Summary
Trans-en multi generationele effecten van persistente chemicaliën zijn essentieel voor het beoordelen van hun langetermijngevolgen in het milieu en op de menselijke gezondheid. Wij bieden nieuwe gedetailleerde methoden voor het bestuderen van trans-en multi-generationele effecten met behulp van Free-Living nematode Caenorhabditis elegans.
Abstract
Informatie over toxiciteiten van chemicaliën is essentieel in hun toepassing en afvalbeheer. Voor chemische stoffen in lage concentraties zijn de effecten op de lange termijn van groot belang voor de beoordeling van de gevolgen ervan voor het milieu en voor de gezondheid van de mens. Bij het aantonen van lange termijn invloeden bieden de effecten van chemische stoffen over generaties in recente studies een nieuw inzicht. Hier beschrijven we protocollen voor het bestuderen van effecten van chemicaliën over meerdere generaties met behulp van vrijlevende nematode Caenorhabditis elegans. Twee aspecten worden gepresenteerd: (1) trans-generationele (TG) en (2) multi-generationele effectstudies, waarvan de laatste is gescheiden voor multi-generationele blootstelling (MGE) en multi-generationele residuele effecten (MGR) effectstudies. De TG-effectstudie is robuust met een eenvoudig doel om te bepalen of chemische blootstelling aan ouders kan resulteren in eventuele resterende gevolgen voor nakomelingen. Nadat de effecten op ouders zijn gemeten, worden natriumhypochloriet oplossingen gebruikt om de ouders te doden en de nakomelingen zo te houden dat de effect meting op de nakomelingen wordt vergemakkelijkt. De TG-effectstudie wordt gebruikt om te bepalen of de nakomelingen worden aangetast wanneer hun ouder aan de verontreinigende stoffen wordt blootgesteld. De MGE en MGR effectstudie is systematisch gebruikt om te bepalen of continue generatie blootstelling kan resulteren in adaptieve reacties bij nakomelingen over generaties. Zorgvuldige pick-up en overdracht worden gebruikt om generaties te onderscheiden om de effect meting van elke generatie te vergemakkelijken. We combineerden ook protocollen voor het meten van bewegingsgedrag, reproductie, levensduur, biochemische en genexpressie veranderingen. Een aantal voorbeeld experimenten worden ook gepresenteerd ter illustratie van de trans-en multi-generationele effectstudies.
Introduction
De toepassing en het afvalbeheer van chemische stoffen is sterk afhankelijk van de informatie over de effecten ervan bij bepaalde concentraties. Met name is tijd een ander essentieel element tussen effecten en concentraties. Dat wil zeggen, chemicaliën, vooral die in lage concentraties in de eigenlijke omgevingen, hebben tijd nodig om meetbare effecten te provoceren1. Daarom regelen onderzoekers verschillende lengtes van de blootstellingsduur in dierproeven en bedekken ze zelfs de hele levenscyclus. Muizen werden bijvoorbeeld blootgesteld aan nicotine voor 30, 90 of 180 dagen om de toxische effecten ervan 2te bestuderen. Toch zijn dergelijke blootstellingsduur nog niet voldoende om de langetermijneffecten van verontreinigende stoffen te verhelderingen (bv. persistente organische verontreinigende stoffen [POPs]) die over generaties van organismen in het milieu kunnen blijven bestaan. Daarom krijgen studies over effecten over generaties steeds meer aandacht.
Er zijn twee belangrijke aspecten in studies voor generationele effecten. De eerste is de trans-generationele (TG) effectstudie die krachtig kan testen of chemische blootstelling aan ouders kan resulteren in eventuele gevolgen voor de nakomelingen3. De tweede is een studie van multi-generationele effecten die systematischer is met overwegingen in zowel blootstelling als residuele effecten. Aan de ene kant worden de effecten met meerdere generationele blootstelling (MGE) gebruikt om adaptieve reacties in de dieren te illustreren aan de langdurige uitdagende omgevingen. Aan de andere kant worden de effecten van multi generationele residuele (MGR) gebruikt om de resterende gevolgen op lange termijn na blootstelling aan te tonen, aangezien de blootstelling van de moeder gepaard gaat met de blootstelling van het embryo aan de eerste nakomelingen en blootstelling aan de kiem lijn aan de tweede nakomelingen die de derde nakomelingen als eerste generatie volledig uit blootstelling4maken.
Hoewel zoogdieren (bijv. muizen) model organismen zijn in toxiciteitsstudies, vooral met betrekking tot mensen, is hun toepassing bij het bestuderen van generatie effecten vrij tijdrovend, duur en ethisch met betrekking tot 5. Dienovereenkomstig bieden organismen, waaronder schaaldieren Daphnia magna6, insect Drosophila melanogaster7 en zebravis Danio rerio8, alternatieve keuzes. Toch hebben deze organismen een gebrek aan gelijkenissen met de mens, of vereisen ze specifieke apparatuur in studies.
Caenorhabditis elegans is een kleine vrijlevende nematode (ongeveer 1 mm lang) met een korte levenscyclus (ongeveer 84 h bij 20 °c)9. Deze nematode deelt vele biologische trajecten conservatief voor de mens, en daarom is het op grote schaal gebruikt om de effecten van verschillende spanningen of Planting10te illustreren. Met name 99,5% van de nematoden zijn hermaphrodites waardoor deze organismen uitermate geschikt zijn voor het bestuderen van generatie effecten, bijvoorbeeld TG-effecten van zware metalen en sulfonamiden3,11, MGE-effecten van gouden nanodeeltjes en zware metalen12 en temperatuur13, Mgr effecten van sulfonamide14, en zowel MGE en Mgr effecten van gammastraling15 en lindaan4. Bovendien zijn er vergelijkbare resultaten gevonden tussen de effecten van chemische stoffen (bv. zearalenon) op de ontwikkeling en reproductie van muizen en C. elegans16,17, die een voordeel zouden bieden voor het extrapoleren van effecten van dit kleine dier op de mens.
Zowel TG en MG effectstudies zijn tijdrovend en moeten zorgvuldig ontwerp en prestaties. Met name bestonden er verschillen in levensfase keuzes, blootstellingsvoorwaarden en generatie scheidingsmethoden in de bovengenoemde studies. Dergelijke verschillen belemmerde de rechtstreekse vergelijking tussen de resultaten en hebben de verdere interpretatie van de resultaten belemmerd. Daarom is het noodzakelijk om uniforme protocollen vast te stellen om TG-en MG-effectenstudies te begeleiden, en ook om een groter beeld te geven om vergelijkbare patronen van verschillende toxicantia of verontreinigende stoffen op langetermijngevolgen te onthullen. Het doel van de huidige protocollen is het aantonen van duidelijke bedrijfsprocessen bij het bestuderen van trans-en multi-generationele effecten met C. elegans. De protocollen zullen ten goede komen aan onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de langetermijneffecten van toxicantia of verontreinigende stoffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cultuur E. coli OP50
- Bereid 1 M natriumhydroxideoplossing door 4 g natriumhydroxide in 100 mL water op te lossen.
- Bereid lysogeny Bouillon (LB) medium door 10 g Tryptone, 5 g gistextract en 10 g natriumchloride met 1 L ultrazuiver water in een conische kolf van 1 L op te lossen. Stel de pH in op 7,0 met 1 M natriumhydroxide-oplossing.
- Aliquot de LB vloeibaar medium van stap 1.2 in 20 conische kolven (maximaal toelaatbare volume: 100 mL) met 50 mL medium in elk. Bedek de conische kolven met Kraft papier.
- Steriliseer het LB vloeibare medium bij 121 °C en 0,105 MPa gedurende 20 min. koel het LB medium op kamertemperatuur.
- Pipetteer 200 μL van de bacteriële suspensies (zie stap 1,8) of kies een kleine kolonie van morfologie (in stap 2,14) met behulp van een inoculerende lus, plaats deze in lb medium.
- Inbroed het LB-medium met schudden bij 150 TPM bij 37 °C gedurende 24-48 uur. Het LB-medium verandert van een bruine transparante vloeistof naar turbide kakikleurige suspensie.
- Gebruik de bacteriële suspensies van 80% van de totale kolven om E. coli OP50 te leveren als nematode voeding die moet worden gebruikt in stap 2,11.
- Bewaar de rest van de kolven die de bacteriële suspensies bevatten in een koelkast bij 4 °C. Pipetteer 200 μL van de LB-suspensies aan de bovenzijde van het verse LB-medium (stap 1,4) en herhaal stap 1.6 voor de daaropvolgende incubatie.
2. cultuur C. elegans
Opmerking: Culture C. elegans gebruikt volgens de standaardmethoden18van de stappen 2,1 tot en met 2,11.
- Los 22,8 g van K2HPO4• 3H2O op in 100 ml steriel gedestilleerd water.
- Los 6,8 g KH2po4 op in 50 ml steriel gedestilleerd water.
- Mengoplossingen van de stappen 2,1 en 2,2, om 1 M K2HPO4-KH2po4 buffer (pH 6,0, 150 ml in totaal) te bereiden.
- Bereid 1,0 M MgSO4 voor door 1,232 g MgSO4• 7h2O in 5 ml steriel gedestilleerd water op te lossen en te steriliseren door de oplossing te filteren via een steriel wegwerp membraanfilter van 0,22 μm in een steriele container.
- Bereid 1 M CaCl2 voor door 0,554 g CACL2 in 5 ml steriel gedestilleerd water op te lossen en te steriliseren door de oplossingen te filteren via een steriel wegwerp membraanfilter van 0,22 μm in een steriele container.
- Bereid 1 M cholesterol oplossing door het oplossen van 0,025 g cholesterol in 5 mL absolute ethanol, en steriliseren door het filteren van de oplossing door middel van een 0,22 μm steriele wegwerp membraanfilter in een steriele container.
- Bereid het nematode groeimedium (NGM) agar door 17 g agar poeder, 2,5 g pepton en 3 g natriumchloride toe te voegen aan een erlenmeyer van 1 l met 1 l ultrapuur water. Voeg 25 mL K2HPO4-KH2po4 -oplossing toe vanaf stap 2,3.
- Steriliseer de NGM agar van stap 2,7 bij 121 °C met 0,105 MPa gedurende 20 min.
- Koel de NGM agar tot ongeveer 50 °C, voeg 1 mL 1 M MgSO4, 1 m CACL2en 5 mg/ml cholesterol-ethanol oplossing toe van de stappen 2,4 tot 2,6 in het medium en meng ze grondig.
- Giet ~ 10 mL NGM agar medium per schotel in 100 steriele Petri schalen (6,0 cm diameter). Koel het medium in de Petri schalen op kamertemperatuur om een massieve agar te vormen.
- Pipetteer 170 μL van de bacteriële suspensies uit stap 1,7 op de bovengenoemde NGM-agar met een steriele punt. Schud de NGM-agar lichtjes om het LB-medium gelijkmatig over het NGM-agar-oppervlak te verdelen.
- Beënt de NGM agar met de top-side omhoog bij 37 °C voor 8-12 h om een bacterie gazon te vormen.
- Gebruik de meeste agar met bacteriële gazons van stap 2,12 tot kweek nematoden in stap 2,15 of 2,19.
- Winkel 1 of 2 morfologie up-side naar beneden om te voorkomen dat Waterverdamping en verontreiniging in koelkasten bij 4 ° c om de bacteriën in de verontreiniging te ondersteunen.
- Wanneer er minder dan 2.000 nematoden op de kous NGM morfologie (van eerdere experimenten of begaafd uit andere laboratoria), snijd een zesde van de NGM agar die C. elegans met een steriele Tip bevat en breng het over naar nieuw bereide NGM-morfologie met bacteriële gazon (vanaf stap 2,13). Houd de NGM-morfologie naar beneden in een incubator van 22 °c voor de daaropvolgende kweek.
- Wanneer er meer dan 2.000 nematoden op de kous NGM agar zitten, spoelen de nematoden van de NGM agar met 2 mL steriel water in centrifugebuizen. De invoer van 2 mL water resulteert in een output van ongeveer 1,5 mL.
- Laat de nematoden zich in de centrifuge buisjes van 30 min vestigen. Gooi 1 ml van de supernatanten weg door pipetteren en voeg 1 ml steriel water toe aan elke buis om de pellets te wassen (d.w.z. de nematoden).
- Plaats de nematoden in de centrifuge buisjes gedurende 30 min. Gooi 1 ml van de supernatanten weg door pipetten. Voeg 1 mL steriel water toe aan elke buis om de nematoden te hervatten.
- Verdeel de nematode suspensies (in totaal ongeveer 1,5 ml) door het pipetteren van 150 μL op elke nieuwe NGM-agar met bacterieel gazon (vanaf stap 2,13), waardoor in totaal 8-10 nieuwe NGM-morfologie worden gebruikt.
- Houd de NGM-morfologie vanaf stap 2,19 up-side in een incubator van 20 °c, 's nachts en vervolgens naar beneden voor de daaropvolgende cultuur.
- Herhaal stap 2,15 of stap 2.16-2.20 elke drie dagen.
3. bereid gesynchroniseerde eieren en L3 larven van C. elegans
- Spoel de zwangere nematoden en de nieuw geproduceerde eieren van de NGM-morfologie af in steriele centrifugebuizen, met 2 ml steriel water op elke NGM-agar, resulterend in ongeveer 1,5 ml uitvoer.
- Neem de nematoden gedurende 30 minuten in de centrifugebuizen en gooi vervolgens 85% van de supernatanten weg door pipetteren.
- Bereid natriumhypochloriet oplossingen door het oplossen van 0,6 g NaOH en 5 mL NaOCl (4-6% actieve gradiënten, zie de tabel met materialen voor details) met 25 ml water om de naoh tot 0,5 M en NaOCl te brengen tot 1%.
- Meng de pellets van stap 3,2 (Markeer het volume als V0) met 7-voudige V0 natriumhypochloriet oplossingen van (stap 3,3, d.w.z., volume ratio van 1:7)19.
- Schud de centrifugebuizen elke 2 min gedurende 10-15 min om de larven en volwassen nematoden te lyseren; de kleur van nematode suspensies zal draaien van troebel naar Clear.
- Centrifugeer de buisjes op 700 x g gedurende 3 minuten bij 20 °c en gooi de supernatanten vervolgens weg met pipetteren.
- Respendeer de pellets in 5-voudige V0 van steriel water om de eieren die op de leeftijd zijn gesynchroniseerd te wassen. Centrifugeer bij 700 x g gedurende 3 minuten bij 20 °c en gooi de supernatants weg.
- Herhaal stap 3,7 tweemaal.
- Voeg 1-voudige V0 van steriel water toe aan de buizen om de eieren die op de leeftijd zijn gesynchroniseerd te hervatten.
- Verdeel de eieren suspensies door pipetteren van 50 μL op elke nieuwe NGM-morfologie met bacterieel gazon uit stap 2,13. Houd de NGM morfologie top-side in een incubator van 20 °c gedurende 30 minuten, zodat het water verdampd wordt of door het bacteriële gazon kan worden geadsorberen. Maak vervolgens de NGM morfologie naar beneden voor de daaropvolgende cultuur. Markeer de tijd als de Eier tijd (T-ei).
- Bereid K-medium door 3 g NaCl en 2,36 g KCl in 1 L water op te lossen. Steriliseer het medium bij 121 °C en 0,105 MPa gedurende 20 minuten en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
- Wanneer de tijd bereikt 36 h na Tei, de nematoden bereiken de L3 larvenstadium (L3 nematoden)20. Spoel de nematoden van de NGM-morfologie af in centrifugebuizen, met 2 ml steriel water op elke NGM-agar, resulterend in ongeveer 1,5 ml uitvoer.
- Na een bezinking voor 30 min, vervang 85% van de supernatanten (door pipetteren) met K-medium van 2 h om het voedsel in de darmen3.
- Gooi de supernatants weg. Gebruik K-medium (vanaf stap 3,11) voor het aanpassen van de nematode suspensies tot ongeveer 200 nematoden per 100 μL voor volgende experimenten.
