Summary
Hier beschrijven we de ontwikkeling van een klinisch relevant muriene model van leverkanker die de typische immuunkenmerken van hepatocellulaire kanker (HCC) recapituleren.
Abstract
De afwezigheid van een klinisch relevant diermodel dat de typische immuunkenmerken van hepatocellulaire kanker (HCC) aanpakt, heeft de verheldering van de onderliggende mechanismen en de ontwikkeling van innovatieve immunotherapeutische strategieën aanzienlijk belemmerd. Om een ideaal diermodel te ontwikkelen dat het humaan HCC samenvoert, krijgen immunocompetente mannelijke C57BL/6J-muizen eerst een koolstoftetrachloride (CCl4)-injectie om leverfibrose te induceren, waarna ze histologisch-normale oncogene hepatocyten van jonge mannen krijgen SV40 T antigeen (TAg)-transgene muizen (MTD2) door intra-splenic (ISPL) inoculatie. Androgeen gegenereerd in de ontvangende mannelijke muizen in de puberteit initieert TAg expressie onder controle van een lever-specifieke promotor. Als gevolg daarvan, de overgedragen hepatocyten worden kankercellen en vorm tumor massa's in de setting van leverfibrose/cirrose. Dit nieuwe model bootst Human HCC initiatie en progressie na in de context van leverfibrose/cirrose en weerspiegelt de meest typische kenmerken van humaan HCC inclusief immuun disfunctie.
Introduction
Hepatocellulaire kanker (HCC) is de snelst groeiende vorm van kanker in de Verenigde Staten (VS)1,2,3. Elk jaar worden ongeveer 850.000 nieuwe gevallen gediagnosticeerd4,5 en 700.000 patiënten sterven aan deze dodelijke ziekte6,7,8,9,10 , waardoor het de op één na hoogste oorzaak van kanker-gerelateerde dood wereldwijd. Het beheer van HCC omvat chirurgische resectie, transplantatie, ablatie, chemoembolisatie of systemische therapieën, zoals sorafenib11. Vroegtijdige diagnose en behandeling met chirurgische resectie of transplantatie hebben het hoogste totale overlevingsvoordeel4. Helaas, de meerderheid van de patiënten aanwezig in een later stadium en vereisen Management met ablatie, chemoembolisatie of sorafenib12. Sorafenib, een receptor tyrosine kinase remmer (rtki), werd goedgekeurd door de Food and Drug Administration in 2008 als de enige systemische medicamenteuze therapie beschikbaar voor de behandeling van inoperabel HCC. Hoewel het medicijn alleen een bescheiden toename van de totale overleving biedt, van 7,9 tot 10,7 maanden13, voorzag het in een nieuwe therapeutische strategie die kon worden gebruikt om HCC te beheren.
Het manipuleren van het immuunsysteem om gevestigde kankers te elimineren is een snel groeiend veld in kankeronderzoek14. Immuun Checkpoint studies hebben aanzienlijk geavanceerde immunotherapeutische drug ontwikkeling in de behandeling van kanker15,16. De FDA keurde het gebruik van antilichamen (ABS) goed tegen cytotoxisch T-lymfocyten antigeen 4 (CTLA-4), geprogrammeerde celdood proteïne 1 (PD-1), en zijn ligand PD-L1 voor de behandeling van melanoom, longkanker, hoofd-en nekkanker, en blaaskanker17, 18 , 19 , 20. klinische studies met monotherapie-of combinatietherapie waarbij gebruik wordt gemaakt van één of meerdere antilichamen tegen pd-1, PD-L1 of ctla-4 voor de behandeling van Advanced HCC zijn aan de gang21,22,23, en sommige proeven hebben gunstige resultaten opgeleverd. In 2017, de FDA verleende versnelde goedkeuring voor anti-PD-1 antilichaam voor de behandeling van HCC patiënten, die resistentie tegen sorafenib zijn, maar de totale responspercentage van deze therapie is slechts 14,3%. Andere strategieën zijn niet vertaald in de klinische praktijk op dit moment24,25. Overwinnen van tumor-geïnduceerde diepgaande immuun tolerantie ter verbetering van immune Checkpoint therapie26; voorspellen van de werkzaamheid van immuuncontrolepunt therapie; preventie van immuungerelateerde ongewenste voorvallen; het optimaliseren van de toedieningsroute, dosering en frequentie; en het vinden van effectieve combinaties van therapieën27,28,29 blijven allemaal uiterst uitdagende taken.
