Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

מודל העכבר המושרה של הפאציט הנגרמת על ידי מדגם של סרטן הפטאותאי העולה בקביעת דלקת הכבד פיברוזיס

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59368
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Surgery, University of Missouri-Columbia, 2Ellis Fischel Cancer Center, University of Missouri-Columbia, 3Molecular Microbiology and Immunology, University of Missouri-Columbia
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מתארים את ההתפתחות של מודל מורטין רלוונטי קלינית של סרטן הכבד לכידה של תכונות החיסונית אופייני של סרטן hepatocellular (HCC).

Abstract

העדר של מודל קליני רלוונטי בעלי חיים התייחסות המאפיינים החיסוניים טיפוסי של סרטן hepatocellular (HCC) יש באופן משמעותי את ההסבר של המנגנונים הבסיסיים ופיתוח של אסטרטגיות חיסוני חדשני. כדי לפתח את המודל החי האידיאלי לחבר את HCC האדם, C57BL זכר המוסמכת/6J העכברים הראשון לקבל פחמן ארבלוריד (CCl4) הזרקה כדי לגרום פיברוזיס בכבד, ולאחר מכן לקבל היסטולוגית נורמלי הפגניים הפטציטים מגבר צעיר SV40 T אנטיגן (תג)-עכברים טרנסגניים (MTD2) על ידי הטחול (ISPL) החיסון. האנדרוגן שנוצר עכברים זכר הנמען בגיל ההתבגרות יוזם ביטוי תג תחת שליטה של מקדם ספציפי לכבד. כתוצאה מכך, hepatocytes הועברו להפוך לתאים סרטניים הגושים הגידול טופס בהגדרה של פיברוזיס בכבד/שחמת. מודל זה הרומן מחקה האדם החניכה HCC והתקדמות בהקשר של פיברוזיס הכבד/שחמת ומשקף את התכונות האופייניות ביותר של HCC האדם כולל תפקוד המערכת החיסונית.

Introduction

סרטן hepatocellular (HCC) הוא הסוג הגדל ביותר במהירות של סרטן בארצות הברית (ארה ב)1,2,3. בכל שנה, כ 850,000 מקרים חדשים מאובחנים4,5 ו 700,000 חולים מתים ממחלה קטלנית זו6,7,8,9,10 , מה שהופך אותו לגורם השני בגובהו של מוות הקשור לסרטן ברחבי העולם. הניהול של HCC כולל כריתת כירורגית, השתלת, אבלציה, chemoembolization, או טיפולים מערכתית, כגון sorafenib11. אבחון וניהול מוקדם עם כריתה כירורגית או השתלת יש יתרון ההישרדות הכולל הגבוה ביותר4. למרבה הצער, רוב המטופלים נוכחים בשלב מאוחר יותר ודורשים ניהול עם אבלציה, chemoembolization או sorafenib12. Sorafenib, קולטן טירופין קינאז מעכב (RTKI), אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות בשנת 2008 כמו טיפול תרופתי מערכתית היחיד זמין לטיפול HCC מחדש. למרות התרופה רק מספק גידול צנוע בהישרדות הכללית, מ 7.9 עד 10.7 חודשים13, זה סיפק אסטרטגיה טיפולית חדשה שיכול להיות מנוצל כדי לנהל HCC.

שינוי מערכת החיסון כדי לחסל סרטן הוקמה היא שדה גדל במהירות במחקר סרטן14. מחקרים חיסוניים במחסום יש מתקדם במידה ניכרת פיתוח תרופות חיסוני טיפול בסרטן15,16. ה-FDA אישר את השימוש בנוגדנים (Abs) נגד אנטיגן T-לימפוציט לימפוציטים 4 (CTLA-4), מתוכנת חלבון מוות של תאים 1 (PD-1), ואת הליגוה PD-L1 לטיפול של מלנומה, סרטן ריאות, הראש והצוואר סרטן, וסרטן שלפוחית השתן17, מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , 20. ניסויים קליניים של מונותרפיה או טיפול משולב באמצעות נוגדנים אחד או מספר נגד PD-1, pd-L1, או ctla-4 לטיפול HCC מתקדם מתמשך21,22,23, וכמה ניסויים הראו תוצאות חיוביות. ב 2017, ה-FDA העניק אישור מואץ עבור נוגדן anti-PD-1 לטיפול בחולים HCC, מי הם התנגדות sorafenib, אבל את קצב התגובה הכולל של טיפול זה הוא רק 14.3%. אסטרטגיות אחרות לא תורגמו לפרקטיקה קלינית בשלב זה24,25. להתגבר על עמידות החיסונית עמוקה מעמיק כדי לשפר את הטיפול במחסום החיסונית26; ניבוי היעילות של טיפול במחסום החיסון; מניעת תופעות לוואי הקשורות למערכת החיסונית; אופטימיזציה של תוואי האדמיניסטרציה, המינון והתדר; ומציאת שילובים יעילים של טיפולים27,28,29 כולם להישאר מאתגרת מאוד משימות.