4. Gebruik C. elegans voor onderzoek naar het trans-generationele effect
- Bereid chemische oplossingen met 5 concentratieniveaus en één oplosmiddel of absolute controle, d.w.z. 6 groepen in totaal.
- Voeg 100 μL controle-of chemische oplossingen met 10 putjes toe als replicaten in elke groep (d.w.z. 60 putten in totaal) in het middelste gedeelte van een 96-goed steriele microplaat om randeffecten te voorkomen.
- Verdun de nematode suspensies van stap 3,14 met K-medium van stap 3,11 door 10-voudige. Voeg 100 μL nematode suspensies toe aan elk van de 60 putten uit stap 4,2. Markeer de tijd als t0.
- Wanneer de tijd bereikt 24 h na t0, tellen de levende en dode nematoden in de putten. Bereken de mediane dodelijke concentratie (LC50).
- Bereid een reeks van 5 concentraties onder 10% van de LC50 -waarden.
- Voeg 100 μL controle-of chemische oplossingen (vanaf stap 4,5) toe met 10 putjes als replicaten in elke groep (d.w.z. 60 putten in totaal) in het middelste gebied van een 96-goed steriele microplaat om randeffecten te voorkomen.
- Voeg 100 μL K-medium met ongeveer 200 L3 nematoden (vanaf stap 3,14) toe aan elk van de 60 putjes uit stap 4,6. Markeer de tijd als T0.
- Voer de belichting gedurende 24 tot 96 uur uit sinds T0.
- Verzamel na de blootstelling nematoden uit vijf putjes in elke groep in 1,5 mL centrifugebuizen door pipetteren (d.w.z. 6 buizen in totaal).
- Bezinken de nematoden gedurende 30 minuten, gooi de supernatanten weg door pipetteren en regeer en spoel nematoden aan de onderkant met 1 ml gesteriliseerd water.
- Bezinken de nematoden gedurende 30 minuten, gooi de supernatanten weg door pipetteren en gebruik de nematoden aan de onderzijde voor de indicator metingen (zie rubriek 7) van de blootgestelde bovenliggende generatie gemarkeerd als F0.
- Verzamelen, vestigen en wassen (door hersuspendeert) de nematoden van de resterende vijf putjes in elke groep in stap 4,9 volgens stap 4,10.
- Bezinken de nematoden van stap 4,12 gedurende 30 min. Gooi de supernatanten weg door pipetteren en voeg 100 μL steriel water toe om de nematoden te hervatten. Breng de nematode suspensies gelijkmatig over op drie nieuw bereide NGM-morfologie met een bacterieel gazon uit stap 2,13.
- Inincuberen de nematoden voor 36 h om zwangere te worden en de leeftijds synchronisatie uit te voeren volgens de stappen 3.1-3.9. Inbroed de gesynchroniseerde eieren op respectieve NGM-morfologie met bacterieel gazon van stap 2,13 voor 36 uur.
- Spoel de nematoden op de NGM-morfologie van stap 4,14 in zes centrifugebuizen.
- Neem de nematoden gedurende 30 minuten op en gooi de supernatanten weg door pipetteren. Respendeer en was de pellets met 1 mL gesteriliseerd water.
- Neem de nematoden gedurende 30 minuten op en gooi de supernatanten weg door pipetteren. Gebruik de nematoden aan de onderzijde voor de indicator metingen (zie rubriek 7) van de nakomelingen die zijn gemarkeerd als T1.
5. Gebruik C. elegans voor onderzoek naar effect van multi-generationele blootstelling (MGE)
- Meng 99,0 ml NGM-morfologie (vanaf stap 2,9) met 1 ml controle-of chemische oplossingen (lage en hoge concentraties in het huidige protocol als voorbeelden, d.w.z. drie groepen in totaal).
- Giet de ongeveer 10 mL NGM agar medium per gerecht van stap 5,1 in 100 steriele Petri schalen (6,0 cm diameter). Koel het medium in de Petri schalen op kamertemperatuur om een massieve agar te vormen.
- Pipetteer bacteriële suspensies op de agar per stap 2,11.
- Zet de bovenste deksels van de Petri schalen opzij en stel het bacteriële gazon bloot aan UV-licht (145 μW/cm2) in de bioveiligheidskast gedurende 15 minuten.
- Kies een kleine kolonie met behulp van een enten lus, plaats het in lb medium van morfologie in stap 1,4. Inbrokkelt het LB-medium met schudden met een snelheid van 150 rpm bij 37 °C gedurende 24 uur om de bacteriegroei van de negligle te bevestigen, waarbij de Killing Step 5,4 wordt valide.
- Pipetteer de eieren die op leeftijd zijn gesynchroniseerd van stap 3,9 op de morfologie (vanaf stap 5,4). Markeer het begin van de blootstelling aan de bovenliggende generatie f0 en markeer de als dag 0 (D0).
- Inbroed de morfologie voor 3 d bij 20 °c. Dan (d.w.z. op D3), gebruik de rijpe nematoden om effecten te meten in F0 (zie rubriek 7).
- Ook op D3, pick F0 rijpe nematoden op nieuwe NGM morfologie (vanaf stap 5,4) met behulp van een glazen staaf, waarvan het uiteinde is uitgerust met een kunststof vezel draad gebogen in een ring.
- Op D4, pick out en gooi de rijpe F0 nematoden uit NGM agars. Markeer de nieuw uitgekomen nakomelingen nematoden binnen deze 24 h (van D3 tot D4) als F1 om de tweede generatie blootstelling te ervaren.
- Op D6, meet indices (zie rubriek 7) van de F1 volwassen nematoden die 3 dagen lang blootstelling hebben gehad.
- Herhaal de stappen 5.8-5.10 op D9, gebruik F1 nematoden om F2-wormen te reproduceren en effecten op F2-nematoden te meten.
- Herhaal stap 5,11 op D12, gebruik F2 nematoden om F3-wormen te reproduceren en effecten op F3-nematoden te meten. Op dezelfde manier, reproduceren nakomelingen en meten van MGE effecten op de nth nakomelingen generatie (FN).
6. Gebruik C. elegans voor de multi-generationele residuele (Mgr) effectstudie
- Herhaal stap 5.1-5.7. Op D3, kies F0 rijpe nematoden op nieuwe NGM morfologie zonder toegevoegde chemicaliën (vanaf stap 2,13).
- Op D4, pick out en gooi de rijpe F0 nematoden. Markeer de nieuw uitgekomen nakomelingen nematoden binnen deze 24 uur als T1 nematoden.
- Op D6, meet indices (zie rubriek 7) van de T1 volwassen nematoden die zijn gegroeid voor 3 dagen.
- Herhaal de stappen 6.2-6.3 op D9, gebruik T1 nematoden om T2 nematoden te reproduceren en effecten in T1 nematoden te meten.
- Op D12, herhaal stappen 6,4, gebruik T2 nematoden om T3 nematoden te reproduceren en effecten te meten bij T2-nematoden. Op dezelfde manier, reproduceren nakomelingen en meten van MGR effecten op de nth nakomelingen generatie (TN) nematoden van F0, of de nth nakomelingen (TN ') nematoden van FN uit stap 5,12.
7. indicatoren meten
- Bewegingsgedrag meten.
- Spoel de nematoden van de NGM-morfologie af met steriel water en Verzamel ze in centrifugebuizen. Neem de nematoden gedurende 30 minuten, gooi de supernatanten weg en gebruik de nematoden in de pellets voor effect meting.
- Rebreng de nematoden in de pellets met 1 ml steriel water en Pipetteer ze op NGM-morfologie zonder bacterieel gazon uit stap 2,10.
- Gebruik een ontleed Microscoop om de nematoden te scoren voor de (aantal) lichaamsbuig frequentie (BBF), die verwijst naar de tijdstippen waarop de achterste bolletje van de farynx richting verandert langs de verticale richting van het reizende pad binnen een interval van 60 sec.
- Gebruik de ontsnij Microscoop om de omkeer beweging (RM) te scoren die verwijst naar de tijden waarop de reis richting verandert over 90 °, inclusief achterwaartse bochten en Omega Turn (OT) in een interval van 60 s. De OT verwijst naar de beweging wanneer het hoofd van de nematode raakt of bijna zijn staart raakt waardoor de nematode vorm zoals de Griekse letter omega (Ω).
NB: in elke experimentele replicaat werden ten minste 6 nematoden onderzocht voor elke behandeling.
| Voorbeelden voor MGE (F0 tot F3) effecten op reproductie en levensduur met 3 groepen (één controle en twee blootstellings behandelingen). | |||
| Dag | NGM agar-nummer voor MGE-studie | Uitleg | |
| Levensduur | Reproductie | ||
| 0 | 30 (F0-belichting) | 10 replicaties voor elke groep, gemarkeerd als F0-1-1-0 tot F0-3-10-0, met het laatste cijfer om de overlevings dagen weer te geven. | |
| 1 | 30 (F0 overleven 1 d) | F0-1-1-0 tot F0-3-10-0 moet worden gewijzigd in F0-1-1-1 tot F0-3-10-1. | |
| 2 | 30 (F0 overleven 2 d) | F0-1-1-1 tot F0-3-10-1 moet worden gewijzigd in F0-1-1-2 tot F0-3-10-2. | |
| Geen noodzaak om F0 nematoden over te dragen tot 3 d. | |||
| 3 | 30 (F0 overleven 3 d, gewist na nematoden overdracht en verzameling) | Na 3 d zijn F0 nematoden rijp en 36 nieuwe NGM-morfologie (met 2 nematoden op elke agar) worden gebruikt om hun overleving en reproductie te observeren. | |
| 36 (F0-1-1-3 tot F0-3-12-3) | Voorbereidende experimenten moeten worden uitgevoerd om het aantal F0 nematoden te regelen, waarbij ten minste 200 nakomelingen worden verzekerd voor het uitvoeren van multi generationele operaties. | ||
| Met name als de effecten van Mgr worden bestudeerd, moeten de F0 nematoden worden overgebracht naar duidelijke NGM-morfologie zonder chemische blootstelling, en het moet worden genoteerd als T1 start. | |||
| De meeste F0 nematoden worden verzameld om chemische en genetische indexen te meten en de 30 morfologie in F0 worden gewist. | |||
| 4 | 36 (F0-1-1-4 tot F0-3-12-4) | 36 (F1-1-1-1 tot en met F1-3-12-1) | De meting van de levensduur en reproductie vereist elke dag een overdracht. |
| Moeder nematoden op F0-1-1-3 tot F0-3-12-3 worden geplukt op nieuwe NGM morfologie gemarkeerd als F0-1-1-4 tot F0-3-12-4. | |||
| De resterende nakomelingen nematoden (d.w.z. F1 in MGE, of T1 in Mgr) in F0-1-1-3 tot F0-3-12-3 morfologie zijn gegroeid voor 1 d, en de markers worden veranderd in F1-1-1-1 naar F1-3-12-1. Deze morfologie worden ook gebruikt voor het bewaken van de levensduur van F1 met dagelijkse overdracht. | |||
| 5 | 36 (F0-1-1-5 tot F0-3-12-5) | 36 (F1-1-1-2 tot en met F1-3-12-2) | Nematoden op F1-1-1-1 tot en met F1-3-12-1 morfologie zijn gegroeid voor 2 d en worden gemakkelijk waarneembaar en de nematoden worden geteld, en de markers worden veranderd in F1-1-1-2 naar F1-3-12-2. |
| 36 (F0-1-1-4 tot F0-3-12-4) | De nakomelingen nematoden in F0-1-1-4 tot F0-3-12-4 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 6 | 36 (F0-1-1-6 tot F0-3-12-6) | 36 (F0-1-1-4 tot F0-3-12-4, gewist na geteld) | Nematoden op F1-1-1-2 tot en met F1-3-12-2 morfologie zijn gegroeid voor 3 d en de markers worden veranderd in F1-1-1-3 naar F1-3-12-3. Met name de F1 nematoden beginnen te reproduceren F2 op deze dag, F1 nematoden moeten worden overgebracht naar nieuwe NGM morfologie maken F2-1-1-0 tot F1-3-12-0. Voor MGR-studies start T2 vandaag. |
| 36 (F1-1-1-3 tot en met F1-3-12-3) | 36 (F0-1-1-5 tot F0-3-12-5) | Dit kan worden vertraagd door chemische blootstelling, en daarom moeten in elk experiment flexibele veranderingen worden uitgevoerd om te zorgen voor voldoende nematoden voor volgende generaties. | |
| 36 (F2-1-1-0 tot F1-3-12-0) | De nakomelingen nematoden op F0-1-1-4 tot F0-3-12-4 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en de morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | ||
| De nakomelingen nematoden op F0-1-1-5 tot F0-3-12-5 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |||
| 7 | 36 (F0-1-1-7 tot F0-3-12-7) | 36 (F0-1-1-5 tot F0-3-12-5, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden op F0-1-1-5 tot F0-3-12-5 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en de morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F1-1-1-4 tot en met F1-3-12-4) | 36 (F0-1-1-6 tot F0-3-12-6) | Het totale nematode getal in F1-1-1-1 tot en met F1-3-12-1 morfologie, F0-1-1-4 tot F0-3-12-4 morfologie en F0-1-1-5 tot F0-3-12-5 worden gebruikt om de initiële reproductie van F0 te berekenen. | |
| 36 (F2-1-1-1 tot F2-3-12-1) | De nakomelingen nematoden op F0-1-1-6 tot F0-3-12-6 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| De F2 nematoden op F2-1-1-0 tot en met F1-3-12-0 zijn gegroeid voor 1 d en hun markers worden veranderd in F2-1-1-1 naar F2-3-12-1. | |||
| 8 | 36 (F0-1-1-8 tot F0-3-12-8) | 36 (F0-1-1-6 tot F0-3-12-6, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden op F0-1-1-6 tot F0-3-12-6 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en de morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F1-1-1-5 tot F1-3-12-5) | 36 (F0-1-1-7 tot F0-3-12-7) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-7 tot F0-3-12-7-morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |
| 36 (F2-1-1-2 tot F2-3-12-2) | 36 (F1-1-1-4 tot en met F1-3-12-4) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-4 tot F1-3-12-4 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |
| 36 (F2-1-1-1 tot F2-3-12-1, gewijzigd in F2-1-1-2 naar F2-3-12-2 na geteld) | De F2 nematoden op F2-1-1-1 tot F2-3-12-1 zijn gegroeid voor 2 d, de nematoden worden geteld en hun markers worden veranderd in F2-1-1-2 naar F2-3-12-2. | ||
| 9 | 36 (F0-1-1-9 tot F0-3-12-9) | 36 (F0-1-1-7 tot F0-3-12-7, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-7 tot F0-3-12-7-morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en de morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F1-1-1-6 tot F1-3-12-6) | 36 (F1-1-1-4 tot F1-3-12-4, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-4 tot F1-3-12-4 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en de morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F2-1-1-3 tot F2-3-12-3) | 36 (F0-1-1-8 tot F0-3-12-8) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-8 tot F0-3-12-8 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |
| 36 (F3-1-1-0 tot F3-3-12-0) | 36 (F1-1-1-5 tot F1-3-12-5) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-5 tot F1-3-12-5 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |
| De F2 nematoden op F2-1-1-2 tot F2-3-12-2 zijn voor 3 dagen gegroeid en hun markers worden veranderd in F2-1-1-3 tot F2-3-12-3. De F2 nematoden beginnen zich vandaag te reproduceren en worden overgebracht naar 36 nieuwe NGM-morfologie zijn nodig en gemarkeerd als F3-1-1-0 tot F3-3-12-0. Voor MGR-studies, T3 start vandaag. | |||
| 10 | 36 (F0-1-1-10 tot F0-3-12-10) | 36 (F0-1-1-8 tot F0-3-12-8, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-8 tot F0-3-12-8 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F1-1-1-7 tot F1-3-12-7) | 36 (F1-1-1-5 tot F1-3-12-5, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-5 tot F1-3-12-5 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F2-1-1-4 tot F2-3-12-4) | 36 (F0-1-1-9 tot F0-3-12-9) | Het totale nematode getal in F2-1-1-1 tot en met F2-3-12-1, F1-1-1-4 tot en met F1-3-12-4 morfologie en F1-1-1-5 tot en met F1-3-12-5 worden gebruikt om de initiële reproductie van F1 te berekenen. | |
| 36 (F3-1-1-1 tot F3-3-12-1) | 36 (F1-1-1-6 tot F1-3-12-6) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-9 tot F0-3-12-9 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |
| De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-6 tot F1-3-12-6 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |||
| De nakomelingen nematode op F3-1-1-0 tot F3-3-12-0 morfologie zijn gegroeid voor 1 d en de markers worden veranderd in F3-1-1-1 tot F3-3-12-1. | |||
| Met name zal de reproductie van F0 nematoden na de eerste paar dagen aanzienlijk afnemen. Daarom is de nematode-overdracht niet strikt nodig om dagelijks na D10 te zijn en elke 2 dagen kan worden uitgevoerd. Toch vereist de overleving nog steeds dagelijkse observatie. | |||
| Dezelfde regel geldt ook in F1 (T1, T1 '), F2 (T2, T2 ') en F3 (T3, T3 '). | |||
| 11 | 36 (F0-1-1-11 tot F0-3-12-11) | 36 (F0-1-1-9 tot F0-3-12-9, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-9 tot F0-3-12-9 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F1-1-1-8 tot F1-3-12-8) | 36 (F1-1-1-6 tot F1-3-12-6, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-6 tot F1-3-12-6 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F2-1-1-5 tot F2-3-12-5) | 36 (F0-1-1-10 tot F0-3-12-10) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-10 tot F0-3-12-10 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |
| 36 (F3-1-1-2 tot F3-3-12-2) | 36 (F1-1-1-7 tot F1-3-12-7) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-7 tot F1-3-12-7 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |
| 36 (F2-1-1-4 tot F2-3-12-4) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-4 tot F2-3-12-4 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F3-1-1-1 tot F3-3-12-1, gewijzigd in F3-1-1-2 tot F3-3-12-2 na het tellen) | De nematoden op F3-1-1-1 tot F3-3-12-1-morfologie zijn gegroeid voor 2 d, de nematoden worden geteld en de markers worden veranderd in F3-1-1-2 tot F3-3-12-2. | ||
| 12 | 36 (F0-1-1-12 tot F0-3-12-12) | 36 (F0-1-1-10 tot F0-3-12-10, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-10 tot F0-3-12-10 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F1-1-1-9 tot F1-3-12-9) | 36 (F1-1-1-7 tot F1-3-12-7, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-7 tot F1-3-12-7 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F2-1-1-6 tot F2-3-12-6) | 36 (F2-1-1-4 tot F2-3-12-4, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-4 tot F2-3-12-4 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F3-1-1-3 tot F3-3-12-3) | 36 (F0-1-1-11 tot F0-3-12-11) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-11 tot F0-3-12-11-morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |
| 36 (F4-1-1-0 tot F4-3-12-0) | 36 (F1-1-1-8 tot F1-3-12-8) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-8 tot en met F1-3-12-8 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |
| 36 (F2-1-1-5 tot F2-3-12-5) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-5 tot F2-3-12-5 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| De nematoden op F3-1-1-2 tot F3-3-12-2 morfologie zijn gegroeid voor 3 d en de markers worden veranderd in F3-1-1-3 tot F3-3-12-3. De F3 nematoden beginnen vandaag te reproduceren en ze worden overgebracht naar 36 nieuwe NGM-morfologie zijn nodig en gemarkeerd als F4-1-1-0 tot F4-3-12-0. Voor MGR-studies beginnen de nakomelingen van F3 (d.w.z. T1 ') vandaag. | |||
| 13 | 36 (F0-1-1-13 tot F0-3-12-13) | 36 (F0-1-1-11 tot F0-3-12-11, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-11 tot F0-3-12-11-morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F1-1-1-10 tot F1-3-12-10) | 36 (F1-1-1-8 tot F1-3-12-8, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-8 tot F1-3-12-8 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F2-1-1-7 tot F2-3-12-9) | 36 (F2-1-1-5 tot F2-3-12-5, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-5 tot F2-3-12-5 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F3-1-1-4 tot F3-3-12-4) | 36 (F0-1-1-12 tot F0-3-12-12) | Het totale nematode getal in F3-1-1-1 tot en met F3-3-12-1, F2-1-1-4 tot en met F2-3-12-4 morfologie en F2-1-1-5 tot F2-3-12-5 worden gebruikt om de oorspronkelijke reproductie van F2 te berekenen. | |
| 36 (F4-1-1-1 tot F4-3-12-1) | 36 (F1-1-1-9 tot F1-3-12-9) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-12 tot F0-3-12-12-morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |
| 36 (F2-1-1-6 tot F2-3-12-6) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-9 tot F1-3-12-9 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-6 tot F2-3-12-6 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |||
| De nakomelingen nematoden van F3 op F4-1-1-0 tot F4-3-12-0 zijn gegroeid voor 1 d, en markers worden veranderd in F4-1-1-1 naar F4-3-12-1. | |||
| 14 | 36 (F0-1-1-14 tot F0-3-12-14) | 36 (F0-1-1-12 tot F0-3-12-12, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-12 tot F0-3-12-12-morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F1-1-1-11 tot F1-3-12-11) | 36 (F1-1-1-9 tot F1-3-12-9, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-9 tot F1-3-12-9 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F2-1-1-8 tot F2-3-12-8) | 36 (F2-1-1-6 tot F2-3-12-6, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-6 tot F2-3-12-6 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F3-1-1-5 tot F3-3-12-5) | 36 (F4-1-1-1 tot F4-3-12-1, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F3 op F4-1-1-1 tot F4-3-12-1 zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. Voor MGR-studies, T1 ' nematoden zijn gegroeid voor 2 d, en zal beginnen met het reproduceren van T2 ' op de volgende dag (D15), en T2 ' zal beginnen met het reproduceren van T3 ' op D18. De levensduur van wild type C. elegans wordt als 15 dagen geëxampeld. Dan, het einde van T3 ' levensduur zal worden op D33. | |
| 36 (F0-1-1-13 tot F0-3-12-13) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-13 tot F0-3-12-13 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F1-1-1-10 tot F1-3-12-10) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-10 tot F1-3-12-10 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F2-1-1-7 tot F2-3-12-7) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-7 tot F2-3-12-7-morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F3-1-1-4 tot F3-3-12-4) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-4 tot F2-3-12-4 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 15 | 36 (F0-1-1-15 tot F0-3-12-15) | 36 (F0-1-1-13 tot F0-3-12-13, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-13 tot F0-3-12-13 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F1-1-1-12 tot F1-3-12-12) | 36 (F1-1-1-10 tot F1-3-12-10, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-10 tot F1-3-12-10 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F2-1-1-9 tot F2-3-12-9) | 36 (F2-1-1-7 tot F2-3-12-7, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-7 tot F2-3-12-7 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F3-1-1-6 tot F3-3-12-6) | 36 (F3-1-1-4 tot F3-3-12-4, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-4 tot F3-3-12-4 morfologie zijn gegroeid voor 2D, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F0-1-1-14 tot F0-3-12-14) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-14 tot F0-3-12-14 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F1-1-1-11 tot F1-3-12-11) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-11 tot en met F1-3-12-11 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F2-1-1-8 tot F2-3-12-8) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-8 tot F2-3-12-8 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F3-1-1-5 tot F3-3-12-5) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-5 tot F2-3-12-5 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 16 | 36 (F0-1-1-15 tot F0-3-12-15, over) | 36 (F0-1-1-14 tot F0-3-12-14, gewist na geteld) | De levensduur van wild type C. elegans wordt als 15 dagen geëxampeld. Daarom moet F0 alle gestorven zijn vóór dag 16 sinds de blootstelling. |
| 36 (F1-1-1-13 tot en met F1-3-12-13) | 36 (F1-1-1-11 tot F1-3-12-11, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-14 tot F0-3-12-14 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F2-1-1-10 tot F2-3-12-10) | 36 (F2-1-1-8 tot F2-3-12-8, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-11 tot F1-3-12-11 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F3-1-1-7 tot F3-3-12-7) | 36 (F3-1-1-5 tot F3-3-12-5, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-8-F2-3-12-8-morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F0-1-1-15 tot F0-3-12-15) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-5 tot F3-3-12-5 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | ||
| 36 (F1-1-1-12 tot F1-3-12-12) | Het totale nematode getal in F4-1-1-1 tot F4-3-12-1, F3-1-1-4 tot F3-3-12-4 morfologie en F3-1-1-5 tot F3-3-12-5 worden gebruikt om de initiële reproductie van F3 te berekenen. | ||
| 36 (F2-1-1-9 tot F2-3-12-9) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-15 tot F0-3-12-15 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F3-1-1-6 tot F3-3-12-6) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-12 tot F1-3-12-12 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-9 tot F2-3-12-9 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |||
