Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

השימוש באלמרנים לחקר התופעות הטראנס-והרב של מזדורי הרעילות

Published: July 29, 2019 doi: 10.3791/59367
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2, 1,2
1College of Environmental Sciences and Engineering, Tongji University, 2Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security, 3Jiaxing Tongji Institute of Environment, 4College of Ecological Technique and Engineering, Shanghai Institute of Technology

Summary

השפעות טרנס ומרובות הדורות של כימיקלים מתמידים הם חיוניים לשפוט את ההשלכות לטווח הארוך שלהם בסביבה ועל בריאות האדם. אנו מספקים שיטות מפורטות הרומן ללמוד טרנס ואפקטים רב הדורי באמצעות בעלי חיים בחינם ה, האלקאנס.

Abstract

מידע על רעילות של כימיקלים הם חיוניים ביישום שלהם וניהול פסולת. עבור כימיקלים בריכוזים נמוכים, ההשפעות ארוכות הטווח חשובות מאוד לשפוט את תוצאותיה בסביבה ועל בריאות האדם. במהלך הפגנת השפעות ארוכות טווח, השפעות של כימיקלים לאורך דורות במחקרים שנעשו לאחרונה מספקים תובנה חדשה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור לימוד השפעות של כימיקלים על פני מספר רב של דורות באמצעות שימוש חופשי לחיות באוטרוהאבאנגדיטיס. שני היבטים מוצגים: (1) טרנס-דורי (TG) ו-(2) מחקרי אפקט רב-דורי, האחרון שהוא מופרד לחשיפה רב-דורי (MGE) וללימודי אפקט שיורית רב-דורי (MGR). מחקר האפקט TG הוא חזק עם מטרה פשוטה כדי לקבוע אם חשיפה כימית להורים יכול לגרום לכל השלכות שיורית על הצאצאים. לאחר ההשפעות נמדדות על ההורים, הנתרן פתרונות היפוכלוניט משמשים כדי להרוג את ההורים ולשמור את הצאצאים כדי להקל על מדידת ההשפעה על הצאצאים. מחקר אפקט TG משמש כדי לקבוע אם הצאצאים מושפעים כאשר הוריהם חשופים המזהמים. המחקר באפקט MGE ו-MGR הוא שיטתית כדי לקבוע אם חשיפה דורי מתמשך יכול לגרום לתגובות אדפטיבית צאצאים מעל דורות. האיסוף הזהיר והעברה משמשים כדי להבדיל בין הדורות כדי להקל על מדידת ההשפעה על כל דור. כמו כן, אנו משלבים פרוטוקולים כדי למדוד התנהגות תנועה, רבייה, תוחלת חיים, ביוכימיה ביטוי גנים שינויים. חלק מהניסויים מוצגות גם כדי להמחיש את מחקרי ההשפעה הטרנס-מרובת הדורות.

Introduction

היישום וניהול פסולת של כימיקלים הוא תלוי מאוד במידע של ההשפעות שלהם בריכוזים מסוימים. בעיקר, הזמן הוא מרכיב חיוני נוסף בין השפעות וריכוזים. כלומר, כימיקלים, במיוחד אלה בריכוזים נמוכים בסביבות בפועל, צריך זמן כדי לעורר השפעות מדידה1. לכן, החוקרים מסדרים באורכים שונים את משך החשיפה בניסויים בבעלי חיים, ואף מכסים את מחזור החיים כולו. לדוגמה, עכברים נחשפו ניקוטין עבור 30, 90 או 180 ימים כדי ללמוד את ההשפעות הרעילות שלה 2. עם זאת, משכי חשיפה כאלה עדיין אינם מספיקים כדי להבהיר את ההשפעות לטווח ארוך של מזהמים (למשל, מזהמים אורגניים מתמידים [פופס]) שיכולים להימשך דורות של אורגניזמים בסביבה. לכן, מחקרים על השפעות על הדורות משיגים יותר ויותר תשומת לב.

ישנם שני היבטים עיקריים בלימודי אפקט הדורות. הראשון הוא מחקר אפקט טרנס (TG) אשר יכול לבדוק אם חשיפה כימית להורים יכול לגרום לכל השלכות על הצאצאים3. השני הוא מחקר רב דורי השפעה אשר שיטתית יותר עם שיקולים הן חשיפה ושרידי אפקטים. מצד אחד, החשיפה הרב-דורי (MGE) משמשות להמחשת התגובות האדפטיבית בבעלי חיים לסביבות מאתגרות לטווח ארוך. מצד שני, ההשפעות שיורית רב הדורות (MGR) משמשות כדי להדגים את ההשלכות לטווח ארוך שיורית לאחר החשיפה, מאז חשיפה אימהית מלווה עם חשיפה העובר לצאצאים הראשונים וחשיפה קו הנבט לשני צאצא שהופך את הצאצא השלישי כדור הראשון לחלוטין מתוך חשיפה4.

למרות היונקים (למשל, עכברים) הם אורגניזמים מודל במחקרים רעילות במיוחד ביחס לבני אדם, היישום שלהם ללמוד תופעות הדור הוא די זמן רב, יקר ומוסרית בנוגע 5. לפיכך, האורגניזמים כולל הסרטריניה מגנה על6, חרק drosophila ילה melanogaster7 ו-דג זברה danio rerio8, לספק בחירות חלופיות. עם זאת, אורגניזמים אלה חסרי דמיון לבני אדם, או דורשים ציוד ספציפי במחקרים.

האלגיה הוא נמטודות קטן לחיות בחינם (כ 1 מ"מ אורך) עם מחזור חיים קצר (כ 84 h ב 20 ° c)9. נמטודות זה משתף מסלולים ביולוגיים רבים שמרני לבני אדם, ולכן הוא הועסק באופן נרחב כדי להמחיש את ההשפעות של מתחים שונים או רעלים הרעילות10. בעיקר, 99.5% של נמטודות הם דו-מיניים עושה את האורגניזמים הזה מתאים מאוד ללמוד תופעות הדור, למשל, TG השפעות של מתכות כבדות, סולולדס3,11, השפעות mge של חלקיקי זהב וכבדים מתכות12 וטמפרטורה13, MGR ההשפעות של סולולאמיד14, והן השפעות mge ו-MGR של גמא הקרנה15 ו lindane4. יתרה מזאת, נמצאו תוצאות דומות בין ההשפעות של כימיקלים (לדוגמה, זאלאלנבי) על פיתוח ושעתוק עכברים ו -C. אלגיה16,17, אשר יספק יתרון לשער השפעות של בעל חיים קטן זה לבני אדם.

שני מחקרי אפקט TG ו-MG הם זמן רב וזקוקים לעיצוב וביצועים זהירים. בעיקר, הבדלים קיימים בבחירות לשלב החיים, בתנאי חשיפה ובשיטות הפרדת הדור במחקרים הנ ל. הבדלים כאלה מעכבת את ההשוואה הישירה בין התוצאות והוא הוסיף פרשנות נוספת של התוצאות. לכן, זה הכרחי להקים פרוטוקולים אחידים כדי להנחות את מחקרי האפקטים TG ו-MG, וגם לספק תמונה גדולה יותר כדי לחשוף דפוסים דומים של רעלים שונים או מזהמים בהשלכות ארוכות טווח. המטרה של הפרוטוקולים הנוכחיים תדגים תהליכי פעולה ברורים בלימוד השפעות טראנס-דוריים ובין האלה. הפרוטוקולים ייהנו מחוקרים המעוניינים ללמוד את ההשפעות ארוכת הטווח של רעלים או מזהמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. OP50 התרבות E. coli

  1. להכין 1 M הידרוקסיד נתרן פתרון על ידי המסת 4 גרם של הידרוקסיד נתרן ב 100 mL מים.
  2. הכנת ציר הקימוט (LB) בינוני על ידי המסת 10 גרם של טריטונים, 5 גרם של תמצית שמרים ו 10 גרם נתרן כלוריד עם 1 l של המים אלקטרופורזה ב 1 l בקבוקון חרוט. להתאים את ה-pH כדי 7.0 עם פתרון 1 מ נתרן הידרוקסידי.
  3. מחלקים את המדיום הנוזלי LB משלב 1.2 לתוך 20 מבחנות חרוט (הנפח המקסימלי המותר: 100 mL) עם 50 mL בינונית בכל אחד. כסו את מבחנות החרוט בנייר קראפט.
  4. לחטא את המדיום הנוזלי LB ב 121 ° צ' ו 0.105 MPa עבור 20 דקות. לצנן את מדיום LB עד טמפרטורת החדר.
  5. פיפטה 200 μL מתוך השעיות בקטריאלי (ראה שלב 1.8) או לבחור מושבה קטנה מ agars (בשלב 2.14) באמצעות לולאה לדון, מניחים אותו במדיום LB.
  6. מודטה את המדיום LB עם טלטול ב 150 rpm ב 37 ° צ' עבור 24-48 h. בינונית ליברות תשתנה מנוזל שקוף חום כדי להפוך השעיה בצבע חאקי.
  7. השתמש השעיות בקטריאלי מ 80% של מבחנות סה כ כדי לספק E. coli OP50 כמו מזון נמטודות לשמש בשלב 2.11.
  8. אחסן את שאר הצלוחיות המכילות את השעיות החיידקי במקרר ב -4 ° c. פיפטה 200 μL של השבולים ליברות על הצד העליון של מדיום ליברות טריים (שלב 1.4) וחזור על שלב 1.6 עבור הדגירה הבאה.