ישנן מספר גישות קונבנציונליות המשמשות כדי לגרום HCC במודלים העכבר כיום והם מנוצלים בהתאם לשאלה הספציפית של החוקר מחקר30. כימית המושרה מודלים העכבר עם תרכובות גנוטוקסיל לחקות פציעה הנגרמת ממאירות. Xenograft מודלים דרך או השתלת חוץ רחמי או אורתוטופית של קווי תא HCC מתאימים הקרנת סמים. מספר עכברים ששונו גנטית ההונדסים לחקור את הפתופסולוגיה של HCC. עכברים טרנסגניים ביטוי גנים ויראליים, אונגנים ו/או גורמי גדילה מאפשרים זיהוי של מסלולים המעורבים hepatocarcinogenesis. בשל המגבלות הטמונות, מודלים אלה אינם מחדשים את מאפייני החיסון האופייני שנראו ב-HCC האנושי, אשר הייתה מוגבלת באופן משמעותי בהסבר למנגנון הבסיסי ולהתפתחות של אסטרטגיות חיסוני חדשניות14 ,15. לאחרונה יצרנו מודל מורטין רלוונטי קליני. זה מודל הרומן לא רק מחקה האדם התחלה HCC והתקדמות אלא גם משקף את התכונות הטיפוסיות ביותר של המחלה האנושית כולל תפקוד המערכת החיסונית. אנחנו האפיינו את המאפיינים. הביולוגיים והאימונולוגיים שלו מינוף זה מודל הרומן, יש לנו בחנו אסטרטגיות חיסוני שונות לטיפול HCC31,32,33,34,35,36, 37. הפלטפורמה הייחודית הזאת מאפשרת לנו ללמוד מנגנונים של עמידות חיסוני הנגרמת על ידי הגידול ולפתח אסטרטגיות טיפול הוכחה של HCC כלפי בסופו של דבר תרגום קליני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל ההליכים כולל נושאי בעלי חיים אושרו על ידי IACUC באוניברסיטת מיזורי. כל העכברים קיבלו טיפול הומאני על פי הקריטריונים המתוארים ב"מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה". יש לבצע את ההליך הבא עבור בידוד תאים וחיסונים במכסה ברדס. כל המבצעים צריכים ללבוש את ציוד ההגנה האישי הסטנדרטי לטיפול בעכברים וברקמות.

1. אינדוקציה של פיברוזיס של הכבד שחמת עם הזרקת IP של פחמן טטרלוריד (CCl4)

הערה: ראה איור 1. (CCl4 הוא מגיב מאוד מסוכן, זה צריך להיות מטופל בזהירות עם לובש כפפות עמידות כימית)

  1. השג עכברים זכרים C57BL/6J שאינם בני 6 עד 8 שבועות (ראו טבלת חומרים).
  2. הכינו 10% CCl4 (v/v) פתרון שמן תירס בשפופרת צנטריפוגה. קבע את אמצעי האחסון הכולל בהתבסס על מספר העכברים שיש להזריק (ראה שלב 1.6).
  3. השימוש עכברים מתאים טיפול בטכניקה כדי לבחור עכבר אחד להזרקה.
  4. לרסן באופן ידני את העכבר עם החלק הימני שלו (בטן) למעלה.
  5. נקה את אתר ההזרקה על קיר הבטן של העכבר על ידי קרצוף עם 70% אלכוהול.
  6. להזריק C57BL זכר/6J עכברים עם 160 μL של 10% CCl4 פתרון על ידי הזרקת הצפק (IP) באמצעות מחט חד פעמי 25-מד.
  7. ודא כי המחט חודרת רק דרך הקיר הבטן (כ 4-5 מ"מ) עם משופע בצד עד בזווית מעט ב 15-20 מעלות.
  8. להזריק עכברים פעמיים בשבוע עבור סך של ארבעה שבועות-כל עכבר יקבל סך של שמונה זריקות.
    הערה: שבועיים לאחר ההזרקה האחרונה, העכברים שטופלו מוכנים לחיסון ISPL של הפטציטים אונגניים מעכברים MTD2.

2. בידוד תג-העברה של הפטציטים מקו MTD2

הערה: ראו טבלה 1 עבור מתכוני פתרונות.

תמיסת מלח מאוזנת של 10x ארל ללא Ca או Mg (EBSS ללא Ca או Mg) 4 ג ' KCl
68 g
1.4 g NaH2PO4 · H2O
10 גר' דקסטרוז
להוסיף מים 1 ליטר, pH כדי 4.32
מעבר במסנן
הפתרון הראשון 20 מ"ל 10x EBSS ללא Ca או Mg
44 משחק3
1.33 מ ל 1.5 מ' הפסי
10 מ ל של 10 מ"ל
הוספת מים ל 200 mL
הפתרון השני 100 מ"ל
2.2 משחק3
6.67 מ"ל 1.5 M הפסי
הוספת מים ל 1 ליטר
0.75% הפתרון לקולגן 15 מ"ג קולגן סוג 1
20 מ ל של פתרון 2
בינוני מלא 2 RPMI
50 מ ל FBS
מסטרפטומיצין לפניצילין 5 מ"ל

טבלה 1: מתכוני פתרונות.

  1. השג שורה MTD2 עכברים38 לשמש כמקור של החרופציטים אונגניים.
  2. שMTD2 בגיל 5 שבועות עכברים באמצעות 2.5% isofלאנה.
    הערה: ההרדמה המתאימה תיבדק על ידי שיטת הצביטה בבוהן. בקיצור, באמצעות שתי אצבעות, לתת את הבוהן העכבר/הרגל לחיצה טובה. אם אין תגובת נסיגה, החיה שנשפט מספיק עמוק כדי להתחיל בניתוח.
  3. כאשר מסומם בצורה מספקת, המקום עכברים במצב פרקדן ולתקן את הגפיים עם הקלטת כדי לספק חשיפה נאותה של משטח הבטן.
  4. לבצע חתך באמצע הדרך באמצעות מספריים לאורך האורך של לינאה אלבה גדול מספיק כדי לספק חשיפה נאותה של הכבד.
  5. להעביר את המעיים שמאלה כדי לספק חשיפה טובה יותר של הכבד טריאדת הפורטל.
  6. נתח מעל הכבד כדי לחשוף את האובורד הנחותים (IVC).
  7. לישער את האגודה מעל הכבד באמצעות מהדק עורק.
  8. חזרה אל הגבול הנחות של הכבד, להשתמש מחט פרפר (לראות חומרים) כדי לקבל את הגישה IV לווריד הפורטל. תקן קטטר ביד.
  9. מבשם ברציפות את הכבד של העכבר באמצעות מזרק הזרקת ב 8.9 mL/min עם 15 מ ל של פתרון 1, 15 מ ל של 0.75% קולגן פתרון 2, ו 15 מ ל של פתרון 2 באמצעות הקטטר.
  10. לקצור את הכבד המקורות על ידי גזירה ונטילת מסת הגידול מ MTD2 עכברים בשפופרת חרוט 50 mL עם 10-15 mL של PBS.
  11. הסר את PBS ושטוף זמן נוסף עם PBS; לא לצנטריפוגה בשלב זה.
  12. חותכים את הכבד לחתיכות קטנות יותר באמצעות מספריים ולאחר מכן לשטוף שוב עם PBS 2x כדי להסיר את הדם הנותרים.
  13. הוסף 5 מ ל של מדיום RPMI להשלים את הצינור החרוט ברציפות את הכבד עם מספריים לחתיכות קטנות (< 3 מ"מ)-רקמות צריך לעבור בצורה חלקה דרך צינור 5 מ"ל.
  14. הוספת RPMI השלם לנפח הסופי של 30 מ ל והשעיית הכבד באמצעות פיפטה 5 מ"ל.
  15. לסנן את הפתרון המעורב עם מסננת 70 יקרומטר לתוך צינורית חרוט 50 mL.
  16. שטוף מסננת מספר פעמים עם RPMI מלאה ולהתאים את הנפח הסופי ל 50 mL על ידי הוספת RPMI מדיום נוספים.
  17. במהירות לסובב את ההשעיה על ידי צנטריפוגה למקסימום של 500 סל ד; ברגע שהמהירות מואצת ל-50 x g, יש לעצור את הצנטריפוגה.
  18. וכדורי השעיה ב -20 מ ל של PBS.
  19. לספור תאים באמצעות הדרה כחול של טרילון ומכשיר הומוטומטר, ולאחר מכן להתאים את הריכוז של התא ל-2.5 x 106/mL עבור החיסון לתא הבא.
    הערה: התשואה הצפויה מ 5 גרם של רקמת הגידול היא 80,000,000 hepatocytes עם יכולת קיום > 95%.

3. הMTD2 ההפטציטים מעכברים לכבד סוג פראי C57BL/6J על ידי הזרקת ISPL

  1. הטכניקה האספטי צריכה לשמש בכל ההליכים
  2. הC57BL את העכברים הזכריים של CCl4שטופלו על ידי גברים עם 2.5% isofלאנה, העכברים צריכים להיות מטופלים עם חומר סיכה כדי למנוע מהעיניים להתייבש.
  3. הכן מזרקים עם 200 μL של הפטציטים להזרקה.
  4. כאשר מסומם בצורה מספקת, מיקום עכברים עם צד שמאל למעלה.
  5. לגלח את כל האגף השמאלי של העכברים, ואז לקרצף את האזור, לסירוגין בין 70% אלכוהול ו betadine שלוש פעמים.
  6. מנהל 5 מ"ג/ק"ג של carprofen subcutaneouly לפני חיתוך כירורגי.
  7. לעשות חתך 1 ס מ על האגף השמאלי במקבילהצלעות 13 מן ההתחלה הקיצונית הקיצוני ממש מתחת לשריר עמוד השדרה.
  8. לזהות את הטחול ולאחר מכן. לצבוע אותו בעזרת מלקחיים בוטים
  9. מחסנית הטחול עם שני קליפים בגודל בינוני טיטניום. הניחו את שני הסרטונים בין עורק הטחול והווריד, השאירו מקום בין הקליפים לקיצוץ מאוחר יותר לאחר החיסון.
    הערה: המטרה היא לבודד את הקוטב הנחות של הטחול כדי להפחית את הסיכון של זריעה.
  10. להזריק 200 μL (500,000) של hepatocytes מוכן לתוך הקוטב הנחות של הטחול באמצעות מחט G 27.
  11. מחסנית את הענף הנחות של העוקץ (כלים נחותים של מוט הטחול) עם קליפ בגודל בינוני אחד.
  12. חותכים את הטחול בין שני הקליפים שמוקמו בתחילה.
  13. להסיר את הקוטב הנחות של הטחול שהוזרק ישירות עם תאים סרטניים.
  14. השימוש 3-0 polyglactin 910 בהפרעה תפירה לסגור את שכבת השריר הפנימי.
  15. השתמש הפצע מעוקר פלדה מהדקים כדי לסגור את שכבת העור החיצונית.
    הערה: אטבי פלדה מעדיפים על תפרים כדי למנוע בעלי חיים ללעוס תפרים ולהשאיר פצע פעור.
  16. מנהל 5 מ"ג/ק"ג של carprofen תת-עורי לאחר תפר.
  17. מניחים את כל החיות מתאושש על כרית חימום מבוקרת טמפרטורה וניטור היטב עד התאושש באופן מלא מן ההרדמה.
  18. תן לעכברים גישה חופשית למים לאחר הניתוח. אם העכבר הופך להתייבש במהלך הניתוח, ניהול נוזלים תת עורית (< 1 מ ל).
  19. הסר קליפי עור ב 7-10 ימים לאחר הניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפטציטים אונגניים מבודדים מעכברים תגים-טרנסגניים (איור 2) נזרע בכבד של עכברים מסוג פראי על ידי הזרקה פנים-הטחול (איור 3). Hepatocytes המושתלים בהצלחה ובאמינות גדל אורתופאהנושא גידולים HCC (איור 4) עם הגידול אנטיגן ספציפי SV40 TAg (איור 5) בהגדרה של דלקת הכבד פיברוזיס (איור 1).

Figure 1
איור 1: סכימטי להכנת מודל העכבר של HCC. העיצוב הניסיוני להקמת מודל מורטין חדשני של HCC. C57BL/6J עכברים מטופלים לראשונה עם הזרקת IP של CCl4 פעמיים בשבוע במשך ארבעה שבועות כדי לגרום פיברוזיס של הכבד. שבועיים לאחר הזרקת ה-IP האחרונה, העכברים שטופלו על-ידי CCl4מקבלים hepatocytes מבודדים מעכברים MTD2 זכרים צעירים באמצעות ispl החיסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: בידוד וטיהור של הפטציטים מקו MTD2. (א) hepatocytes מבודד מעכברים MTD2 הוכנו על פי הפרוטוקול והוכתם בטריטין כחול כדי לזהות כדאיות וטוהר של בידוד תאים.  הפאנל השמאלי מראה הן hepatocytes (חץ שחור) ואת הגידול לימפוציטים החדירה (חיצים אדומים) כי הם מבודדים במהלך חילוץ התא.  הפאנל הימני מציג את אוכלוסיית התאים הנותרים לאחר צנטריפוגה מהירות נמוכה, כולל hepatocytes (חץ שחור) ומשמעותית פחות הגידול החדירה לימפוציטים. הגדלה המטרה = 10x, סרגל קנה מידה = 100 μm. (ב) hepatocytes מבודדים מעכברים MTD2 מוכתמים בתמיסה כחולה טריטין לפני החיסונים של סוג פראי C57BL/6j.  בידוד התא נקבע להצלחה אם הכדאיות היא > 95%.  תאים מתים יהיו מוכתמים כחול טריכאני (חיצים אדומים), בעוד תאים קיימא לא יהיה מוכתם (חץ שחור).  הגדלה המטרה = 10x, סרגל קנה מידה = 100 μm. הגרף בצד ימין מציג את התוצאות של בידוד התא עם > 95% של hepatocytes להיות קיימא, נתונים סטטיסטיים מגיעים 5 שדה נצפה שונים תחת מיקרוסקופ; קווי שגיאה מייצגים +SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הטחול הפנימי של hepatocytes לתוך הכבד של סוג פראי C57BL/6J עכברים.  העיצוב הניסיוני של החיסון העצמי לצורך לגרום ל-HCC בעכברים C57BL/6J. (1) הטחול מזוהה ומתחת לפני המוות. (2) הטחול מקוטע עם שני קטעי טיטניום בגודל בינוני. (3) מוזרקים מוכנים לתוך הקוטב הנחות של הטחול. (4) הענף הנחות של ה עוקץ (מיכלי הטחול הנחותים) מקוטע בקליפ אחד בגודל בינוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: התפתחות הגידול הפרוגרסיבי בעכברים C57BL/6J לאחר חיסון עם MTD2-hepatocytes. (A) קרצינומה של סרטן (HCC)מודלהגידול אורתופאסטית הוקמה על פי הפרוטוקול. התמונות האנטומיות צולמו לפני. החיסון ובקורסי זמן תת-רציפים (א) מראה כבד בריא לפני החיסון עם MTD2 hepatocytes. (ב) כבד עכבר 3 חודשים לאחר החיסון עם ראיות של התפתחות הגידול הגולמי. (ג) 3.5 חודשים לאחר חיסון עם הגדלת עול הגידול. (ד) 4.5 חודשים לאחר החיסון. (e) 6 חודשים לאחר חיסון עם ראיות של גידול ברחבי הכבד. (ב) גושים הגידול נקצרו ושקלו בנקודות הזמן שצוין לאחר החיסון עם MTD2 hepatocytes.  קווי שגיאה מייצגים +SD. * * *P < 0.001, ניתוח סטטיסטי בוצע על ידי t-בדיקות.  (ג) דמויות מייצגות של מMTD2 מסוג ומקטעי הכבד שחוסנו. המטאוקסילין והאאוזין (H & E) מתארת מבנה פסבדו-שטח (חיצים שחורים). יש צפיפות גרעינית, ותאי הגידול הם אאוזינופילית עם יחסי גרעין-אל-ציטופלסמה גבוהים (תמונה מוגדלת). הגדלה היעד = 20x, סרגל קנה מידה = 50 μm. האינטסטים בחלק העליון של הימנית העליונה מוגברה באופן ידני. (ד) סיריוס אדום מכתים המציין התצהיר קולגן נורמלי, עקבי עם הכבד פיברוזיס. הגדלה: המטרה 40x, סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: זיהוי ספציפי של SV40 T אנטיגן של גן בגידול.  (א) רקמת הגידול ודגימות רקמות נוספותברחביהעכברים נאספו מעכברים מבוסס גידול.  דנ א גנומית היה מבודד רקמות והתחל עבור הן SV40 T Ag ו P53 (שליטה) היו מסונתז עבור PCR קונבנציונאלי. SV40 T אנטיגן גן זוהה ברקמת הגידול אבל הוא לא נוכח או רקמות נורמלי או רקמות אחרות בעכברים. (ב) רקמת הגידול נאסף מפני הגידול עכברים הנושאת ומוכתם נגד נוגדן אנטיגן ANTI-SV40 T. פאנל שמאלי הוא שליטה שלילית מרקמת כבד בריאה שנאסף מעכברים תמימים.  פאנל ימני מראה משמעותי SV40 T אנטיגן כתמים של רקמת הגידול שנאסף מפני גידול עכברים הנושאת (צבע חום).  הגדלה המטרה = 40x, סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עם פרוטוקול זה, הקמנו מודל מורטין אמין ומהימן של HCC כי מחקה את האדם החניכה של HCC והתקדמות. קלינית, גורמי סיכון רבים לגרום לפציעה בכבד, הכבד פיברוזיס, שחמת והשלב הסופי של HCC. בפרוטוקול שלנו, הזרקת IP של CCl4 משמש לייצר הראשון פיברוזיס של הכבד בעכברים סוג פראי, אשר מאפשר הhepatocytes הבאים ליצור את הגידולים בהגדרה של פיברוזיס בכבד. מצאנו כי היווצרות הגידול התרחשה בהצלחה ביותר בעכברים שקיבלו את החיסון הרפואי שבועיים לאחר CCl4 הטיפול, לעומת עכברים מקבל זריקות בנקודות זמן אחרות. בנוסף, מצאנו פיברוזיס בכבד ניתן להבחין עד ארבעה חודשים לאחר הזרקת CCl4 . גישה זו נובעת יותר מ 90% של עכברים לפתח גידולים HCC בהשוואה לעכברים ללא חשיפה ל-CCl4. במודל שלנו, hepatocytes הועבר מ קו MTD2 עכברים לתוך C57BL/6J עכברים, התנועה אל הכבד שבו הם משולבים כמו hepatocytes כי לבטא תג כמו אנטיגן רקמות. בידוד של hepatocytes מ MTD2 הוא צעד קריטי במהלך פרוטוקול זה. MTD2 כבדי העכבר מושם ביסודיות עם פתרון 1 ו 2 כדי להסיר במחזור כדוריות הדם האדומות בתוך הכבד לחלוטין. הפתרון הקולגן משמש כדי להביא את הכבד על הריכוז המצוין ומהירות לייצר עיכול הכבד הנכון כדי לשחרר hepatocytes. השימוש בריכוזים נמוכים יותר של הקולגן אינו מספיק לעיכול, והתוצאה היא גושים של hepatocytes. לעומת זאת, ריכוזים גבוהים הם קשים מדי על הרקמה, וכתוצאה מכך ירידה משמעותית של hepatocytes קיימא. כמו כן, אנו מוצאים שצנטריפוגה הקצרה כפי שמתואר בפרוטוקול שלנו נדרשת כדי לשפר את טוהר ההיפטציטים. הספין הנמוך ביותר שנהגנו לצנטריפוגה יכול לזרז את הפטציטים ולהשאיר את הלוקוציטים ב-supernatant על בסיס הבדלי הצפיפות של שני סוגי תאים אלה.

הצעד הקריטי הבא הוא התוואי של הקשה להיפטרוציטים לתוך עכברים מסוג פראי. במחקרים הקליניים שלנו, בחנו דרכים שונות לניהול הפטוציט חיסונים. הגידול המצליח אורתופאגית הצמיחה בכבד הוא ראה הטוב ביותר עכברים קבלת החיסון הפנימי של הפטציטים אונגניים במינון של חצי מיליון תאים לכל עכבר, לעומת עכברים מקבל תאים מנוהל באמצעות וריד הזנב הצפק זריקה במינונים שונים. ממצאים אלה מצביעים על כך שהגידול האורטו-ממדי של HCC הוא התוואי והתלות במינון. טרנספורמציה ממאירה מתרחשת בהדרגה והיא מוגבלת האוכלוסיה של hepatocytes המושתלים במקום את הכבד כולו בתוך כימומה. המשך התפשטות התא תוצאות גושים סרטניים להתפתח ברחבי הכבד.

עבור HCC או סרטן אחרים כדי להתקדם זה חייב להתחמק מהמערכת החיסונית; למעשה, הימנעות ההרס החיסונית נחשב כעת סימן ההיכר של סרטן39. עם זאת, העדר אנטיגן ספציפי לגידול הוא מכשול קריטי כדי להבהיר את המנגנון הבסיסי. במודל שלנו, תג מתבטא גידולים, לא איברים אחרים, אשר משמש אנטיגן ספציפי לגידול. כמו כן, לתג יש מספר אפיסקופים מוגדרים היטב שניתן לזהות על ידי תאי CD8 T בעכברים C57BL/6J. בנוגע לתגית אפיפיקה-I, יצרנו קו 416 עכברים אשר מבטאים את קולטני התא T באופן מקוון עבור אפירופה זה34. מיקוד תג כדי לבחון את התגובה החיסונית של הגידול אנטיגן מאפשר לנו לחקור מעקב החיסונית הגידול במהלך חניכה הגידול התקדמות, אשר אינו אפשרי באמצעות מודלים הנגרמת על ידי DEN או מניפולציה גנטית. להבהיר את המנגנונים הבסיסיים מאפשר לנו לזהות תאים קריטיים ומולקולות עמידות בפני גידול המערכת החיסונית. פילוח גורמי מפתח אלה יכול לקדם באופן משמעותי את ההתפתחות שלנו של אסטרטגיות חיסוני חדשני נגד HCC. באמצעות מודל ייחודי זה HCC והקימו כלים, חקרנו את המנגנונים המשמשים המושרה עמידות לגידול25,35 ובחנו שונים חיסונית antitumor אנטי סרטניים מבוססי סרטן31,32 , 36 , 37.

לסיכום, מודל murine הוקמה שלנו של HCC משקף כמה תכונות טיפוסיות של המחלה האנושית. במאמר הקודם שלנו שפורסם, הצלחנו ליצור את זה כמודל הגידול הרלוונטי קלינית כי היו תכונות טיפוסיות של HCC האדם. הראנו כי העכברים מטופלים עם CCl4 ו MTD2 hepatocytes מפותחים גידולים הביעו אנטיגנים הקשורים ל-HCC, afp ו-GPC336. פתולוגיה קבעה כי הנגעים במודל murine שלנו דומים הן מאקרובולוגית והן באופן פתולוגי ל HCC האנושי. מינוף זה מודל אמין וכלים מפותחים, אנחנו יכולים ללמוד את המחלה האנושית המורכבת הזאת כולל תובנה לתוך מנגנונים של התפתחות HCC וטיפול קליני זמין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. אין שום דבר להצהיר עליו

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. סטיילי-או'קארול, PI) ו-NIH/NCI R01CA208396 (מארק Kester, Guangfu לי, קווין פ. סטיילי-או'קרול).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia machine VETEQUIP IMPAC6 anesthesia machine for surgery
Butterfly needle BD 8122963 Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice Jackson Lab 000664  mice used in prototol
Carprofen CRESCENT CHEMICAL 20402 carprofen for pain release
Cell Strainer  CORNING REF 431751 Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-30R centrifuge for cell isolation
Clips  Teleflex Medical REF 523700 Titanium Clips for spleen
Microscope Zeiss Primovert  microscope for cell observation
Mtd2 mice N/A Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle BD REF 305109 BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture ETHICON J303H coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody Abcam ab16879 anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe BD REF 309626 1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue SIGMA T 8154 Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips Reflex reflex9, Part. No. 201-1000 stainless steel wound clips for wound close

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Connor, S., Ward, J. W. Hepatocellular carcinoma - United States. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59, 517-520 (2010).
  2. Petrick, J., Kelly, S., Altekruse, S., McGlynn, K., Rosenberg, P. Future of Hepatocellular Carcinoma Incidence in the United States Forecast Through 2030. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 34, 1787-1794 (2016).
  3. Greten, T., Lai, C., Li, G., Staveley-O'Carroll, K. Targeted and Immune-based Therapies for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology. 156, 510-524 (2019).
  4. Llovet, J., Zucman-Rossi, J., Pikarsky, E., Sangro, B., Schwartz, M., Sherman, M., Gores, G. Hepatocellular Carcinoma. Nature reviews. Disease primers. 2, 16018 (2016).
  5. Ding, X., et al. Precision medicine for hepatocellular carcinoma: driver mutations and targeted therapy. Oncotarget. 8, 55715-55730 (2017).
  6. Colombo, M., Maisonneuve, P. Controlling liver cancer mortality on a global scale: still a long way to go. Journal of Hepatology. 67, 216-217 (2017).
  7. Llovet, J., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362, 1907-1917 (2003).
  8. Parkin, D., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. International Journal of Cancer. 94, 153-156 (2001).
  9. Thomas, M., Zhu, A. Hepocellular carcinoma: the need for progress. Journal of Clinical Oncology. 23, 2892-2899 (2005).
  10. Llovet, J., Bruix, J. Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 48, 1312-1327 (2008).
  11. Bruix, J., Sherman, M. Management of hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology. 53, 1020-1022 (2011).
  12. Pang, T., Lam, V. Surgical management of hepatocellular carcinoma. World Journal of Hepatology. 7, 245-252 (2015).
  13. Llovet, J., et al. Design and endpoints of clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of the National Cancer Institution. 100, 698-711 (2008).
  14. Mueller, K. Cancer immunology and immunotherapy. Realizing the promise. Introduction. Science. 348, 54-55 (2015).
  15. Gajewski, T., Schreiber, H., Fu, Y. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14, 1014-1022 (2013).
  16. Ribas, A., Wolchok, J. Combining cancer immunotherapy and targeted therapy. Current Opinion in Immunology. 25, 291-296 (2013).
  17. Postow, M., Callahan, M., Wolchok, J. Immune checkpoint blockade in cancer therapy. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33, 1974-1982 (2015).
  18. Gao, J., et al. VISTA is an inhibitory immune checkpoint that is increased in ipilimumab therapy in patients with prostate cancer. Nature Medicine. 23, 551-555 (2017).
  19. Hahn, A., Gill, D., Pal, S., Agarwal, N. The future of immune checkpoint cancer therapy after PD-1 and CTLA-4. Immunotherapy. 9, 681-692 (2017).
  20. Remon, J., Besse, B. Immune checkpoint inhibitors in first-line therapy of advanced non-small cell lung cancer. Current Opinion in Oncology. 29, 97-104 (2017).
  21. Kudo, M. Immune checkpoint blockade in hepatocellular carcinoma: 2017 update. Liver Cancer. 6, 1-12 (2017).
  22. Kudo, M. Immune checkpoint inhibition in hepatocellular carcinoma: Basics and ongoing clinical trials. Oncology. 92, 50-62 (2017).
  23. Breous, E., Thimme, R. Potential of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 54, 830-834 (2011).
  24. Sprinzl, M., Galle, P. Facing the dawn of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 59, 9-10 (2013).
  25. Liu, D., Staveley-O'Carroll, K., Li, G. Immune-based therapy clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of Clinical Cell Immunology. 6, 376 (2015).
  26. Greten, T., Wang, X., Korangy, F. Current concepts of immune based treatments for patients with HCC: from basic science to novel treatment approaches. Gut. 64, 842-848 (2015).
  27. Koster, B., de Gruijl, T., van den Eertwegh, A. Recent developments and future challenges in immune checkpoint inhibitory cancer treatment. Current Opinion in Oncology. 27, 482-488 (2015).
  28. Johnson, D., Sullivan, R., Menzies, A. Immune checkpoint inhibitors in challenging populations. Cancer. 123, 1904-1911 (2017).
  29. Li, H., et al. Programmed cell death-1 (PD-1) checkpoint blockade in combination with an mTOR inhibitor restrains hepatocellular carcinoma growth induced by hepatoma cell-intrinsic PD-1. Hepatology. 66, 1920-1933 (2017).
  30. Heindryckx, F., Colle, I., van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
  31. Qi, X., et al. Development of inCVAX, in situ cancer vaccine, and its immune response in mice with hepatocellular cancer. Journal of Clinical and Cellular Immunology. 7, 438 (2016).
  32. Qi, X., et al. Development of a radiofrequency ablation platform in a clinically relevant murine model of hepatocellular cancer. Cancer Biology and Therapy. 16, 1812-1819 (2015).
  33. Liu, D., et al. Sunitinib represses regulatory T cells to overcome immunotolerance in a murine model of hepatocellular cancer. Oncoimmunology. 7, 1372079 (2017).
  34. Staveley-O'Carroll, K., et al. In vivo ligation of CD40 enhances priming against the endogenous tumor antigen and promotes CD8+ T cell effector function in SV40 T antigen transgenic mice. Journal of Immunology. 171, 697-707 (2003).
  35. Avella, D., et al. Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model. Hepatology. 55, 141-152 (2012).
  36. Li, G., et al. Successful chemoimmunotherapy against hepatocellular cancer in a novel murine model. Journal of Hepatology. 66, 75-85 (2017).
  37. Li, G., et al. Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice. Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).
  38. Held, W., et al. T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene. EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).
  39. Hanahan, D., Weinber, R. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 151 סרטן hepatocellular מודל הגידול עכבר מודל מורלא פיברוזיס של הכבד סרטן
מודל העכבר המושרה של הפאציט הנגרמת על ידי מדגם של סרטן הפטאותאי העולה בקביעת דלקת הכבד פיברוזיס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qi, X., Schepers, E., Avella, D.,… More

Qi, X., Schepers, E., Avella, D., Kimchi, E. T., Kaifi, J. T., Staveley-O'Carroll, K. F., Li, G. An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis. J. Vis. Exp. (151), e59368, doi:10.3791/59368 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter