在肝炎症和纤维化环境中产生的肝细胞癌的致癌肝细胞诱导正交小鼠模型

Summary

在这里，我们描述了一个临床相关的肝癌小鼠模型的发展，概括了肝细胞癌（HCC）的典型免疫特征。

Abstract

缺乏临床相关动物模型，解决肝细胞癌（HCC）的典型免疫特征，大大阻碍了阐明其基本机制和开发创新的免疫治疗策略。为了开发一种理想的动物模型来概括人类HCC，免疫能力雄性C57BL/6J小鼠首先接受四氯化碳（CCl_4）注射以诱导肝纤维化，然后从年轻雄性小鼠获得组织学正常的致癌肝细胞SV40 T抗原（TAg）-转基因小鼠（MTD2）通过精内（ISPL）接种。在青春期接受的雄性小鼠中产生的雄激素在肝脏特异性启动子的控制下启动TAg表达。因此，转移的肝细胞成为癌细胞，在肝纤维化/肝硬化的设置中形成肿瘤质量。这一新颖的模型模仿了人类HCC在肝纤维化/肝硬化背景下的启动和进展，反映了人类HCC的最典型特征，包括免疫功能障碍。

Introduction

肝细胞癌（HCC）是美国（^{美国）1、2、3}类癌症中增加速度最快的类型。每年约有85万新病例被诊断^为4，5和70万患者死于这种致命的疾病6，7，8，9，10，使其成为全球癌症相关死亡的第二高原因。HCC的管理包括手术切除，移植，消融，化疗，或全身疗法，如索拉菲尼^布11。早期诊断和管理与手术切除或移植有最高的整体生存^效益4。不幸的是，大多数患者在后期出现，需要管理与消融，化学代谢或索拉菲尼^布12。Sorafenib，一种受体酪氨酸激酶抑制剂（RTKI），于2008年被美国食品和药物管理局批准为治疗不可分离的HCC的唯一系统药物治疗。虽然这种药物只提供了一个适度的增加整体存活率，从7.9个月到10.7^个月13，它提供了一个新的治疗策略，可以用来管理HCC。

操纵免疫系统来消除已建立的癌症是癌症研究中一个迅速成长^的领域。免疫检查点研究大大推进了癌症治疗中的免疫治疗药物^{开发15、16。}FDA批准使用抗体（Abs）对抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4），程序化细胞死亡蛋白1（PD-1），及其配体PD-L1用于治疗黑色素瘤、肺癌、头颈部癌症和膀胱^{癌1718,19,20.}使用一种或多种抗体治疗高级HCC的单一疗法或联合疗法的临床试验^{正在进行中，21、22、23}和一些试验已显示出良好的结果。2017年，FDA批准加速批准抗PD-1抗体治疗HCC患者，这些患者对索拉菲尼具有抗药性，但该疗法的总体反应率仅为14.3%。其他策略尚未转化为临床实践^{在这个时候24，25。}克服肿瘤诱发的深层免疫耐受性，改善免疫检查点^治疗26;预测免疫检查点治疗的疗效;预防免疫相关不良事件;优化管理路线、剂量和频率;并找到有效的治疗方法组合27，28，29都仍然是极具挑战性的任务。

目前，在小鼠模型中，有几种用于诱导HCC的常规方法，根据研究者的特定研究^问题30加以利用。化学诱导的HCC小鼠模型与基因毒性化合物模仿损伤引起的恶性。通过HCC细胞系的异位或正位植入的异种移植模型适用于药物筛选。一些转基因小鼠被设计用于研究HCC的病理生理学。表达病毒基因、肿瘤基因和/或生长因子的转基因小鼠能够识别与肝癌有关的途径。由于固有的局限性，这些模型不重述在人类HCC中看到的典型免疫特征，这大大阻碍了阐明潜在的机制和开发创新的免疫治疗^{策略14 ， 15}.我们最近创建了一个临床相关的鼠模型。这种新颖的模型不仅模仿人类HCC的启动和进展，而且反映了人类疾病的最典型特征，包括免疫功能障碍。我们具有其生物学和免疫学特征。利用这一新颖的模式，我们探索了治疗HCC^{31、32、33、34、35、36}的各种免疫治疗^{策略。 37.}这个独特的平台使我们能够研究肿瘤诱导免疫耐受机制，并为HCC制定概念验证治疗策略，最终实现临床翻译。