| De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-6 tot F2-3-12-6 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | |||
| 17 | 36 (F1-1-1-14 tot F1-3-12-14) | 36 (F0-1-1-15 tot F0-3-12-15, gewist na geteld, over) | De nakomelingen nematoden van F0 op F0-1-1-15 tot F0-3-12-15 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. Er zullen niet meer F0 nakomelingen zijn. |
| 36 (F2-1-1-11 tot F2-3-12-11) | 36 (F1-1-1-12 tot F1-3-12-12, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-12 tot F1-3-12-12 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F3-1-1-8 tot F3-3-12-8) | 36 (F2-1-1-9 tot F2-3-12-9, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-9 tot F2-3-12-9 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F3-1-1-6 tot F3-3-12-6, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-6 tot F3-3-12-6 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | ||
| 36 (F1-1-1-13 tot en met F1-3-12-13) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-13 tot en met F1-3-12-13 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F2-1-1-10 tot F2-3-12-10) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-10 tot F2-3-12-10 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F3-1-1-7 tot F3-3-12-7) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-7 tot F2-3-12-7-morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 18 | 36 (F1-1-1-15 tot F1-3-12-15) | 36 (F1-1-1-13 tot en met F1-3-12-13, gewist na het tellen) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-13-F1-3-12-13 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F2-1-1-12 tot F2-3-12-12) | 36 (F2-1-1-10 tot F2-3-12-10, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-10 tot F2-3-12-10 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F3-1-1-9 tot F3-3-12-9) | 36 (F3-1-1-7 tot F3-3-12-7, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-7 tot F3-3-12-7-morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F1-1-1-14 tot F1-3-12-14) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-14 tot F1-3-12-14 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F2-1-1-11 tot F2-3-12-11) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-11 tot F2-3-12-11-morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F3-1-1-8 tot F3-3-12-8) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-8 tot F2-3-12-8 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| In MGR studies, T2 ' zal beginnen met het reproduceren van T3 ' vandaag. De levensduur van wild type C. elegans wordt als 15 dagen geëxampeld. Dan, het einde van T3 ' levensduur zal worden op D33. | |||
| 19 | 36 (F1-1-1-15 tot F1-3-12-15, over) | 36 (F1-1-1-14 tot F1-3-12-14, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-14 tot F1-3-12-14 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F2-1-1-13 tot F2-3-12-13) | 36 (F2-1-1-11 tot F2-3-12-11, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-11-F2-3-12-11-morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F3-1-1-10 tot F3-3-12-10) | 36 (F3-1-1-8 tot F3-3-12-8, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-8 tot F3-3-12-8 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F1-1-1-15 tot F1-3-12-15) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-15 tot F1-3-12-15 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F2-1-1-12 tot F2-3-12-12) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-12 tot F2-3-12-12-morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F3-1-1-9 tot F3-3-12-9) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-9 tot F2-3-12-9 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 20 | 36 (F2-1-1-14 tot F2-3-12-14) | 36 (F1-1-1-15 tot F1-3-12-15, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F1 op F1-1-1-14 tot F1-3-12-14 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. Er zullen geen F1-nakomelingen meer zijn. |
| 36 (F3-1-1-11 tot F3-3-12-11) | 36 (F2-1-1-12 tot F2-3-12-12, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-12 tot F2-3-12-12 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F3-1-1-9 tot F3-3-12-9, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-9 tot F3-3-12-9 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | ||
| 36 (F2-1-1-13 tot F2-3-12-13) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-13 tot F2-3-12-13-morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F3-1-1-10 tot F3-3-12-10) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-10 tot F2-3-12-10 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 21 | 36 (F2-1-1-15 tot F2-3-12-15) | 36 (F2-1-1-13 tot F2-3-12-13, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-13-F2-3-12-13-morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F3-1-1-12 tot F3-3-12-12) | 36 (F3-1-1-10 tot F3-3-12-10, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-10 tot F3-3-12-10 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F2-1-1-14 tot F2-3-12-14) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-14 tot F2-3-12-14 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 36 (F3-1-1-11 tot F3-3-12-11) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-11-F2-3-12-11-morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 22 | 36 (F2-1-1-15 tot F2-3-12-15, over) | 36 (F2-1-1-14 tot F2-3-12-14, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-14 tot F2-3-12-14 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F3-1-1-13 tot F3-3-12-13) | 36 (F3-1-1-11 tot F3-3-12-11, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-11 tot F3-3-12-11-morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| 36 (F3-1-1-12 tot F3-3-12-12) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-12 tot F2-3-12-12-morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 23 | 36 (F3-1-1-14 tot F3-3-12-14) | 36 (F2-1-1-15 tot F2-3-12-15, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F2 op F2-1-1-15 tot F2-3-12-15 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. Er zullen geen F2-nakomelingen meer zijn. |
| 36 (F3-1-1-12 tot F3-3-12-12, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-12 tot F3-3-12-12-morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | ||
| 36 (F3-1-1-13 tot F3-3-12-13) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-13 tot F2-3-12-13 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 24 | 36 (F3-1-1-15 tot F3-3-12-15) | 36 (F3-1-1-13 tot F3-3-12-13, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-13 tot F3-3-12-13 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F3-1-1-14 tot F3-3-12-14) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-14 tot F2-3-12-14 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 25 | 36 (F3-1-1-15 tot F3-3-12-15, over) | 36 (F3-1-1-14 tot F3-3-12-14, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-14 tot F3-3-12-14 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. |
| 36 (F3-1-1-15 tot F3-3-12-15) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-15 tot F2-3-12-15 morfologie zijn gegroeid voor 1 d. | ||
| 26 | 36 (F3-1-1-15 tot F3-3-12-15, gewist na geteld) | De nakomelingen nematoden van F3 op F3-1-1-15 tot F3-3-12-15 morfologie zijn gegroeid voor 2 d, en morfologie worden gewist nadat de nematoden zijn geteld. | |
| Met name, in MGR studies, de eerste niet-blootgestelde nakomelingen van F3 (dat wil zeggen, T3 ') zou worden geboren op D18. De levensduur van wild type C. elegans wordt als 15 dagen geëxampeld. Dan, het einde van T3 ' levensduur zal worden op D33. | |||
| Zowel MGE-als MGR-studies zullen meer dagen beslaan wanneer de nematode levensduur langer is. | |||
Tabel 1: lijst van markers en hun definities.
- Meten van reproductie en levensduur in MGE effectstudies.
- Op D0, herhaal stap 5,6. Markeer de morfologie (3 groepen met 10 replicaten in elk) als Fx-a-b-c, waarbij x verwijst naar het generatie nummer, a verwijst naar het groepsnummer (1 voor controle, 2 voor de lage concentratie en 3 voor de hoge concentratie ); b verwijst naar het repliceren van 1 tot 10; en c verwijst naar de belichtingsduur (0 geeft de start aan). Voor D0 markeert de morfologie als F0-1-1-0 tot F0-3-10-0. Lezers kunnen verwijzen naar tabel 1 voor gedetailleerde informatie.
- Op D1, Controleer de nematode groei op de agars, en verander de markeringen van F0-1-1-0 tot F0-3-10-0 tot F0-1-1-1 tot F0-3-10-1.
- Op D2, Controleer de nematode groei op de agars, en verander de markers F0-1-1-2 tot F0-3-10-2.
- Op D3, kies 24 F0 nematoden van elke groep op 12 nieuwe NGM-morfologie met twee NGM agar uit stap 5,4. Markeer de morfologie als F0-1-1-3 tot F0-3-12-3.
- Breng op D4 de twee moeder nematoden over van F0-1-1-3 tot F0-3-12-3 door op nieuwe NGM-morfologie te plukken vanaf stap 5,4. Markeer de nieuwe NGM-morfologie als F0-1-1-4 tot F0-3-12-4. Verander de markers van F0-1-1-3 tot F0-3-12-3 tot en met F1-1-1-1 tot en met F1-3-12-1 om de nakomelingen van F0 (d.w.z. F1) te vertegenwoordigen binnen de eerste dag sinds F0 begint te reproduceren.
- Gebruik op D5 een ontleed Microscoop om de nematoden te tellen op F1-1-1-1 tot F1-3-12-1-morfologie waar de nematoden 2 dagen zijn gegroeid. Laat F1-1-1-1 tot en met F1-3-12-1-morfologie voor opeenvolgende generaties F2 reproduceren.
- Breng de twee moeder nematoden over van F0-1-1-4 tot F0-3-12-4 morfologie door op de nieuwe NGM-morfologie te plukken vanaf stap 5,4. Mark NGM morfologie als F0-1-1-5 tot F0-3-12-5. Verander de markeringen van F0-1-1-4 tot F0-3-12-4 naar F1-1-1-2 tot en met F1-3-12-2 om de nakomelingen van F0 (d.w.z. F1) te vertegenwoordigen binnen de tweede dag sinds F0 begint te reproduceren.
- Tel op D6 de nematoden op F1-1-1-2 tot F1-3-12-2 agars. Breng de bovenliggende nematoden over van F0-1-1-5 tot F0-3-12-5 morfologie tot F0-1-1-6 tot F0-3-12-6. Verander de markers van F0-1-1-5 tot F0-3-12-5 tot F1-1-1-3 tot en met F1-3-12-3 om de nakomelingen van F0 (d.w.z. F1) te vertegenwoordigen binnen de derde dag sinds F0 begint te reproduceren.
- De nematoden op F1-1-1-1 tot en met F1-3-12-1-morfologie zijn voor 3 dagen gegroeid. Gebruik ze om F2 te reproduceren in de daaropvolgende MGE effectstudies. Gebruik op dezelfde manier F2 nematoden om F3 te reproduceren om de MGE effectstudies voort te zetten.
- Breng de twee moeder nematoden op dezelfde manier dagelijks over en Tel de nakomelingen nematoden de volgende dag, totdat de moeder nematoden in 6 NGM-morfologie (d.w.z. de helft van de totale morfologie in elke groep) de voortplanting stopzet.
- Bereken het totale aantal nakomelingen over de gehele reproductie duur als de totale broed grootte. Gebruik het nummer van de nakomelingen binnen de eerste 3 dagen om de oorspronkelijke reproductie van de ouders weer te geven.
- Gebruik de dag waarop de reproductie van de bovenliggende nematode stopt bij 6 NGM-morfologie om de reproductie duur te schatten. Gebruik de dagen die elke individuele ouder heeft overleefd als zijn levensduur.
- Het verkrijgen van de initiële reproductie, reproductie duur, totale broed grootte en levensduur van F1 op dezelfde manier als gedaan voor F0. Evenzo kan, door herhaling van de bovengenoemde procedure, de reproductie-en levensduur-informatie van F2 (naar FN) worden verkregen.
- Meten van reproductie en levensduur in MGR effectstudies.
- Voer stap 7.2.4 uit met de NGM-morfologie uit stap 5,4 die zijn gewijzigd in stap 2,13.
- Biochemische indices meten.
- Spoel de nematoden van de NGM-morfologie af met steriel water en Verzamel ze in centrifugebuizen. Neem de nematoden gedurende 30 minuten en gooi de supernatants weg. Gebruik de nematoden in de pellets voor effect meting.
- Voeg 1 mL ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,0) toe aan de nematoden (pellets) van de 1,5 mL centrifugebuizen om de nematoden te wassen.
- Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en gooi de supernatanten voorzichtig weg met een pipet.
- Maak de pellets bevriezen met vloeibare stikstof of in a-80 °C vriezer.
- Homogeniseren de pellets met behulp van stampers in een ijsbad. Gebruik 200 μL ijskoude PBS om de rest vloeistoffen op de stamper in de centrifugebuis te wassen alvorens de stamper uit te nemen.
- Centrifugeer op 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en gebruik de supernatanten om de activiteiten of hoeveelheden biochemicaliën te bepalen met de commerciële Kits (Zie de tabel met materialen voor details).
- Meet de hoeveelheden van het totale eiwit (TP) in monsters en gebruik de resultaten als de noemer bij het vertegenwoordigen van andere biochemische indicatoren, zodat het verschil tussen de nematode getallen tussen de monsters kan worden geëlimineerd.
- Meet de genexpressie.
- Herhaal stap 7.4.1 tot en met 7.4.4. Isoleer het totale RNA uit de nematode monsters met behulp van een commerciële RNA-extractie Kit (Zie de tabel met materialen voor details) volgens de instructies van de fabrikant21.
- Gebruik het RNA om cDNA te synthetiseren volgens de instructies van de fabrikant21.
- Analyseer het cDNA-monster in de real-time polymerase kettingreactie (RT-PCR) met behulp van SYBR Green RT-PCR-kits volgens de instructies van de fabrikant (Zie tabel met materialen)21.
- Kwantificeer de relatieve uitdrukkings niveaus van de gekozen genen met de 2-δδct -methode22en behandel de uitdrukkings niveaus van het BBP-2 (of een ander referentie-gen) als negatieve referentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier beschrijven we protocollen voor het bestuderen van effecten van chemicaliën over generaties met behulp van C. elegans in trans-GENERATIONELE (TG), multi-generationele blootstelling (MGE) en multi-generationele RESIDUELE (Mgr) effectstudies. Onze eigen onderzoeksresultaten worden als voorbeeld gepresenteerd. Een studie presenteert de TG effecten van zware metalen op motoriek gedrag3. De andere twee studies aanwezig MGE en Mgr effecten van sulfomethoxazol en lindaan op de reproductie en biochemische en genetische indexen metingen4,14.
TG-effecten van zware metalen op het bewegingsgedrag van C. elegans
De TG-effecten van cadmium (cd), koper (Cu), lood (PB) en zink (Zn) op de lichaams buig frequentie (BBF) werden bestudeerd bij de nematode ouder (F0) na blootstelling aan de moeder en hun nakomelingen (T1)3. De effecten van metalen op BBF toonden aan dat de inhibities in T1 groter waren dan in F0, wat leidt tot meer ernstige toxiciteiten van zware metalen op het motorische gedrag in de embryo-blootgestelde nakomelingen dan in de direct blootgestelde ouder. De TG-effecten van zware metalen in milieu-realistische concentraties toonden aan dat de blootstelling van de moeder de gevaren van zware metaal vervuiling in de daaropvolgende generaties kan vermenigvuldigen. Zie Figuur 1.
Figuur 1 : De effecten van cadmium (cd), koper (Cu), lood (PB) en zink (Zn) op de lichaams buigings frequentie van de nematode ouder (F0, blank) na prenatale blootstelling en hun nakomelingen (T1, gearceerd). Foutbalk = standaardfout; * = significant verschillend van het besturingselement, p < 0,05; # = significant verschillend van de lagere concentratie, p < 0,05; + impliceert significant verschillende effecten in F1 dan in F0, p < 0,05. Dit cijfer is gewijzigd van Yu et al.3 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
MGR effecten van sulfamethoxazol (SMX) op de nematode levensduur en reproductie
De effecten van de MGR van sulfamethoxazol (SMX) op de levensduur van nematoden en reproductie14 werden bestudeerd op de geverklaarde ouder (F0), embryo-blootgestelde nakomelingen (T1), germline blootgestelde nakomelingen (T2), de eerste niet-blootgestelde nakomelingen (T3) en de drie volgende generaties (T4-T6). De resultaten toonden aan dat de reproductie (een totale broed grootte als 49% van de controle) significant werd beïnvloed bij blootstelling aan kiembaan (T2), en de toxiciteiten bleven bestaan in niet-blootgestelde generaties van T3 tot T6-generaties (Figuur 2). Onze bevindingen hebben nieuwe bezorgdheid geuit over de lange termijn invloeden van antibiotica zelf, naast hun effecten op de antibioticaresistentie.
Figuur 2 : Broed grootte (in a), uitgedrukt in percentage van de controle) en oorspronkelijke reproductie (B) van C. elegans in de blootgestelde moeder en haar nakomelingen (F0, T1 tot T6, van links naar rechts bij elke concentratie). Foutbalk = standaardfout; a = significant verschillend van de controle door ANOVA (p < 0,05); b = significant verschillend van de controle en van de eerdere generatie bij dezelfde concentratie (p < 0,05); c = significant verschillend van de controle en van de lagere concentratie in dezelfde generatie (p < 0,05); d = significant verschillend van de controle en van de eerdere generatie bij dezelfde concentratie en de lagere concentratie in dezelfde generatie (p < 0,05); e = significant verschillend van de eerdere generatie bij dezelfde concentratie en de lagere concentratie in dezelfde generatie (p < 0,05); f = significant verschillend van de eerdere generatie bij dezelfde concentratie (p < 0,05). Dit cijfer is gewijzigd van Yu et al.14 met toestemming.
MGE-en Mgr-effecten van lindaan op de biochemische en genetische indices van nematode
De effecten van de MGE en Mgr van lindaan (een persistente organische verontreinigende stof [pop]) werden bestudeerd op belangrijke biochemicaliën in de lipide metabolisme en veranderingen in genetische expressie in het verwante insuline-achtige traject4. De resultaten toonden aan dat lindaan gehoorsogene effecten vertoonde met stoornissen in de insuline signaal verordening (Figuur 3). Bovendien gaven de veranderingen tussen SGK-1 (F0, F3, T1 ' en T3 ') en Akt-1 (T1 en T3) signalering aan dat nematoden van verschillende blootstellings generaties verschillende responsstrategieën vertoonden voor tolerantie en vermijding.
Figuur 3 : Veranderingen van de expressieniveaus van belangrijke genen in insuline-achtige signaal traject in nematoden met verschillende blootstellings ervaringen. →: positieve regulering; 
: negatieve regulering; ↑: expressie-up-verordening; ↓: uitdrukking down-regulering. Dit cijfer is gewijzigd van Chen in al.4 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om het beschreven protocol met succes te kunnen uitvoeren, moet rekening worden gehouden met de volgende suggesties. Voer de algemene experimentele operaties uit in een steriele omgeving. Onjuiste werking kan resulteren in besmetting van de E. coli stammen, bijvoorbeeld, schimmels en mijten kunnen de normale groei van C. elegans belemmeren en dus invloed hebben op de experimentele resultaten. In de sectie die de cultiveren c. elegans beschrijft, observeer je de groei schaal van c. elegans op de NGM-morfologie door blote ogen of microscopen. Wanneer de schaal van C. elegans op de agar groter is dan 75% in het gebied, of de kweektijd langer is dan een week, voert u een nieuwe ronde van inoculatie uit om overmatige groei of bevolkingsafname van C. eleganste voorkomen. Gebruik voor het proces van de synchronisatie een microscoop om de groei van C. eleganste observeren en het proces voort te zetten wanneer nematode eieren op grote schaal op de agar worden verdeeld. Als oplosmiddelen (bv. dimethylsulfoxide [DMSO]) worden gebruikt, moeten de concentraties in de voorraadoplossingen bovendien lager zijn dan 1% om ervoor te zorgen dat hun uiteindelijke concentraties niet hoger zijn dan 0,5% (v/v) om de nadelige effecten van de oplosmiddelen zelf te voorkomen. In TG-effectstudies is de duur van de blootstelling over 24 h noodzakelijk om ervoor te zorgen dat de blootstellingstijd de embryonale vorming van de volgende generatie dekt, en de duur moet binnen 96 uur liggen om de volgende generatie scheiding mogelijk te maken. Gebruik kleine hoeveelheden nematoden (meestal binnen 20) voor het meten van de levensduur en reproductie. Aan de andere kant, gebruik grote hoeveelheden nematoden (meestal meer dan 500) voor het meten van biochemische en genetische regulatie indices. Daarom, om voldoende aantal monsters te garanderen, voert u voorbereidende experimenten uit om ongeveer te schatten hoeveel nakomelingen de volwassen F0 nematoden binnen de eerste 24 uur kunnen reproduceren sinds ze beginnen met de voortplanting. Bepaal vervolgens het aantal F0 nematoden dat nodig is om ervoor te zorgen dat er ten minste 200 nakomelingen zijn voor de procedure van multi-generationele studies.
In vergelijking met eerdere rapporten van TG studies met C. elegans, het huidige experimentele protocol was meer attent van de keuze van de levensfase. In C. elegansworden sperma gevormd in L4-fase om de later gevormde eicellen23te bevruchten. Dienovereenkomstig zal de blootstelling met betrekking tot de spermiogenese en de oocytogenese periode een bepaald venster bieden om de TG-effecten op de nakomelingen te bestuderen. De eieren die op de leeftijd zijn gesynchroniseerd, worden gebruikt voor studies met meerdere generationele effecten om ervoor te zorgen dat de blootstelling de totale periode vanaf het begin van elke levenscyclus dekt. Vergeleken met eerdere multi-generationele studies, faciliteerde het huidige experimentele protocol de meting van effecten over meerdere generaties in plaats van slechts 1-2 generaties. Bovendien, het huidige protocol beschouwd als zowel MGE en MGR effecten, die systematischer is dan eerdere studies die alleen gemeten MGE of MGR effecten.
Met name, er zijn nog enkele kwesties in overweging te worden genomen in het huidige experimentele protocol. Het huidige protocol maakt gebruik van wild-type C. elegans waarvan de generatie tijd is rond 60 uur en de levensduur is 20 dagen. Dit maakt de totale duur van het experiment vrij lang (bijvoorbeeld, MGE effectenstudie over levensduur over 3 generaties vereist ten minste 30 dagen). Om de tijd te verkorten, kunnen onderzoekers kiezen voor Mutant C. elegans, zoals de kortstondige Mutant nematoden. Een ander probleem is de moord behandeling op de bacteriën, de live-status van die nodig is om nematoden gezond te houden 24. Ook kan het UV-Killing procesveranderingen in de chemicaliën introduceren25. Daarom moeten andere behandelingen op de bacteriën worden overwogen, en zorgvuldige controle van de chemische veranderingen tijdens het preparaat of het blootstellings proces kan noodzakelijk zijn, vooral voor instabiele verbindingen. Op hetzelfde moment, er zijn beperkingen in het bestuderen van de geslachts verschillen in toxische effecten, omdat het grootste deel van het feit dat C. elegans is hermafrodiet. Verdere verbeteringen om de seksuele bijdrage in de TG, MGE of MGR effecten te onderzoeken zijn nodig. Samenvattend verwachten we dat het voorgestelde protocol van groot belang is voor het gebruik van C. elegans om TG-, MGE-en Mgr-effecten van toxicantia te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van de nationale wetenschap en technologie grote project voor water verontreiniging controle en behandeling (2017ZX07201004), en internationale wetenschap & technologie samenwerkingsprogramma van China (nr. 2016YFE0123700).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar?Corning?America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
References
- Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
- Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
- Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
- Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
- Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
- Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
- Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
- Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
- Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
- Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
- Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
- Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
- Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
- Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
- Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
- Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
- Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
- Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
- Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
- Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).
