Summary
Hier beschreiben wir die Entwicklung eines klinisch relevanten murinen Modells von Leberkrebs, das die typischen Immunmerkmale von hepatozellulärem Krebs (HCC) rekapituliert.
Abstract
Das Fehlen eines klinisch relevanten Tiermodells, das sich mit den typischen Immunmerkmalen von hepatozellulärem Krebs (HCC) befasst, hat die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und die Entwicklung innovativer immuntherapeutischer Strategien erheblich behindert. Um ein ideales Tiermodell zu entwickeln, das menschliche HCC rekapituliert, erhalten immunkompetente männliche C57BL/6J-Mäuse zunächst eine Tetrachlorsäure-Injektion (CCl4), um Leberfibrose zu induzieren, und erhalten dann histologisch-normale onkogene Hepatozyten von jungen SV40 T Antigen (TAg)-transgene Mäuse (MTD2) durch intrasplenische (ISPL) Inokulation. Androgen erzeugt in Empfänger männlichen Mäusen in der Pubertät initiiert TAg-Expression unter Kontrolle eines Leber-spezifischen Promotor. Dadurch werden die übertragenen Hepatozyten zu Krebszellen und bilden Tumormassen bei der Einstellung von Leberfibrose/Zirrhose. Dieses neuartige Modell imitiert die Initiierung und Progression des menschlichen HCC im Kontext von Leberfibrose/Zirrhose und spiegelt die typischsten Merkmale des menschlichen HCC einschließlich Immunfunktionsstörungen wider.
Introduction
Hepatozellulärer Krebs (HCC) ist die am schnellsten zunehmende Krebsart in den Vereinigten Staaten (US)1,2,3. Jedes Jahr werden ca. 850.000 neue Fälle diagnostiziert4,5 und 700.000 Patienten sterben an dieser tödlichen Krankheit6,7,8,9,10 und ist damit weltweit die zweithäufigste Todesursache im Zusammenhang mit Krebs. Die Verwaltung von HCC umfasst chirurgische Resektion, Transplantation, Ablation, Chemoembolisierung oder systemische Therapien, wie Sorafenib11. Früherkennung und Management mit chirurgischer Resektion oder Transplantation haben den höchsten Gesamtüberlebensvorteil4. Leider, die Mehrheit der Patienten in einem späteren Stadium anwesend und erfordern Management mit Ablation, Chemoembolisierung oder Sorafenib12. Sorafenib, ein Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor (RTKI), wurde von der Food and Drug Administration im Jahr 2008 als einzige systemische medikamentöse Therapie zur Behandlung von nicht resezierbaren HCC zugelassen. Obwohl das Medikament nur eine bescheidene Erhöhung des Gesamtüberlebens bietet, von 7,9 auf 10,7 Monate13, es bot eine neue therapeutische Strategie, die verwendet werden könnte, um HCC zu verwalten.
Die Manipulation des Immunsystems zur Beseitigung etablierter Krebsarten ist ein schnell wachsendes Feld in der Krebsforschung14. Immun-Checkpoint-Studien haben erheblich fortgeschrittene immuntherapeutische Arzneimittelentwicklung in der Krebsbehandlung15,16. Die FDA genehmigte die Verwendung von Antikörpern (Abs) gegen zytotoxisches T-Lymphozyten-Antigen 4 (CTLA-4), programmiertes Zelltodprotein 1 (PD-1) und seinen Liganden PD-L1 zur Behandlung von Melanom, Lungenkrebs, Kopf- und Nackenkrebs und Blasenkrebs17, 18 , 19 , 20. Klinische Studien zur Monotherapie oder Kombinationstherapie mit einem oder mehreren Antikörpern gegen PD-1, PD-L1 oder CTLA-4 zur Behandlung fortgeschrittener HCC sind im Gange21,22,23und einige Studien haben positive Ergebnisse gezeigt. Im Jahr 2017 erteilte die FDA eine beschleunigte Zulassung für Anti-PD-1-Antikörper zur Behandlung von HCC-Patienten, die gegen Sorafenib resistenzen, aber die Gesamtansprechrate dieser Therapie beträgt nur 14,3%. Andere Strategien wurden zu diesem Zeitpunkt nicht in die klinische Praxis übersetzt24,25. Überwindung der tumorinduzierten tiefen Immuntoleranz zur Verbesserung der Immun-Checkpoint-Therapie26; Vorhersage der Wirksamkeit der Immun-Checkpoint-Therapie; Immunbedingte Nebenwirkungen zu verhindern; Optimierung der Verabreichung S-Route, Dosierung, und Häufigkeit; und die Suche nach effektiven Kombinationen der Therapien27,28,29 bleiben alle extrem herausfordernde Aufgaben.