Protocol

注：所有程序，包括动物科目，都已获得密苏里大学IACUC的批准。所有小鼠均按照《实验室动物护理和使用指南》中概述的标准得到人道照顾。以下细胞分离和接种过程应在罩内执行。所有表演者应佩戴标准个人防护设备，以处理小鼠和组织。

1. 肝纤维化和肝硬化与四氯化碳IP注射 （CCl₄）

注：参见图1。（CCl₄是高度危险的试剂，应小心处理，并佩戴耐化学手套）

1. 获取六至八周大的雄性C57BL/6J小鼠（见材料表）。
2. 在离心管中的玉米油中制备10%CCl 4（v/v）溶液。根据要注射的小鼠数量确定总体积（参见步骤 1.6）。
3. 使用适当的鼠标处理技术选择一只小鼠进行注射。
4. 手动约束鼠标的背肩（腹部）侧向上。
5. 用70%的酒精擦洗小鼠腹壁上的注射部位。
6. 使用25号一次性针头注射160μL的10%CCl₄溶液，注射雄性C57BL/6J小鼠。
7. 确保针穿透腹部壁（约 4-5 毫米），侧斜面向上，在 15-20 度下略角。
8. 每周注射小鼠两次，共四周，每只小鼠总共接受八次注射。
   注：上次注射两周后，经过治疗的小鼠已准备好接种MTD2小鼠的致癌肝细胞的ISPL。

2. 从线MTD2小鼠中分离标记转基因肝细胞

注：有关解决方案配方，请参阅表 1。

10x Earle 平衡盐溶液，不含钙或镁（EBSS 无 Ca 或 Mg）	4 g KCl 68 克纳Cl 1.4 g NaH2PO4*H2o 10 g 德克斯罗斯 将水加到 1 升，pH 到 4.32 通过过滤器
解决方案 1	20 mL 10x EBSS，不含卡或镁 44 克 NaHCO3 1.33 mL 1.5M 海普斯 10 mL 的 10 mL EGTA 将水加到 200 mL
解决方案 2	100 mL 10x EBSS 2.2 克 NaHCO3 6.67 mL 1.5 M 海普斯 加水到1升
0.75% 胶原酶溶液	15毫克胶原酶类型1 20 mL 溶液 2
完整中等	2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x 青霉素-链霉素

