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Uso de Caenorhabditis elegans para el estudio de los efectos trans y multigeneracionales de los tóxicos

Published: July 29, 2019 doi: 10.3791/59367
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2, 1,2
1College of Environmental Sciences and Engineering, Tongji University, 2Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security, 3Jiaxing Tongji Institute of Environment, 4College of Ecological Technique and Engineering, Shanghai Institute of Technology

Summary

Los efectos trans y multigeneracionales de los productos químicos persistentes son esenciales para juzgar sus consecuencias a largo plazo en el medio ambiente y en la salud humana. Proporcionamos métodos detallados novedosos para estudiar los efectos trans y multigeneracionales utilizando nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans.

Abstract

La información sobre las toxicidades de los productos químicos es esencial en su aplicación y gestión de residuos. En el caso de los productos químicos a bajas concentraciones, los efectos a largo plazo son muy importantes para juzgar sus consecuencias en el medio ambiente y en la salud humana. Al demostrar influencias a largo plazo, los efectos de los productos químicos a lo largo de generaciones en estudios recientes proporcionan nuevos conocimientos. Aquí, describimos protocolos para el estudio de los efectos de los productos químicos a lo largo de varias generaciones utilizando nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans. Se presentan dos aspectos: (1) estudios de efectos transgeneracionales (TG) y (2) multigeneracionales, el segundo de los cuales se separa en estudios de efectos de exposición multigeneracional (MGE) y residual multigeneracional (MGR). El estudio de efecto TG es robusto con un propósito simple de determinar si la exposición química a los padres puede resultar en consecuencias residuales en la descendencia. Después de que los efectos se miden en los padres, las soluciones de hipoclorito de sodio se utilizan para matar a los padres y mantener la descendencia con el fin de facilitar la medición del efecto en la descendencia. El estudio de efecto TG se utiliza para determinar si la descendencia se ve afectada cuando su padre está expuesto a los contaminantes. El estudio de efectos MGE y MGR es sistemático utilizado para determinar si la exposición generacional continua puede dar lugar a respuestas adaptativas en descendencia a lo largo de generaciones. La recogida y la transferencia cuidadosas se utilizan para distinguir las generaciones para facilitar la medición del efecto en cada generación. También combinamos protocolos para medir el comportamiento de la locomoción, la reproducción, la vida útil, los cambios bioquímicos y de expresión génica. También se presentan algunos experimentos de ejemplo para ilustrar los estudios de efectos trans y multigeneracionales.

Introduction

La aplicación y la gestión de residuos de productos químicos depende en gran medida de la información de sus efectos en determinadas concentraciones. En particular, el tiempo es otro elemento esencial entre los efectos y las concentraciones. Es decir, los productos químicos, especialmente aquellos a bajas concentraciones en los entornos reales, necesitan tiempo para provocar efectos mensurables1. Por lo tanto, los investigadores organizan diferentes longitudes de la duración de la exposición en experimentos con animales, e incluso cubren todo el ciclo de vida. Por ejemplo, los ratones estuvieron expuestos a la nicotina durante 30, 90 o 180 días para estudiar sus efectos tóxicos 2. Sin embargo, esas duraciones de exposición todavía no son suficientes para dilucidar los efectos a largo plazo de los contaminantes (por ejemplo, contaminantes orgánicos persistentes [POP]) que pueden durar a lo largo de generaciones de organismos en el medio ambiente. Por lo tanto, los estudios sobre los efectos a lo largo de las generaciones están ganando cada vez más atención.

Hay dos aspectos principales en los estudios de efectos generacionales. El primero es el estudio del efecto transgeneracional (TG) que puede probar con firmez si la exposición química a los padres puede resultar en consecuencias en la descendencia3. El segundo es un estudio de efectos multigeneracional que es más sistemático con consideraciones tanto en la exposición como en los efectos residuales. Por un lado, los efectos de exposición multigeneracional (MGE) se utilizan para ilustrar las respuestas adaptativas en los animales a los entornos desafiantes a largo plazo. Por otro lado, los efectos residuales multigeneracionales (MGR) se utilizan para demostrar las consecuencias residuales a largo plazo después de la exposición, ya que la exposición materna se acompaña de la exposición de embriones a la primera descendencia y la exposición a la línea de gérmenes a la segunda descendencia que hace que la tercera descendencia como la primera generación completamente fuera de la exposición4.

Aunque los mamíferos (por ejemplo, ratones) son organismos modelo en estudios de toxicidad, especialmente en relación con los seres humanos, su aplicación en el estudio de los efectos generacionales es bastante lenta, costosa y éticamente preocupante 5. En consecuencia, organismos como el crustáceo Daphnia magna6, el insecto Drosophila melanogaster7 y el pez cebra Danio rerio8, ofrecen opciones alternativas. Sin embargo, estos organismos carecen de similitudes con los seres humanos o requieren equipos específicos en los estudios.

Caenorhabditis elegans es un pequeño nematodo de vida libre (aproximadamente 1 mm de longitud) con un ciclo de vida corto (aproximadamente 84 h a 20 oC)9. Este nematodo comparte muchas vías biológicas conservadoras para los seres humanos, y por lo tanto se ha empleado ampliamente para ilustrar los efectos de diversas tensiones o tóxicos10. En particular, el 99,5% de los nematodos son hermafroditas por lo que estos organismos son extremadamente adecuados en el estudio de los efectos generacionales, por ejemplo, los efectos TG de metales pesados y sulfonamidos3,11, MGE efectos de nanopartículas de oro y pesadas metales12 y temperatura13, efectos MGR de sulfonamida14, y tanto MGE como MGR efectos de irradiación gamma15 y lindano4. Además, se encontraron resultados comparables entre los efectos de los productos químicos (por ejemplo, zearalenona) en el desarrollo y la reproducción de ratones y C. elegans16,17, lo que proporcionaría una ventaja para extrapolar efectos de este pequeño animal a los seres humanos.

Los estudios de efectos TG y MG consumen mucho tiempo y necesitan un diseño y un rendimiento cuidadosos. En particular, existían diferencias en las opciones en etapa de vida, las condiciones de exposición y los métodos de separación de generación en los estudios antes mencionados. Esas diferencias obstaculizaron la comparación directa entre los resultados y obstaculizaron una interpretación ulterior de los resultados. Por lo tanto, es imperativo establecer protocolos uniformes para guiar los estudios de efectos TG y MG, y también proporcionar un panorama más amplio para revelar patrones similares de diversos tóxicos o contaminantes en consecuencias a largo plazo. El objetivo excesivo de los protocolos actuales demostrará procesos de operación claros en el estudio de los efectos trans y multigeneracionales con C. elegans. Los protocolos beneficiarán a los investigadores interesados en estudiar los efectos a largo plazo de los tóxicos o contaminantes.

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Protocol

1. Cultura E. coli OP50

  1. Preparar 1 M de solución de hidróxido sódico disolviendo 4 g de hidróxido de sodio en agua de 100 ml.
  2. Preparar el caldo de lisógenia (LB) medio disolviendo 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de cloruro de sodio con 1 L de agua ultrapura en un matraz cónico de 1 L. Ajuste el pH a 7,0 con 1 M de solución de hidróxido sódico.
  3. Aliquot el medio líquido LB de step1.2 a 20 matraces cónicos (volumen máximo permitido: 100 mL) con medio de 50 ml en cada uno. Cubra los matraces cónicos con papel kraft.
  4. Esterilice el medio líquido LB a 121 oC y 0,105 MPa durante 20 minutos.
  5. Pipetear 200 l de las suspensiones bacterianas (ver paso 1.8) o recoger una pequeña colonia de agars (en el paso 2.14) utilizando un bucle inoculante, colóquela en medio LB.
  6. Incubar el medio LB con agitación a 150 rpm a 37oC durante 24-48 h. El medio LB cambiará de un líquido transparente marrón a una suspensión de color caqui turbia.
  7. Utilice las suspensiones bacterianas del 80% del total de matraces para proporcionar E. coli OP50 como alimento de nematodos que se utilizará en el paso 2.11.
  8. Almacene el resto de los matraces que contienen las suspensiones bacterianas en un frigorífico a 4oC. Pipetear 200 l de las suspensiones LB en la parte superior del medio nuevo LB (paso 1.4) y repetir el paso1.6 para su posterior incubación.

2. Cultura C. elegans

NOTA: Cultura C. elegans utilizando según los pasos 2.1 a 2.11 basados en los métodos estándar18.

  1. Disolver 22,8 g de K2HPO4•3H2O en 100 ml de agua destilada estéril.
  2. Disolver 6,8 g de KH2PO4 en 50 ml de agua destilada estéril.
  3. Mezclar soluciones de los pasos 2.1 y 2.2, para preparar 1 M K2HPO4-KH2PO4 buffer (pH 6.0, 150 mL en total).
  4. Preparar 1.0 M MgSO4 disolviendo 1.232 g de MgSO4•7H2O en 5 ml de agua destilada estéril, y esterilizarla filtrando la solución a través de un filtro de membrana estéril desechable de 0,22 m en un recipiente estéril.
  5. Preparar 1 M CaCl2 disolviendo 0,554 g de CaCl2 en 5 ml de agua destilada estéril, y esterilizarlo filtrando las soluciones a través de un filtro de membrana desechable estéril de 0,22 m en un recipiente estéril.
  6. Preparar 1 M de solución de colesterol disolviendo 0,025 g de colesterol en 5 ml de etanol absoluto, y esterilizarla filtrando la solución a través de un filtro de membrana desechable estéril de 0,22 m en un recipiente estéril.
  7. Preparar el agar medio de crecimiento de nematodos (NGM) añadiendo 17 g de agar en polvo, 2,5 g de peptona y 3 g de cloruro de sodio a un matraz cónico de 1 L que contenga 1 L de agua ultrapura. Añadir 25 ml de K2HPO4-KH2PO4 solución del paso 2.3.
  8. Esterilice el agar NGM desde el paso 2.7 a 121oC con 0,105 MPa durante 20 min.
  9. Enfriar el agar NGM a unos 50 oC, añadir 1 mL de 1 M MgSO4, 1 M CaCl2y 5 mg/ml de solución de colesterol-etanol de los pasos 2.4 a 2.6 en el medio y mezclarlos a fondo.
  10. Vierta el medio de agar NGM de 10 ml por plato en 100 platos estériles de Petri (6,0 cm de diámetro). Enfriar el medio en los platos Petri a temperatura ambiente para formar agar sólido.
  11. Pipetear 170 l de las suspensiones bacterianas del paso 1.7 sobre el agar NGM antes mencionado utilizando una punta estéril. Agitar ligeramente el agar NGM para distribuir el medio LB uniformemente sobre la superficie del agar NGM.
  12. Inocular el agar NGM con la parte superior hacia arriba a 37 oC durante 8-12 h para formar un césped bacteriano.
  13. Utilice la mayor parte del agar con césped bacteriano del paso 2.12 para cultivar nematodos en los pasos 2.15 o 2.19.
  14. Almacene 1 o 2 agars boca abajo para evitar la evaporación del agua y la contaminación en los refrigeradores a 4 oC para mantener las bacterias en la contaminación.
  15. Cuando haya menos de 2.000 nematodos en los agars NGM de siembra (de experimentos anteriores o dotados de otros laboratorios), corte una sexta parte del agar NGM que contiene C. elegans con una punta estéril y transfiérala a agars NGM recién preparados con agars bacterianos césped (del paso 2.13). Mantenga los agars NGM boca abajo en una incubadora de 22 oC para el cultivo posterior.
  16. Cuando haya más de 2.000 nematodos en el agar NGM de siembra, enjuague los nematodos del agar NGM con 2 ml de agua estéril en tubos de centrífuga. La entrada de 2 ml de agua dará como resultado una salida de aproximadamente 1,5 ml.
  17. Deje que los nematodos se asienten en los tubos centrífugos desde 30 min. Deseche 1 ml de los sobrenatos pipeteando y agregue 1 ml de agua estéril en cada tubo para lavar los pellets (es decir, los nematodos).
  18. Asentar los nematodos en los tubos centrífugos durante 30 min. Deseche 1 ml de los sobrenados pipeteando. Añadir 1 ml de agua estéril en cada tubo para resuspender los nematodos.
  19. Distribuir las suspensiones de nematodos (aproximadamente 1,5 ml en total) pipeteando 150 l en cada nuevo agar NGM con césped bacteriano (del paso 2.13), haciendo 8-10 nuevos agares NGM en total.
  20. Mantenga los agars NGM del paso 2.19 hacia arriba en una incubadora de 20 oC durante la noche y luego al revés para el cultivo posterior.
  21. Repita el paso 2.15 o el paso 2.16-2.20 cada tres días.

3. Preparar huevos sincronizados y larvas L3 de C. elegans

  1. Enjuague los nematodos gravid y los huevos recién producidos de los agars NGM en tubos estériles de centrífuga, con 2 ml de agua estéril en cada agar NGM dando como resultado aproximadamente 1,5 ml de salida.
  2. Asentar los nematodos en los tubos de centrífuga durante 30 minutos, y luego desechar el 85% de los sobrenatos mediante pipeteo.
  3. Preparar soluciones de hipoclorito de sodio mediante la disolución de 0,6 g de NaOH y 5 ml de NaOCl (4-6% gradientes activos, ver la Tabla de Materiales para más detalles) con 25 ml de agua para llevar el NaOH a 0,5 M y NaOCl al 1%.
  4. Mezclar los pellets del paso 3.2 (marcar el volumen como V0) con 7 veces V0 de soluciones de hipoclorito sódico de (paso 3.3, es decir, relación de volumen de 1:7)19.
  5. Agitar los tubos de centrífuga cada 2 minutos durante 10-15 minutos para blanquear las larvas y los nematodos adultos; el color de las suspensiones de nematodos pasará de turbenses a claros.
  6. Centrifugar los tubos a 700 x g durante 3 min a 20 oC, y luego desechar los sobrenadores pipeteando.
  7. Resuspenda los pellets en 5 v0 de agua estéril para lavar los huevos sincronizados con la edad. Centrifugar a 700 x g durante 3 min a 20 oC, y luego desechar los sobrenadores.
  8. Repita el paso 3.7 dos veces.
  9. Añadir 1 plegado V0 de agua estéril en los tubos para resuspender los huevos sincronizados con la edad.
  10. Distribuya las suspensiones de los huevos pipeteando 50 ml en cada nuevo agar NGM con césped bacteriano del paso 2.13. Mantenga los agars NGM de arriba en una incubadora de 20 oC durante 30 minutos, lo que permite que el agua se evapore o se absorba por el césped bacteriano. Luego, haga los agars NGM al revés para la cultura posterior. Marque el tiempo como eltiempo del huevo (huevo T).
  11. Preparar K-medio disolviendo 3 g de NaCl y 2.36 g de KCl en 1 L de agua. Esterilice el medio a 121 oC y 0,105 MPa durante 20 minutos y enfríe a temperatura ambiente.
  12. Cuando el tiempo alcanza las 36 h después delhuevoT, los nematodos alcanzarán la etapa de larvas L3 (nematodos L3)20. Enjuague los nematodos de los agars NGM en tubos centrífugos, con 2 ml de agua estéril en cada agar NGM, lo que resulta en aproximadamente 1,5 ml de salida.
  13. Después de un asentamiento durante 30 minutos, reemplace el 85% de los supernatantes (por pipeteo) por k-medio de 2 h para digerir el alimento en las tripas3.
  14. Descarta los supernatantes. Utilice K-medium (del paso 3.11) para ajustar las suspensiones de nematodos a unos 200 nematodos por 100 oL para experimentos posteriores.