Es gibt mehrere konventionelle Ansätze, die verwendet werden, um HCC in Mausmodellen zu induzieren und werden in Abhängigkeit von der speziellen Forschungsfrage des Forschersverwendet 30. Chemisch induzierte HCC-Mausmodelle mit genotoxischen Verbindungen imitieren verletzungsinduzierte Malignität. Xenograft-Modelle durch ektopische oder orthotopische Implantation von HCC-Zelllinien eignen sich für das Arzneimittelscreening. Eine Reihe von genetisch veränderten Mäusen wurden entwickelt, um die Pathophysiologie von HCC zu untersuchen. Transgene Mäuse, die virale Gene, Onkogene und/oder Wachstumsfaktoren exdrücken, ermöglichen die Identifizierung von Wegen, die an der Hepatocarcinogenese beteiligt sind. Aufgrund inhärenter Einschränkungen fassen diese Modelle nicht die typischen Immuneigenschaften des menschlichen HCC zusammen, was die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und die Entwicklung innovativer immuntherapeutischer Strategien erheblich behindert hat14 ,15. Kürzlich haben wir ein klinisch relevantes murines Modell entwickelt. Dieses neuartige Modell imitiert nicht nur die Menschliche HCC-Initiierung und Progression, sondern spiegelt auch die meisten typischen Merkmale menschlicher Krankheiten wider, einschließlich Immunfunktionsstörungen. Wir haben seine biologischen und immunologischen Eigenschaften charakterisiert. Unter Der Nutzung dieses neuartigen Modells haben wir verschiedene immuntherapeutische Strategien zur Behandlung von HCC31,32,33,34,35,36, 37. Diese einzigartige Plattform ermöglicht es uns, Mechanismen der tumorinduzierten Immunverträglichkeit zu untersuchen und proof-of-Concept-Therapiestrategien für HCC für eine eventuelle klinische Translation zu entwickeln.
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Protocol
HINWEIS: Das gesamte Verfahren einschließlich tierischer Probanden wurde vom IACUC an der University of Missouri genehmigt. Alle Mäuse wurden nach den Kriterien des "Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren" human gepflegt. Das folgende Verfahren zur Zellisolierung und -impfung sollte in einer Kapuze durchgeführt werden. Alle Darsteller sollten die standardmäßige persönliche Schutzausrüstung für den Umgang mit Mäusen und Gewebe tragen.
1. Induktion von Leberfibrose und Zirrhose mit IP-Injektion von Kohlenstofftetrachlorid (CCl4)
HINWEIS: Siehe Abbildung 1. (CCl4 ist ein hochgefährliches Reagenz, es sollte sorgfältig und mit chemikalienbeständigen Handschuhen behandelt werden)
- Erhalten Sie männliche C57BL/6J-Mäuse, die sechs bis acht Wochen alt sind (siehe Tabelle der Materialien).
- 10% CCl4 (v/v) Lösung in Maisöl in einem Zentrifugenrohr vorbereiten. Bestimmen Sie das Gesamtvolumen basierend auf der Anzahl der zu injizierenden Mäuse (siehe Schritt 1.6).
- Verwenden Sie die geeignete Mäusehandhabungstechnik, um eine Maus für die Injektion auszuwählen.
- Halten Sie die Maus mit ihrer rückenden Seite (Bauch) manuell zurück.
- Reinigen Sie die Injektionsstelle an der Bauchwand der Maus, indem Sie mit 70% Alkohol schrubben.
- Injizieren Sie männliche C57BL/6J-Mäuse mit 160 l 10% CCl4-Lösung durch intraperitoneale (IP) Injektion mit einer 25-Spur-Einwegnadel.
- Stellen Sie sicher, dass die Nadel nur durch die Bauchwand (ca. 4-5 mm) mit Abschrägung nach oben und leicht abgewinkelt bei 15-20 Grad eindringt.
- Injizieren Sie Mäuse zweimal pro Woche für insgesamt vier Wochen - jede Maus erhält insgesamt acht Injektionen.
HINWEIS: Zwei Wochen nach der letzten Injektion sind behandelte Mäuse bereit für die ISPL-Impfung onkogener Hepatozyten von MTD2-Mäusen.
2. Isolierung von Tag-transgenen Hepatozyten von MtD2-Mäusen der Linie
HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Lösungsrezepte.
| 10x Ausgewogene Salzlösung von Earle ohne Ca oder Mg (EBSS ohne Ca oder Mg) | 4 g KCl 68 g NaCl 1.4 g NaH2PO4 H2o 10 g Dextrose Wasser zu 1 Liter hinzufügen, pH bis 4.32 Durchpassern des Filters |
| Lösung 1 | 20 ml 10x EBSS ohne Ca oder Mg 44 g NaHCO3 1,33 ml 1,5 Mio. Hepes 10 ml von 10 ml EGTA Wasser zu 200 ml hinzufügen |
| Lösung 2 | 100 ml 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M Hepes Wasser zu 1 Liter hinzufügen |
| 0,75% Kollagennaselösung | 15 mg Kollagenase Typ 1 20 ml Lösung 2 |
| Komplettes Medium | 2 RPMI 50 ml FBS 5 mL 100x Penicillin-Streptomycin |
Tabelle 1: Lösungsrezepte.
- Besorgen Sie sich die Linie MTD2-Mäuse38, um als Quelle onkogener Hepatozyten zu dienen.
- Anästhetisieren Sie 5 Wochen alte MTD2-Mäuse mit 2,5% Isofluran.
HINWEIS: Die richtige Anästhesisierung wird durch die Toe Pinch-Methode überprüft. Kurz gesagt, mit zwei Fingern, geben Sie der Maus Zehen / Fuß eine gute Quetschung. Wenn es keine Entzugsreaktion gibt, wird das Tier tief genug beurteilt, um mit der Operation zu beginnen. - Wenn sie angemessen sediert sind, platzieren Sie Mäuse in eine Supine-Position und fixieren Sie die Extremitäten mit Klebeband, um eine ausreichende Exposition der Bauchoberfläche zu gewährleisten.
- Führen Sie einen Mittellinien-Laparotomie-Einschnitt mit einer Schere entlang der Länge der Linea alba groß genug, um eine ausreichende Exposition der Leber zu bieten.
- Verdrängen Sie den Darm nach links, um eine bessere Exposition der Leber und Portal Triade zu bieten.
- Sezieren Sie über der Leber, um die minderwertige Vena cava (IVC) zu belichten.
- Ligate die IVC über der Leber mit einer Arterienklemme.
- Zurück zur unteren Grenze der Leber, verwenden Sie eine Schmetterlingsnadel (siehe Materialien), um IV Zugang zur Portalvene zu erhalten. Fix Katheter von Hand.
- Sukzessive durchdringen Sie die Mausleber mit einer Injektionsspritze bei 8,9 ml/min mit 15 ml Lösung 1, 15 ml 0,75% Kollagennaselösung 2 und 15 ml Lösung 2 über den Katheter.
- Ernten Sie die durchnässte Leber, indem Sie die Tumormasse von MTD2-Mäusen in einem 50 ml konischen Rohr mit 10-15 ml PBS schneiden und einnehmen.
- ENTFERNEN Sie PBS und waschen Sie eine zusätzliche Zeit mit PBS; zentrifugieren Sie bei diesem Schritt nicht.
- Schneiden Sie die Leber in kleinere Stücke mit der Schere und dann wieder mit PBS 2x waschen, um restliches Blut zu entfernen.
- Fügen Sie 5 ml komplettes RPMI-Medium in das konische Rohr und kontinuierlich Hacken der Leber mit schere zu kleinen Stücken (<3 mm)-Gewebe sollte glatt durch eine 5 ml Pipette gehen.
- Fügen Sie ein vollständiges RPMI zu einem Endvolumen von 30 ml hinzu und suspendieren Sie die Leber mit einer 5 ml Pipette.
- Filtern Sie die Mischlösung mit einem 70-mm-Sieb in ein 50 ml konisches Rohr.
- Waschen Sie das Sieb mehrmals mit komplettem RPMI und stellen Sie das Endvolumen auf 50 ml ein, indem Sie zusätzliches RPMI-Medium hinzufügen.
- Drehen Sie die Suspension schnell durch Zentrifuge auf maximal 500 U/min; sobald die Geschwindigkeit auf 50 x gbeschleunigt wird, sollte die Zentrifuge gestoppt werden.
- Dekantieren Sie den Überstand und hängen Pellets in 20 ml PBS.
- Zählen Sie Zellen mit Trypan-Blauausschluss und einem Hämozytometer, und passen Sie dann die Zellkonzentration für die folgende Zellimpfung auf 2,5 x 106/ml an.
HINWEIS: Die erwartete Ausbeute von 5 Gramm Tumorgewebe beträgt 80 Millionen Hepatozyten mit Lebensfähigkeit >95%.
3. Impfung der Hepatozyten von MTD2-Mäusen in die Leber von wildlebenden Typ C57BL/6J-Mäusen durch ISPL-Injektion
- Die aseptische Technik sollte in allen Verfahren
- Anästhetisieren Siedie CCl 4-behandelten männlichen C57BL/6J-Mäuse mit 2,5% Isofluran, die Mäuse sollten mit Augenschmiere behandelt werden, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.
- Bereiten Sie Spritzen mit 200 L Hepatozyten zur Injektion vor.
- Wenn ausreichend sediert, positionieren Sie Mäuse mit der linken Seite nach oben.
- Rasieren Sie die gesamte linke Flanke der Mäuse, dann schrubben Sie die Fläche, abwechselnd zwischen 70% Alkohol und Betadin dreimal.
- 5 mg/kg Carprofen subkutaneouly vor dem chirurgischen Schnitt verabreichen.
- Machen Sie einen 1 cm Schnitt auf der linken Flanke parallel zur13. Rippe vom dorsalen Extrembeginnen direkt unterhalb des Wirbelsäulenmuskels.
- Identifizieren Sie die Milz, und exemiten Sie sie dann mit stumpfspitzen Zangen.
- Beschneiden Sie die Milz mit zwei mittelgroßen Titanclips. Platzieren Sie beide Clips zwischen der Milzarterie und der Vene, lassen Sie Raum zwischen den Clips, um sie später nach der Impfung zu schneiden.
HINWEIS: Das Ziel ist es, den unteren Pol der Milz zu isolieren, um das Risiko der Aussaat zu reduzieren. - Mit einer 27 G-Nadel in die untere Milz der Milz injizieren.
- Schneiden Sie den unteren Zweig des Pedikles (untere Splenic-Polgefäße) mit einem mittelgroßen Clip ab.
- Schneiden Sie die Milz zwischen den beiden zunächst platzierten Clips.
- Entfernen Sie den unteren Pol der Milz, die direkt mit Tumorzellen injiziert wurde.
- Verwenden Sie 3-0 Polyglactin 910 unterbrochenes Nähen, um die innere Muskelschicht zu schließen.
- Verwenden Sie sterilisierte Stahl-Wundclips, um die äußere Hautschicht zu schließen.
HINWEIS: Stahlclips werden bevorzugt über Nähten, um zu vermeiden, dass Tiere Nähte auskauen und eine klaffende Wunde hinterlassen. - 5 mg/kg Carprofen subkutan nach der Naht verabreichen.
- Legen Sie alle erholenden Tiere auf ein temperaturgeregeltes Heizkissen und überwachen Sie genau, bis sie vollständig von der Anästhesie genesen sind.
- Geben Sie Mäusen nach der Operation freien Zugang zu Wasser. Wenn die Maus während der Operation dehydriert wird, verabreichen Sie subkutane Flüssigkeiten (<1 ml).
- Entfernen Sie Hautclips nach 7-10 Tagen nach der Operation.
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Representative Results
Onkogene Hepatozyten, die von TAg-transgenen Mäusen isoliert wurden (Abbildung 2), wurden in der Leber von Wildtypmäusen durch intra-splenische Injektion ausgesät (Abbildung 3). Die transplantierten Hepatozyten wuchsen erfolgreich und zuverlässig orthotopische HCC-Tumoren (Abbildung 4) mit tumorspezifischem Antigen SV40 TAg (Abbildung 5) bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose ( Abbildung1).
Abbildung 1: Schema für die Vorbereitung des Mausmodells von HCC. Das experimentelle Design zur Etablierung eines innovativen murinen Modells von HCC. C57BL/6J-Mäuse werden zunächst zweimal wöchentlich für vier Wochen mit IP-Injektion von CCl4 behandelt, um Leberfibrose zu induzieren. Zwei Wochen nach der letzten IP-Injektion erhalten die mit CCl4behandelten Mäuse Hepatozyten, die von jungen männlichen MTD2-Mäusen über die ISPL-Impfung isoliert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Isolierung und Reinigung von Hepatozyten aus MTD2-Mäusen der Linie. (A) Hepatozyten, die von MTD2-Mäusen isoliert wurden, wurden protokollarisch hergestellt und mit Trypanblau gefärbt, um die Lebensfähigkeit und Reinheit der Zellisolierung zu erkennen. Die linke Seite zeigt sowohl Hepatozyten (schwarzer Pfeil) als auch tumorinfiltrierende Lymphozyten (rote Pfeile), die während der Zellextraktion isoliert werden. Das rechte Panel zeigt die Zellpopulation, die nach der Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit verbleibt, einschließlich Hepatozyten (schwarzer Pfeil) und deutlich weniger tumorinfiltrierenden Lymphozyten. Vergrößerung = 10x Objektiv, Schuppenstange = 100 m. (B) Hepatozyten, die von MTD2-Mäusen isoliert wurden, werden vor der Impfung von wilden Mäusen des Typs C57BL/6J mit Trypanblaulösung gebeizt. Die Zellisolation wird als erfolgreich ermittelt, wenn die Lebensfähigkeit >95% beträgt. Tote Zellen werden mit dem Trypanblau (rote Pfeile) befleckt, während lebensfähige Zellen nicht befleckt werden (schwarzer Pfeil). Vergrößerung = 10x Objektiv, Skalenbalken = 100 m. Die Grafik auf der rechten Seite zeigt die Ergebnisse der Zellisolation, wobei >95% der Hepatozyten lebensfähig sind, statistische Daten stammen aus 5 verschiedenen beobachteten Felduntermikroskop; Fehlerbalken stehen für +SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Intrasplenische Impfung von Hepatozyten in die Leber von wildlebenden Mäusen des Typs C57BL/6J. Das experimentelle Design für die ISPL-Inokulation von Hepatozyten, um HCC bei C57BL/6J-Mäusen zu induzieren. (1) Die Milz wird identifiziert und nach außen exteriorisiert. (2) Die Milz ist mit zwei mittelgroßen Titanclips beschnitten. (3) Zubereitete Hepatozyten werden in den unteren Pol der Milz injiziert. (4) Der untere Zweig des Pedikeln (untere Plenipolgefäße) wird mit einem mittelgroßen Clip abgeschnitten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Progressive Tumorentwicklung bei C57BL/6J-Mäusen nach Impfung mit MTD2-Hepatozyten. (A) Das orthozelluläre Karzinom (HCC) orthotopisches Tumormodell wurde protokollarisch erstellt. Anatomische Bilder wurden vor der Impfung und in subsesequenzigen Zeitkursen aufgenommen. a) Zeigt eine gesunde Leber vor der Impfung mit MTD2-Hepatozyten. b) Mausleber 3 Monate nach der Inokulation mit Nachweisen der groben Tumorentwicklung. c) 3,5 Monate nach der Impfung mit zunehmender Tumorbelastung. d) 4,5 Monate nach der Impfung. e) 6 Monate nach der Impfung mit Anzeichen eines Tumors in der Leber. (B) Tumorknollen wurden geerntet und zu den nach der Impfung mit MTD2-Hepatozyten angegebenen Zeitpunkten gewogen. Fehlerbalken stehen für +SD. ***P < 0.001, statistische Auswertung wurde durch t-tests durchgeführt. (C) Repräsentative Bilder von Wildtyp- und MTD2-inokulierten Leberabschnitten. Die Färbe von Hämatoxylin und Eosin (H&E) stellt die Pseudoglandbildung (schwarze Pfeile) dar. Es gibt nukleare Smenge, und Tumorzellen sind eosinophile mit hohen Kern-Zu-Zytoplasma-Verhältnisse (vergrößertes Bild). Vergrößerung = 20x Objektiv, Skalenbalken = 50 m. Die Eindräuer oben rechts werden weiter manuell verstärkt. (D) Sirius rote Färbung, die auf eine abnormale Kollagenablagerung hinweist, die mit Leberfibrose übereinstimmt. Vergrößerung: 40x Objektiv, Skalenbalken = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Spezifischer Nachweis des SV40-T-Antigen-Gens im Tumor. (A) Tumorgewebe und zusätzliche Gewebeproben im gesamten Mäusealter wurden von tumoretablierten Mäusen entnommen. Genomische DNA wurde aus Gewebe isoliert und Primer für SV40 T Ag und P53 (Kontrolle) wurden für konventionelle PCR synthetisiert. DAS SV40-T-Antigengen wurde im Tumorgewebe nachgewiesen, ist aber weder im normalen Gewebe noch in anderen Geweben der Mäuse vorhanden. (B) Tumorgewebe wurde von tumortragenden Mäusen gesammelt und mit Anti-SV40 T-Antigen-Antikörper niert. Linkes Panel ist eine negative Kontrolle aus gesundem Lebergewebe, das von naiven Mäusen gesammelt wird. Rechte Spanel zeigt signifikante SV40 T Antigen Färbung von Tumorgewebe von tumortragenden Mäusen gesammelt (braune Farbe). Vergrößerung = 40x Objektiv, Skalenbalken = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Mit diesem Protokoll haben wir ein zuverlässiges und reproduzierbares murines Modell von HCC etabliert, das die menschliche HCC-Initiierung und Progression imitiert. Klinisch, viele Risikofaktoren sukzessive induzieren Leberschäden, Leberfibrose, Zirrhose und die endk.-Phase von HCC. In unserem Protokoll wird die IP-Injektion von CCl4 verwendet, um zuerst Leberfibrose bei Wildtypmäusen zu produzieren, was es den nachfolgenden onkogenen Hepatozyten ermöglicht, die Tumoren bei der Einstellung von Leberfibrose zu bilden. Wir fanden heraus, dass die Tumorbildung am erfolgreichsten bei Mäusen stattfand, die zwei Wochen nach der CCl4-Behandlung die Hepatozytenimpfung erhielten, verglichen mit Mäusen, die Zuführungen zu anderen Zeitpunkten erhielten. Darüber hinaus fanden wir Leberfibrose kann bis zu vier Monate nach CCl4 Injektion nachgewiesen werden. Dieser Ansatz führt dazu, dass mehr als 90% der Mäuse HCC-Tumoren entwickeln, verglichen mit den Mäusen ohne Exposition gegenüber CCl4. In unserem Modell, Hepatozyten übertragen von Linie MTD2 Mäuse in C57BL/6J Mäuse, Verkehr in die Leber, wo sie als Hepatozyten, die TAg als Gewebeantigen ausdrücken integriert werden. Die Isolierung von Hepatozyten von MTD2 ist ein wichtiger Schritt während dieses Protokolls. MTD2 Mausleber werden gründlich mit der Lösung 1 und 2 durchdrungen, um zirkulierende rote Blutkörperchen in der Leber vollständig zu entfernen. Die Kollagenase-Lösung wird verwendet, um die Leber in der angegebenen Konzentration und Geschwindigkeit zu durchdringen, um eine richtige Leberverdauung zu erzeugen, um Hepatozyten freizusetzen. Die Verwendung niedrigerer Konzentrationen von Kollagenase ist nicht ausreichend für die Verdauung, was zu Klumpen von Hepatozyten führt. Im Gegensatz dazu sind hohe Konzentrationen zu hart auf das Gewebe, was zu einer signifikanten Verringerung der lebensfähigen Hepatozyten. Wir stellen auch fest, dass eine kurze Zentrifugation, wie in unserem Protokoll beschrieben, erforderlich ist, um die Reinheit von Hepatozyten zu verbessern. Die niedrigere Drehung, die wir für die Zentrifugierung verwendet haben, kann Hepatozyten ausfällen und Leukozyten im Überstand hinterlassen, basierend auf dem Dichteunterschied dieser beiden Zelltypen.
Der nächste kritische Schritt ist der Weg zur Impfung von Hepatozyten in Wilde-Typ-Mäuse. In unseren Pilotstudien untersuchten wir verschiedene Möglichkeiten, Hepatozyteninokulation durchzuführen. Das erfolgreiche orthotopische Tumorwachstum in der Leber wird am besten bei Mäusen beobachtet, die intrasplenische Inokulation onkogener Hepatozyten in einer Dosis von einer halben Million Zellen pro Maus erhalten, im Vergleich zu den Mäusen, die Zellen erhalten, die über Schwanzvene und intraperitoneale Injektion in verschiedenen Dosen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das orthotopische HCC-Wachstum routen- und dosisabhängig ist. Die bösartige Transformation erfolgt allmählich und beschränkt sich auf die Subpopulation transplantierter Hepatozyten und nicht auf das gesamte Leberparenchym. Fortgesetzte Zellproliferation führt zu Tumorknötchen, die sich in der Leber entwickeln.
Damit HCC oder andere Krebsarten vorankommen, muss es dem Immunsystem ausweichen; in der Tat, die Vermeidung von Immunzerstörung gilt jetzt als ein Kennzeichen von Krebs39. Jedoch, der Mangel an tumorspezifischen Antigen ist eine kritische Barriere zur Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen. In unserem Modell wird TAg in den Tumoren ausgedrückt, nicht in anderen Organen, die als tumorspezifisches Antigen wirken. Außerdem verfügt TAg über zahlreiche gut definierte Epitope, die von CD8-T-Zellen bei C57BL/6J-Mäusen erkannt werden können. In Bezug auf TAg Epitop-I haben wir Linie 416 Mäuse erzeugt, die transgenEn exprimierenT Zellrezeptoren für dieses Epitop34ausdrücken. Targeting TAg zur Untersuchung der tumorantigenspezifischen Immunantwort ermöglicht es uns, die Tumorimmunüberwachung während der Tumorinitiierung und -progression zu untersuchen, was mit Modellen, die durch DEN oder genetische Manipulation induziert werden, nicht möglich ist. Die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen ermöglicht es uns, kritische Zellen und Moleküle zu identifizieren, die eine tumorinduzierte Immuntoleranz vermitteln. Die Ausrichtung auf diese Schlüsselfaktoren kann unsere Entwicklung innovativer immuntherapeutischer Strategien gegen HCC erheblich voranbringen. Mit diesem einzigartigen HCC-Modell und etablierten Werkzeugen haben wir die Mechanismen untersucht, die der tumorinduzierten Toleranz25,35 zugrunde liegen, und verschiedene immunbasierte Antitumor-Immuntherapien untersucht31,32 , 36 , 37.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser etabliertes murines Modell von HCC einige typische Merkmale menschlicher Krankheiten widerspiegelt. In unserem zuvor veröffentlichten Artikel konnten wir dies als klinisch relevantes Tumormodell mit typischen Merkmalen des menschlichen HCC etablieren. Wir zeigten, dass die mit CCl4 und MTD2 behandelten Mäuse Tumore entwickelten, die HCC-assoziierte Antigene, AFP und GPC336exprimierten. Die Pathologie stellte fest, dass die Läsionen in unserem murinen Modell sowohl makroskopisch als auch pathologisch dem menschlichen HCC ähneln. Mit diesem zuverlässigen Modell und den entwickelten Werkzeugen können wir diese komplexe menschliche Krankheit einschließlich Einblick in Mechanismen der HCC-Entwicklung und klinisch verfügbare Behandlung untersuchen.
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Disclosures
Es gibt keine zu deklarieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird unterstützt von NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) und NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O'Carroll).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | VETEQUIP | IMPAC6 | anesthesia machine for surgery |
| Butterfly needle | BD | 8122963 | Needle used for liver perfusion |
| C57BL/6 mice | Jackson Lab | 000664 | mice used in prototol |
| Carprofen | CRESCENT CHEMICAL | 20402 | carprofen for pain release |
| Cell Strainer | CORNING | REF 431751 | Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | centrifuge for cell isolation |
| Clips | Teleflex Medical | REF 523700 | Titanium Clips for spleen |
| Microscope | Zeiss | Primovert | microscope for cell observation |
| Mtd2 mice | N/A | Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab | |
| Needle | BD | REF 305109 | BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm) |
| Suture | ETHICON | J303H | coated VICRYL suture |
| SV40 T Ag antibody | Abcam | ab16879 | anti-SV40 T-antigen antibody for IHC |
| Syringe | BD | REF 309626 | 1 mL TB syringe for cell injection |
| Trypan blue | SIGMA | T 8154 | Trypan blue solution for cell viability test |
| Wound clips | Reflex | reflex9, Part. No. 201-1000 | stainless steel wound clips for wound close |
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