Er zijn verschillende conventionele benaderingen gebruikt voor het induceren van HCC in muismodellen momenteel en worden gebruikt, afhankelijk van de onderzoeker specifieke onderzoek vraag30. Chemisch geïnduceerde HCC-Muismodellen met genotoxische verbindingen bootsen letsel geïnduceerde maligniteit na. Xenograft-modellen via ectopische of orthotopic implantatie van HCC-cellijnen zijn geschikt voor geneesmiddelen screening. Een aantal genetisch gemodificeerde muizen is ontwikkeld om de pathofysiologie van HCC te onderzoeken. Transgene muizen die virale genen, oncogenen en/of groeifactoren uitdrukken, maken de identificatie mogelijk van trajecten die betrokken zijn bij hepatocarcinogenese. Vanwege inherente beperkingen, deze modellen niet recapituleren de typische immuunkenmerken gezien in humaan HCC, die aanzienlijk heeft belemmerd verheldering van de onderliggende mechanismen en ontwikkeling van innovatieve immunotherapeutische strategieën14 ,15. Onlangs hebben we een klinisch relevant Murine model gecreëerd. Dit nieuwe model bootst niet alleen menselijke HCC initiatie en progressie na, maar weerspiegelt ook de meest typische kenmerken van menselijke ziekte, waaronder immuun disfunctie. We hebben de biologische en immunologische kenmerken ervan gekenmerkt. Gebruikmakend van dit nieuwe model hebben we verschillende immunotherapeutische strategieën onderzocht voor de behandeling van HCC31,32,33,34,35,36, 37. dit unieke platform stelt ons in staat om mechanismen van tumor-geïnduceerde immunotolerance te bestuderen en om proof-of-concept therapeutische strategieën te ontwikkelen voor HCC naar uiteindelijke klinische vertaling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: alle procedures inclusief dierproef personen zijn goedgekeurd door de IACUC aan de Universiteit van Missouri. Alle muizen kregen humane verzorging volgens de criteria die zijn uiteengezet in de "gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren". De volgende procedure voor celisolatie en inoculatie moet worden uitgevoerd in een afzuigkap. Alle performers moeten de standaard persoonlijke beschermingsmiddelen dragen voor het hanteren van de muizen en weefsels.
1. inductie van leverfibrose en cirrose met IP-injectie van tetrachloorkoolstof (CCl4)
Opmerking: Zie afbeelding 1. (CCl4 is zeer gevaarlijk reagens, moet zorgvuldig worden behandeld en met chemicaliën bestendige handschoenen)
- Verkrijg mannelijke C57BL/6J muizen die zes tot acht weken oud zijn (Zie tabel met materialen).
- Bereid 10% CCl4 (v/v) oplossing in maïsolie in een centrifugebuis. Bepaal het totale volume op basis van het aantal te injecteren muizen (zie stap 1,6).
- Gebruik geschikte muizen handlingtechniek om één muis voor injectie te selecteren.
- Handmatig de muis met de rugzijde (buik) omhoog te rebelasten.
- Reinig de injectieplaats op de buikwand van de muis door te schrobben met 70% alcohol.
- Injecteer mannelijke C57BL/6J muizen met 160 μL 10% CCl4 oplossing door intraperitoneale (IP) injectie met een 25-gauge wegwerp naald.
- Zorg ervoor dat de naald door de buikwand dringt (ongeveer 4-5 mm) met schuine kant naar boven en licht schuin op 15-20 graden.
- Injecteer muizen twee keer per week gedurende een totaal van vier weken-elke muis krijgt in totaal acht injecties.
Opmerking: twee weken na de laatste injectie zijn behandelde muizen klaar voor ISPL-inoculatie van oncogene hepatocyten van MTD2 muizen.
2. isoleren van tag-transgene hepatocyten van lijn MTD2 muizen
Opmerking: Zie tabel 1 voor oplossings recepten.
| een uitgebalanceerde zoutoplossing van 10x Earle zonder CA of mg (EBSS zonder CA of mg) | 4 g KCl 68 g NaCl 1,4 g NaH2PO4 · H2O 10 g dextrose Voeg water toe aan 1 liter, pH tot 4,32 Doorlopen filter |
| Oplossing 1 | 20 mL 10x EBSS zonder CA of mg 44 g NaHCO3 1,33 mL 1,5 M Hepes 10 mL van 10 mL EGTA Voeg water toe aan 200 mL |
| Oplossing 2 | 100 mL 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M Hepes Voeg water toe aan 1 liter |
| 0,75% Collagenase-oplossing | 15 mg Collagenase type 1 20 mL oplossing 2 |
| Volledige medium | 2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x Penicillaire-streptomycine |
Tabel 1: oplossings recepten.
- Verkrijg lijn MTD2 muizen38 om te dienen als de bron van oncogene hepatocyten.
- Anesthetize 5-week-oude MTD2 muizen met 2,5% isoflurane.
Opmerking: goede anesthetisering zal worden gecontroleerd door middel van de teen pinch methode. In het kort, met behulp van twee vingers, geef de muis teen/voet een goede squeeze. Als er geen terugtrekkings reactie is, wordt het dier diep genoeg beoordeeld om een operatie te starten. - Plaats muizen in een liggende positie en fixeer de extremiteiten met tape om voldoende blootstelling van het buik oppervlak te bieden.
- Voer een middellijn laparotomie incisie met behulp van een schaar langs de lengte van de linea alba groot genoeg om te zorgen voor een adequate blootstelling van de lever.
- Verplaats de darmen naar links om een betere blootstelling van de lever en portaal triade te bieden.
- Ontleden boven de lever om de onderste vena cava (IVC) bloot te leggen.
- Ligate de IVC boven de lever met behulp van een slagader klem.
- Terugkeren naar de inferieure grens van de lever, gebruik een vlindernaald (Zie materialen) te krijgen IV toegang tot de poortader. Repareer katheter met de hand.
- Achtereenvolgens parfumeer de muis lever met behulp van een injectiespuit op 8,9 mL/min met 15 mL oplossing 1, 15 mL 0,75% Collagenase oplossing 2, en 15 mL oplossing 2 via de katheter.
- Oogst de geperfundeerd lever door snijden en het nemen van de tumor massa van MTD2 muizen in een 50 ml conische buis met 10-15 ml PBS.
- Verwijder PBS en was een extra tijd met PBS; niet centrifugeren bij deze stap.
- Snijd de lever in kleinere stukken met behulp van een schaar en spoel vervolgens opnieuw met PBS 2x om het resterende bloed te verwijderen.
- Voeg 5 mL volledig RPMI medium toe aan de conische buis en de lever voortdurend met een schaar op kleine stukjes (< 3 mm)-weefsel moet soepel door een 5 mL pipet gaan.
- Voeg complete RPMI toe aan een eindvolume van 30 mL en onderbreek de lever met een 5 mL pipet.
- Filtreer de gemengde oplossing met een 70 μm zeef in een conische buis van 50 mL.
- Was de zeef meerdere malen met volledige RPMI en stel het eindvolume in op 50 mL door extra RPMI-medium toe te voegen.
- Draai de suspensie snel door te centrifugeren tot een maximum van 500 rpm; Zodra de snelheid wordt versneld tot 50 x g, moet de centrifuge worden gestopt.
- Decanterende de supernatant en Suspendeer pellets in 20 mL PBS.
- Tel cellen met behulp van Trypan blauwe uitsluiting en een hemocytometer, stel vervolgens de celconcentratie in op 2,5 x 106/ml voor de volgende celinoculatie.
Opmerking: de verwachte opbrengst van 5 gram tumorweefsel is 80.000.000 hepatocyten met levensvatbaarheid > 95%.
3. Inoculating van de hepatocyten van MTD2 muizen naar de lever van wild type C57BL/6J muizen door ISPL injectie
- De aseptische techniek moet worden gebruikt in alle procedures
- Anesthetiseer de CCl4-behandelde mannelijke C57BL/6j-muizen met 2,5% Isofluraan, de muizen moeten worden behandeld met een ooglube om te voorkomen dat de ogen uitdrogen.
- Bereid spuiten met 200 μL hepatocyten voor injectie.
- Plaats muizen met de linker kant omhoog wanneer ze voldoende verdoofd zijn.
- Scheer de hele linkerflank van de muizen en schrobben het gebied af, afgewisseld tussen 70% alcohol en Betadine drie keer.
- Dien 5 mg/kg carprofen subcutaan toe vóór de chirurgische incisie.
- Maak een incisie van 1 cm op de linkerflank evenwijdig aan de 13e rib van de dorsale extreme beginnend net onder de rugspier.
- Identificeer de milt en exterioriseer het met behulp van bot-puntige Tang.
- Klem de milt met twee middelgrote Titanium klemmen. Plaats beide clips tussen de milt slagader en de ader, laat de ruimte tussen de clips na de inoculatie later knippen.
Opmerking: het doel is om de inferieure pool van de milt te isoleren om het risico op zaaien te verminderen. - Injecteer 200 μL (500.000) van de bereide hepatocyten in de onderste pool van de milt met een naald van 27 G.
- Clip de inferieure tak van de pedile (inferieure milt Pole vaten) met één middelgrote clip.
- Snijd de milt tussen de twee in eerste instantie geplaatste clips.
- Verwijder de inferieure pool van de milt die direct met tumorcellen werd geïnjecteerd.
- Gebruik 3-0 polyglactin 910 onderbroken hechten om de binnenste spier laag te sluiten.
- Gebruik gesteriliseerde stalen wond klemmen om de buitenste huidlaag te sluiten.
Opmerking: stalen klemmen hebben de voorkeur boven hechtingen om te voorkomen dat dieren hechtingen uitkauwen en een gapende wond achterlaten. - Dien 5 mg/kg carprofen subcutaan toe na hecht.
- Plaats alle herstellende dieren op een temperatuurgestuurde verwarmingspad en monitor nauwkeurig tot volledig hersteld van anesthesie.
- Geef muizen vrije toegang tot water na de operatie. Als de muis tijdens een operatie gedehydrateerd wordt, dien dan subcutane vloeistoffen toe (< 1 mL).
- Verwijder skin clips op 7-10 dagen na de operatief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oncogene hepatocyten die zijn geïsoleerd van TAg-transgene muizen (Figuur 2) werden in de lever van wild type muizen geënt door intra-milt injectie (Figuur 3). De getransplanteerde hepatocyten succesvol en betrouwbaar groeide orthotopic HCC tumoren (Figuur 4) met tumor specifieke antigeen SV40 TAg (Figuur 5) in de setting van hepatische ontsteking en fibrose (Figuur 1).
Afbeelding 1: schematisch voor het voorbereiden van het muismodel van HCC. Het experimentele ontwerp voor het opzetten van een innovatief Murine model van HCC. C57BL/6J muizen worden eerst behandeld met IP-injectie van CCl4 tweemaal per week gedurende vier weken voor het opwekken van leverfibrose. Twee weken na de laatste IP-injectie krijgen de CCl4-behandelde muizen hepatocyten geïsoleerd van jonge mannelijke MTD2 muizen via ISPL-inoculatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: isolatie en zuivering van hepatocyten uit lijn MTD2 muizen. A) hepatocyten GEÏSOLEERD van MTD2 muizen werden volgens protocol bereid en gekleurd met trypaan blauw om de levensvatbaarheid en zuiverheid van celisolatie te detecteren. Het linker paneel toont zowel hepatocyten (zwarte pijl) en tumor infiltreren lymfocyten (rode pijlen) die zijn geïsoleerd tijdens de extractie van de cel. Het rechter paneel toont de celpopulatie die overblijft na centrifugeren met lage snelheid, inclusief hepatocyten (zwarte pijl) en significant minder tumor infiltrerende lymfocyten. Vergroting = 10x objectief, schaalbalk = 100 μm. (B) hepatocyten GEÏSOLEERD van MTD2 muizen zijn gekleurd met trypan blauwe oplossing voorafgaand aan de inoculatie van wild type C57BL/6j muizen. Celisolatie is vastbesloten om succesvol te zijn als de levensvatbaarheid > 95% is. Dode cellen zal worden gekleurd met de trypan blauw (rode pijlen), terwijl levensvatbare cellen niet zal worden gekleurd (zwarte pijl). Vergroting = 10x objectief, schaalbalk = 100 μm. De grafiek aan de rechterkant toont de resultaten van celisolatie met > 95% van de hepatocyten levensvatbaar, statistische gegevens komen uit 5 verschillende waargenomen veld onder Microscoop; Foutbalken vertegenwoordigen +SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Intrasplenische inoculatie van hepatocyten in de lever van wilde type C57BL/6J muizen. Het experimentele ontwerp voor ISPL inoculatie van hepatocyten voor het induceren van HCC in C57BL/6J muizen. (1) de milt wordt geïdentificeerd en exteriorized. (2) de milt wordt geknipt met twee middelgrote Titanium klemmen. (3) bereide hepatocyten worden geïnjecteerd in de inferieure pool van de milt. (4) de inferieure tak van de pedile (inferieure milt Pole-vaten) wordt geknipt met één middelgrote clip. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: progressieve tumor ontwikkeling in C57BL/6J muizen na inoculatie met MTD2-hepatocyten. (A) hepatocellulair carcinoom (HCC) orthotopic tumor model werd vastgesteld volgens protocol. Anatomische beelden werden genomen voor de inoculatie en tijdens sub-sequentiële tijd cursussen. (a) toont gezonde lever voorafgaand aan de inoculatie met MTD2 hepatocyten. (b) muis lever 3 maanden na inoculatie met bewijs van de ontwikkeling van de bruto tumor. (c) 3,5 maanden na de inoculatie met toenemende tumorlast. d) 4,5 maanden na de inoculatie. (e) 6 maanden na inoculatie met bewijs van tumor in de lever. B) tumor knobbeltjes werden geoogst en gewogen op de tijdstippen aangegeven na de inoculatie met MTD2 hepatocyten. Foutbalken vertegenwoordigen +SD. * * *P < 0,001, statistische analyse werd uitgevoerd door t-tests. C) representatieve beelden van wild type-en MTD2-inocculeerde lever secties. Hematoxylin en eosine (H & E) kleuring beeldt pseudo honden land vorming (zwarte pijlen). Er is nucleaire crowding, en tumorcellen zijn eosinofiel met hoge Nucleus-naar-cytoplasma ratio's (vergrote afbeelding). Vergroting = 20 x objectief, schaalbalk = 50 μm. De inzet in de rechterbovenhoek wordt verder handmatig versterkt. D) Sirius rode kleuring die wijst op abnormale collageen depositie, consistent met leverfibrose. Vergroting: 40x objectief, schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: specifieke detectie van SV40 T-antigeen gen in tumor. (A) tumorweefsel en aanvullende weefselmonsters in muizen werden verzameld bij muizen die in de tumor zijn gevestigd. Genomisch DNA werd geïsoleerd van weefsel en primers voor zowel SV40 T AG en P53 (controle) werden gesynthetiseerd voor conventionele PCR. SV40 T-antigeen-gen werd aangetroffen in tumorweefsel, maar is niet aanwezig in het normale weefsel of andere weefsels in de muizen. (B) tumorweefsel werd verzameld van tumor-dragende muizen en gekleurd met anti-SV40 T antigeen antilichaam. Linker paneel is een negatieve controle van gezonde leverweefsel verzameld van naïeve muizen. Rechter paneel toont significante SV40 T antigeen kleuring van tumorweefsel verzameld van tumor-dragende muizen (bruine kleur). Vergroting = 40x objectief, schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met dit protocol hebben we een betrouwbaar en reproduceerbaar muriene model van HCC opgezet dat menselijke HCC initiatie en progressie nabootst. Klinisch, veel risicofactoren achtereenvolgens induceren leverletsel, leverfibrose, cirrose en de laatste fase van HCC. In ons protocol wordt IP-injectie van CCl4 gebruikt om eerst leverfibrose te produceren in wild type muizen, waardoor de daaropvolgende oncogene hepatocyten de tumoren vormen in de setting van leverfibrose. We ontdekten dat tumorvorming het meest succesvol gebeurde in muizen die twee weken na behandeling met CCl4 de Hepatocyt-inoculatie ontvingen, vergeleken met muizen die op andere tijdstippen injecties kregen. Bovendien, we vonden leverfibrose kan worden gedetecteerd tot vier maanden na CCl4 injectie. Deze aanpak resulteert in meer dan 90% van de muizen die HCC-tumoren ontwikkelen in vergelijking met de muizen zonder blootstelling aan CCl4. In ons model, hepatocyten overgebracht van lijn MTD2 muizen in C57BL/6J muizen, verkeer naar de lever waar ze worden opgenomen als hepatocyten die Express TAg als een weefsel antigeen. Isolatie van hepatocyten van MTD2 is een kritieke stap tijdens dit protocol. MTD2 muis levers worden grondig geperfectiongebruikt met de oplossing 1 en 2 om circulerende rode bloedcellen in de lever volledig te verwijderen. De Collagenase-oplossing wordt gebruikt om de lever op de aangegeven concentratie en snelheid te parfuteren om een goede lever vertering te genereren om hepatocyten vrij te geven. Het gebruik van lagere concentraties Collagenase is onvoldoende voor de spijsvertering, resulterend in klonten hepatocyten. In tegenstelling, hoge concentraties zijn te hard op het weefsel, wat resulteert in een significante vermindering van levensvatbare hepatocyten. We vinden ook dat korte centrifugeren zoals beschreven in ons protocol nodig is om de zuiverheid van hepatocyten te verbeteren. De lagere spin die we gebruikten voor centrifugeren kan hepatocyten neerslaan en leukocyten achterlaten in het supernatant op basis van het dichtheids verschil van deze twee soorten cellen.
De volgende kritieke stap is de route voor het inoculeren van hepatocyten in wilde type muizen. In onze pilotstudies, we onderzocht verschillende manieren om te voeren hepatocyte inoculatie. De succesvolle orthotopic tumorgroei in de lever wordt het best gezien bij muizen die intrasplenische inoculatie van oncogene hepatocyten krijgen in een dosis van een half miljoen cellen per muis, in vergelijking met de muizen die cellen krijgen toegediend via een staart ader en intraperitoneale injectie bij verschillende doseringen. Deze bevindingen suggereren dat de orthotopic HCC-groei route en dosis afhankelijk is. Kwaadaardige transformatie treedt geleidelijk op en is beperkt tot de subpopulatie van getransplanteerde hepatocyten in plaats van het hele leverparenchym. Aanhoudende celproliferatie resulteert in tumor knobbeltjes ontwikkelen in de lever.
Voor HCC of andere kankers om te vooruitgang het moet het immuunsysteem te omzeilen; in feite, het vermijden van immuun vernietiging wordt nu beschouwd als een kenmerk van kanker39. Het ontbreken van tumor-specifiek antigeen is echter een kritische barrière om de onderliggende mechanismen te verhelderend. In ons model, TAg wordt uitgedrukt in de tumoren, niet andere organen, die fungeert als een tumor-specifieke antigeen. Ook heeft TAg tal van goed gedefinieerde epitopen die kunnen worden herkend door CD8 T-cellen in C57BL/6J-muizen. Met betrekking tot TAg epitoop-I, we hebben gegenereerd lijn 416 muizen die transgenically Express T cel receptoren voor deze epitoop34. Targeting TAg om te onderzoeken tumor antigen-specifieke immuunrespons stelt ons in staat om te onderzoeken van tumor immuun surveillance tijdens tumor initiatie en progressie, dat is niet mogelijk met behulp van modellen geïnduceerd door DEN of genetische manipulatie. Het verhelderend maken van de onderliggende mechanismen stelt ons in staat om kritische cellen en moleculen te identificeren die door tumor veroorzaakte immuuntolerantie worden bemiddeld. Het targeten van deze belangrijke factoren kan onze ontwikkeling van innovatieve immunotherapeutische strategieën tegen HCC aanzienlijk verder ontwikkelen. Met behulp van deze unieke HCC model en gevestigde instrumenten, we hebben onderzocht de mechanismen onderliggende tumor-geïnduceerde tolerantie25,35 en onderzocht verschillende immuun-gebaseerde antitumorale immunotherapieën31,32 , 36 , 37.
Kortom, ons gevestigde Murine model van HCC weerspiegelt een aantal typische kenmerken van de menselijke ziekte. In ons eerder gepubliceerde artikel, we waren in staat om dit te vestigen als een klinisch relevant tumor model dat typische kenmerken van menselijke HCC had. We toonden aan dat de muizen behandeld met CCl4 en MTD2 hepatocyten ontwikkelden tumoren die HCC-geassocieerde antigenen, AFP en GPC336uitgedrukt. Pathologie bepaalden dat de laesies in ons muriene model zowel macroscopisch als pathologisch voor humaan HCC vergelijkbaar zijn. Door gebruik te maken van dit betrouwbare model en de ontwikkelde tools, kunnen we deze complexe menselijke ziekte bestuderen, inclusief inzicht in mechanismen van HCC-ontwikkeling en klinisch beschikbare behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen declareren.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) en NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O'Carroll).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | VETEQUIP | IMPAC6 | anesthesia machine for surgery |
| Butterfly needle | BD | 8122963 | Needle used for liver perfusion |
| C57BL/6 mice | Jackson Lab | 000664 | mice used in prototol |
| Carprofen | CRESCENT CHEMICAL | 20402 | carprofen for pain release |
| Cell Strainer | CORNING | REF 431751 | Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | centrifuge for cell isolation |
| Clips | Teleflex Medical | REF 523700 | Titanium Clips for spleen |
| Microscope | Zeiss | Primovert | microscope for cell observation |
| Mtd2 mice | N/A | Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab | |
| Needle | BD | REF 305109 | BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm) |
| Suture | ETHICON | J303H | coated VICRYL suture |
| SV40 T Ag antibody | Abcam | ab16879 | anti-SV40 T-antigen antibody for IHC |
| Syringe | BD | REF 309626 | 1 mL TB syringe for cell injection |
| Trypan blue | SIGMA | T 8154 | Trypan blue solution for cell viability test |
| Wound clips | Reflex | reflex9, Part. No. 201-1000 | stainless steel wound clips for wound close |
References
- O'Connor, S., Ward, J. W. Hepatocellular carcinoma - United States. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59, 517-520 (2010).
- Petrick, J., Kelly, S., Altekruse, S., McGlynn, K., Rosenberg, P. Future of Hepatocellular Carcinoma Incidence in the United States Forecast Through 2030. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 34, 1787-1794 (2016).
- Greten, T., Lai, C., Li, G., Staveley-O'Carroll, K. Targeted and Immune-based Therapies for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology. 156, 510-524 (2019).
- Llovet, J., Zucman-Rossi, J., Pikarsky, E., Sangro, B., Schwartz, M., Sherman, M., Gores, G. Hepatocellular Carcinoma. Nature reviews. Disease primers. 2, 16018 (2016).
- Ding, X., et al. Precision medicine for hepatocellular carcinoma: driver mutations and targeted therapy. Oncotarget. 8, 55715-55730 (2017).
- Colombo, M., Maisonneuve, P. Controlling liver cancer mortality on a global scale: still a long way to go. Journal of Hepatology. 67, 216-217 (2017).
- Llovet, J., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362, 1907-1917 (2003).
- Parkin, D., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. International Journal of Cancer. 94, 153-156 (2001).
- Thomas, M., Zhu, A. Hepocellular carcinoma: the need for progress. Journal of Clinical Oncology. 23, 2892-2899 (2005).
- Llovet, J., Bruix, J. Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 48, 1312-1327 (2008).
- Bruix, J., Sherman, M. Management of hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology. 53, 1020-1022 (2011).
- Pang, T., Lam, V. Surgical management of hepatocellular carcinoma. World Journal of Hepatology. 7, 245-252 (2015).
- Llovet, J., et al. Design and endpoints of clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of the National Cancer Institution. 100, 698-711 (2008).
- Mueller, K. Cancer immunology and immunotherapy. Realizing the promise. Introduction. Science. 348, 54-55 (2015).
- Gajewski, T., Schreiber, H., Fu, Y. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14, 1014-1022 (2013).
- Ribas, A., Wolchok, J. Combining cancer immunotherapy and targeted therapy. Current Opinion in Immunology. 25, 291-296 (2013).
- Postow, M., Callahan, M., Wolchok, J. Immune checkpoint blockade in cancer therapy. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33, 1974-1982 (2015).
- Gao, J., et al. VISTA is an inhibitory immune checkpoint that is increased in ipilimumab therapy in patients with prostate cancer. Nature Medicine. 23, 551-555 (2017).
- Hahn, A., Gill, D., Pal, S., Agarwal, N. The future of immune checkpoint cancer therapy after PD-1 and CTLA-4. Immunotherapy. 9, 681-692 (2017).
- Remon, J., Besse, B. Immune checkpoint inhibitors in first-line therapy of advanced non-small cell lung cancer. Current Opinion in Oncology. 29, 97-104 (2017).
- Kudo, M. Immune checkpoint blockade in hepatocellular carcinoma: 2017 update. Liver Cancer. 6, 1-12 (2017).
- Kudo, M. Immune checkpoint inhibition in hepatocellular carcinoma: Basics and ongoing clinical trials. Oncology. 92, 50-62 (2017).
- Breous, E., Thimme, R. Potential of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 54, 830-834 (2011).
- Sprinzl, M., Galle, P. Facing the dawn of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 59, 9-10 (2013).
- Liu, D., Staveley-O'Carroll, K., Li, G. Immune-based therapy clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of Clinical Cell Immunology. 6, 376 (2015).
- Greten, T., Wang, X., Korangy, F. Current concepts of immune based treatments for patients with HCC: from basic science to novel treatment approaches. Gut. 64, 842-848 (2015).
- Koster, B., de Gruijl, T., van den Eertwegh, A. Recent developments and future challenges in immune checkpoint inhibitory cancer treatment. Current Opinion in Oncology. 27, 482-488 (2015).
- Johnson, D., Sullivan, R., Menzies, A. Immune checkpoint inhibitors in challenging populations. Cancer. 123, 1904-1911 (2017).
- Li, H., et al. Programmed cell death-1 (PD-1) checkpoint blockade in combination with an mTOR inhibitor restrains hepatocellular carcinoma growth induced by hepatoma cell-intrinsic PD-1. Hepatology. 66, 1920-1933 (2017).
- Heindryckx, F., Colle, I., van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Qi, X., et al. Development of inCVAX, in situ cancer vaccine, and its immune response in mice with hepatocellular cancer. Journal of Clinical and Cellular Immunology. 7, 438 (2016).
- Qi, X., et al. Development of a radiofrequency ablation platform in a clinically relevant murine model of hepatocellular cancer. Cancer Biology and Therapy. 16, 1812-1819 (2015).
- Liu, D., et al. Sunitinib represses regulatory T cells to overcome immunotolerance in a murine model of hepatocellular cancer. Oncoimmunology. 7, 1372079 (2017).
- Staveley-O'Carroll, K., et al. In vivo ligation of CD40 enhances priming against the endogenous tumor antigen and promotes CD8+ T cell effector function in SV40 T antigen transgenic mice. Journal of Immunology. 171, 697-707 (2003).
- Avella, D., et al. Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model. Hepatology. 55, 141-152 (2012).
- Li, G., et al. Successful chemoimmunotherapy against hepatocellular cancer in a novel murine model. Journal of Hepatology. 66, 75-85 (2017).
- Li, G., et al. Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice. Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).
- Held, W., et al. T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene. EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).
- Hanahan, D., Weinber, R. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