表 1：解决方案配方。

1. 获得线MTD2^小鼠38，作为致癌肝细胞的来源。
2. 用2.5%的半子胶麻醉5周大的MTD2小鼠。
   注：正确的麻醉将通过脚趾捏法检查。简而言之，用两根手指，给鼠标脚趾/脚一个很好的挤压。如果没有退位反应，动物被判断得足够深，可以开始手术。
3. 当充分镇静时，将小鼠置于镇静位置，用胶带固定四肢，以提供足够的腹部表面暴露。
4. 使用剪刀沿长线 alba 做中线腹腔切除术，足以提供足够的肝脏暴露。
5. 将肠道向左放置，以更好地暴露肝脏和门户三重物。
6. 解剖肝脏上方，露出劣质的维纳卡瓦（IVC）。
7. 使用动脉夹将 IVC 压到肝脏上方。
8. 回到肝脏的下边界，使用蝴蝶针（见材料）获得静脉进入入口静脉。用手固定导管。
9. 连续使用注射注射器以8.9 mL/min注射小鼠肝脏，溶液115 mL，15 mL 0.75%胶原酶溶液2，溶液215 mL溶液2。
10. 在50 mL锥形管中切割和取取MTD2小鼠的肿瘤质量，在10-15 mL的PBS中采集注入的肝脏。
11. 删除 PBS 并用 PBS 清洗额外的时间;不要在这一步离心。
12. 用剪刀将肝脏切成小块，然后用PBS 2x再次清洗，以去除剩余的血液。
13. 将5 mL的完整RPMI介质加入锥形管中，用剪刀连续将肝脏切碎到小块（<3 mm）上，组织应顺利通过5 mL移液器。
14. 将完整的 RPMI 添加到 30 mL 的最终体积中，并使用 5 mL 移液器暂停肝脏。
15. 用 70 μm 滤网将混合溶液过滤到 50 mL 锥形管中。
16. 使用完整的 RPMI 清洗滤网几次，并通过添加额外的 RPMI 介质将最终音量调整到 50 mL。
17. 通过离心机快速旋转悬架至最大 500 rpm;一旦速度加速到50 x g，离心机就应该停止。
18. 在 20 mL 的 PBS 中去除了上清液并悬浮颗粒。
19. 使用Trypan蓝色排除和血细胞计对细胞进行计数，然后将细胞浓度调整到2.5 x 10⁶/mL，用于以下细胞接种。
    注：5克肿瘤组织的预期产量为8000万肝细胞，可存活+95%。

3. 通过ISPL注射，将MTD2小鼠的肝细胞接种到野生C57BL/6J型小鼠的肝脏

1. 无菌技术应用于所有程序
2. 麻醉CCl₄处理的雄性C57BL/6J小鼠与2.5%的除胶，小鼠应用眼睛润滑处理，以防止眼睛干燥。
3. 用200μL肝细胞准备注射器注射。
4. 当充分镇静时，将左侧向上的小鼠定位。
5. 刮掉整个小鼠的左侧翼，然后擦洗区域，在70%酒精和βdine之间交替三次。
6. 在手术切口前，先施用5毫克/千克的卡洛芬下皮。
7. 在左侧侧翼上做一个1厘米的切口，与脊柱肌肉下方的背侧最纬13根肋骨平行。
8. 识别脾脏，然后用钝尖钳将其外化。
9. 用两个中等大小的钛夹夹夹住脾脏。将两个夹子放在脾动脉和静脉之间，在接种后在夹子之间留出空间进行切割。
   注：目标是隔离脾脏的下杆，以降低播种风险。
10. 使用27G针将200μL（50万）制备的肝细胞注射到脾脏的下杆中。
11. 用一个中等大小的夹子夹子夹住脚尖的树枝（低级的胸杆容器）。
12. 切下两个最初放置的夹子之间的脾脏。
13. 取出直接注射肿瘤细胞的脾脏下极。
14. 使用 3-0 聚酰辛 910 中断缝合关闭内肌肉层。
15. 使用消毒钢伤口夹关闭外皮层。
    注：钢夹优先于缝合线，以避免动物咀嚼缝合线，留下裂开的伤口。
16. 缝合后，在皮下施用5毫克/千克的卡洛芬。
17. 将所有恢复的动物放在温控加热垫上，并密切监控，直到完全从麻醉中恢复。
18. 手术后让老鼠免费喝水。如果小鼠在手术过程中脱水，则给皮下液体（<1 mL）。
19. 手术后7-10天取出皮肤夹。

Representative Results

从TAg转基因小鼠中分离的致基因肝细胞（图2）通过内注射在野生型小鼠的肝脏中播种（图3）。移植的肝细胞在肝炎症和纤维化设置中成功可靠地生长出具有肿瘤特异性抗原SV40 TAg的正交HCC肿瘤（图4）。

图1：用于准备HCC鼠标模型的原理图。建立HCC创新鼠模型的实验设计。C57BL/6J小鼠首先接受CCl₄的IP注射，每周两次，为期四周，以诱导肝纤维化。上次IP注射两周后，CCl₄治疗小鼠通过ISPL接种接受从年轻雄性MTD2小鼠中分离出的肝细胞。请点击此处查看此图的较大版本。