2. תרבות מג

הערה: תרבות ג. אלאנים שימוש לפי שלבים 2.1 עד 2.11 בהתבסס על שיטות סטנדרטיות18.

  1. התמוססות 22.8 גרם של K2hpo4• 3h2O ב 100 מ ל של מים מזוקקים סטרילי.
  2. מתמוסס 6.8 גרם של KH2פו4 ב 50 מ ל של מים מזוקקים סטרילי.
  3. מערבבים פתרונות משלבים 2.1 ו 2.2, כדי להכין 1 M K2hpo4-KH 2PO מאגר (pH 6.0, 150 mL בסך הכל).
  4. הכינו 1.0 M mgso4 על ידי המסת 1.232 g של mgso4• 7h2O ב 5 מ ל של מים מזוקקים סטרילי, ולעקר אותו על ידי סינון הפתרון באמצעות 0.22 יקרומטר מסנן קרום חד פעמי סטרילי לתוך מכולה סטרילית.
  5. להכין 1 M cacl2 על ידי המסת 0.554 g של cacl2 ב 5 מ ל של מים מזוקקים סטרילי, ולעקר אותו על-ידי סינון הפתרונות באמצעות מסנן הקרום החד מעוקר של 0.22 יקרומטר לתוך מכולה סטרילית.
  6. להכין פתרון כולסטרול 1 M על ידי המסת 0.025 g של כולסטרול 5 מ ל של אתנול מוחלט, ולעקר אותו על ידי סינון הפתרון באמצעות מסנן הקרום החד מעוקר של 0.22 יקרומטר לתוך מכולה סטרילית.
  7. להכין את הצמיחה נמטודות בינונית (ngm) אגר על ידי הוספת 17 גרם של אבקת אגר, 2.5 g של peptone ו 3 גרם נתרן כלוריד ל 1 l בקבוקון חרוטי המכיל 1 l של מים באולטרטהורים. להוסיף 25 מ ל של K2hpo4-KH2PO4 פתרון משלב 2.3.
  8. לחטא NGM אגר משלב 2.7 בשעה 121 ° צ' עם 0.105 MPa עבור 20 דקות.
  9. Cool-NGM אגר כדי כ 50 ° צ', להוסיף 1 מ ל של 1 M MgSO4, 1 m cacl2, ו 5 מ"ג/mL כולסטרול-אתנול פתרון משלבים 2.4 כדי 2.6 לתוך המדיום ולערבב אותם ביסודיות.
  10. יוצקים ~ 10 mL NGM אגר בינוני לכל מנה לתוך 100 מנות פטרי סטרילי (6.0 בקוטר ס מ). מצננים את המדיום במנות פטרי לטמפרטורת החדר כדי ליצור מוצק אגר.
  11. פיפטה 170 μL של השעיות בקטריאלי משלב 1.7 אל האמור NGM אגר באמצעות טיפ סטרילי. לנענע את אגר NGM מעט כדי להפיץ את המדיום LB באופן שווה על פני השטח NGM אגר.
  12. איחסן NGM אגר עם הצד העליון למעלה ב 37 ° c עבור 8-12 h כדי ליצור מדשאה בקטריאלי.
  13. השימוש ברוב אגר עם מדשאות חיידקית משלב 2.12 לתרבות נמטודות בשלב 2.15 או 2.19.
  14. חנות 1 או 2 agars למעלה למטה כדי למנוע אידוי מים וזיהום במקררים 4 ° c כדי לקיים את החיידקים של זיהום.
  15. כאשר יש פחות מ 2,000 נמטודות על גרב ngm agars (מתוך ניסויים מוקדמים או מחוננים ממעבדות אחרות), גזור אחד שישית של ngm אגר המכיל C. אלגיה עם טיפ סטרילי ולהעביר אותו agars ngm החדש מוכן עם חיידקים דשא (משלב 2.13). שמרו על האגארים הנמצאים בקצה השני, בחממה של 22 ° c לתרבות הבאה.
  16. כאשר יש יותר מ 2,000 נמטודות על גרב ngm אגר, לשטוף את נמטודות של באגר ngm עם 2 מ ל של מים סטרילי צינורות צנטריפוגה. הקלט של 2 מ ל של מים יגרום פלט של כ 1.5 mL.
  17. הניחו לנמטודות להתיישב בצינורות הצנטריפוגה מתוך 30 דקות. השמט 1 מ ל של סופרנטנים על ידי ליטוף ולהוסיף 1 מ ל של מים סטרילי לתוך צינור כל לשטוף את כדורי (כלומר, נמטודות).
  18. התיישב את הנמטודות בצינורות הצנטריפוגה למשך 30 דקות. להיפטר 1 מ ל של סופרנטנים על ידי ליטוף. הוסיפו 1 מ ל של מים סטריליים לתוך כל צינור כדי להשעות מחדש את הנמטודות.
  19. הפץ את השעיות נמטודות (כ 1.5 mL בסך הכל) על ידי pipetting 150 μl על כל חדש ngm אגר עם מדשאה בקטריאלי (משלב 2.13), עושה 8-10 agars ngm חדש בסך הכל.
  20. שמור את agars NGM משלב 2.19 למעלה-למעלה בחממה 20 ° c לילה ולאחר מכן למטה לצד התרבות הבאה.
  21. חזור על שלב 2.15 או צעד 2.16-2.20 כל שלושה ימים.

3. להכין ביצים מסונכרנות ו הזחלים L3 של ג. אלגיה

  1. לרוקן את gravid נמטודות וביצים המיוצרים לאחרונה מן agars ngm לתוך צינורות צנטריפוגה סטרילי, עם 2 מ ל של מים סטרילי על כל התוצרת ngm אגר וכתוצאה מכך כ 1.5 mL של פלט.
  2. התיישב את הנמטודות בצינורות הצנטריפוגה למשך 30 דקות, ולאחר מכן התעלם מ-85% מהסופרנטנים על-ידי ליטוף.
  3. הכנת הנתרן היפוכלוניט פתרונות על ידי המסת 0.6 g של NaOH ו-5 מ ל של NaOCl (4-6% הדרגתיים פעילים, לראות את הטבלה של חומרים לפרטים) עם 25 מ ל של מים כדי להביא את naoh ל 0.5 M ו naocl ל 1%.
  4. לערבב את כדורי משלב 3.2 (לסמן את עוצמת הקול כמו V0) עם 7-מקפלים v0 של פתרונות רדמה נתרן מ (שלב 3.3, כלומר, יחס הנפח של 1:7)19.
  5. לנער את צינורות צנטריפוגה כל 2 דקות עבור 10-15 דקות כדי lyse את הזחלים nematodes למבוגרים; הצבע של השעיות נמטודות יהפוך מ נחל דלוח כדי לנקות.
  6. צנטריפוגה את הצינורות ב 700 x g עבור 3 דקות ב 20 ° c, ולאחר מכן לבטל את הסופרנטנמלים על ידי ליטוף.
  7. השהה מחדש את כדורי ב 5 מקפלים V0 של מים סטרילי לשטוף את הגיל-מסונכרן ביצים. צנטריפוגה ב 700 x g עבור 3 דקות ב 20 ° c, ולאחר מכן למחוק את הסופרנטנמלים.
  8. חזור על שלב 3.7 פעמיים.
  9. הוסף V0 קיפול 1 של מים סטריליים לתוך צינורות להשעות מחדש את הגיל-מסונכרן ביצים.
  10. הפצת הביצים השעיות על ידי pipetting 50 μL על כל agars חדש NGM עם מדשאה בקטריאלי משלב 2.13. שמור את agars ngm בצד העליון של 20 ° c בחממה עבור 30 דקות, המאפשר למים להתאדות או להיות נספחת על ידי הדשא חיידקי. ואז, לעשות את agars NGM למעלה-בצד למטה עבור התרבות הבאה. סמן את השעה כזמן הביצה (T ביצה).
  11. להכין K-בינוני על ידי המסת 3 g של הנרוג ו 2.36 g של KCl ב 1 L של מים. לחטא את המדיום ב 121 ° צ' ו 0.105 MPa עבור 20 דקות ולצנן אותו לטמפרטורת החדר.
  12. כאשר הזמן מגיע 36 hלאחר ביצה T, נמטודות תגיע לשלב הזחלים l3 (l3)20. לרוקן את נמטודות את agars ngm לתוך צינורות צנטריפוגה, עם 2 מ ל של מים סטרילי על כל ngm אגר וכתוצאה מכך כ 1.5 mL של פלט.
  13. לאחר ההתיישבות במשך 30 דקות, להחליף 85% של סופרנטנמלים (על ידי ליטוף) עם K-medium מ 2 h כדי לעכל את המזון במעיים3.
  14. . להיפטר מהסופרנטנמלים השתמש ב-K-medium (משלב 3.11) כדי לכוונן את השעיות נמטודות ל כ 200 נמטודות לכל 100 μl עבור הניסויים הבאים.

4. השתמש ב-C. אלגיה למחקר של אפקט טרנס-דורי

  1. הכנת פתרונות כימיים עם 5 רמות ריכוז ושליטה אחת ממס או מוחלטת, כלומר, 6 קבוצות בסך הכל.
  2. הוסף 100 μL של שליטה או פתרונות כימיים עם 10 בארות כמו משכפל בכל קבוצה (כלומר, 60 בארות בסך הכל) לתוך האזור האמצעי של 96-מיקרוצלחת סטרילי היטב כדי למנוע השפעות קצה.
  3. לדלל את השכקויות נמטודות משלב 3.14 עם K-בינוני משלב 3.11 על-ידי קיפול 10. להוסיף 100 μl נמטודות השבולים לכל אחד 60 בארות משלב 4.2. סמן את השעה כ-t0.
  4. כאשר הזמן מגיע 24 שעות אחרי t0, לספור את היצורים חיים ומתים בבארות. חישוב הריכוז הקטלני החציוני (LC50).
  5. הכן סדרה של 5 ריכוזים מתחת 10% של ערכי LC50 .
  6. הוסף 100 μL של שליטה או פתרונות כימיים (משלב 4.5) עם 10 בארות כמו משכפל בכל קבוצה (כלומר, 60 בארות בסך הכל) לתוך האזור האמצעי של 96-היטב מיקרופלייט סטרילי כדי למנוע השפעות קצה.
  7. הוסף 100 μl של K-בינוני המכיל כ 200 L3 נמטודות (משלב 3.14) לכל אחד הבארות 60 משלב 4.6. סמן את השעה כ-T0.
  8. בצע את החשיפה עבור 24 עד 96 h מאז T0.
  9. לאחר החשיפה, לאסוף נמטודות מחמש בארות בכל קבוצה לתוך 1.5 mL צנטריפוגה צינורות על ידי ליטוף (כלומר, 6 צינורות בסך הכל).
  10. ליישב את הנמטודות במשך 30 דקות, להשליך את הסופרנטנים על ידי ליטוף, ו להשהות ולשטוף מחדש בתחתית עם 1 מ ל של מים מעוקר.
  11. ליישב את הנמטודות במשך 30 דקות, להשליך את הסופרנטנים על ידי ליטוף ולהשתמש נמטודות בתחתית עבור מדידות אינדיקטור (ראה סעיף 7) של דור ההורה חשוף מסומן כ F0.
  12. לאסוף, להתיישב ולשטוף (על ידי השעיית) נמטודות מתוך חמש הבארות הנותרות בכל קבוצה בשלב 4.9 על פי שלב 4.10.
  13. ליישב את הנמטודות משלב 4.12 במשך 30 דקות. להיפטר על ידי מלטף ולהוסיף 100 μl של מים סטרילי כדי להשעות מחדש את נמטודות. העבר את השעיות נמטודות באופן שווה על שלושה החדש מוכן agars ngm עם מדשאה בקטריאלי משלב 2.13.
  14. מודרת נמטודות עבור 36 h להפוך gravid ולבצע סינכרון גיל על פי שלבים 3.1-3.9. מודטה את הביצים מסונכרנים על agars NGM המתאימים עם מדשאה בקטריאלי משלב 2.13 עבור 36 h.
  15. לרוקן את נמטודות על agars ngm משלב 4.14 לתוך שש צינורות צנטריפוגה.
  16. ליישב את הנמדות במשך 30 דקות, ולהשליך את הסופרנטנים על ידי ליטוף. השהה מחדש ושטוף את כדורי עם 1 מ ל של מים מעוקרים.
  17. ליישב את הנמדות במשך 30 דקות, ולהשליך את הסופרנטנים על ידי ליטוף. השתמשו בנמטודות בתחתית למדידות המחוונים (ראו סעיף 7) של דור הצאצאים המסומן כ-T1.

5. השתמש ב-C. אלגיה עבור חשיפה רב דורי (mge) מחקר אפקט

  1. מערבבים 99.0 mL NGM agars (משלב 2.9) עם 1 מ ל של שליטה או פתרונות כימיים (ריכוזים נמוכים וגבוהים בפרוטוקול הנוכחי כדוגמאות, כלומר, שלוש קבוצות בסך הכל).
  2. יוצקים את כ 10 מ ל של NGM אגר בינונית למנה משלב 5.1 לתוך 100 מנות פטרי סטרילי (6.0 ס"מ קוטר). מצננים את המדיום במנות פטרי לטמפרטורת החדר כדי ליצור מוצק אגר.
  3. פיפטה בקטריאלי משעיות על אל אגר לפי שלב 2.11.
  4. הניחו את העפעפיים העליונים של מנות פטרי וחשפו את הדשא החיידקי לאור אולטרא-סגול (145 μW/cm2) בארון הביובטיחות במשך 15 דקות.
  5. בחר מושבה קטנה באמצעות לולאה להגבר, למקם אותו בינוני LB מ agars בשלב 1.4. דגירה המדיום LB עם טלטול במהירות של 150 סל ד ב 37 ° צ' עבור 24 שעות כדי לאשר את הצמיחה חיידקי negligle, אימות שלב ההריגה 5.4.
  6. פיפטה הגיל-מסונכרן ביצים משלב 3.9 אל האגארים (משלב 5.4). סמן את תחילת החשיפה לדור האב F0 וסמן את התאריך 0 (D0).
  7. מקרין את האגארים עבור 3 ד ב 20 ° c. אז (כלומר, על D3), להשתמש בנמטודות בוגרים כדי למדוד את ההשפעות ב F0 (ראה סעיף 7).
  8. גם על D3, לקחת F0 מבוגרים על גבי agars חדש NGM (מ שלב 5.4) באמצעות מוט זכוכית, אשר הקצה מצויד תיל סיבים מעשה ידי אדם כפוף לטבעת.
  9. על D4, לבחור ולהיפטר F0 נמטודות בוגרת מ ngm agars. סמן את נמטודות צאצא מקווקו בתוך אלה 24 h (מ D3 כדי D4) כמו F1 לחוות הדור השני חשיפה.
  10. ב D6, למדוד מדדים (ראה סעיף 7) של נמטודות מבוגרים F1 כי חוו חשיפה במשך 3 ימים.
  11. ב-D9, חזור על שלבים 5.8-5.10, השתמש ב-F1 נמטודות כדי לשכפל תולעים f2 ולמדוד אפקטים ב-F2 נמטודות.
  12. ב-D12, חזור על שלב 5.11, השתמש באפשרות נמטודות F2 כדי לשכפל תולעים f3 ולמדוד אפקטי מדידה בנמטודות f3. באותו אופן, לשכפל צאצאים ולמדוד אפקטים MGE בדור nהצאצאים (Fn).

6. השתמש ב-C. אלגיה עבור מחקר אפקט שיורית רב דורי (MGR)

  1. חזור על שלבים 5.1-5.7. על D3, לקחת F0 מבוגרים על גבי agars NGM חדש ללא כימיקלים הוסיף (משלב 2.13).
  2. ב D4, לבחור ולהיפטר F0 nematodes בוגרת. סמן את הצאצאים החדשים של צאצא מקווקו בתוך אלה 24 שעות כמו T1 נמטודות.
  3. ב-D6, מדדי למידה (ראו סעיף 7) של הנמטודות הבוגרים של T1 שגדלו במשך 3 ימים.
  4. ב-D9, חזור על שלבים 6.2-6.3, השתמש ב-t1 נמטודות כדי לשכפל נמטודות T2 ולמדוד אפקטים ב-t1 נמטודות.
  5. ב-D12, חזור על שלבים 6.4, השתמש בנמטודות t2 כדי לשכפל ממטידות T3 ולמדוד את ההשפעות ב נמטודות t2. באותו אופן, לשכפל צאצאים ולמדוד אפקטים של MGR על הדור nהצאצאים (tn) נמטודות של F0, או הצאצאים n(tn) של Fn משלב 5.12.

7. מדדי מחוונים

  1. מדידת התנהגות תנועה.
    1. לרוקן את נמטודות את agars ngm באמצעות מים סטריליים ולאסוף אותם צינורות צנטריפוגה. ליישב את נמטודות עבור 30 דקות, להיפטר supernatants ולהשתמש נמטודות בתוך כדורי מדידה להשפיע.
    2. להשעות את נמטודות בתוך כדורי עם 1 מ ל של מים סטרילי ופיפטה אותם אל ngm agars ללא מדשאה בקטריאלי משלב 2.10.
    3. השתמש במיקרוסקופ מבתר כדי להבקיע נמטודות עבור (מספר של) הגוף מכופף תדר (bbf) אשר מתייחס לזמנים הנורה האחורי של הלוע שינוי הכיוון לאורך הכיוון האנכי של הנתיב נסיעה בתוך מרווח של 60 s.
    4. השתמש מיקרוסקופ מבתר כדי להבקיע התנועה היפוך (RM) אשר מתייחס לזמנים כאשר כיוון נסיעה משתנה מעל 90 ° כולל פונה לאחור ולהפוך אומגה (OT) במרווח של 60 s. ה-OT מתייחס לתנועה כאשר הראש של נמטודות נוגע או כמעט נוגע זנבו עושה את הצורה נמטודות כמו האות היוונית אומגה (Ω).
      הערה: לפחות 6 הנמדות נבדקו עבור כל טיפול בכל שכפול ניסיוני.
דוגמאות עבור אפקטים MGE (F0-F3) על שעתוק ותוחלת חיים עם 3 קבוצות (שליטה אחת ושני טיפולי חשיפה).
יום NGM אגר מספר עבור מחקר MGE סבר
תוחלת רבייה
0 30 (חשיפה F0) 10 משכפל עבור כל קבוצה, מסומן כ-F0-1-0 עד F0-3-10-0, עם הספרה האחרונה כדי להציג את ימי ההישרדות.
1 30 (F0 לשרוד 1 ד) F0-1-1-0 כדי F0-3-10-0 יש לשנות כדי F0-1-1-1 עד F0-3-10-1.
2 30 (F0 לשרוד 2 ד) F0-1-1-1 כדי F0-3-10-1 יש לשנות ל F0-1-1-2 כדי F0-3-10-2.
אין צורך להעביר F0 נמטודות עד 3 ד.
3 30 (F0 לשרוד 3 ד, נוקה לאחר העברה נמטודות ואיסוף) לאחר 3 ד, F0 נמטודות בוגרים ו 36 ngm agars חדש (עם 2 נמטודות על כל אגר) משמשים כדי להתבונן ההישרדות שלהם רבייה.
36 (F0-1-1-3 עד F0-3-12-3) ניסויים ראשוניים יש לבצע כדי להסדיר את מספר F0 nematodes, המבטיח לפחות 200 צאצאים להצליח פעולות רב דורי.
בעיקר, אם השפעות MGR נלמדים, F0 נמטודות צריך להיות מועבר אל agars ngm ברור ללא חשיפה כימית, וזה צריך להיות מצוין כמו T1 להתחיל.
רוב F0 נמטודות נאספים למדוד מדדים כימיים וגנטיים ו 30 agars ב F0 מנוקה.
4 36 (F0-1-1-4 עד F0-3-12-4) 36 (f1-1-1-1 עד F1-3-12-1) המדידה על תוחלת החיים והרבייה דורשת העברה כל יום.
ההורה נמטודות ב-F0-1-1-3 כדי F0-3-12-3 הם הרים על אגארים חדשים שסומנו כ-F0-1-1-4 כדי F0-3-12-4.
הצאצאים הנותרים נמטודות (כלומר, F1 ב mge, או T1 ב-MGR) ב F0-1-1-3 כדי F0-3-12-3 agars גדלו עבור 1 d, ואת הסמנים מוחלפים F1-1-1 -1 כדי f1-3-12-1. Agars אלה משמשים גם כדי לפקח על תוחלת החיים של F1 עם העברה יומית.
מיכל 5 36 (F0-1-1-5 עד F0-3-12-5) 36 (f1-1-1-2 עד F1-3-12-2) מטודות על f1-1-1-1 עד F1-3-12-1 agars גדלו עבור 2 ד ולהיות בקלות הנצפה ו נמטודות נספרים, ואת סמנים מוחלפים f1-1-1-2 כדי f1-3-12-2.
36 (F0-1-1-4 עד F0-3-12-4) הצאצאים F0-1-1-4 כדי F0-3-12-4 agars גדלו עבור 1 ד.
6 36 (F0-1-1-6 עד F0-3-12-6) 36 (F0-1-1-4 עד F0-3-12-4, נוקה לאחר ספירה) Nematodes על F1-1-1-2 כדי F1-3-12-2 agars גדלו עבור 3 ד וסמנים מוחלפים F1-1-1-3 כדי F1-3-12-3. בעיקר, הנמטודות f1 להתחיל לשכפל F2 ביום זה, f1 נמטודות צריך להיות מועבר על החדש ngm agars הפיכת F2-1-1-0 כדי F1-3-12-0. למחקרים של MGR, T2 מתחילים היום.
36 (f1-1-1-3 עד F1-3-12-3) 36 (F0-1-1-5 עד F0-3-12-5) זה יכול להיות מתעכב על ידי חשיפה כימית, ולכן שינויים גמישים צריך להתבצע בכל ניסוי כדי להבטיח מספיק נמטודות עבור הדורות הבאים.
36 (F2-1-1-0 עד F1-3-12-0) נמטודות צאצאים על F0-1-1-4 כדי F0-3-12-4 agars גדלו עבור 2 d, ואת agars מנוקה לאחר נמטודות נספרות.
הצאצאים על F0-1-1-5 כדי F0-3-12-5 agars גדלו עבור 1 ד.
7 36 (F0-1-1-7 עד F0-3-12-7) 36 (F0-1-1-5 עד F0-3-12-5, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא על F0-1-1-5 כדי F0-3-12-5 agars גדלו עבור 2 d, ואת agars מנוקה לאחר נמטודות נספרות.
36 (f1-1-1-4 עד F1-3-12-4) 36 (F0-1-1-6 עד F0-3-12-6) מספר נמטודות הכולל ב-F1 -1-1-1 עד F1-3-12-1 agars, F0-1-1-4 כדי F0-3-12-4 agars ו F0-1-1-5 כדי F0-3-12-5 משמשים לחישוב הרבייה הראשונית של F0.
36 (f2-1-1-1 ל-F2-3-12-1) הצאצאים של צאצא על F0-1-1-6 כדי F0-3-12-6 agars גדלו עבור 1 ד.
הנמטודות F2 ב-F2-1-1-0 עד F1-3-12-0 גדלו עבור 1 d והסמנים שלהם מוחלפים ב F2-1-1- -1 ל-F2-3-12-1.
8 36 (F0-1-1-8 עד F0-3-12-8) 36 (F0-1-1-6 עד F0-3-12-6, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא על F0-1-1-6 כדי F0-3-12-6 agars גדלו עבור 2 d, ואת agars מנוקה לאחר נמטודות נספרות.
36 (f1-1-1-5 עד F1-3-12-5) 36 (F0-1-1-7 עד F0-3-12-7) הצאצאים של F0 על F0-1-1-7 כדי F0-3-12-7 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (f2-1-1-2 כדי F2-3-12-2) 36 (f1-1-1-4 עד F1-3-12-4) הצאצאים של הצאצא F1 על F1-1-1-4 כדי F1-3-12-4 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (f2-1-1-1 ל-F2-3-12-1, השתנה ל-F2-1-1-2 ל-F2-3-12-2 לאחר הספירה) הנמטודות F2 ב-F2-1-1-1 ל-F2-3-12-1 גדלו עבור 2 ד, הנמטודות נספרים והסמנים שלהם מוחלפים ב-F2-1-1-2 כדי F2-3-12-2.
9 36 (F0-1-1-9 עד F0-3-12-9) 36 (F0-1-1-7 עד F0-3-12-7, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של F0 על F0-1-1-7 כדי F0-3-12-7 agars גדלו עבור 2 d, ואת agars מנוקה לאחר נמטודות נספרות.
36 (f1-1-1-6 עד F1-3-12-6) 36 (f1-1-1-4 עד F1-3-12-4, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא f1 על f1-1-1-4 כדי f1-3-12-4 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f2-1-1-3 כדי F2-3-12-3) 36 (F0-1-1-8 עד F0-3-12-8) הצאצאים של F0 על F0-1-1-8 כדי F0-3-12-8 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (F3-1-1-0 ל-F3-3-12-0) 36 (f1-1-1-5 עד F1-3-12-5) הצאצאים של הצאצא F1 על F1-1-1-5 כדי F1-3-12-5 agars גדלו עבור 1 ד.
הנמדות F2 ב F2-1-1-2 כדי F2-3-12-2 גדלו במשך 3 ימים והסמנים שלהם מוחלפים F2-1-1-3 כדי F2-3-12-3. נמטודות F2 להתחיל לשכפל היום והם מועברים 36 החדש ngm agars נדרשים ומסומנים f3-1-1-0 כדי F3-3-12-0. למחקרים של MGR, מתחיל היום T3.
10 36 (F0-1-1-10 עד F0-3-12-10) 36 (F0-1-1-8 עד F0-3-12-8, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של F0 על F0-1-1-8 כדי F0-3-12-8 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f1-1-1-7 עד F1-3-12-7) 36 (f1-1-1-5 עד F1-3-12-5, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא f1 על f1-1-1-5 כדי f1-3-12-5 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f2-1-1-4 כדי F2-3-12-4) 36 (F0-1-1-9 עד F0-3-12-9) מספר נמטודות הכולל ב f2-1-1-1 ל-f2-3-12-1, F1-1-1-4 כדי f1-3-12-4 agars ו-f1-1-1-5 ל-f1-3-12-5 משמשים לחישוב הרבייה הראשונית של F1.
36 (F3-1-1-1 עד F3-3-12-1) 36 (f1-1-1-6 עד F1-3-12-6) הצאצאים של F0 על F0-1-1-9 כדי F0-3-12-9 agars גדלו עבור 1 ד.
הצאצאים של הצאצא F1 על F1-1-1-6 כדי F1-3-12-6 agars גדלו עבור 1 ד.
הצאצא נמטודות על f3-1-1-0 ל-f3-3-12-0 agars גדלו עבור 1 d והסמנים משתנים לתוך F3-1-1 -1 עד f3-3-12-1.
בעיקר, שעתוק F0 נמטודות יקטן באופן משמעותי לאחר מספר ימים הראשונים. לכן, העברת נמטודות לא נדרש בקפדנות להיות מדי יום לאחר D10 והוא יכול להתבצע כל יומיים. עם זאת, ההישרדות עדיין דורשת התבוננות יומית.
אותו כלל חל גם ב F1 (T1, T1), F2 (T2, T2) ו-F3 (T3, T3).
11 36 (F0-1-1-11 עד F0-3-12-11) 36 (F0-1-1-9 עד F0-3-12-9, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של F0 על F0-1-1-9 כדי F0-3-12-9 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars מנוקה לאחר נמטודות נספרות.
36 (f1-1-1-8 עד F1-3-12-8) 36 (f1-1-1-6 עד F1-3-12-6, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא f1 על f1-1-1-6 כדי f1-3-12-6 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f2-1-1-5 כדי F2-3-12-5) 36 (F0-1-1-10 עד F0-3-12-10) הצאצאים של F0 על F0-1-1-10 עד F0-3-12-10 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (F3-1-1-2 עד F3-3-12-2) 36 (f1-1-1-7 עד F1-3-12-7) הצאצאים של הצאצא F1 על F1-1-1-7 כדי F1-3-12-7 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (f2-1-1-4 כדי F2-3-12-4) הצאצאים של צאצא של F2 על F2-1-1-4 כדי F2-3-12-4 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (F3-1-1-1 עד F3-3-12-1, השתנה ל-F3-1-1-2 עד F3-3-12-2 לאחר הספירה) הנמטודות ב-F3 -1-1-1 עד F3-3-12-1 agars גדלו עבור 2 ד, הנמטודות נספרים והסמנים משתנים לתוך F3-1-1-2 ל-F3-3-12-2.
12 36 (F0-1-1-12 עד F0-3-12-12) 36 (F0-1-1-10 עד F0-3-12-10, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של F0 על F0-1-1-10 עד F0-3-12-10 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f1-1-1-9 עד F1-3-12-9) 36 (f1-1-1-7 עד F1-3-12-7, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא f1 על f1-1-1-7 כדי f1-3-12-7 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f2-1-1-6 כדי F2-3-12-6) 36 (f2-1-1-4 עד F2-3-12-4, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של f2 על f2-1-1-4 כדי f2-3-12-4 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-3 עד F3-3-12-3) 36 (F0-1-1-11 עד F0-3-12-11) הצאצאים של F0 על F0-1-1-11 עד F0-3-12-11 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (f4-1-1-0 ל-F4-3-12-0) 36 (f1-1-1-8 עד F1-3-12-8) הצאצאים של הצאצא F1 על F1-1-1-8 כדי F1-3-12-8 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (f2-1-1-5 כדי F2-3-12-5) הצאצאים של צאצא של F2 על F2-1-1-5 כדי F2-3-12-5 agars גדלו עבור 1 ד.
הנמטודות ב-F3-1-1-2 ל-F3-3-12-2 agars גדלו עבור 3 ד ו סמנים מוחלפים F3-1-1-3 כדי F3-3-12-3. נמטודות F3 להתחיל לשכפל היום והם מועברים 36 חדש ngm agars נדרשים ומסומנים כ-f4 1-1-0 ל-f4-3-12-0. למחקרים של MGR, צאצאים של F3 (קרי, T1) מתחילים היום.
13 36 (F0-1-1-13 עד F0-3-12-13) 36 (F0-1-1-11 עד F0-3-12-11, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של F0 ב-F0-1-1-11 עד F0-3-12-11 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f1-1-1-10 עד F1-3-12-10) 36 (f1-1-1-8 עד F1-3-12-8, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא f1 על f1-1-1-8 כדי f1-3-12-8 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f2-1-1-7 כדי F2-3-12-9) 36 (f2-1-1-5 ל-F2-3-12-5, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של f2 על f2-1-1-5 כדי f2-3-12-5 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-4 עד F3-3-12-4) 36 (F0-1-1-12 עד F0-3-12-12) מספר נמטודות הכולל ב f3-1 -1-1 ל-f3-3-12-1, F2-1-1-4 ל-f2-3-12-4 agars ו-f2-1-1-5 ל-f2-3-12-5 משמשים לחישוב הרבייה הראשונית של F2.
36 (f4-1-1-1 עד F4-3-12-1) 36 (f1-1-1-9 עד F1-3-12-9) הצאצאים של F0 על F0-1-1-12 עד F0-3-12-12 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (f2-1-1-6 כדי F2-3-12-6) הצאצאים של הצאצא F1 על F1-1-1-9 כדי F1-3-12-9 agars גדלו עבור 1 ד.
הצאצאים של צאצא של F2 על F2-1-1-6 כדי F2-3-12-6 agars גדלו עבור 1 ד.
הצאצאים של הצאצא של F3 ב-F4-1-1-0 ל-F4-3-12-0 גדלו עבור 1 d, וסמנים משתנים ל-F4-1-1- -1 ל-F4-3-12-1.
14 36 (F0-1-1-14 עד F0-3-12-14) 36 (F0-1-1-12 עד F0-3-12-12, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של F0 ב-F0-1-1-12 עד F0-3-12-12 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f1-1-1-11 עד F1-3-12-11) 36 (f1-1-1-9 עד F1-3-12-9, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא f1 על f1-1-1-9 כדי f1-3-12-9 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f2-1-1-8 כדי F2-3-12-8) 36 (f2-1-1-6 כדי F2-3-12-6, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של f2 על f2-1-1-6 כדי f2-3-12-6 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-5 עד F3-3-12-5) 36 (f4-1-1-1 ל-F4-3-12-1, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של F3 על f4-1-1-1 ל f4-3-12-1 גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות. עבור מחקרים MGR, T1 ' נמטודות גדלו עבור 2 d, ויתחיל לשכפל T2 ' ביום למחרת (D15), ו T2 ' יתחיל לשכפל T3 ' על D18. תוחלת החיים של הטיפוס הפראי הוא כ -15 ימים. לאחר מכן, הסיום של תוחלת החיים של T3 יהיה ב D33.
36 (F0-1-1-13 עד F0-3-12-13) הצאצאים של F0 על F0-1-1-13 עד F0-3-12-13 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (f1-1-1-10 עד F1-3-12-10) הצאצאים של הצאצא F1 על F1-1-1-10 כדי F1-3-12-10 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (f2-1-1-7 כדי F2-3-12-7) הצאצאים של צאצא של F2 על F2-1-1-7 כדי F2-3-12-7 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (F3-1-1-4 עד F3-3-12-4) הצאצאים של הצאצא של F3 על F3-1-1-4 כדי F2-3-12-4 agars גדלו עבור 1 ד.
15 36 (F0-1-1-15 עד F0-3-12-15) 36 (F0-1-1-13 עד F0-3-12-13, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של F0 על F0-1-1-13 עד F0-3-12-13 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f1-1-1-12 עד F1-3-12-12) 36 (f1-1-1-10 עד F1-3-12-10, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא f1 על f1-1-1-10 עד F1-3-12-10 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f2-1-1-9 כדי F2-3-12-9) 36 (f2-1-1-7 ל-F2-3-12-7, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של f2 על f2-1-1-7 כדי f2-3-12-7 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-6 עד F3-3-12-6) 36 (F3-1-1-4 עד F3-3-12-4, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של f3 על f3-1-1-4 כדי f3-3-12-4 agars גדלו עבור 2d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F0-1-1-14 עד F0-3-12-14) הצאצאים של F0 על F0-1-1-14 עד F0-3-12-14 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (f1-1-1-11 עד F1-3-12-11) הצאצאים של הצאצא F1 על F1-1-1-11 כדי F1-3-12-11 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (f2-1-1-8 כדי F2-3-12-8) הצאצאים של צאצא של F2 על F2-1-1-8 כדי F2-3-12-8 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (F3-1-1-5 עד F3-3-12-5) הצאצאים של הצאצא של F3 על F3-1-1-5 כדי F2-3-12-5 agars גדלו עבור 1 ד.
16 36 (F0-1-1-15 עד F0-3-12-15, מעל) 36 (F0-1-1-14 עד F0-3-12-14, נוקה לאחר ספירה) תוחלת החיים של הטיפוס הפראי הוא כ -15 ימים. לכן, F0 צריך למות לפני יום 16 מאז החשיפה.
36 (f1-1-1-13 עד F1-3-12-13) 36 (f1-1-1-11 עד F1-3-12-11, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של F0 על F0-1-1-14 עד F0-3-12-14 agars גדלו עבור 2 d, ו agars הם נוקו לאחר נמטודות נספרות.
36 (f2-1-1-10 עד F2-3-12-10) 36 (f2-1-1-8 ל-F2-3-12-8, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא f1 על f1-1-1-11 כדי f1-3-12-11 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-7 עד F3-3-12-7) 36 (f3-1-1-5 עד F3-3-12-5, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של f2 על f2-1-1-8 כדי f2-3-12-8 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F0-1-1-15 עד F0-3-12-15) הצאצאים של הצאצא של f3 על f3-1-1-5 כדי f3-3-12-5 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f1-1-1-12 עד F1-3-12-12) מספר נמטודות הכולל ב-f4-1 -1-1 ל-f4-3-12-1, F3-1-1-4 עד f3-3-12-4 agars ו-f3-1-1-5 ל-f3-3-12-5 משמשים לחישוב הרבייה הראשונית של F3.
36 (f2-1-1-9 כדי F2-3-12-9) הצאצאים של F0 על F0-1-1-15 עד F0-3-12-15 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (F3-1-1-6 עד F3-3-12-6) הצאצאים של הצאצא F1 על F1-1-1-12 כדי F1-3-12-12 agars גדלו עבור 1 ד.
הצאצאים של צאצא של F2 על F2-1-1-9 כדי F2-3-12-9 agars גדלו עבור 1 ד.
הצאצאים של הצאצא של F3 על F3-1-1-6 כדי F2-3-12-6 agars גדלו עבור 1 ד.
17 36 (f1-1-1-14 עד F1-3-12-14) 36 (F0-1-1-15 עד F0-3-12-15, נוקה לאחר ספירה, over) הצאצאים של F0 על F0-1-1-15 עד F0-3-12-15 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות. . לא יהיו יותר F0 צאצאים
36 (f2-1-1-11 כדי F2-3-12-11) 36 (f1-1-1-12 עד F1-3-12-12, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא f1 על f1-1-1-12 כדי f1-3-12-12 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-8 עד F3-3-12-8) 36 (f2-1-1-9 עד F2-3-12-9, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של f2 על f2-1-1-9 כדי f2-3-12-9 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-6 עד F3-3-12-6, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של f3 על f3-1-1-6 כדי f3-3-12-6 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f1-1-1-13 עד F1-3-12-13) הצאצאים של הצאצא F1 על F1-1-1-13 כדי F1-3-12-13 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (f2-1-1-10 עד F2-3-12-10) הצאצאים של הצאצא של F2 על F2-1-1-10 כדי F2-3-12-10 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (F3-1-1-7 עד F3-3-12-7) הצאצאים של הצאצא של F3 על F3-1-1-7 כדי F2-3-12-7 agars גדלו עבור 1 ד.
18 36 (f1-1-1-15 עד F1-3-12-15) 36 (f1-1-1-13 עד F1-3-12-13, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא f1 על f1-1-1-13 כדי f1-3-12-13 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f2-1-1-12 ל-F2-3-12-12) 36 (f2-1-1-10 עד F2-3-12-10, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של f2 על f2-1-1-10 כדי f2-3-12-10 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-9 עד F3-3-12-9) 36 (F3-1-1-7 עד F3-3-12-7, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של f3 על f3-1-1 -7 כדי f3-3-12-7 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f1-1-1-14 עד F1-3-12-14) הצאצאים של הצאצא F1 על F1-1-1-14 כדי F1-3-12-14 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (f2-1-1-11 כדי F2-3-12-11) הצאצאים של הצאצא של F2 ב F2-1-1-11 כדי F2-3-12-11 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (F3-1-1-8 עד F3-3-12-8) הצאצאים של הצאצא של F3 על F3-1-1-8 כדי F2-3-12-8 agars גדלו עבור 1 ד.
במחקרים של MGR, T2 יתחיל לשכפל את ה-T3 היום. תוחלת החיים של הטיפוס הפראי הוא כ -15 ימים. לאחר מכן, הסיום של תוחלת החיים של T3 יהיה ב D33.
19 36 (f1-1-1-15 עד F1-3-12-15, מעל) 36 (f1-1-1-14 עד F1-3-12-14, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא f1 על f1-1-1-14 עד F1-3-12-14 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f2-1-1-13 ל-F2-3-12-13) 36 (f2-1-1-11 עד F2-3-12-11, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של f2 ב f2-1-1-11 כדי f2-3-12-11 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-10 עד F3-3-12-10) 36 (F3-1-1-8 עד F3-3-12-8, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של f3 על f3-1-1-8 כדי f3-3-12-8 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f1-1-1-15 עד F1-3-12-15) הצאצאים של הצאצא F1 על F1-1-1-15 כדי F1-3-12-15 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (f2-1-1-12 ל-F2-3-12-12) הצאצאים של הצאצא של F2 ב F2-1-1-12 כדי F2-3-12-12 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (F3-1-1-9 עד F3-3-12-9) הצאצאים של הצאצא של F3 על F3-1-1-9 כדי F2-3-12-9 agars גדלו עבור 1 ד.
20 36 (f2-1-1-14 עד F2-3-12-14) 36 (f1-1-1-15 עד F1-3-12-15, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא f1 על f1-1-1-14 עד F1-3-12-14 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות. . לא יהיו יותר צאצאים של F1
36 (F3-1-1-11 עד F3-3-12-11) 36 (f2-1-1-12 עד F2-3-12-12, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של f2 ב f2-1-1-12 כדי f2-3-12-12 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-9 עד F3-3-12-9, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של f3 על f3-1-1-9 כדי f3-3-12-9 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f2-1-1-13 ל-F2-3-12-13) הצאצאים של הצאצא של F2 על F2-1-1-13 כדי F2-3-12-13 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (F3-1-1-10 עד F3-3-12-10) הצאצאים של הצאצא של F3 על F3-1-1-10 כדי F2-3-12-10 agars גדלו עבור 1 ד.
21 36 (f2-1-1-15 ל-F2-3-12-15) 36 (f2-1-1-13 ל-F2-3-12-13, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של f2 על f2-1-1-13 כדי f2-3-12-13 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-12 עד F3-3-12-12) 36 (F3-1-1-10 עד F3-3-12-10, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של f3 על f3-1-1-10 עד F3-3-12-10 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (f2-1-1-14 עד F2-3-12-14) הצאצאים של הצאצא של F2 על F2-1-1-14 כדי F2-3-12-14 agars גדלו עבור 1 ד.
36 (F3-1-1-11 עד F3-3-12-11) הצאצאים של הצאצא של F3 על F3-1-1-11 כדי F2-3-12-11 agars גדלו עבור 1 ד.
22 36 (f2-1-1-15 ל-F2-3-12-15, מעל) 36 (f2-1-1-14 עד F2-3-12-14, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של צאצא של f2 על f2-1-1-14 כדי f2-3-12-14 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-13 עד F3-3-12-13) 36 (F3-1-1-11 עד F3-3-12-11, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של f3 על f3-1-1-11 עד F3-3-12-11 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-12 עד F3-3-12-12) הצאצאים של הצאצא של F3 על F3-1-1-12 כדי F2-3-12-12 agars גדלו עבור 1 ד.
23 36 (F3-1-1-14 עד F3-3-12-14) 36 (f2-1-1-15 ל-F2-3-12-15, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של f2 על f2-1-1-15 כדי f2-3-12-15 agars גדלו עבור 2 d, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות. . לא יהיו עוד צאצאים של F2
36 (F3-1-1-12 עד F3-3-12-12, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של f3 על f3-1-1-12 עד F3-3-12-12 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-13 עד F3-3-12-13) הצאצאים של הצאצא של F3 על F3-1-1-13 ל-F2-3-12-13 agars גדלו עבור 1 ד.
24 36 (F3-1-1-15 עד F3-3-12-15) 36 (F3-1-1-13 עד F3-3-12-13, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של f3 על f3-1-1-13 עד F3-3-12-13 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-14 עד F3-3-12-14) הצאצאים של הצאצא של F3 על F3-1-1-14 כדי F2-3-12-14 agars גדלו עבור 1 ד.
25 36 (F3-1-1-15 עד F3-3-12-15, מעל) 36 (F3-1-1-14 עד F3-3-12-14, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של f3 על f3-1-1-14 עד F3-3-12-14 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
36 (F3-1-1-15 עד F3-3-12-15) הצאצאים של הצאצא של F3 על F3-1-1-15 כדי F2-3-12-15 agars גדלו עבור 1 ד.
26 36 (F3-1-1-15 עד F3-3-12-15, נוקה לאחר ספירה) הצאצאים של הצאצא של f3 על f3-1-1-15 עד F3-3-12-15 agars גדלו עבור 2 ד, ו agars נמחקים לאחר נמטודות נספרות.
בעיקר, במחקרים של MGR, הצאצא הראשון שאינו חשוף של F3 (כלומר, T3) נולד ב D18. תוחלת החיים של הטיפוס הפראי הוא כ -15 ימים. לאחר מכן, הסיום של תוחלת החיים של T3 יהיה ב D33.
הן mge ו-מחקרים MGR יכסה ימים נוספים כאשר תוחלת החיים של נמטודות ארוך יותר.

טבלה 1: רשימת סמנים והגדמותיהם.

  1. מדידת רבייה ותוחלת החיים בלימודי אפקט MGE.
    1. בD0, חזור על שלב 5.6. סמן את ה-agars (3 קבוצות עם 10 משכפל בכל אחד) כ-Fx-a-b-c, כאשר x מתייחס למספר היצירה, מתייחס למספר הקבוצה (1 עבור בקרה, 2 עבור ריכוז נמוך ו-3 עבור ריכוז גבוה ); b מתייחס לשכפול מ-1 עד 10; ו- c מתייחס למשך החשיפה (0 מציין את ההתחלה). עבור D0, מסמן את ה-agars כ-F0-1-1-0 עד F0-3-10-0. הקוראים יכולים להפנות לטבלה 1 לקבלת מידע מפורט.
    2. ב-D1, בדוק את הגידול נמטודות על agars, ולשנות את סמנים מ F0-1-1-0 כדי F0-3-10-0 כדי F0-1-1-1 כדי F0-3-10-1.
    3. ב-D2, בדוק את הצמיחה נמטודות על agars, ולשנות את סמנים F0-1-1-2 כדי F0-3-10-2.
    4. על D3, לאסוף 24 F0 נמטודות מן הקבוצה אל 12 חדש ngm agars עם שני ngm אגר משלב 5.4. סמן את האגארים כ-F0-1-1-3 עד F0-3-12-3.
    5. על D4, להעביר את שני נמטודות של ההורה מ F0-1-1-3 כדי F0-3-12-3 על ידי להרים את agars חדש ngm משלב 5.4. סמן את האגארים החדשים כמו F0-1-1-4 עד F0-3-12-4. לשנות את הסמנים של F0-1-1-3 כדי F0-3-12-3 כדי F1-1-1-1 עד F1-3-12-1 כדי לייצג את הצאצאים של F0 (כלומר, F1) בתוך היום הראשון מאז F0 להתחיל להתרבות.
    6. ב D5, השתמש מיקרוסקופ מבתר כדי לספור את נמטודות על f1-1-1-1 כדי F1-3-12-1 agars שבו נמטודות גדלו 2 ימים. אפשר F1-1-1-1 עד F1-3-12-1 agars לשכפל F2 עבור דורות רצופים.
    7. העבר את שני נמטודות ההורה מ F0-1-1-4 כדי F0-3-12-4 agars על ידי בחירת agars ngm חדש משלב 5.4. מארק NGM agars as F0-1-1-5 כדי F0-3-12-5. לשנות את הסימנים של F0-1-1-4 כדי F0-3-12-4 כדי F1-1-1-2 כדי F1-3-12-2 כדי לייצג את הצאצאים של F0 (כלומר, F1) בתוך היום השני מאז F0 להתחיל להתרבות.
    8. בD6, ספרו את הנמטודות על F1-1-1-2 עד F1-3-12-2 אגארים. העבר את מטודות האב מ-F0-1-1-5 עד F0-3-12-5 agars ל-F0-1-1-6 עד F0-3-12-6. לשנות את סמנים של F0-1-1-5 כדי F0-3-12-5 כדי F1-1-1-3 כדי F1-3-12-3 כדי לייצג את הצאצאים של F0 (כלומר, F1) בתוך היום השלישי מאז F0 להתחיל להתרבות.
    9. הנמטודות על F1-1-1 -1 עד F1-3-12-1 agars גדלו במשך 3 ימים. השתמש בהם כדי לשכפל F2 בהצלחה MGE לימודי אפקט. בדרך זהה, השתמש נמטודות F2 כדי לשכפל F3 כדי להמשיך את האפקט mge ללמוד.
    10. באותו האופן, להעביר את שני נמטודות ההורה מדי יום לספור את הצאצאים נמטודות למחרת, עד נמטודות ההורה ב 6 ngm agars (כלומר, מחצית agars הכולל בכל קבוצה) להפסיק רבייה.
    11. חשב את מספר הצאצא הכולל במשך הרבייה כולו כגודל הקבוצה הכולל. השתמש במספר הצאצא בתוך 3 הימים הראשונים כדי לייצג את הרבייה הראשונית של ההורים.
    12. השתמש ביום שבו רבייה נמטודות ההורה עצירות 6 ngm agars כדי להעריך את משך הרבייה. השתמש בימים שכל הורה בודד שרד כתוחלת החיים שלו.
    13. השג את הרבייה הראשונית, משך הרבייה, גודל הקבוצה הכולל ואת תוחלת החיים של F1 באותו אופן כפי שנעשה עבור F0. באופן דומה, על ידי חזרה על ההליך הנ ל, מידע שכפול ותוחלת חיים של F2 (כדי Fn) ניתן להשיג.
  2. מדידת הרבייה ותוחלת החיים במחקרי אפקט MGR.
    1. בצע את השלב 7.2.4 עם agars NGM משלב 5.4 שונה לאלה משלב 2.13.
  3. למדוד מדדים ביוכימיים.
    1. לרוקן את נמטודות את agars ngm עם מים סטרילי ולאסוף אותם צינורות צנטריפוגה. ליישב את הנמטודות למשך 30 דקות ולהשליך את הסופרנטנים. השתמשו בנמטודות כדורי למדידת האפקט.
    2. הוסף 1 מ ל של מלוחים קרח קר פוספט באגירה (PBS, pH 7.0) לתוך נמטודות (כדורי) בצינורות צנטריפוגה mL 1.5 לשטוף נמטודות.
    3. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c, ובזהירות למחוק את הסופרנטנמלים עם פיפטה.
    4. הצמד להקפיא את כדורי על ידי חנקן נוזלי או a-80 מקפיא ° c.
    5. הומוגון כדורי באמצעות קוצים באמבט קרח. השתמש 200 μL הקרח קר PBS לשטוף את הנוזלים שיורית על הפטאל לתוך צינור הצנטריפוגה לפני להוציא את הסחוס.
    6. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c שוב, ולהשתמש הסופרנטנים כדי לקבוע את הפעילויות או כמויות של ביוכימיקלים עם ערכות מסחריות (לראות את הטבלה של חומרים לפרטים).
    7. למדוד את כמויות החלבון הכולל (TP) בדגימות, ולהשתמש בתוצאות כמכנה בייצוג אינדיקטורים ביוכימיים אחרים, כך שההבדל בין מספרי נמטודות בין דגימות ניתן לחסל.
  4. למדוד ביטוי גנים.
    1. חזור על שלבים ה7.4.1 ל7.4.4. לבודד את ה-RNA הכולל מתוך דגימות נמטודות באמצעות ערכת החילוץ rna מסחרי (עיין בטבלה של חומרים לפרטים) על פי הוראות היצרן של21.
    2. השתמש ב-RNA כדי לסנתז cDNA לפי הוראות היצרן21.
    3. לנתח את דגימת cDNA בתגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR) באמצעות SYBR גרין RT-PCR ערכות לפי הוראות היצרן (ראה לוח חומרים)21.
    4. לכמת את רמות הביטוי היחסי של הגנים שנבחרו על ידי שיטת 2-ΔΔCT 22, ולטפל ברמות הביטוי של התוצר-2 (או גן התייחסות אחרים) כמו התייחסות שלילית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור לימוד השפעות של כימיקלים על פני דורות באמצעות C. אלגיה ב טרנס דורי (TG), חשיפה רב דורי (mge) ומחקרים שיורית רב דורי (MGR). תוצאות המחקר שלנו מוצגות כדוגמאות. מחקר אחד מציג את ההשפעות TG של מתכות כבדות על התנהגות תנועה3. שני המחקרים האחרים להציג mge ו-MGR השפעות של sulfomethoxazole ו lindane על שעתוק ומדדים ביוכימיים וגנטיים מדידות4,14.

השפעות TG של מתכות כבדות על התנהגות תנועה של ג. אלגיה

ההשפעות TG של קדמיום (Cd), נחושת (Cu), עופרת (Pb) ו אבץ (zn) על תדר כיפוף הגוף (bbf) נחקרו ב ההורה נמטודות (F0) לאחר חשיפה אימהית וצאצהם (T1)3. ההשפעות של מתכות על BBF הראו כי העכבות ב T1 היו גדולים יותר ב F0, הוכחת רעלים חמורים יותר של מתכות כבדות על התנהגות תנועה העובר-הצאצא חשוף מאשר ההורה חשוף ישירות. השפעות TG של מתכות כבדות בריכוזים סביבתיים מציאותיים הראו כי חשיפה אימהית יכולה להכפיל את הסכנות של זיהום מתכות כבדות בדורות הבאים. ראה איור 1.

Figure 1
איור 1 : ההשפעות של קדמיום (Cd), נחושת (Cu), עופרת (Pb) ו אבץ (zn) על תדירות כיפוף הגוף של ההורה נמטודות (F0, ריק) לאחר חשיפה לפני הלידה ואת צאצאם (T1, מוצלל). שגיאה בשורת השגיאה = שגיאה תקנית; * = שונה באופן משמעותי מהפקד, p < 0.05; = שונה באופן משמעותי מן הריכוז הנמוך, p < 0.05; + מרמז על אפקטים שונים באופן משמעותי F1 מאשר ב F0, p < 0.05. דמות זו שונתה מ-Yu et al.3 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

השפעות MGR של סולפאמתוקסאזול (SMX) על תוחלת החיים נמטודות ורבייה

השפעות MGR של סולפאמתוקסאזול (SMX) על תוחלת החיים נמטודות ו שעתוק14 נחקרו על ההורה הראשי (F0), העובר-חשוף הצאצאים (T1), הצאצאים חשופים של germline (T2), הצאצא הלא חשוף הראשון (T3) ואת שלושת דורות הבאים (T4-T6). תוצאות המחקר הראו כי הרבייה (גודל הקבוצה סך כ 49% של השליטה) הושפעו באופן משמעותי בחשיפה germline (T2), ואת הרעלים המשיכו בדורות שאינם חשופים מ-T3 אל T6 דורות (איור 2). הממצאים שלנו העלו חששות חדשים לגבי ההשפעות ארוכת טווח של אנטיביוטיקה עצמם מלבד ההשפעות שלהם על עמידות לאנטיביוטיקה.

Figure 2
איור 2 : גודל הרבייה (בתוך (א), המבוטא באחוזי שליטה) ורבייה הראשונית (ב (ב)) של ג. אלאנים בהורה החשוף ובצאצאיו (F0, T1 ל-T6, משמאל לימין בכל ריכוז). שגיאה בשורת השגיאה = שגיאה תקנית; a = שונה באופן משמעותי מהפקד על ידי ANOVA (p < 0.05); b = שונה באופן משמעותי מהפקד ומהדור הקודם באותו ריכוז (p < 0.05); ג = שונה באופן משמעותי מהפקד ומהריכוז הנמוך באותו דור (p < 0.05); ד = שונה באופן משמעותי מהפקד ומהדור הקודם באותו הריכוז והריכוז הנמוך באותו דור (p < 0.05); ה = שונה באופן משמעותי מהדור הקודם באותו הריכוז והריכוז הנמוך באותו דור (p < 0.05); f = שונה באופן משמעותי מהדור הקודם באותו ריכוז (p < 0.05). דמות זו שונתה מ-Yu et al.14 עם אישור.

השפעות mge ו-MGR של לינדיין על המדדים הביוכימיים והגנטיים של נמטודות

ההשפעות MGE ו-MGR של lindane (מזהמים אורגניים מתמשך [POP]) נחקרו על ביוכימיקלים מרכזיים ב מטבוליזם השומנים שינויים ביטוי גנטי במסלול הקשורים כמו אינסולין4. תוצאות המחקר הראו כי לינדיין הראה השפעות מעבגניים עם הפרעות בתקנה של אותות אינסולין (איור 3). יתר על כן, השינויים בין sgk-1 (F0, F3, t1 ' ו-t3 ') ו -akt-1 (t1 ו-t3) איתות הצביעו על כך מדורות של חשיפה שונים הראו אסטרטגיות תגובה שונות עבור סובלנות והימנעות.

Figure 3
איור 3 : שינויים של רמות הביטוי של גנים מרכזיים במסלול האותות אינסולין כמו בתוך נמטודות עם חוויות חשיפה שונות. →: רגולציה חיובית; symbol : רגולציה שלילית; ↑: ביטוי למעלה-רגולציה; ↓: ביטוי למטה-רגולציה. דמות זו שונתה מצ'ן באל.4 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי לנהל בהצלחה את הפרוטוקול המתואר, יש לקחת בחשבון את ההצעות הבאות. בצע את הפעולות הנסיוניות הכלליות בסביבה סטרילית. פעולה לא הולמת עלולה לגרום לזיהום של הזנים E. coli , למשל, פטריות וקרדית יכול לעכב את הצמיחה הרגילה של C. אלגיה ולכן להשפיע על התוצאות הנסיוניות. בסעיף המתאר את טיפוח c. אלגיה, התבונן בקנה המידה של ה -"אלאלגיה " על agars ngm בעיניים עירומות או מיקרוסקופים. כאשר קנה המידה של ה -C. אלגיה על האגר עולה על 75% בשטח, או שזמן התרבות חורג משבוע, מבצע סבב חדש של חיסונים כדי להימנע מגידול יתר או מירידה באוכלוסיית הג . לפני תהליך הסנכרון, השתמש במיקרוסקופ כדי להתבונן בצמיחת ה -C. אלגיה, והמשך בתהליך כאשר ביצי נמטודות מופצים בהרחבה על אגר. בנוסף, אם ממיסים (למשל, diמתיל סולפוקסיד [DMSO]) משמשים, ריכוזי שלהם בפתרונות מניות צריך להיות נמוך יותר מ 1% כדי להבטיח ריכוזים הסופי שלהם לא יעלה על 0.5% (v/v) כדי למנוע את ההשפעות השליליות של ממיסים עצמם. במחקרים TG, משך החשיפה לאורך 24 שעות הכרחי כדי להבטיח שזמן החשיפה יכסה את היווצרות העובר של הדור הבא, והמשך צריך להיות בתוך 96 h כדי להקל על הפרדת הדור הבאה. השתמשו בכמויות קטנות של נמטודות (בדרך כלל בתוך 20) למדידת תוחלת החיים והרבייה. מצד שני, להשתמש בכמויות גדולות של נמטודות (בדרך כלל יותר מ 500) למדידת מדדי רגולציה ביוכימיים וגנטיים. מכאן, כדי להבטיח מספר מספיק של דגימות, לבצע ניסויים ראשוניים כדי להעריך בערך כמה צאצאים F0 נמטודות בוגרת יכול להתרבות בתוך 24 h הראשון מאז הם מתחילים רבייה. לאחר מכן לקבוע את מספר F0 נמטודות הנדרשת כדי להבטיח שיש לפחות 200 צאצאים עבור הליך מחקרים רב דורי.

בהשוואה לדיווחים מוקדמים יותר של מחקרי TG עם הג, הפרוטוקול הנסיוני הנוכחי היה מתחשב יותר בבחירת שלב החיים. ב C. אלגיה, תאי זרע נוצרים בשלב L4 כדי לדשן את המבנה המאוחר יותר23. בהתאם לכך, החשיפה המכסה את הספרמיבגנזה והתקופה האוציטוגנזה תספק חלון מסוים כדי ללמוד את השפעות TG על הצאצאים. הגיל-מסונכרן ביצים משמשים עבור מחקרים בעלי אפקט רב דורי כדי להבטיח כי החשיפה מכסה את התקופה הכוללת מתחילתו של כל מחזור חיים. בהשוואה למחקרים רב-דוריים מוקדמים יותר, הפרוטוקול הניסיוני הנוכחי הנחה את מדידת ההשפעות על פני דורות מרובים במקום רק 1-2 דורות. יתר על כן, הפרוטוקול הנוכחי נחשב הן השפעות MGE ו-MGR, אשר שיטתית יותר מאשר מחקרים קודמים שנמדדו רק MGE או אפקטים של MGR.

בעיקר, יש עדיין כמה בעיות להיחשב בפרוטוקול ניסיוני הנוכחי. הפרוטוקול הנוכחי מעסיק מסוג פראי C. אלגיה שזמן הדור שלהם הוא סביב 60 h ותוחלת החיים היא 20 ימים. זה הופך את המשך הכולל של הניסוי ארוך למדי (למשל, השפעות MGE לחקור על תוחלת חיים מעל 3 דורות דורש לפחות 30 ימים). כדי לקצר את הזמן, החוקרים יכולים לבחור מוטציה C. אלגיה, כגון nematodes מוטציה קצרת. בעיה נוספת היא הטיפול ההרג על החיידקים, הסטטוס החי של אשר יש צורך לשמור על נמטודות בריאה 24. כמו כן, תהליך ההרג של UV עשוי להחדיר שינויים בכימיקלים25. לכן, יש לשקול טיפולים אחרים על החיידקים, וניטור קפדני של השינויים הכימיים במהלך תהליך ההכנה או החשיפה עשוי להיות נחוץ, במיוחד עבור תרכובות לא יציבות. במקביל, ישנן מגבלות בלימוד הבדלי המין בהשפעות רעילות משום שרוב העובדה שג. אלגיה הוא דו-מיניים. שיפורים נוספים כדי לחקור את תרומת המין באפקטים TG, MGE או MGR נדרשים. לסיכום, אנו מצפים כי הפרוטוקול המוצע יהיה משמעותי מאוד לשימוש ב -C. אלגיה לחקר השפעות TG, mge ו-MGR של הרעילות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אסירי תודה על התמיכה הפיננסית על ידי המדע הלאומי וטכנולוגיה הפרויקט המרכזי לבקרת זיהום מים וטיפול (2017ZX07201004), ובינלאומיים מדעי & טכנולוגיה תוכנית שיתוף פעולה של סין (No 2016YFE0123700).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar?Corning?America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
  2. Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
  3. Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
  4. Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
  5. Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
  6. Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
  7. Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
  8. Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
  9. Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
  10. Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
  11. Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
  12. Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
  13. Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
  14. Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
  15. Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
  16. Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
  17. Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
  20. Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
  21. Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
  22. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  23. Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
  24. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
  25. Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).

Tags

מדעי הסביבה סוגיה 149 אפקט טרנס-דורי אפקט חשיפה רב דורי אפקט שיורית רב דורי פרוטוקול ניסוי מזהמים מתמידים
השימוש באלמרנים לחקר התופעות הטראנס-והרב של מזדורי הרעילות <em> </em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z.,… More

Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter