakterielle suspensioner fra 80% af de samlede kolber til at levere E. coli OP50 som fyrretræsnematoden fødevarer, der skal anvendes i trin 2,11.
  8. Resten af kolberne, der indeholder bakterielle suspensioner, opbevares i køleskab ved 4 °C. Afpipettér 200 μL af LB-suspensionerne på den øvre side af det friske LB-medium (trin 1,4), og Gentag trin 1.6 for efterfølgende inkubation.

2. kultur C. elegans

Bemærk: kultur C. elegans anvender pr. trin 2,1 til 2,11 baseret på standardmetoder18.

  1. 22,8 g K2HPO4• 3h2O opløses i 100 ml sterilt destilleret vand.
  2. 6,8 g KH2po4 opløses i 50 ml sterilt destilleret vand.
  3. Bland opløsninger fra trin 2,1 og 2,2 for at tilberede 1 M K2HPO4-KH2po4 buffer (pH 6,0, 150 ml i alt).
  4. Forbered 1,0 M MgSO4 ved opløsning af 1,232 g mgso4• 7h2O i 5 ml sterilt destilleret vand, og Steriliser den ved at filtrere opløsningen gennem et 0,22 μm sterilt engangs membranfilter i en steril beholder.
  5. Forbered 1 M CaCl2 ved at opløse 0,554 g CaCl2 i 5 ml sterilt destilleret vand, og sterilisere det ved at filtrere løsningerne gennem et 0,22 μm sterilt engangs membranfilter i en steril beholder.
  6. Forbered 1 M kolesterol opløsning ved at opløse 0,025 g kolesterol i 5 mL absolut ethanol, og sterilisere det ved at filtrere opløsningen gennem et 0,22 μm sterilt engangs membranfilter i en steril beholder.
  7. Der forberedes fyrretræsnematoden vækstmedium (NGM) agar ved tilsætning af 17 g agar pulver, 2,5 g pepton og 3 g natriumchlorid til en 1 l konisk kolbe indeholdende 1 l ultrarent vand. Tilsæt 25 mL K2HPO4-KH2PO4 -opløsning fra trin 2,3.
  8. NGM agar steriliseres fra trin 2,7 ved 121 °C med 0,105 MPa i 20 min.
  9. Cool NGM agar til omkring 50 °C, tilsæt 1 mL 1 M MgSO4, 1 m CaCl2, og 5 mg/ml kolesterol-ethanol opløsning fra trin 2,4 til 2,6 i mediet og bland dem grundigt.
  10. Hæld ~ 10 mL NGM agar medium per skål i 100 sterile Petri skåle (6,0 cm diameter). Afkøl mediet i Petri skålene til stuetemperatur for at danne solid agar.
  11. Der afpipetteres 170 μL af de bakterielle suspensioner fra trin 1,7 til den førnævnte NGM-agar med en steril spids. NGM-agar rystes en anelse for at fordele LB-mediet jævnt over NGM-agar-overfladen.
  12. NGM agar inokuleres med den øverste side opad ved 37 °C i 8-12 h for at danne en bakteriel græsplæne.
  13. Brug det meste af agar med bakterielle græsplæner fra trin 2,12 til kultur nematoder i trin 2,15 eller 2,19.
  14. Opbevar 1 eller 2 agarer op-side ned for at undgå fordampning af vand og kontaminering i køleskabe ved 4 °c, så bakterierne i kontamineringen opretholder.
  15. Når der er mindre end 2.000 nematoder på strømpe NGM agarer (fra tidligere eksperimenter eller begavet fra andre laboratorier), skæres en sjettedel af NGM agar, der indeholder C. elegans med en steril spids og overføre den til nyforberedte NGM agarer med bakteriel græsplænen (fra trin 2,13). Hold NGM agarer op-side ned i en 22 °c inkubator for den efterfølgende kultur.
  16. Når der er mere end 2.000 nematoder på strømpe NGM agar, skylles nematoder af NGM agar med 2 mL sterilt vand i centrifugeglas. Tilførslen af 2 mL vand vil resultere i en ca. 1,5 mL udgang.
  17. Lad Nematoderne bosætte sig i centrifuge rørene fra 30 min. 1 mL af Supernatanterne kasseres ved pipettering, og der tilsættes 1 mL sterilt vand i hvert rør for at vaske pillerne (dvs. nematoder).
  18. Udsæt Nematoderne i centrifuge rørene i 30 min. kassér 1 mL af Supernatanterne ved pipettering. Der tilsættes 1 mL sterilt vand i hvert rør for at resuspendere nematoder.
  19. Distribuer fyrretræsnematoden suspensionerne (ca. 1,5 ml i alt) ved pipettering 150 μl på hver ny NGM agar med bakteriel græsplæne (fra trin 2,13), hvilket gør 8-10 nye NGM agarer i alt.
  20. Hold NGM agarer fra Step 2,19 up-side op i en 20 °c inkubator natten over og derefter op-side ned for den efterfølgende kultur.
  21. Gentag trin 2,15 eller trin 2.16-2.20 hver tredje dag.

3. Forbered synkroniserede æg og L3 larver af C. elegans

  1. Gravid Nematoderne og nyproducerede æg fra NGM agarerne skylles ud i sterile centrifugerør med 2 mL sterilt vand på hver NGM-agar, hvilket resulterer i ca. 1,5 mL udgang.
  2. Afsæt Nematoderne i centrifuge rørene i 30 minutter, og kassér derefter 85% af Supernatanterne ved pipettering.
  3. Forbered natriumhypochlorit-opløsninger ved at opløse 0,6 g NaOH og 5 mL NaOCl (4-6% aktive gradienter, se tabellen over materialer for detaljer) med 25 ml vand for at bringe naoh til 0,5 M og naocl til 1%.
  4. Bland pellets fra trin 3,2 (Marker volumen som V0) med 7-fold V0 af natriumhypochlorit-opløsninger fra (trin 3,3, dvs. volumen forhold på 1:7)19.
  5. Ryst centrifuge rørene hver 2 min for 10-15 min til at lyse larverne og voksne nematoder; farven på fyrretræsnematoden suspensioner vil vende sig fra uklar til Clear.
  6. Rørene centrifugeres ved 700 x g i 3 minutter ved 20 °c, hvorefter Supernatanterne kasseres ved pipettering.
  7. Resuspendere pellets i 5-fold V0 af sterilt vand til at vaske de alders synkroniserede æg. Centrifugeres ved 700 x g i 3 minutter ved 20 °c, og derefter kasseres Supernatanterne.
  8. Gentag trin 3,7 to gange.
  9. Tilsæt 1-fold V0 af sterilt vand ind i rørene for at resuspendere de alders synkroniserede æg.
  10. Distribuer ægsuspensionerne ved at pipettere 50 μl på hver ny NGM-agarer med bakteriel græsplæne fra trin 2,13. Hold NGM agarer top-side op i en 20 °c inkubator i 30 min, så vandet kan fordampe eller blive adsorberet af den bakterielle græsplæne. Så gør NGM agarer op-side ned for den efterfølgende kultur. Marker tiden som ægtid (Tæg).
  11. Forbered K-medium ved at opløse 3 g NaCl og 2,36 g KCl i 1 L vand. Steriliser mediet ved 121 °C og 0,105 MPa i 20 min., og Afkøl det til stuetemperatur.
  12. Når tiden når 36 h efter TEgg, vil Nematoderne nå L3 larver Stage (L3 kartoffelcystenematoder)20. Nematoderne skylles ud af NGM agarerne i centrifugeglas med 2 mL sterilt vand på hver NGM-agar, hvilket resulterer i ca. 1,5 mL udgang.
  13. Efter en afregning i 30 min, erstatte 85% af supernatanter (ved pipettering) med K-medium fra 2 h at fordøje fødevarer i tarme3.
  14. Kassér Supernatanterne. Brug K-medium (fra trin 3,11) til at justere fyrretræsnematoden suspensionerne til omkring 200 nematoder pr. 100 μL til efterfølgende eksperimenter.

4. Brug C. elegans til undersøgelse af Trans generations effekt

  1. Forbered kemiske opløsninger med 5 koncentrationsniveauer og én opløsningsmiddel eller absolut kontrol, dvs 6 grupper i alt.
  2. Tilsæt 100 μL kontrol eller kemiske opløsninger med 10 brønde som replikater i hver gruppe (dvs. 60 brønde i alt) ind i det midterste område af en 96-brønd steril mikroplade for at undgå kanteffekter.
  3. Fortynd fyrretræsnematoden suspensionerne fra trin 3,14 med K-medium fra trin 3,11 med 10 gange. Tilsæt 100 μL fyrretræsnematoden-suspensioner til hver af 60 brøndene fra trin 4,2. Marker klokkeslættet som t0.
  4. Når tiden når 24 h efter t0, tælle de levende og døde kartoffelcystenematoder i brøndene. Beregn median dødelig koncentration (LC50).
  5. Forbered en serie på 5 koncentrationer under 10% af LC50 værdier.
  6. Tilsæt 100 μL kontrol eller kemiske opløsninger (fra trin 4,5) med 10 brønde som replikater i hver gruppe (dvs., 60 brønde i alt) i det midterste område af en 96-brønd steril mikroplade for at undgå kanteffekter.
  7. Tilsæt 100 μL K-medium indeholdende ca. 200 L3 nematoder (fra trin 3,14) til hver af de 60 brønde fra trin 4,6. Marker klokkeslættet som T0.
  8. Udfør eksponeringen for 24 til 96 h siden T0.
  9. Efter eksponeringen opsamles nematoder fra fem brønde i hver gruppe til 1,5 mL centrifugeglas ved pipettering (dvs. 6 rør i alt).
  10. Aflever Nematoderne i 30 min., kassér Supernatanterne ved pipettering, og gensuspender og vask nematoder i bunden med 1 mL steriliseret vand.
  11. Nematoderne afregnes i 30 min., kassér Supernatanterne ved pipettering og brug Nematoderne nederst til indikator målingerne (Se afsnit 7) i den eksponerede Stam generation, der er markeret som F0.
  12. Saml, Aflever og vask (ved at suspendere) nematoder fra de resterende fem brønde i hver gruppe i trin 4,9 i henhold til trin 4,10.
  13. Udlign Nematoderne fra trin 4,12 i 30 min. kassér Supernatanterne ved pipettering og tilsæt 100 μL sterilt vand for at resuspendere nematoder. Overføre fyrretræsnematoden suspensionerne jævnt på tre nyforberedte NGM agarer med bakteriel græsplæne fra trin 2,13.
  14. Der inkubateres Nematoderne i 36 h for at blive gravid og udføre alders synkronisering i henhold til trin 3.1-3.9. De synkroniserede æg inkubates på de respektive NGM agarer med bakteriel græsplæne fra trin 2,13 til 36 h.
  15. Nematoder skylles på NGM agarer fra trin 4,14 til seks centrifugeglas.
  16. Udlign Nematoderne i 30 minutter, og kassér Supernatanterne ved pipettering. Resuspension og vask pellets med 1 mL steriliseret vand.
  17. Udlign Nematoderne i 30 minutter, og kassér Supernatanterne ved pipettering. Brug Nematoderne nederst til indikator målingerne (Se afsnit 7) af afkom, der er markeret som T1.

5. Brug C. elegans til multi generations eksponering (MGE) effektundersøgelse

  1. Bland 99,0 ml NGM agarer (fra trin 2,9) med 1 ml kontrol eller kemiske opløsninger (lave og høje koncentrationer i denne protokol som eksempler, dvs. tre grupper i alt).
  2. Hæld ca. 10 mL NGM agar medium pr. skål fra trin 5,1 til 100 sterile Petri skåle (6,0 cm diameter). Afkøl mediet i Petri skålene til stuetemperatur for at danne solid agar.
  3. Afpipettere bakterielle suspensioner på agar som pr. trin 2,11.
  4. Sæt de øvre låg af Petri skålene og eksponere den bakterielle græsplæne til UV-lys (145 μw/cm2) i biosikkerhed kabinettet i 15 min.
  5. Vælg en lille koloni ved hjælp af en inokulerende løkke, Placer den i lb medium fra agarer i trin 1,4. LB-mediet inkubes med en hastighed på 150 rpm ved 37 °C i 24 timer for at bekræfte uagtsom bakterievækst og validere aflivnings trinnet 5,4.
  6. Pipetter de alders synkroniserede æg fra trin 3,9 på agarer (fra trin 5,4). Markér starten af eksponeringen til den overordnede generation F0, og Markér som dag 0 (d0).
  7. Inkuber agarerne i 3 d ved 20 °C. Derefter (dvs. på D3), skal du bruge de modne nematoder til at måle effekter i F0 (Se afsnit 7).
  8. Også på D3, pick F0 modne kartoffelcystenematoder på nye NGM agarer (fra trin 5,4) ved hjælp af en glas stang, hvis ende er udstyret med en menneskeskabt fiber wire bøjet i en ring.
  9. På d4, udvælge og kassere de modne F0 kartoffelcystenematoder fra NGM agars. Marker de nyligt udklækkede afkom kartoffelcystenematoder inden for disse 24 timer (fra D3 til d4) som F1 for at opleve andengenerations eksponering.
  10. På D6, måle indeks (Se afsnit 7) af F1-modne nematoder, som har oplevet eksponering i 3 dage.
  11. På D9 skal du gentage trin 5.8-5.10, bruge F1-nematoder til at gengive F2-orme og måle effekter på F2-nematoder.
  12. På D12 skal du gentage trin 5,11, bruge F2-nematoder til at gengive F3-orme og måle effekter på F3-kartoffelcystenematoder. På samme måde, reproducere afkom og måle MGE virkninger på nth afkom generation (FN).