图2：从线MTD2小鼠中分离和纯化肝细胞。（A） 从MTD2小鼠中分离出的肝细胞，按照协议制备，并沾上锥蓝色，以检测细胞分离的可行性和纯度。 左面板显示肝细胞（黑色箭头）和肿瘤渗透淋巴细胞（红色箭头），在细胞提取过程中被分离。 右面板显示低速离心后剩余的细胞群，包括肝细胞（黑箭头）和显著减少肿瘤渗透淋巴细胞。放大 = 10 倍物镜，刻度杆 = 100 μm . （B） 从 MTD2 小鼠分离的肝细胞在接种野生型 C57BL/6J 小鼠之前，会沾染锥蓝色溶液。 如果存活能力为 >95%，则确定细胞分离是成功的。 死细胞将被色与锥形蓝色（红色箭头），而可行的细胞将不会染色（黑色箭头）。 放大率 = 10 倍物镜，刻度杆 = 100 μm。右图显示细胞分离结果，其中大于95%的肝细胞是可行的，统计数据来自显微镜下5个不同的观察场;误差条表示+SD。请点击此处查看此图的较大版本。

图3：将肝细胞内膜接种到野生型C57BL/6J小鼠的肝脏中。 肝细胞ISPL接种诱导HCC的实验设计。（1） 脾脏被识别和外化。（2） 脾脏用两个中等大小的钛夹夹夹住。（3） 制备的肝细胞被注射到脾脏的下杆。（4） 用一个中等尺寸的夹子夹住下部子（下部胸杆容器）。请点击此处查看此图的较大版本。

图4：用MTD2-肝细胞接种后C57BL/6J小鼠的渐进肿瘤发育。（A） 根据协议建立了肝细胞癌（HCC）正交肿瘤模型。解剖图像是在接种前和亚顺序时间课程拍摄的。（a） 使用MTD2肝细胞接种前显示健康的肝脏。（b） 小鼠肝脏接种后3个月，有严重肿瘤发展的证据。（c） 接种后3.5个月，肿瘤负担加重。（d） 接种后4.5个月。（e） 接种后6个月，整个肝脏有肿瘤证据。（B） 肿瘤结核在用MTD2肝细胞接种后指示的时间点被收获和称重。 误差柱表示=SD =P < 0.001，统计分析由t检验执行。 （C） 野生型和MTD2接种肝部分的代表性图像。血氧林和欧辛（H&E）染色描绘了伪格桑形成（黑色箭头）。有核拥挤，肿瘤细胞是嗜酸性细胞与高细胞核细胞比（放大图像）。放大率 = 20 倍物镜，刻度杆 = 50 μm。右上方上的内装被进一步手动放大。（D） 天狼星红色染色，表明胶原蛋白沉积异常，与肝纤维化一致。放大倍数：40倍，刻度柱=20μm。请点击此处查看此图的较大版本。

图5：肿瘤SV40T抗原基因特异性检测。 （A） 从肿瘤已建立的小鼠中收集了整个小鼠的肿瘤组织和额外的组织样本。 从组织分离出基因组DNA，为传统PCR合成了SV40 T Ag和P53（控制）的引体。SV40 T抗原基因在肿瘤组织中被检测出来，但小鼠的正常组织或其他组织中均不存在。（B） 肿瘤组织从产肿瘤小鼠中收集，并沾染抗SV40 T抗原抗体。左面板是从天真的小鼠收集的健康的肝脏组织的负对照。 右侧面板显示从肿瘤携带小鼠收集的肿瘤组织的重要SV40 T抗原染色（棕色）。 放大度 = 40 倍目标，刻度条 = 20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