4. Utilice C. elegans para el estudio de efectos transgeneracionales

  1. Preparar soluciones químicas con 5 niveles de concentración y un disolvente o control absoluto, es decir, 6 grupos en total.
  2. Añadir 100 l de soluciones químicas o de control con 10 pozos y réplicas en cada grupo (es decir, 60 pozos en total) en el área media de una microplaca estéril de 96 pocillos para evitar efectos en los bordes.
  3. Diluir las suspensiones de nematodos del paso 3.14 con K-medio del paso 3.11 por 10 veces. Añadir suspensiones de nematodos de 100 l a cada uno de los 60 pozos del paso 4.2. Marque la hora como t0.
  4. Cuando el tiempo llegue a24 h después de t 0, contar los nematodos vivos y muertos en los pozos. Calcular la mediana de concentración letal (LC50).
  5. Preparar una serie de 5 concentraciones por debajo del 10% de los valores de LC50.
  6. Añadir 100 l de soluciones de control o químicas (del paso 4.5) con 10 pozos y réplicas en cada grupo (es decir, 60 pozos en total) en el área media de una microplaca estéril de 96 pocillos para evitar efectos en los bordes.
  7. Añadir 100 l de k-medio que contenga aproximadamente 200 nematodos L3 (del paso 3.14) a cada uno de los 60 pozos del paso 4.6. Marque la hora como T0.
  8. Realice la exposición de 24 a 96 h desde T0.
  9. Después de la exposición, recoja los nematodos de cinco pozos de cada grupo en tubos centrífugos de 1,5 ml mediante pipeteo (es decir, 6 tubos en total).
  10. Asentar los nematodos durante 30 minutos, desechar los sobrenadores pipeteando, y resuspender y lavar los nematodos en la parte inferior con 1 ml de agua esterilizada.
  11. Resuelva los nematodos durante 30 minutos, deseche los sobrenados pipeteando y utilice los nematodos en la parte inferior para las mediciones del indicador (ver sección 7) de la generación primaria expuesta marcada como F0.
  12. Recoger, asentar y lavar (por resuponiendo) los nematodos de los cinco pozos restantes en cada grupo en el paso 4.9 según el paso 4.10.
  13. Asentar los nematodos del paso 4.12 durante 30 min. Deseche los sobrenatos pipeteando y agregue 100 l de agua estéril para resuspender los nematodos. Transfiera las suspensiones de nematodos uniformemente a tres agars NGM recién preparados con césped bacteriano del paso 2.13.
  14. Incubar los nematodos durante 36 h para que se vuelvan gravitos y realizar la sincronización de la edad de acuerdo con los pasos 3.1-3.9. Incubar los huevos sincronizados en los respectivos agars NGM con césped bacteriano del paso 2.13 durante 36 h.
  15. Enjuague los nematodos de los agars NGM del paso 4.14 en seis tubos de centrífuga.
  16. Liquidar los nematodos durante 30 minutos, y desechar los sobrenatos pipeteando. Resuspender y lavar los pellets con 1 ml de agua esterilizada.
  17. Liquidar los nematodos durante 30 minutos, y desechar los sobrenatos pipeteando. Utilice los nematodos en la parte inferior para las mediciones del indicador (ver sección 7) de la generación de descendencia marcada como T1.

5. Utilice C. elegans para el estudio de efectos de exposición multigeneracional (MGE)

  1. Mezclar 99,0 mL de agars NGM (del paso 2.9) con 1 ml de soluciones de control o químicas (bajas y altas concentraciones en el protocolo actual como ejemplos, es decir, tres grupos en total).
  2. Vierta los aproximadamente 10 ml de medio de agar NGM por plato desde el paso 5.1 en 100 platos estériles de Petri (6,0 cm de diámetro). Enfriar el medio en los platos Petri a temperatura ambiente para formar agar sólido.
  3. Pipetear suspensiones bacterianas en el agar según el paso 2.11.
  4. Deje a un lado los párpados superiores de los platos De Petri y exponga el césped bacteriano a la luz UV (145 W/cm2) en el gabinete de bioseguridad durante 15 min.
  5. Elija una pequeña colonia usando un bucle inoculante, colóquela en medio LB de los agars en el paso 1.4. Incubar el medio LB con agitación a una velocidad de 150 rpm a 37 oC durante 24 h para confirmar el crecimiento bacteriano de la negación, validando el paso de matanza 5.4.
  6. Pipetear los huevos sincronizados por la edad del paso 3.9 sobre los agars (del paso 5.4). Marque el inicio de la exposición a la generación padre F0 y marque el día 0 (D0).
  7. Incubar los agars durante 3 d a 20oC. A continuación (es decir, en D3), utilice los nematodos maduros para medir los efectos en F0 (ver sección 7).
  8. También en D3, recoger los nematodos maduros F0 en los nuevos agars NGM (del paso 5.4) usando una varilla de vidrio, cuyo extremo está equipado con un alambre de fibra artificial doblado en un anillo.
  9. En D4, elija y deseche los nematodos F0 maduros de los agars NGM. Marque los nematodos de descendencia recién eclosionados dentro de estas 24 h (de D3 a D4) como F1 para experimentar la exposición de segunda generación.
  10. En D6, mida los índices (ver sección 7) de los nematodos maduros F1 que han experimentado exposición durante 3 días.
  11. En D9, repita los pasos 5.8-5.10, utilice nematodos F1 para reproducir gusanos F2 y medir los efectos sobre los nematodos F2.
  12. En D12, repita el paso 5.11, utilice nematodos F2 para reproducir gusanos F3 y medir los efectos sobre los nematodos F3. De la misma manera, reproducir la descendencia y medir los efectos MGE en la na generación de descendencia (Fn).

6. Utilice C. elegans para el estudio del efecto residual multigeneracional (MGR)

  1. Repita los pasos 5.1-5.7. En D3, recoja los nematodos maduros F0 en los nuevos agars NGM sin productos químicos añadidos (del paso 2.13).
  2. En D4, escoja y deseche los nematodos F0 maduros. Marque los nematodos de descendencia recién eclosionados dentro de estos 24 h como nematodos T1.
  3. En D6, mida los índices (ver sección 7) de los nematodos maduros T1 que han crecido durante 3 días.
  4. En D9, repita los pasos 6.2-6.3, utilice nematodos T1 para reproducir nematodos T2 y medir los efectos en los nematodos T1.
  5. En D12, repita los pasos 6.4, utilice nematodos T2 para reproducir nematodos T3 y medir los efectos en nematodos T2. De la misma manera, reproduce la descendencia y mide los efectos de la simm EN los nth de generación de crías (Tn) de F0, o los nth offspring (Tn') nematodos de Fn del paso 5.12.

7. Medir indicadores

  1. Mida el comportamiento de la locomoción.
    1. Tire los nematodos de los agars NGM con agua estéril y recójalos en tubos de centrífuga. Liquidar los nematodos durante 30 minutos, desechar los sobrenatos y utilizar los nematodos en los pellets para la medición del efecto.
    2. Resuspender los nematodos en los pellets con 1 ml de agua estéril y pipetearlos en agars NGM sin césped bacteriano del paso 2.10.
    3. Utilice un microscopio de disección para puntuar los nematodos para la (número de) frecuencia de flexión corporal (BBF) que se refiere a las veces que la bombilla posterior de la faringe cambia de dirección a lo largo de la dirección vertical de la ruta de desplazamiento dentro de un intervalo de 60 s.
    4. Utilice el microscopio de disección para puntuar el movimiento de inversión (RM) que se refiere a los tiempos en que la dirección de viaje cambia más de 90o, incluidos giros hacia atrás y giro Omega (OT) en un intervalo de 60 s. El OT se refiere al movimiento cuando la cabeza del nematodo toca o casi toca su cola haciendo la forma del nematodo como la letra griega Omega.
      NOTA: Se examinaron al menos 6 nematodos para cada tratamiento en cada réplica experimental.
Ejemplos de mgE (F0 a F3) efectos en la reproducción y la vida útil con 3 grupos (un control y dos tratamientos de exposición).
Día Número de agar NGM para el estudio MGE Explicación
Vida útil Reproducción
0 30 (exposición F0) 10 réplicas para cada grupo, marcadas como F0-1-1-0 a F0-3-10-0, con el último dígito para mostrar los días de supervivencia.
1 30 (F0 sobrevivir 1 d) F0-1-1-0 a F0-3-10-0 debe cambiarse a F0-1-1-1 a F0-3-10-1.
2 30 (F0 sobrevivir 2 d) F0-1-1-1 a F0-3-10-1 debe cambiarse a F0-1-1-2 a F0-3-10-2.
No es necesario transferir nematodos F0 hasta 3 d.
3 30 (F0 sobrevivir 3 d, despejado después de la transferencia y recolección de nematodos) Después de 3 d, los nematodos F0 son maduros y 36 nuevos agars NGM (con 2 nematodos en cada agar) se utilizan para observar su supervivencia y reproducción.
36 (F0-1-1-3 a F0-3-12-3) Se deben realizar experimentos preliminares para organizar el número de nematodos F0, asegurando al menos 200 crías para las operaciones multigeneracionales que se realizan correctamente.
En particular, si se estudian los efectos de la MGR, los nematodos F0 deben transferirse a agars NGM claros sin exposición química, y debe observarse como inicio De 1.
La mayoría de los nematodos F0 se recogen para medir índices químicos y genéticos y los 30 agars en F0 se eliminan.
4 36 (F0-1-1-4 a F0-3-12-4) 36 (F1-1-1-1 a F1-3-12-1) La medición de la vida útil y la reproducción requiere transferencia todos los días.
Los nematodos de los padres en F0-1-1-3 a F0-3-12-3 se recogen en los nuevos agars NGM marcados como F0-1-1-4 a F0-3-12-4.
Los nematodos de descendencia restantes (es decir, F1 en MGE, o T1 en MGR) en F0-1-1-3 a agars F0-3-12-3 han crecido para 1 d, y los marcadores se cambian a F1-1-1-1 a F1-3-12-1. Estos agars también se utilizan para monitorear la vida útil de La F1 con transferencia diaria.
5 36 (F0-1-1-5 a F0-3-12-5) 36 (F1-1-1-2 a F1-3-12-2) Los nematodos en los agars F1-1-1-1 a F1-3-12-1 han crecido durante 2 d y se vuelven fácilmente observables y los nematodos se cuentan, y los marcadores se cambian a F1-1-1-2 a F1-3-12-2.
36 (F0-1-1-4 a F0-3-12-4) Los nematodos de descendencia en f0-1-1-4 a Agars F0-3-12-4 han crecido durante 1 d.
6 36 (F0-1-1-6 a F0-3-12-6) 36 (F0-1-1-4 a F0-3-12-4, despejado después de contar) Los nematodos en los agars F1-1-1-2 a F1-3-12-2 han crecido durante 3 d y los marcadores se cambian a F1-1-1-3 a F1-3-12-3. En particular, los nematodos F1 comienzan a reproducir F2 en este día, los nematodos F1 deben transferirse a nuevos agars NGM haciendo F2-1-1-0 a F1-3-12-0. Para los estudios MGR, T2 comienza hoy.
36 (F1-1-1-3 a F1-3-12-3) 36 (F0-1-1-5 a F0-3-12-5) Esto puede retrasarse por la exposición química, y por lo tanto se deben realizar cambios flexibles en cada experimento para asegurar suficientes nematodos para las generaciones posteriores.
36 (F2-1-1-0 a F1-3-12-0) Los nematodos de descendencia en los agars F0-1-1-4 a F0-3-12-4 han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
Los nematodos de descendencia en los agars F0-1-1-5 a F0-3-12-5 han crecido durante 1 d.
7 36 (F0-1-1-7 a F0-3-12-7) 36 (F0-1-1-5 a F0-3-12-5, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia en los agars F0-1-1-5 a F0-3-12-5 han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F1-1-1-4 a F1-3-12-4) 36 (F0-1-1-6 a F0-3-12-6) El número total de nematodos en agars F1-1-1-1 a F1-3-12-1, F0-1-1-4 a agars F0-3-12-4 y F0-1-1-5 a F0-3-12-5 se utilizan para calcular la reproducción inicial de F0.
36 (F2-1-1-1 a F2-3-12-1) Los nematodos de descendencia en los agars F0-1-1-6 a F0-3-12-6 han crecido durante 1 d.
Los nematodos F2 en F2-1-1-0 a F1-3-12-0 han crecido durante 1 d y sus marcadores se cambian a F2-1-1-1 a F2-3-12-1.
8 36 (F0-1-1-8 a F0-3-12-8) 36 (F0-1-1-6 a F0-3-12-6, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia en los agars F0-1-1-6 a F0-3-12-6 han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F1-1-1-5 a F1-3-12-5) 36 (F0-1-1-7 a F0-3-12-7) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-7 a F0-3-12-7 agars han crecido durante 1 d.
36 (F2-1-1-2 a F2-3-12-2) 36 (F1-1-1-4 a F1-3-12-4) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-4 a F1-3-12-4 agars han crecido durante 1 d.
36 (F2-1-1-1 a F2-3-12-1, cambiado a F2-1-1-2 a F2-3-12-2 después de contar) Los nematodos F2 en F2-1-1-1 a F2-3-12-1 han crecido durante 2 d, los nematodos se cuentan y sus marcadores se cambian en F2-1-1-2 a F2-3-12-2.
9 36 (F0-1-1-9 a F0-3-12-9) 36 (F0-1-1-7 a F0-3-12-7, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-7 a F0-3-12-7 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F1-1-1-6 a F1-3-12-6) 36 (F1-1-1-4 a F1-3-12-4, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-4 a F1-3-12-4 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F2-1-1-3 a F2-3-12-3) 36 (F0-1-1-8 a F0-3-12-8) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-8 a F0-3-12-8 agars han crecido durante 1 d.
36 (F3-1-1-0 a F3-3-12-0) 36 (F1-1-1-5 a F1-3-12-5) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-5 a F1-3-12-5 agars han crecido durante 1 d.
Los nematodos F2 en F2-1-1-2 a F2-3-12-2 han crecido durante 3 días y sus marcadores se cambian a F2-1-1-3 a F2-3-12-3. Los nematodos F2 comienzan a reproducirse hoy en día y se transfieren a 36 nuevos agars NGM son necesarios y marcados como F3-1-1-0 a F3-3-12-0. Para los estudios MGR, T3 comienza hoy.
10 36 (F0-1-1-10 a F0-3-12-10) 36 (F0-1-1-8 a F0-3-12-8, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-8 a F0-3-12-8 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F1-1-1-7 a F1-3-12-7) 36 (F1-1-1-5 a F1-3-12-5, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-5 a F1-3-12-5 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F2-1-1-4 a F2-3-12-4) 36 (F0-1-1-9 a F0-3-12-9) El número total de nematodos en F2-1-1-1 a F2-3-12-1, F1-1-1-4 a agars F1-3-12-4 y F1-1-1-5 a F1-3-12-5 se utilizan para calcular la reproducción inicial de F1.
36 (F3-1-1-1 a F3-3-12-1) 36 (F1-1-1-6 a F1-3-12-6) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-9 a F0-3-12-9 agars han crecido durante 1 d.
Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-6 a F1-3-12-6 agars han crecido durante 1 d.
El nematodo de descendencia en los agars F3-1-1-0 a F3-3-12-0 ha crecido durante 1 d y los marcadores se cambian en F3-1-1-1 a F3-3-12-1.
En particular, la reproducción de nematodos F0 disminuirá significativamente después de los primeros días. Por lo tanto, la transferencia de nematodos no está estrictamente obligada a ser diaria después de D10 y se puede realizar cada 2 días. Sin embargo, la supervivencia todavía requiere observación diaria.
La misma regla también se aplica en F1 (T1, T1'), F2 (T2, T2') y F3 (T3, T3').
11 36 (F0-1-1-11 a F0-3-12-11) 36 (F0-1-1-9 a F0-3-12-9, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-9 a F0-3-12-9 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F1-1-1-8 a F1-3-12-8) 36 (F1-1-1-6 a F1-3-12-6, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-6 a F1-3-12-6 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F2-1-1-5 a F2-3-12-5) 36 (F0-1-1-10 a F0-3-12-10) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-10 a F0-3-12-10 agars han crecido durante 1 d.
36 (F3-1-1-2 a F3-3-12-2) 36 (F1-1-1-7 a F1-3-12-7) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-7 a F1-3-12-7 agars han crecido durante 1 d.
36 (F2-1-1-4 a F2-3-12-4) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-4 a F2-3-12-4 agars han crecido durante 1 d.
36 (F3-1-1-1 a F3-3-12-1, cambiado a F3-1-1-2 a F3-3-12-2 después de contar) Los nematodos en los agars F3-1-1-1 a F3-3-12-1 han crecido durante 2 d, los nematodos se cuentan y los marcadores se cambian en F3-1-1-2 a F3-3-12-2.
12 36 (F0-1-1-12 a F0-3-12-12) 36 (F0-1-1-10 a F0-3-12-10, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-10 a F0-3-12-10 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F1-1-1-9 a F1-3-12-9) 36 (F1-1-1-7 a F1-3-12-7, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-7 a F1-3-12-7 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F2-1-1-6 a F2-3-12-6) 36 (F2-1-1-4 a F2-3-12-4, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-4 a F2-3-12-4 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-3 a F3-3-12-3) 36 (F0-1-1-11 a F0-3-12-11) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-11 a F0-3-12-11 agars han crecido durante 1 d.
36 (F4-1-1-0 a F4-3-12-0) 36 (F1-1-1-8 a F1-3-12-8) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-8 a F1-3-12-8 agars han crecido durante 1 d.
36 (F2-1-1-5 a F2-3-12-5) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-5 a F2-3-12-5 agars han crecido durante 1 d.
Los nematodos en los agars F3-1-1-2 a F3-3-12-2 han crecido durante 3 d y los marcadores se cambian en F3-1-1-3 a F3-3-12-3. Los nematodos F3 comienzan a reproducirse hoy en día y se transfieren a 36 nuevos agars NGM son necesarios y marcados como F4-1-1-0 a F4-3-12-0. Para los estudios MGR, la descendencia de F3 (es decir, T1') comienza hoy.
13 36 (F0-1-1-13 a F0-3-12-13) 36 (F0-1-1-11 a F0-3-12-11, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-11 a F0-3-12-11 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F1-1-1-10 a F1-3-12-10) 36 (F1-1-1-8 a F1-3-12-8, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-8 a F1-3-12-8 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F2-1-1-7 a F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-5 a F2-3-12-5, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-5 a F2-3-12-5 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-4 a F3-3-12-4) 36 (F0-1-1-12 a F0-3-12-12) El número total de nematodos en F3-1-1-1 a F3-3-12-1, F2-1-1-4 a agars F2-3-12-4 y F2-1-1-5 a F2-3-12-5 se utilizan para calcular la reproducción inicial de F2.
36 (F4-1-1-1 a F4-3-12-1) 36 (F1-1-1-9 a F1-3-12-9) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-12 a F0-3-12-12 agars han crecido durante 1 d.
36 (F2-1-1-6 a F2-3-12-6) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-9 a F1-3-12-9 agars han crecido durante 1 d.
Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-6 a F2-3-12-6 agars han crecido durante 1 d.
Los nematodos de descendencia de F3 en F4-1-1-0 a F4-3-12-0 han crecido durante 1 d, y los marcadores se cambian en F4-1-1-1 a F4-3-12-1.
14 36 (F0-1-1-14 a F0-3-12-14) 36 (F0-1-1-12 a F0-3-12-12, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-12 a F0-3-12-12 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F1-1-1-11 a F1-3-12-11) 36 (F1-1-1-9 a F1-3-12-9, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-9 a F1-3-12-9 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F2-1-1-8 a F2-3-12-8) 36 (F2-1-1-6 a F2-3-12-6, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-6 a F2-3-12-6 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-5 a F3-3-12-5) 36 (F4-1-1-1 a F4-3-12-1, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F4-1-1-1 a F4-3-12-1 han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos. Para los estudios mgr, los nematodos T1' han crecido durante 2 d, y comenzarán a reproducir T2' al día siguiente (D15), y T2' comenzará a reproducirT3' en D18. La vida útil del tipo salvaje C. elegans se muestra como 15 días. Entonces, el final de la vida útil de T3' será en D33.
36 (F0-1-1-13 a F0-3-12-13) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-13 a F0-3-12-13 agars han crecido durante 1 d.
36 (F1-1-1-10 a F1-3-12-10) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-10 a F1-3-12-10 agars han crecido durante 1 d.
36 (F2-1-1-7 a F2-3-12-7) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-7 a F2-3-12-7 agars han crecido durante 1 d.
36 (F3-1-1-4 a F3-3-12-4) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-4 a F2-3-12-4 agars han crecido durante 1 d.
15 36 (F0-1-1-15 a F0-3-12-15) 36 (F0-1-1-13 a F0-3-12-13, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-13 a F0-3-12-13 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F1-1-1-12 a F1-3-12-12) 36 (F1-1-1-10 a F1-3-12-10, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-10 a F1-3-12-10 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F2-1-1-9 a F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-7 a F2-3-12-7, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-7 a F2-3-12-7 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-6 a F3-3-12-6) 36 (F3-1-1-4 a F3-3-12-4, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-4 a F3-3-12-4 agars han crecido para 2d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F0-1-1-14 a F0-3-12-14) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-14 a F0-3-12-14 agars han crecido durante 1 d.
36 (F1-1-1-11 a F1-3-12-11) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-11 a F1-3-12-11 agars han crecido durante 1 d.
36 (F2-1-1-8 a F2-3-12-8) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-8 a F2-3-12-8 agars han crecido durante 1 d.
36 (F3-1-1-5 a F3-3-12-5) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-5 a F2-3-12-5 agars han crecido durante 1 d.
16 36 (F0-1-1-15 a F0-3-12-15, over) 36 (F0-1-1-14 a F0-3-12-14, despejado después de contar) La vida útil del tipo salvaje C. elegans se muestra como 15 días. Por lo tanto, F0 debería haber muerto antes del día 16 desde la exposición.
36 (F1-1-1-13 a F1-3-12-13) 36 (F1-1-1-11 a F1-3-12-11, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-14 a F0-3-12-14 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F2-1-1-10 a F2-3-12-10) 36 (F2-1-1-8 a F2-3-12-8, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-11 a F1-3-12-11 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-7 a F3-3-12-7) 36 (F3-1-1-5 a F3-3-12-5, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-8 a F2-3-12-8 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F0-1-1-15 a F0-3-12-15) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-5 a F3-3-12-5 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F1-1-1-12 a F1-3-12-12) El número total de nematodos en F4-1-1-1 a F4-3-12-1, F3-1-1-4 a agars F3-3-12-4 y F3-1-1-5 a F3-3-12-5 se utilizan para calcular la reproducción inicial de F3.
36 (F2-1-1-9 a F2-3-12-9) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-15 a F0-3-12-15 agars han crecido durante 1 d.
36 (F3-1-1-6 a F3-3-12-6) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-12 a F1-3-12-12 agars han crecido durante 1 d.
Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-9 a F2-3-12-9 agars han crecido durante 1 d.
Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-6 a F2-3-12-6 agars han crecido durante 1 d.
17 36 (F1-1-1-14 a F1-3-12-14) 36 (F0-1-1-15 a F0-3-12-15, despejado después de contar, más) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-15 a F0-3-12-15 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos. No habrá más descendencia F0.
36 (F2-1-1-11 a F2-3-12-11) 36 (F1-1-1-12 a F1-3-12-12, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-12 a F1-3-12-12 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-8 a F3-3-12-8) 36 (F2-1-1-9 a F2-3-12-9, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-9 a F2-3-12-9 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-6 a F3-3-12-6, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-6 a F3-3-12-6 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F1-1-1-13 a F1-3-12-13) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-13 a F1-3-12-13 agars han crecido durante 1 d.
36 (F2-1-1-10 a F2-3-12-10) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-10 a F2-3-12-10 agars han crecido durante 1 d.
36 (F3-1-1-7 a F3-3-12-7) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-7 a F2-3-12-7 agars han crecido durante 1 d.
18 36 (F1-1-1-15 a F1-3-12-15) 36 (F1-1-1-13 a F1-3-12-13, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-13 a F1-3-12-13 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F2-1-1-12 a F2-3-12-12) 36 (F2-1-1-10 a F2-3-12-10, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-10 a F2-3-12-10 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-9 a F3-3-12-9) 36 (F3-1-1-7 a F3-3-12-7, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-7 a F3-3-12-7 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F1-1-1-14 a F1-3-12-14) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-14 a F1-3-12-14 agars han crecido durante 1 d.
36 (F2-1-1-11 a F2-3-12-11) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-11 a F2-3-12-11 agars han crecido durante 1 d.
36 (F3-1-1-8 a F3-3-12-8) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-8 a F2-3-12-8 agars han crecido durante 1 d.
En los estudios mgr, T2' comenzará a reproducir T3' hoy en día. La vida útil del tipo salvaje C. elegans se muestra como 15 días. Entonces, el final de la vida útil de T3' será en D33.
19 36 (F1-1-1-15 a F1-3-12-15, over) 36 (F1-1-1-14 a F1-3-12-14, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-14 a F1-3-12-14 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F2-1-1-13 a F2-3-12-13) 36 (F2-1-1-11 a F2-3-12-11, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-11 a F2-3-12-11 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-10 a F3-3-12-10) 36 (F3-1-1-8 a F3-3-12-8, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-8 a F3-3-12-8 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F1-1-1-15 a F1-3-12-15) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-15 a F1-3-12-15 agars han crecido durante 1 d.
36 (F2-1-1-12 a F2-3-12-12) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-12 a F2-3-12-12 agars han crecido durante 1 d.
36 (F3-1-1-9 a F3-3-12-9) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-9 a F2-3-12-9 agars han crecido durante 1 d.
20 36 (F2-1-1-14 a F2-3-12-14) 36 (F1-1-1-15 a F1-3-12-15, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-14 a F1-3-12-14 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos. No habrá más descendencia de F1.
36 (F3-1-1-11 a F3-3-12-11) 36 (F2-1-1-12 a F2-3-12-12, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-12 a F2-3-12-12 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-9 a F3-3-12-9, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-9 a F3-3-12-9 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F2-1-1-13 a F2-3-12-13) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-13 a F2-3-12-13 agars han crecido durante 1 d.
36 (F3-1-1-10 a F3-3-12-10) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-10 a F2-3-12-10 agars han crecido durante 1 d.
21 36 (F2-1-1-15 a F2-3-12-15) 36 (F2-1-1-13 a F2-3-12-13, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-13 a F2-3-12-13 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-12 a F3-3-12-12) 36 (F3-1-1-10 a F3-3-12-10, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-10 a F3-3-12-10 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F2-1-1-14 a F2-3-12-14) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-14 a F2-3-12-14 agars han crecido durante 1 d.
36 (F3-1-1-11 a F3-3-12-11) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-11 a F2-3-12-11 agars han crecido durante 1 d.
22 36 (F2-1-1-15 a F2-3-12-15, over) 36 (F2-1-1-14 a F2-3-12-14, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-14 a F2-3-12-14 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-13 a F3-3-12-13) 36 (F3-1-1-11 a F3-3-12-11, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-11 a F3-3-12-11 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-12 a F3-3-12-12) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-12 a F2-3-12-12 agars han crecido durante 1 d.
23 36 (F3-1-1-14 a F3-3-12-14) 36 (F2-1-1-15 a F2-3-12-15, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-15 a F2-3-12-15 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos. No habrá más descendencia F2.
36 (F3-1-1-12 a F3-3-12-12, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-12 a F3-3-12-12 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-13 a F3-3-12-13) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-13 a F2-3-12-13 agars han crecido durante 1 d.
24 36 (F3-1-1-15 a F3-3-12-15) 36 (F3-1-1-13 a F3-3-12-13, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-13 a F3-3-12-13 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-14 a F3-3-12-14) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-14 a F2-3-12-14 agars han crecido durante 1 d.
25 36 (F3-1-1-15 a F3-3-12-15, over) 36 (F3-1-1-14 a F3-3-12-14, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-14 a F3-3-12-14 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
36 (F3-1-1-15 a F3-3-12-15) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-15 a F2-3-12-15 agars han crecido durante 1 d.
26 36 (F3-1-1-15 a F3-3-12-15, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-15 a F3-3-12-15 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.
En particular, en los estudios de MGR, la primera descendencia no expuesta de F3 (es decir, T3') nacería en D18. La vida útil del tipo salvaje C. elegans se muestra como 15 días. Entonces, el final de la vida útil de T3' será en D33.
Tanto los estudios MGE como MGR cubrirán más días cuando la vida útil del nematodo sea más larga.

Tabla 1: Lista de marcadores y sus definiciones.

  1. Mida la reproducción y la vida útil en estudios de efectos MGE.
    1. En D0, repita el paso 5.6. Marque los agars (3 grupos con 10 réplicasen cada uno) como Fx- a -b-c, donde x se refiere al número de generación, a se refiere al número de grupo (1 para el control, 2 para la baja concentración y 3 para la alta concentración ); b se refiere a la réplica de 1 a 10; y c se refiere a la duración de la exposición (0 indica el inicio). Para D0, marca los agars como F0-1-1-0 a F0-3-10-0. Los lectores pueden consultar la Tabla 1 para obtener información detallada.
    2. En D1, compruebe el crecimiento del nematodo en los agars y cambie los marcadores de F0-1-1-0 a F0-3-10-0 a F0-1-1-1 a F0-3-10-1.
    3. En D2, compruebe el crecimiento del nematodo en los agars y cambie los marcadores F0-1-1-2 a F0-3-10-2.
    4. En D3, elija 24 nematodos F0 de cada grupo en 12 nuevos agars NGM con dos agar NGM del paso 5.4. Marque los agars como F0-1-1-3 a F0-3-12-3.
    5. En D4, transfiera los dos nematodos principales de F0-1-1-3 a F0-3-12-3 recogiendo nuevos agars NGM del paso 5.4. Marque los nuevos agars NGM como F0-1-1-4 a F0-3-12-4. Cambie los marcadores de F0-1-1-3 a F0-3-12-3 a F1-1-1-1 a F1-3-12-1 para representar la descendencia de F0 (es decir, F1) dentro del primer día desde que F0 comienza a reproducirse.
    6. En D5, utilice un microscopio de disección para contar los nematodos en los agars F1-1-1-1 a F1-3-12-1 donde los nematodos han crecido 2 días. Permita que F1-1-1-1 a los agars F1-3-12-1 reproduzcaN F2 para generaciones sucesivas.
    7. Transfiera los dos nematodos principales de F0-1-1-4 a agars F0-3-12-4 recogiendo nuevos agars NGM del paso 5.4. Marcos NGM agars como F0-1-1-5 a F0-3-12-5. Cambie las marcas de F0-1-1-4 a F0-3-12-4 a F1-1-1-2 a F1-3-12-2 para representar la descendencia de F0 (es decir, F1) dentro del segundo día desde que F0 comienza a reproducirse.
    8. En D6, cuente los nematodos en los agars F1-1-1-2 a F1-3-12-2. Transfiera los nematodos primarios de F0-1-1-5 a agars F0-3-12-5 a F0-1-1-6 a F0-3-12-6. Cambie los marcadores de F0-1-1-5 a F0-3-12-5 a F1-1-1-3 a F1-3-12-3 para representar la descendencia de F0 (es decir, F1) dentro del tercer día desde que F0 comienza a reproducirse.
    9. Los nematodos en los agars F1-1-1-1 a F1-3-12-1 han crecido durante 3 días. Utilícelos para reproducir F2 en estudios de efectos MGE sucesivos. De la misma manera, utilice nematodos F2 para reproducir F3 para continuar con los estudios de efectoMGE.
    10. De la misma manera, transferir los dos nematodos principales diariamente y contar los nematodos de la descendencia al día siguiente, hasta que los nematodos primarios en 6 agars NGM (es decir, la mitad del total de agars en cada grupo) detengan la reproducción.
    11. Calcule el número total de crías durante toda la duración de la reproducción como el tamaño total de la cría. Utilice el número de descendencia dentro de los primeros 3 días para representar la reproducción inicial de los padres.
    12. Utilice el día en que la reproducción de nematodos padre se detenga en 6 agars NGM para estimar la duración de la reproducción. Utilice los días que cada padre ha sobrevivido como su vida útil.
    13. Obtener la reproducción inicial, la duración de la reproducción, el tamaño total de la cría y la vida útil de F1 de la misma manera que se hace para F0. Del mismo modo, repitiendo el procedimiento antes mencionado, se puede obtener información de reproducción y vida útil de F2 (a Fn).
  2. Mida la reproducción y la vida útil en estudios de efectos MGR.
    1. Realice el paso 7.2.4 con los agars NGM del paso 5.4 cambiadoa a los del paso 2.13.
  3. Mida los índices bioquímicos.
    1. Tire los nematodos de los agars NGM con agua estéril y recójalos en tubos de centrífuga. Liquidar los nematodos durante 30 minutos y desechar los sobrenatos. Utilice los nematodos en los pellets para la medición del efecto.
    2. Añadir 1 ml de solución salina tamponada de fosfato frío por hielo (PBS, pH 7.0) en los nematodos (pellets) en los tubos de centrífuga de 1,5 ml para lavar los nematodos.
    3. Centrifugar a 10.000 x g durante 5 min a 4 oC, y desechar cuidadosamente los sobrenadores con una pipeta.
    4. Congele los pellets con nitrógeno líquido o en un congelador de -80 oC.
    5. Homogeneizar los pellets utilizando pestillos en un baño de hielo. Utilice PBS helado de 200 l para lavar los líquidos residuales del pestillo en el tubo de centrífuga antes de sacar el pestillo.
    6. Centrifugar a 10.000 x g durante 5 min de nuevo a 4 oC de nuevo, y utilizar los sobrenadores para determinar las actividades o cantidades de bioquímicos con los kits comerciales (ver la Tabla de Materiales para más detalles).
    7. Mida las cantidades de la proteína total (TP) en las muestras y utilice los resultados como denominador en la representación de otros indicadores bioquímicos, de modo que se pueda eliminar la diferencia entre los números de nematodos entre las muestras.
  4. Mida la expresión génica.
    1. Repita los pasos 7.4.1 a 7.4.4. Aísle el ARN total de las muestras de nematodos utilizando un kit de extracción de ARN comercial (consulte la Tabla de materiales para más detalles) de acuerdo con las instrucciones21del fabricante.
    2. Utilice el ARN para sintetizar el ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante21.
    3. Analizar la muestra de ADNendo en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) utilizando kits Rt-PCR sin fin de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales)21.
    4. Cuantifique los niveles de expresión relativos de los genes elegidos por el método 2- CT22, y trate los niveles de expresión de gdp-2 (u otro gen de referencia) como referencia negativa.

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Representative Results

Aquí, describimos protocolos para estudiar los efectos de los productos químicos a lo largo de generaciones utilizando C. elegans en estudios de efectos transgeneracionales (TG), exposición multigeneracional (MGE) y residuos multigeneracionales (MGR). Nuestros propios resultados de investigación se presentan como ejemplos. Un estudio presenta los efectos TG de los metales pesados en el comportamiento de la locomoción3. Los otros dos estudios presentan los efectos MGE y MGR del sulfometoxazoly el lindano en las mediciones de reproducción e índices bioquímicos y genéticos 4,14.

Efectos tG de metales pesados en el comportamiento de locomoción de C. elegans

Los efectos TG del cadmio (Cd), cobre (Cu), plomo (Pb) y zinc (Zn) en la frecuencia de flexión corporal (BBF) se estudiaron en el nematodo padre (F0) después de la exposición materna y su progenie (T1)3. Los efectos de los metales en BBF mostraron que las inhibiciones en T1 eran mayores que en F0, demostrando toxicidades más severas de metales pesados en el comportamiento de la locomoción en la descendencia expuesta al embrión que en el padre directamente expuesto. Los efectos TG de los metales pesados a concentraciones ambientalmente realistas demostraron que la exposición materna puede multiplicar los peligros de la contaminación por metales pesados en las generaciones venideras. Vea la figura1.

Figure 1
Figura 1 : Los efectos del cadmio (Cd), cobre (Cu), plomo (Pb) y zinc (Zn) en la frecuencia de flexión corporal del padre nematodo (F0, en blanco) después de la exposición prenatal y su progenie (T1, sombreado). Barra de error: error estándar; * - significativamente diferente del control, p < 0.05; • - significativamente diferente de la concentración más baja, p < 0.05; + implica efectos significativamente diferentes en F1 que en F0, p < 0,05. Esta cifra ha sido modificada de Yu et al.3 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Efectos del MGR del sulfametoxazol (SMX) en la vida útil y reproducción del nematodos

Los efectos mgr de sulfametoxazol (SMX) en la vida útil del nematodo y la reproducción14 se estudiaron en el padre gestante (F0), descendencia expuesta a embrionarios (T1), descendencia expuesta a la línea germinal (T2), la primera descendencia no expuesta (T3) y las tres las siguientes generaciones (T4-T6). Los resultados mostraron que la reproducción (un tamaño total de la cría en el 49% del control) se vio significativamente afectada en la exposición a la línea germinal (T2), y las toxicidades persistieron en generaciones no expuestas de las generaciones T3 a T6 (Figura2). Nuestros hallazgos plantearon nuevas preocupaciones con respecto a las influencias a largo plazo de los propios antibióticos además de sus efectos sobre la resistencia a los antibióticos.

Figure 2
Figura 2 : Tamaño de la cría (en (A), expresado en porcentaje de control) y reproducción inicial (en (B)) de C. elegans en el padre expuesto y su descendencia (F0, T1 a T6, de izquierda a derecha en cada concentración). Barra de error: error estándar; a - significativamente diferente del control por ANOVA (p < 0.05); b - significativamente diferente del control y de la generación anterior a la misma concentración (p < 0.05); c - significativamente diferente del control y de la menor concentración en la misma generación (p < 0.05); d - significativamente diferente del control y de la generación anterior a la misma concentración y la menor concentración en la misma generación (p < 0.05); e - significativamente diferente de la generación anterior a la misma concentración y la menor concentración en la misma generación (p < 0.05); f - significativamente diferente de la generación anterior a la misma concentración (p < 0.05). Esta cifra ha sido modificada de Yu et al.14 con permiso.

Efectos MGE y MGR del lindano en los índices bioquímicos y genéticos del nematodos

Los efectos MGE y MGR del lindano (un contaminante orgánico persistente [POP]) se estudiaron en los bioquímicos clave en los metabolismos lipídicos y los cambios en la expresión genética en la vía similar a la insulina4. Los resultados mostraron que el lindano mostró efectos obesogénicos con alteraciones en la regulación de la señal de insulina (Figura3). Además, los cambios entre la señalización sgk-1 (F0, F3, T1' y T3') y akt-1 (T1 y T3) indicaron que los nematodos de diferentes generaciones de exposición mostraban diferentes estrategias de respuesta para la tolerancia y la evitación.

Figure 3
Figura 3 : Cambios de los niveles de expresión de genes clave en la vía de señal similar a la insulina en nematodos con diferentes experiencias de exposición. • Regulación positiva; symbol : regulación negativa; :expresión up-regulation; :expresión down-regulation. Esta figura ha sido modificada de Chen al.4 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Con el fin de llevar a cabo con éxito el protocolo descrito, se deben tener en cuenta las siguientes sugerencias. Realizar las operaciones experimentales generales en un entorno estéril. Un funcionamiento inadecuado puede dar lugar a la contaminación de las cepas de E. coli, por ejemplo, hongos y ácaros pueden obstaculizar el crecimiento normal de C. elegans y, por lo tanto, afectar a los resultados experimentales. En la sección que describe el cultivo de C. elegans, observe la escala de crecimiento de C. elegans en los agars NGM por ojos desnudos o microscopios. Cuando la escala de C. elegans en el agar supere el 75% en el área, o el tiempo de cultivo supere una semana, realice una nueva ronda de inoculación para evitar el crecimiento excesivo o la disminución de la población de C. elegans. Antes del proceso de sincronización, utilice un microscopio para observar el crecimiento de C. elegans,y continúe el proceso cuando los huevos de nematodos se distribuyen ampliamente en el agar. Además, si se utilizan disolventes (p. ej., dimetilsulfóxido [DMSO]), sus concentraciones en las soluciones de stock deben ser inferiores al 1 % para garantizar que sus concentraciones finales no superen el 0,5% (v/v) para evitar los efectos adversos de los propios disolventes. En los estudios de efecto TG, la duración de la exposición superior a 24 h es necesaria para garantizar que el tiempo de exposición cubra la formación embrionaria de la siguiente generación, y la duración debe ser dentro de 96 h para facilitar la separación de la generación posterior. Utilice pequeñas cantidades de nematodos (generalmente dentro de 20) para medir la vida útil y la reproducción. Por otro lado, utilizar grandes cantidades de nematodos (generalmente más de 500) para medir índices de regulación bioquímica y genética. Por lo tanto, con el fin de asegurar un número suficiente de muestras, realizar experimentos preliminares para estimar aproximadamente cuántos descendientes pueden reproducirse los nematodos F0 maduros dentro de las primeras 24 horas desde que comienzan la reproducción. A continuación, determine el número de nematodos F0 necesarios para asegurarse de que hay al menos 200 crías para los estudios multigeneracionales que proceden.

En comparación con los informes anteriores de estudios de TG con C. elegans,el protocolo experimental actual era más considerado de la elección de la etapa de la vida. En C. elegans,los espermatozoides se forman en la etapa L4 para fertilizar los ovocitos formados posteriormente23. En consecuencia, la exposición que cubre el período de espermogénesis y ootogénesis proporcionará una ventana particular para estudiar los efectos de TG en la descendencia. Los huevos sincronizados con la edad se utilizan para estudios de efectos multigeneracionales para garantizar que la exposición cubra el período global desde el comienzo de cada ciclo de vida. En comparación con estudios multigeneracionales anteriores, el protocolo experimental actual facilitó la medición de efectos a lo largo de varias generaciones en lugar de sólo 1-2 generaciones. Además, el presente protocolo consideró los efectos MGE y MGR, que es más sistemático que los estudios anteriores que sólo midieron los efectos MGE o MGR.

En particular, todavía hay algunas cuestiones que deben tenerse en cuenta en el actual protocolo experimental. El protocolo actual emplea C. elegans de tipo salvaje cuyo tiempo de generación es de alrededor de 60 h y la vida útil es de 20 días. Esto hace que la duración total del experimento sea bastante larga (por ejemplo, el estudio de efectos MGE sobre la vida útil durante 3 generaciones requiere al menos 30 días). Con el fin de acortar el tiempo, los investigadores pueden elegir mutante C. elegans, como los nematodos mutantes de corta duración. Otro problema es el tratamiento de matar a las bacterias, cuyo estado vivo es necesario para mantener los nematodos sanos 24. Además, el proceso de matanza UV podría introducir cambios en los productos químicos25. Por lo tanto, se deben considerar otros tratamientos en las bacterias, y puede ser necesario un control cuidadoso de los cambios químicos durante el proceso de preparación o exposición, especialmente para compuestos inestables. Al mismo tiempo, hay limitaciones en el estudio de las diferencias sexuales en los efectos tóxicos porque la mayoría del hecho de que C. elegans es hermafrodita. Se necesitan más mejoras para investigar la contribución sexual en los efectos TG, MGE o MGR. En resumen, anticipamos que el protocolo propuesto será un gran significado para el uso de C. elegans para estudiar los efectos TG, MGE y MGR de los tóxicos.

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Disclosures

Los autores agradecen los apoyos financieros del Proyecto Principal Nacional de Ciencia y Tecnología para el Control y Tratamiento de la Contaminación del Agua (2017ZX07201004), y el Programa Internacional de Cooperación Científica y Tecnológica de China (No 2016YFE0123700).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar?Corning?America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Ciencias Ambientales Número 149 Efecto transgeneracional Efecto de exposición multigeneracional efecto residual multigeneracional protocolo de experimento caenorhabditis elegans,contaminante persistente
Uso de <em>Caenorhabditis elegans </em>para el estudio de los efectos trans y multigeneracionales de los tóxicos
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Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z.,… More

Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

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