6. Brug C. elegans til multi generations rest (Mgr) effektundersøgelse

  1. Gentag trin 5.1-5.7. På D3, pick F0 modne kartoffelcystenematoder på nye NGM agarer uden tilsat kemikalier (fra trin 2,13).
  2. På d4, udvælge og kassere de modne F0 nematodes. Marker de nyligt udklækkede afkom kartoffelcystenematoder inden for disse 24 timer som T1-nematoder.
  3. På D6, måle indeks (Se afsnit 7) af T1 modne kartoffelcystenematoder, der er vokset i 3 dage.
  4. På D9 skal du gentage trin 6.2-6.3, bruge T1-nematoder til at gengive T2-nematoder og måle effekter i T1-nematoder.
  5. På D12 skal du gentage trin 6,4, bruge T2-nematoder til at gengive T3-nematoder og måle effekter i T2-nematoder. På samme måde, reproducere afkom og måle mgr effekter på nth afkom generation (TN) kartoffelcystenematoder af F0, eller nth afkom (TN ') kartoffelcystenematoder af FN fra trin 5,12.

7. måle indikatorer

  1. Mål bevægelsesadfærd.
    1. Skyl Nematoderne ud af NGM agarer ved hjælp af sterilt vand og saml dem i centrifugeglas. Udlign Nematoderne i 30 min., kassér Supernatanterne og brug nematoder i pellets til effektmåling.
    2. Resuspension af Nematoderne i pellets med 1 ml sterilt vand og pipetter dem på NGM agarer uden bakteriel græsplæne fra trin 2,10.
    3. Brug et dissekere mikroskop til at score kartoffelcystenematoder for (antallet af) krops bøjnings frekvens (BBF), som refererer til de gange, den bageste pære af svælget ændrer retning langs den lodrette retning af den rejsende sti inden for et 60 s interval.
    4. Brug dissekere mikroskop til at score tilbageførsel bevægelse (RM), som refererer til de tidspunkter, hvor den rejsende retning skifter over 90 ° herunder baglæns sving og Omega turn (OT) i et interval på 60 s. OT refererer til bevægelsen, når lederen af fyrretræsnematoden rører eller næsten rører sin hale gør fyrretræsnematoden form som det græske bogstav Omega (Ω).
      Bemærk: mindst 6 nematoder blev undersøgt for hver behandling i hver eksperimentel replikat.
Eksempler på MGE (F0 til F3) effekter på reproduktion og levetid med 3 grupper (én kontrol og to eksponerings behandlinger).
Dag NGM agar-nummer for MGE-undersøgelse Forklaring
Levetid Reproduktion
0 30 (F0 eksponering) 10 replikater for hver gruppe, markeret som F0-1-1-0 til F0-3-10-0, med det sidste ciffer for at vise overlevelses dagene.
1 30 (F0 overleve 1 d) F0-1-1-0 til F0-3-10-0 skal ændres til F0-1-1-1 til F0-3-10-1.
2 30 (F0 overleve 2 d) F0-1-1-1 til F0-3-10-1 skal ændres til F0-1-1-2 til F0-3-10-2.
Ingen grund til at overføre F0 kartoffelcystenematoder indtil 3 d.
3 30 (F0 overleve 3 d, ryddet efter kartoffelcystenematoder overførsel og indsamling) Efter 3 d er F0 kartoffelcystenematoder modne og 36 nye NGM agarer (med 2 nematoder på hver agar) anvendes til at observere deres overlevelse og reproduktion.
36 (F0-1-1-3 til F0-3-12-3) Indledende eksperimenter bør udføres for at arrangere antallet af F0 nematodes, der sikrer mindst 200 afkom for efterfølgende multi generations operationer.
Især, hvis mgr effekter er undersøgt, bør F0 kartoffelcystenematoder overføres til klare NGM agarer uden kemisk eksponering, og det skal bemærkes som T1 start.
De fleste af de F0 nematoder er indsamlet til at måle kemiske og genetiske indekser og 30 agarer i F0 er ryddet.
4 36 (F0-1-1-4 til F0-3-12-4) 36 (F1-1-1-1 til F1-3-12-1) Måling af levetid og reproduktion kræver overførsel hver dag.
Forældre-nematoder på F0-1-1-3 til F0-3-12-3 plukkes til nye NGM agarer markeret som F0-1-1-4 til F0-3-12-4.
De resterende afkom nematoder (dvs., F1 i MGE, eller T1 i mgr) i F0-1-1-3 til F0-3-12-3 agarer er vokset til 1 d, og markører er ændret til F1-1-1-1 til F1-3-12-1. Disse agarer bruges også til at overvåge levetiden for F1 med daglig overførsel.
5 36 (F0-1-1-5 til F0-3-12-5) 36 (F1-1-1-2 til F1-3-12-2) Nematoder på F1-1-1-1 til F1-3-12-1 agarer er vokset til 2 d og bliver let observerbare, og Nematoderne tælles, og mærkerne ændres til F1-1-1-2 til F1-3-12-2.
36 (F0-1-1-4 til F0-3-12-4) Afkommet kartoffelcystenematoder i F0-1-1-4 til F0-3-12-4 agarer er vokset til 1 d.
6 36 (F0-1-1-6 til F0-3-12-6) 36 (F0-1-1-4 til F0-3-12-4, ryddet efter optalt) Nematodes på F1-1-1-2 til F1-3-12-2 agarer er vokset til 3 d og markører ændres til F1-1-1-3 til F1-3-12-3. Især F1 kartoffelcystenematoder begynder at gengive F2 på denne dag, F1 kartoffelcystenematoder bør overføres til nye NGM agarer gør F2-1-1-0 til F1-3-12-0. For MGR undersøgelser, T2 start i dag.
36 (F1-1-1-3 til F1-3-12-3) 36 (F0-1-1-5 til F0-3-12-5) Dette kan forsinkes ved kemisk eksponering, og derfor bør der foretages fleksible ændringer i hvert eksperiment for at sikre nok nematoder for de efterfølgende generationer.
36 (F2-1-1-0 til F1-3-12-0) Afkommet kartoffelcystenematoder på F0-1-1-4 til F0-3-12-4 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
Afkommet kartoffelcystenematoder på F0-1-1-5 til F0-3-12-5 agarer er vokset til 1 d.
7 36 (F0-1-1-7 til F0-3-12-7) 36 (F0-1-1-5 til F0-3-12-5, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder på F0-1-1-5 til F0-3-12-5 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F1-1-1-4 til F1-3-12-4) 36 (F0-1-1-6 til F0-3-12-6) Det overordnede fyrretræsnematoden nummer i F1-1-1-1 til F1-3-12-1 agarer, F0-1-1-4 til F0-3-12-4 agarer og F0-1-1-5 til F0-3-12-5 anvendes til at beregne den oprindelige gengivelse af F0.
36 (F2-1-1-1 til F2-3-12-1) Afkommet kartoffelcystenematoder på F0-1-1-6 til F0-3-12-6 agarer er vokset til 1 d.
F2-Nematoderne på F2-1-1-0 til F1-3-12-0 er vokset for 1 d, og deres markører ændres til F2-1-1-1 til F2-3-12-1.
8 36 (F0-1-1-8 til F0-3-12-8) 36 (F0-1-1-6 til F0-3-12-6, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder på F0-1-1-6 til F0-3-12-6 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F1-1-1-5 til F1-3-12-5) 36 (F0-1-1-7 til F0-3-12-7) Afkommet kartoffelcystenematoder af F0 på F0-1-1-7 til F0-3-12-7 agarer er vokset til 1 d.
36 (F2-1-1-2 til F2-3-12-2) 36 (F1-1-1-4 til F1-3-12-4) Afkommet kartoffelcystenematoder af F1 på F1-1-1-4 til F1-3-12-4 agarer er vokset til 1 d.
36 (F2-1-1-1 til F2-3-12-1, ændret til F2-1-1-2 til F2-3-12-2 efter optalt) F2-Nematoderne på F2-1-1-1 til F2-3-12-1 er vokset for 2 d, nematoder tælles og deres markører ændres til F2-1-1-2 til F2-3-12-2.
9 36 (F0-1-1-9 til F0-3-12-9) 36 (F0-1-1-7 til F0-3-12-7, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F0 på F0-1-1-7 til F0-3-12-7 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F1-1-1-6 til F1-3-12-6) 36 (F1-1-1-4 til F1-3-12-4, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F1 på F1-1-1-4 til F1-3-12-4 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F2-1-1-3 til F2-3-12-3) 36 (F0-1-1-8 til F0-3-12-8) Afkom kartoffelcystenematoder af F0 på F0-1-1-8 til F0-3-12-8 agarer er vokset til 1 d.
36 (F3-1-1-0 til F3-3-12-0) 36 (F1-1-1-5 til F1-3-12-5) Afkommet kartoffelcystenematoder af F1 på F1-1-1-5 til F1-3-12-5 agarer er vokset til 1 d.
F2-kartoffelcystenematoder på F2-1-1-2 til F2-3-12-2 er vokset i 3 dage, og deres markører ændres til F2-1-1-3 til F2-3-12-3. F2 kartoffelcystenematoder begynder at reproducere i dag, og de overføres til 36 nye NGM agarer er nødvendige og markeret som F3-1-1-0 til F3-3-12-0. For MGR Studies, T3 start i dag.
10 36 (F0-1-1-10 til F0-3-12-10) 36 (F0-1-1-8 til F0-3-12-8, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F0 på F0-1-1-8 til F0-3-12-8 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F1-1-1-7 til F1-3-12-7) 36 (F1-1-1-5 til F1-3-12-5, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F1 på F1-1-1-5 til F1-3-12-5 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F2-1-1-4 til F2-3-12-4) 36 (F0-1-1-9 til F0-3-12-9) Det samlede fyrretræsnematoden nummer i F2-1-1-1 til F2-3-12-1, F1-1-1-4 til F1-3-12-4 agarer og F1-1-1-5 til F1-3-12-5 bruges til at beregne den oprindelige gengivelse af F1.
36 (F3-1-1-1 til F3-3-12-1) 36 (F1-1-1-6 til F1-3-12-6) Afkommet nematoder af F0 på F0-1-1-9 til F0-3-12-9 agarer er vokset til 1 d.
Afkommet kartoffelcystenematoder af F1 på F1-1-1-6 til F1-3-12-6 agarer er vokset til 1 d.
Afkommet fyrretræsnematoden på F3-1-1-0 til F3-3-12-0 agarer er vokset til 1 d, og mærkerne ændres til F3-1-1-1 til F3-3-12-1.
Især, reproduktion af F0 kartoffelcystenematoder vil betydeligt falde efter de første flere dage. Derfor er fyrretræsnematoden overførslen ikke strengt nødvendig for at være daglig efter D10 og kan udføres hver 2 dage. Men overlevelse kræver stadig daglig observation.
Samme regel gælder også i F1 (T1, T1 '), F2 (T2, T2 ') og F3 (T3, T3 ').
11 36 (F0-1-1-11 til F0-3-12-11) 36 (F0-1-1-9 til F0-3-12-9, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F0 på F0-1-1-9 til F0-3-12-9 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F1-1-1-8 til F1-3-12-8) 36 (F1-1-1-6 til F1-3-12-6, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F1 på F1-1-1-6 til F1-3-12-6 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F2-1-1-5 til F2-3-12-5) 36 (F0-1-1-10 til F0-3-12-10) Afkommet nematoder af F0 på F0-1-1-10 til F0-3-12-10 agarer er vokset til 1 d.
36 (F3-1-1-2 til F3-3-12-2) 36 (F1-1-1-7 til F1-3-12-7) Afkommet kartoffelcystenematoder af F1 på F1-1-1-7 til F1-3-12-7 agarer er vokset til 1 d.
36 (F2-1-1-4 til F2-3-12-4) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-4 til F2-3-12-4 agarer er vokset til 1 d.
36 (F3-1-1-1 til F3-3-12-1, ændret til F3-1-1-2 til F3-3-12-2 efter optælling) Kartoffelcystenematoder på F3-1-1-1 til F3-3-12-1 agarer er vokset for 2 d, Nematoderne tælles og markører ændres til F3-1-1-2 til F3-3-12-2.
12 36 (F0-1-1-12 til F0-3-12-12) 36 (F0-1-1-10 til F0-3-12-10, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F0 på F0-1-1-10 til F0-3-12-10 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F1-1-1-9 til F1-3-12-9) 36 (F1-1-1-7 til F1-3-12-7, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F1 på F1-1-1-7 til F1-3-12-7 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F2-1-1-6 til F2-3-12-6) 36 (F2-1-1-4 til F2-3-12-4, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-4 til F2-3-12-4 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F3-1-1-3 til F3-3-12-3) 36 (F0-1-1-11 til F0-3-12-11) Afkommet nematoder af F0 på F0-1-1-11 til F0-3-12-11 agarer er vokset til 1 d.
36 (F4-1-1-0 til F4-3-12-0) 36 (F1-1-1-8 til F1-3-12-8) Afkommet kartoffelcystenematoder af F1 på F1-1-1-8 til F1-3-12-8 agarer er vokset til 1 d.
36 (F2-1-1-5 til F2-3-12-5) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-5 til F2-3-12-5 agarer er vokset til 1 d.
Nematoderne på F3-1-1-2 til F3-3-12-2 agarer er vokset i 3 d, og mærkerne ændres til F3-1-1-3 til F3-3-12-3. F3 kartoffelcystenematoder begynder at reproducere i dag, og de overføres til 36 nye NGM agarer er nødvendige og markeret som F4-1-1-0 til F4-3-12-0. For MGR undersøgelser, afkom af F3 (dvs., T1 ') starter i dag.
13 36 (F0-1-1-13 til F0-3-12-13) 36 (F0-1-1-11 til F0-3-12-11, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F0 på F0-1-1-11 til F0-3-12-11 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F1-1-1-10 til F1-3-12-10) 36 (F1-1-1-8 til F1-3-12-8, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F1 på F1-1-1-8 til F1-3-12-8 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F2-1-1-7 til F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-5 til F2-3-12-5, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-5 til F2-3-12-5 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F3-1-1-4 til F3-3-12-4) 36 (F0-1-1-12 til F0-3-12-12) Det overordnede fyrretræsnematoden-nummer i F3-1-1-1 til F3-3-12-1, F2-1-1-4 til F2-3-12-4 agarer og F2-1-1-5 til F2-3-12-5 bruges til at beregne den oprindelige gengivelse af F2.
36 (F4-1-1-1 til F4-3-12-1) 36 (F1-1-1-9 til F1-3-12-9) Afkom kartoffelcystenematoder af F0 på F0-1-1-12 til F0-3-12-12 agarer er vokset til 1 d.
36 (F2-1-1-6 til F2-3-12-6) Afkommet kartoffelcystenematoder af F1 på F1-1-1-9 til F1-3-12-9 agarer er vokset til 1 d.
Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-6 til F2-3-12-6 agarer er vokset til 1 d.
Afkom kartoffelcystenematoder af F3 på F4-1-1-0 til F4-3-12-0 er vokset til 1 d, og markører ændres til F4-1-1-1 til F4-3-12-1.
14 36 (F0-1-1-14 til F0-3-12-14) 36 (F0-1-1-12 til F0-3-12-12, ryddet efter optalt) Afkom nematoder af F0 på F0-1-1-12 til F0-3-12-12 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F1-1-1-11 til F1-3-12-11) 36 (F1-1-1-9 til F1-3-12-9, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F1 på F1-1-1-9 til F1-3-12-9 agarer er vokset for 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F2-1-1-8 til F2-3-12-8) 36 (F2-1-1-6 til F2-3-12-6, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-6 til F2-3-12-6 agarer er vokset for 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F3-1-1-5 til F3-3-12-5) 36 (F4-1-1-1 til F4-3-12-1, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F3 på F4-1-1-1 til F4-3-12-1 er vokset for 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles. For mgr undersøgelser, T1 ' kartoffelcystenematoder er vokset til 2 d, og vil begynde at reproducere T2 ' på den næste dag (D15), og T2 ' vil begynde at reproducere T3 ' på D18. Levetiden for vilde type C. elegans er under eksamin som 15 dage. Derefter, slutter af T3 ' levetid vil være på D33.
36 (F0-1-1-13 til F0-3-12-13) Afkommet nematoder af F0 på F0-1-1-13 til F0-3-12-13 agarer er vokset til 1 d.
36 (F1-1-1-10 til F1-3-12-10) Afkommet kartoffelcystenematoder af F1 på F1-1-1-10 til F1-3-12-10 agarer er vokset til 1 d.
36 (F2-1-1-7 til F2-3-12-7) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-7 til F2-3-12-7 agarer er vokset til 1 d.
36 (F3-1-1-4 til F3-3-12-4) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-4 til F2-3-12-4 agarer er vokset til 1 d.
15 36 (F0-1-1-15 til F0-3-12-15) 36 (F0-1-1-13 til F0-3-12-13, ryddet efter optalt) Afkom nematoder af F0 på F0-1-1-13 til F0-3-12-13 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F1-1-1-12 til F1-3-12-12) 36 (F1-1-1-10 til F1-3-12-10, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F1 på F1-1-1-10 til F1-3-12-10 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F2-1-1-9 til F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-7 til F2-3-12-7, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-7 til F2-3-12-7 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F3-1-1-6 til F3-3-12-6) 36 (F3-1-1-4 til F3-3-12-4, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-4 til F3-3-12-4 agarer er vokset til 2D, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F0-1-1-14 til F0-3-12-14) Afkom kartoffelcystenematoder af F0 på F0-1-1-14 til F0-3-12-14 agarer er vokset til 1 d.
36 (F1-1-1-11 til F1-3-12-11) Afkommet kartoffelcystenematoder af F1 på F1-1-1-11 til F1-3-12-11 agarer er vokset til 1 d.
36 (F2-1-1-8 til F2-3-12-8) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-8 til F2-3-12-8 agarer er vokset til 1 d.
36 (F3-1-1-5 til F3-3-12-5) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-5 til F2-3-12-5 agarer er vokset til 1 d.
16 36 (F0-1-1-15 til F0-3-12-15, over) 36 (F0-1-1-14 til F0-3-12-14, ryddet efter optalt) Levetiden for vilde type C. elegans er under eksamin som 15 dage. Derfor bør F0 have alle døde før dag 16 siden eksponeringen.
36 (F1-1-1-13 til F1-3-12-13) 36 (F1-1-1-11 til F1-3-12-11, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F0 på F0-1-1-14 til F0-3-12-14 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F2-1-1-10 til F2-3-12-10) 36 (F2-1-1-8 til F2-3-12-8, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F1 på F1-1-1-11 til F1-3-12-11 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F3-1-1-7 til F3-3-12-7) 36 (F3-1-1-5 til F3-3-12-5, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-8 til F2-3-12-8 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F0-1-1-15 til F0-3-12-15) Afkommet nematoder af F3 på F3-1-1-5 til F3-3-12-5 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F1-1-1-12 til F1-3-12-12) Det overordnede fyrretræsnematoden-nummer i F4-1-1-1 til F4-3-12-1, F3-1-1-4 til F3-3-12-4 agarer og F3-1-1-5 til F3-3-12-5 bruges til at beregne den oprindelige gengivelse af F3.
36 (F2-1-1-9 til F2-3-12-9) Afkommet nematoder af F0 på F0-1-1-15 til F0-3-12-15 agarer er vokset til 1 d.
36 (F3-1-1-6 til F3-3-12-6) Afkommet kartoffelcystenematoder af F1 på F1-1-1-12 til F1-3-12-12 agarer er vokset til 1 d.
Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-9 til F2-3-12-9 agarer er vokset til 1 d.
Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-6 til F2-3-12-6 agarer er vokset til 1 d.
17 36 (F1-1-1-14 til F1-3-12-14) 36 (F0-1-1-15 til F0-3-12-15, ryddet efter optalt, over) Afkommet nematoder af F0 på F0-1-1-15 til F0-3-12-15 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles. Der vil ikke være mere F0 afkom.
36 (F2-1-1-11 til F2-3-12-11) 36 (F1-1-1-12 til F1-3-12-12, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F1 på F1-1-1-12 til F1-3-12-12 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F3-1-1-8 til F3-3-12-8) 36 (F2-1-1-9 til F2-3-12-9, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F2 på F2-1-1-9 til F2-3-12-9 agarer er vokset for 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F3-1-1-6 til F3-3-12-6, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F3 på F3-1-1-6 til F3-3-12-6 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter at kartoffelcystenematoder er talt.
36 (F1-1-1-13 til F1-3-12-13) Afkommet kartoffelcystenematoder af F1 på F1-1-1-13 til F1-3-12-13 agarer er vokset til 1 d.
36 (F2-1-1-10 til F2-3-12-10) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-10 til F2-3-12-10 agarer er vokset til 1 d.
36 (F3-1-1-7 til F3-3-12-7) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-7 til F2-3-12-7 agarer er vokset til 1 d.
18 36 (F1-1-1-15 til F1-3-12-15) 36 (F1-1-1-13 til F1-3-12-13, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F1 på F1-1-1-13 til F1-3-12-13 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F2-1-1-12 til F2-3-12-12) 36 (F2-1-1-10 til F2-3-12-10, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-10 til F2-3-12-10 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F3-1-1-9 til F3-3-12-9) 36 (F3-1-1-7 til F3-3-12-7, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-7 til F3-3-12-7 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F1-1-1-14 til F1-3-12-14) Afkommet kartoffelcystenematoder af F1 på F1-1-1-14 til F1-3-12-14 agarer er vokset til 1 d.
36 (F2-1-1-11 til F2-3-12-11) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-11 til F2-3-12-11 agarer er vokset til 1 d.
36 (F3-1-1-8 til F3-3-12-8) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-8 til F2-3-12-8 agarer er vokset til 1 d.
I MGR undersøgelser, T2 ' vil begynde at reproducere T3 ' i dag. Levetiden for vilde type C. elegans er under eksamin som 15 dage. Derefter, slutter af T3 ' levetid vil være på D33.
19 36 (F1-1-1-15 til F1-3-12-15, over) 36 (F1-1-1-14 til F1-3-12-14, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F1 på F1-1-1-14 til F1-3-12-14 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F2-1-1-13 til F2-3-12-13) 36 (F2-1-1-11 til F2-3-12-11, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-11 til F2-3-12-11 agarer er vokset for 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F3-1-1-10 til F3-3-12-10) 36 (F3-1-1-8 til F3-3-12-8, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-8 til F3-3-12-8 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles.
36 (F1-1-1-15 til F1-3-12-15) Afkommet kartoffelcystenematoder af F1 på F1-1-1-15 til F1-3-12-15 agarer er vokset til 1 d.
36 (F2-1-1-12 til F2-3-12-12) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-12 til F2-3-12-12 agarer er vokset til 1 d.
36 (F3-1-1-9 til F3-3-12-9) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-9 til F2-3-12-9 agarer er vokset til 1 d.
20 36 (F2-1-1-14 til F2-3-12-14) 36 (F1-1-1-15 til F1-3-12-15, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F1 på F1-1-1-14 til F1-3-12-14 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter kartoffelcystenematoder tælles. Der vil ikke mere F1 afkom.
36 (F3-1-1-11 til F3-3-12-11) 36 (F2-1-1-12 til F2-3-12-12, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-12 til F2-3-12-12 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F3-1-1-9 til F3-3-12-9, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F3 på F3-1-1-9 til F3-3-12-9 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter at kartoffelcystenematoder er talt.
36 (F2-1-1-13 til F2-3-12-13) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-13 til F2-3-12-13 agarer er vokset til 1 d.
36 (F3-1-1-10 til F3-3-12-10) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-10 til F2-3-12-10 agarer er vokset til 1 d.
21 36 (F2-1-1-15 til F2-3-12-15) 36 (F2-1-1-13 til F2-3-12-13, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-13 til F2-3-12-13 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F3-1-1-12 til F3-3-12-12) 36 (F3-1-1-10 til F3-3-12-10, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F3 på F3-1-1-10 til F3-3-12-10 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter at kartoffelcystenematoder er talt.
36 (F2-1-1-14 til F2-3-12-14) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-14 til F2-3-12-14 agarer er vokset til 1 d.
36 (F3-1-1-11 til F3-3-12-11) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-11 til F2-3-12-11 agarer er vokset til 1 d.
22 36 (F2-1-1-15 til F2-3-12-15, over) 36 (F2-1-1-14 til F2-3-12-14, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-14 til F2-3-12-14 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F3-1-1-13 til F3-3-12-13) 36 (F3-1-1-11 til F3-3-12-11, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F3 på F3-1-1-11 til F3-3-12-11 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter at kartoffelcystenematoder er talt.
36 (F3-1-1-12 til F3-3-12-12) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-12 til F2-3-12-12 agarer er vokset til 1 d.
23 36 (F3-1-1-14 til F3-3-12-14) 36 (F2-1-1-15 til F2-3-12-15, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F2 på F2-1-1-15 til F2-3-12-15 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles. Der vil ikke være mere F2 afkom.
36 (F3-1-1-12 til F3-3-12-12, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F3 på F3-1-1-12 til F3-3-12-12 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter at kartoffelcystenematoder er talt.
36 (F3-1-1-13 til F3-3-12-13) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-13 til F2-3-12-13 agarer er vokset til 1 d.
24 36 (F3-1-1-15 til F3-3-12-15) 36 (F3-1-1-13 til F3-3-12-13, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-13 til F3-3-12-13 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F3-1-1-14 til F3-3-12-14) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-14 til F2-3-12-14 agarer er vokset til 1 d.
25 36 (F3-1-1-15 til F3-3-12-15, over) 36 (F3-1-1-14 til F3-3-12-14, ryddet efter optalt) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-14 til F3-3-12-14 agarer er vokset til 2 d, og agarer ryddes efter at Nematoderne tælles.
36 (F3-1-1-15 til F3-3-12-15) Afkommet kartoffelcystenematoder af F3 på F3-1-1-15 til F2-3-12-15 agarer er vokset til 1 d.
26 36 (F3-1-1-15 til F3-3-12-15, ryddet efter optalt) Afkommet nematoder af F3 på F3-1-1-15 til F3-3-12-15 agarer er vokset til 2 d, og agarer er ryddet efter at kartoffelcystenematoder er talt.
Især i MGR undersøgelser, den første ikke-eksponeret afkom af F3 (dvs., T3 ') ville blive født på D18. Levetiden for vilde type C. elegans er under eksamin som 15 dage. Derefter, slutter af T3 ' levetid vil være på D33.
Både MGE og MGR undersøgelser vil dække flere dage, hvor fyrretræsnematoden levetid er længere.