通过该协议，我们建立了一个可靠和可重复的HCC模型，模仿人类HCC的启动和进展。临床上，许多危险因素相继诱发肝损伤、肝纤维化、肝硬化和HCC的最后阶段。在我们的协议中，CCl₄的 IP 注射用于在野生型小鼠中首先产生肝纤维化，这允许随后的致癌肝细胞在肝纤维化设置中形成肿瘤。我们发现，肿瘤形成最成功地发生在CCl₄治疗两周后接受肝细胞接种的小鼠身上，而在其他时间点接受注射的小鼠则非常成功。此外，我们发现肝纤维化可以在CCl₄注射后四个月内被检测到。这种方法导致超过90%的小鼠出现HCC肿瘤，而没有接触CCl₄的小鼠则多于HCC肿瘤。在我们的模型中，肝细胞从线MTD2小鼠转移到C57BL/6J小鼠，流量到肝脏，在那里他们成为肝细胞，表达TAg作为组织抗原。在该协议期间，从MTD2分离肝细胞是一个关键步骤。MTD2小鼠肝脏与溶液1和2彻底注入，以完全去除肝脏内的循环红细胞。胶原酶溶液用于以指示的浓度和速度注入肝脏，以产生适当的肝脏消化以释放肝细胞。使用低浓度的胶原酶不足以消化，导致肝细胞团。相反，高浓度对组织过于苛刻，导致可存活的肝细胞显著减少。我们还发现，需要按照我们的协议来描述的短暂离心来提高肝细胞的纯度。我们用于离心的较低自旋可以沉淀肝细胞，并根据这两种细胞的密度差异将白细胞留在上清。

下一个关键步骤是向野生型小鼠接种肝细胞的路线。在我们的试验研究中，我们探索了进行肝细胞接种的各种方法。与接受通过尾静脉和腹腔内注射的细胞的小鼠相比，在接受致癌肝细胞内接种的小鼠中，肝脏中成功的正交肿瘤生长情况最好。注射各种剂量。这些发现表明，正交性HCC生长是路线和剂量依赖。恶性转化逐渐发生，仅限于移植肝细胞的亚群，而不是整个肝囊肿。细胞持续增殖导致肿瘤结节在整个肝脏中发展。

HCC或其他癌症要进展，就必须避开免疫系统;事实上，避免免疫破坏现在被认为是癌症^{的标志39。}然而，缺乏肿瘤特异性抗原是阐明潜在机制的关键障碍。在我们的模型中，TAg在肿瘤中表达，而不是其他器官，作为肿瘤特异性抗原。此外，TAg 具有许多定义良好的表位，可在 C57BL/6J 小鼠中的 CD8 T 细胞中识别。关于TAg表位-I，我们已经生成了416个小鼠线，它们通过转基因表达T细胞受体的表^位34。以TAg为目标检查肿瘤抗原特异性免疫反应，使我们能够在肿瘤启动和进展期间研究肿瘤免疫监测，这无法使用DEN或基因操作诱导的模型。阐明潜在的机制使我们能够识别关键细胞和分子，调解肿瘤引起的免疫耐受性。针对这些关键因素，可以显著推进针对 HCC 的创新免疫治疗策略的发展。利用这种独特的HCC模型和成熟的工具，我们研究了肿瘤诱导耐受^性25、35的深层机制，并探索了各种基于免疫的抗肿瘤免疫^{疗法31，32,36,37}.

综上所述，我国已建立的HCC鼠模型反映了人类疾病的一些典型特征。在之前发表的文章中，我们能够将之确立为具有人类HCC典型特征的临床相关肿瘤模型。我们表明，_用CCl4和MTD2肝细胞治疗的小鼠发展出表达HCC相关抗原的肿瘤，AFP和GPC3^36。病理学确定，我们鼠模型中的病变在宏观和病理上都与人类HCC相似。利用这个可靠的模型和开发的工具，我们可以研究这种复杂的人类疾病，包括洞察HCC开发和临床可用的治疗机制。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close