Tabel 1: liste over markører og deres definitioner.

  1. Måling af reproduktion og levetid i MGE-Effektstudier.
    1. På d0 skal du gentage trin 5,6. Marker agarer (3 grupper med 10 replikater i hver) som Fx-a-b-c, hvor x refererer til generation nummer, a refererer til gruppenummeret (1 for kontrol, 2 for den lave koncentration og 3 for den høje koncentration ); b refererer til replikatet fra 1 til 10; og c refererer til eksponeringsvarigheden (0 indikerer start). For d0, markerer agarer som F0-1-1-0 til F0-3-10-0. Læsere kan henvise til tabel 1 for detaljerede oplysninger.
    2. På D1, kontrollere fyrretræsnematoden vækst på agars, og ændre markører fra F0-1-1-0 til F0-3-10-0 til F0-1-1-1 til F0-3-10-1.
    3. På D2 skal du kontrollere fyrretræsnematoden-væksten på agars og ændre mærkerne F0-1-1-2 til F0-3-10-2.
    4. På D3, pick 24 F0 kartoffelcystenematoder fra hver gruppe på 12 nye NGM agarer med to NGM agar fra trin 5,4. Marker agarer som F0-1-1-3 til F0-3-12-3.
    5. På d4, overføre de to overordnede nematoder fra F0-1-1-3 til F0-3-12-3 ved at plukke på nye NGM agarer fra trin 5,4. Markér de nye NGM agarer som F0-1-1-4 til F0-3-12-4. Skift markører for F0-1-1-3 til F0-3-12-3 til F1-1-1-1 til F1-3-12-1 for at repræsentere afkom af F0 (dvs. F1) inden for den første dag, siden F0 begynder at reproducere.
    6. På D5 skal du bruge et dissekere mikroskop til at tælle Nematoderne på F1-1-1-1 til F1-3-12-1 agarer, hvor nematoder er vokset 2 dage. Tillad F1-1-1-1 til F1-3-12-1 agarer at gengive F2 for successive generationer.
    7. Overfør de to overordnede nematoder fra F0-1-1-4 til F0-3-12-4 agarer ved at plukke på nye NGM-agarer fra trin 5,4. Mark NGM agarer som F0-1-1-5 til F0-3-12-5. Skift mærkerne F0-1-1-4 til F0-3-12-4 til F1-1-1-2 til F1-3-12-2 for at repræsentere afkom af F0 (dvs. F1) inden for den anden dag, siden F0 begynder at reproducere.
    8. På D6 skal du tælle kartoffelcystenematoder på F1-1-1-2 til F1-3-12-2 agars. Overfør de overordnede nematoder fra F0-1-1-5 til F0-3-12-5 agarer til F0-1-1-6 til F0-3-12-6. Skift markører for F0-1-1-5 til F0-3-12-5 til F1-1-1-3 til F1-3-12-3 for at repræsentere afkom af F0 (dvs. F1) inden for den tredje dag, siden F0 begynder at reproducere.
    9. Kartoffelcystenematoder på F1-1-1-1 til F1-3-12-1 agarer er vokset i 3 dage. Brug dem til at gengive F2 i efterfølgende MGE-Effektstudier. Brug på samme måde F2-nematoder til at gengive F3 for at fortsætte MGE-effekt undersøgelserne.
    10. På samme måde, overføre de to forældre kartoffelcystenematoder dagligt og tælle afkommet kartoffelcystenematoder den næste dag, indtil moder luftfartsnematoder i 6 NGM agarer (dvs. halvdelen af den samlede agarer i hver gruppe) stoppe reproduktion.
    11. Beregn det samlede afkom-nummer over hele reproduktions varigheden som den totale Brood størrelse. Brug afkommets nummer inden for de første 3 dage til at repræsentere den første reproduktion af forældrene.
    12. Brug den dag, hvor den overordnede fyrretræsnematoden gengivelse stopper i 6 NGM-agarer for at estimere reproduktions varigheden. Brug de dage, som hver enkelt forælder har overlevet som sin levetid.
    13. Opnå den indledende reproduktion, reproduktion varighed, samlede Brood størrelse og levetid på F1 på samme måde som gjort for F0. Tilsvarende, ved at gentage den førnævnte procedure, reproduktion og levetiden oplysninger om F2 (til FN) kan opnås.
  2. Mål reproduktion og levetid i MGR effektundersøgelser.
    1. Udfør trin 7.2.4 med NGM agarer fra trin 5,4 ændret til dem fra trin 2,13.
  3. Måle biokemiske indekser.
    1. Skyl Nematoderne af NGM agarer med sterilt vand og saml dem i centrifugeglas. Udlign Nematoderne i 30 min. og kassér Supernatanterne. Brug kartoffelcystenematoder i pellets til effektmåling.
    2. Der tilsættes 1 mL iskold fosfat bufferet saltvand (PBS, pH 7,0) i Nematoderne (pellets) i 1,5 mL centrifugeglas for at vaske nematoderne.
    3. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 5 minutter ved 4 °c, og Supernatanterne kasseres forsigtigt med en pipette.
    4. Snap fryse pellets af flydende nitrogen eller i a-80 °C fryser.
    5. Homogeniser pellets ved hjælp af pestles i et isbad. Brug 200 μL iskold PBS til at vaske de resterende væsker på Pestle i centrifugeglasset, før du tager Pestle ud.
    6. Centrifuge ved 10.000 x g i 5 min ved 4 °c igen, og brug supernatanter til at bestemme aktiviteter eller mængder af biokemikalier med de kommercielle kits (Se tabellen over materialer for detaljer).
    7. Måle mængderne af det totale protein (TP) i prøverne og bruge resultaterne som nævner i at repræsentere andre biokemiske indikatorer, således at forskellen mellem fyrretræsnematoden numrene blandt prøverne kan elimineres.
  4. Mål genekspression.
    1. Gentag trin 7.4.1 til 7.4.4. Isoler det totale RNA fra fyrretræsnematoden prøverne ved hjælp af et kommercielt RNA-ekstraktions udstyr (Se tabellen over materialer for detaljer) i henhold til producentens anvisninger21.
    2. Brug RNA til at syntetisere cDNA i henhold til producentens anvisninger21.
    3. Analysér cDNA-prøven i realtids polymerase-Kædereaktionen (RT-PCR) ved hjælp af SYBR Green RT-PCR kits i henhold til producentens anvisninger (Se tabel over materialer)21.
    4. Kvantificere de relative ekspressionsniveauer for de valgte gener ved 2-δδct -metode22og behandle ekspressions niveauerne for BNP-2 (eller et andet referencegen) som negativ reference.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskriver vi protokoller for at studere virkningerne af kemikalier i generationer ved hjælp af C. elegans i Trans generations-(TG), multi-generations eksponering (MGE) og multi generations rest (Mgr) effektundersøgelser. Vores egne forskningsresultater præsenteres som eksempler. En undersøgelse præsenterer TG virkningerne af tungmetaller på bevægelsesadfærd3. De to andre undersøgelser præsenterer MGE og mgr virkninger af sulfomethoxazol og lindan på reproduktion og biokemiske og genetiske indekser målinger4,14.

TG virkninger af tungmetaller på bevægelsesadfærd af C. elegans

TG-effekterne af cadmium (CD), kobber (Cu), bly (PB) og zink (Zn) på krops bøjnings frekvensen (BBF) blev undersøgt i fyrretræsnematoden Parent (F0) efter maternel eksponering og deres afkom (T1)3. Virkningerne af metaller på BBF viste, at hæmninger i T1 var større end i F0, hvilket viser mere alvorlige toksiciteter af tungmetaller på bevægelses adfærden i det embryo-udsatte afkom end i den direkte udsatte forælder. TG-effekterne af tungmetaller ved miljømæssigt realistiske koncentrationer viste, at maternel eksponering kan formere farerne ved tungmetalforurening i efterfølgende generationer. Se figur 1.

Figure 1
Figur 1 : Virkningerne af cadmium (CD), kobber (Cu), bly (PB) og zink (Zn) på krops bøjnings frekvensen for fyrretræsnematoden forælderen (F0, blank) efter prænatal eksponering og deres afkom (T1, skygget). Fejl linje = standardfejl; * = signifikant forskellig fra kontrol, p < 0,05; # = signifikant forskellig fra den nedre koncentration, p < 0,05; + indebærer signifikant forskellige effekter i F1 end i F0, p < 0,05. Dette tal er blevet ændret fra Yu et al.3 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

MGR virkninger af sulfamethoxazol (SMX) på fyrretræsnematoden levetid og reproduktion

MGR virkningerne af sulfamethoxazol (SMX) på fyrretræsnematoden levetid og reproduktion14 blev undersøgt på drægtige forælder (F0), embryo-eksponeret afkom (T1), germline-eksponeret afkom (T2), den første ikke-eksponerede afkom (T3) og de tre følgende generationer (T4-T6). Resultaterne viste, at gengivelsen (en total yngle størrelse som 49% af kontrolelementet) var signifikant påvirket i kimcelle-eksponeringen (T2), og toksiciteterne vedvarede i ikke-eksponerede generationer fra T3 til T6 generationer (figur 2). Vores resultater rejste nye bekymringer med hensyn til de langsigtede påvirkninger af antibiotika selv foruden deres virkninger på antibiotikaresistens.

Figure 2
Figur 2 : Brood størrelse (i (A), udtrykt i procent af kontrol) og første reproduktion (i (B)) af C. elegans i den udsatte forælder og dens afkom (F0, T1 til T6, fra venstre til højre ved hver koncentration). Fejl linje = standardfejl; a = signifikant forskellig fra kontrol af ANOVA (p < 0,05); b = signifikant forskellig fra kontrol og fra den tidligere generation i samme koncentration (p < 0,05) c = signifikant forskellig fra kontrol og fra den nedre koncentration i samme generation (p < 0,05); d = signifikant forskellig fra kontrol og fra den tidligere generation ved samme koncentration og den nedre koncentration i samme generation (p < 0,05); e = signifikant forskellig fra den tidligere generation ved samme koncentration og den lavere koncentration i samme generation (p < 0,05); f = signifikant forskellig fra den tidligere generation i samme koncentration (p < 0,05). Dette tal er blevet ændret fra Yu et al.14 med tilladelse.

MGE og MGR effekter af lindan på fyrretræsnematoden biokemiske og genetiske indekser

MGE-og MGR-effekterne af lindan (et persistent organisk forurenende stof [POP]) blev undersøgt på vigtige biokemikalier i lipid-metabolismen og ændringer i genetisk ekspression i den relaterede insulinlignende pathway4. Resultaterne viste, at lindan udviste obesogenic effekt med forstyrrelser i insulin signal forordningen (figur 3). Desuden indikerede ændringerne mellem SGK-1- (F0, F3, T1 ' og T3 ') og akt-1 (T1 og T3) signalering, at nematoder fra forskellige eksponerings generationer viste forskellige respons strategier for tolerance og undgåelse.

Figure 3
Figur 3 : Ændringer i ekspressions niveauerne for vigtige gener i insulin-lignende signal pathway i nematoder med forskellige eksponerings oplevelser. →: positiv regulering; symbol : negativ regulering; ↑: udtryks-up-regulering; ↓: nedregulering af udtryk. Dette tal er blevet ændret fra Chen på al.4 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at kunne gennemføre den beskrevne protokol bør følgende forslag tages i betragtning. Udfør de samlede eksperimentelle operationer i et sterilt miljø. Ukorrekt drift kan medføre kontaminering af E. coli -stammerne, f. eks., svampe og mider kan hæmme den normale vækst af C. elegans og derfor påvirke de eksperimentelle resultater. I afsnittet beskriver dyrke c. elegans, observere vækst skalaen af c. elegans på NGM agarer ved nøgne øjne eller mikroskoper. Når skalaen af C. elegans på agar overstiger 75% i området, eller kulturen tid overstiger en uge, udføre en ny runde af inokulation for at undgå overvækst eller befolkningsnedgang af C. elegans. Før processen med synkroniseringen, bruge et mikroskop til at observere væksten af C. elegans, og fortsætte processen, når fyrretræsnematoden æg er bredt fordelt på agar. Hvis der anvendes opløsningsmidler (f. eks. dimethylsulfoxid [DMSO]), bør deres koncentrationer i stamopløsninger desuden være lavere end 1% for at sikre, at deres endelige koncentrationer ikke overstiger 0,5% (v/v) for at undgå de negative virkninger af opløsningsmidlerne selv. I TG-effektundersøgelser er varigheden af eksponeringen over 24 timer nødvendig for at sikre, at eksponeringstiden dækker embryo dannelsen af den næste generation, og varigheden bør være inden for 96 h for at lette den efterfølgende generations separation. Brug små mængder nematoder (normalt inden for 20) til at måle levetid og reproduktion. På den anden side, brug store mængder af nematoder (normalt mere end 500) til måling af biokemiske og genetiske regulering indekser. Derfor, for at sikre et tilstrækkeligt antal prøver, udføre indledende eksperimenter til groft anslå, hvor mange afkom de modne F0 kartoffelcystenematoder kan reproducere inden for de første 24 h, da de begynder reproduktion. Derefter bestemme antallet af F0 nematoder kræves for at sikre, at der er mindst 200 afkom for undersøgelsen multi generations studier.

Sammenlignet med tidligere rapporter om TG-studier med C. elegansvar den nuværende forsøgsprotokol mere hensynsfuld i valget af livsstadie. I C. elegansdannes Spermer på L4-stadiet for at befrugte de senere dannede oocytter23. Derfor, eksponeringen dækker spermiogenesen og oocytogenesis periode vil give et bestemt vindue til at studere TG virkninger på afkommet. De alders synkroniserede æg anvendes til undersøgelser med flere generationer for at sikre, at eksponeringen dækker den samlede periode fra begyndelsen af hver livscyklus. Sammenlignet med tidligere multi generations studier gjorde den nuværende forsøgsprotokol det lettere at måle virkningerne over flere generationer i stedet for kun 1-2 generationer. Desuden fandt denne protokol både MGE-og MGR-effekter, som er mere systematiske end tidligere undersøgelser, der kun målte MGE-eller MGR-effekter.

Der er navnlig stadig nogle spørgsmål, som skal tages i betragtning i den nuværende forsøgsprotokol. Denne protokol anvender Wild-type C. elegans , hvis generationstid er omkring 60 h og levetid er 20 dage. Dette gør eksperimentets samlede varighed temmelig lang (f. eks. kræver MGE-effektundersøgelse af levetid over 3 generationer mindst 30 dage). For at forkorte tiden kan forskerne vælge mutant C. elegans, såsom de kortlivede mutante nematoder. Et andet spørgsmål er drab behandling på bakterierne, hvis levende status er nødvendig for at holde kartoffelcystenematoder sundt 24. Også, UV-drab proces kan indføre ændringer i kemikalierne25. Derfor bør andre behandlinger på bakterierne overvejes, og omhyggelig overvågning af de kemiske ændringer under tilberednings-eller eksponerings processen kan være nødvendig, især for ustabile forbindelser. På samme tid, der er begrænsninger i at studere køn forskelle i toksiske virkninger, fordi det meste af det faktum, at C. elegans er hermaphrodite. Yderligere forbedringer for at undersøge sex bidrag i TG, MGE eller MGR effekter er nødvendige. Kort sagt, vi forventer, at den foreslåede protokol vil være stor betydning for at bruge C. elegans at studere TG, MGE og mgr effekter af giftstoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne er taknemmelige for den finansielle støtte fra National Science and Technology store projekt for vandforurening kontrol og behandling (2017ZX07201004), og international Science & Technology Cooperation program i Kina (no. 2016YFE0123700).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar?Corning?America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
  2. Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
  3. Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
  4. Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
  5. Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
  6. Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
  7. Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
  8. Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
  9. Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
  10. Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
  11. Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
  12. Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
  13. Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
  14. Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
  15. Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
  16. Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
  17. Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
  20. Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
  21. Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
  22. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  23. Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
  24. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
  25. Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).

Tags

Miljøvidenskab Trans generations effekt multi generations eksponering effekt multi generations resteffekt eksperiment protokol caenorhabditis elegans persistente forurenende stoffer
Brug af <em>Caenorhabditis elegans </em>til at studere Trans-og multi generations effekter af giftstoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z.,… More

Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter