Summary
Aqui, nós descrevemos o desenvolvimento de um modelo murino clìnica relevante do cancro do fígado que recapitulando as características imunes típicas do cancro hepatocelular (HCC).
Abstract
A ausência de um modelo animal clinicamente relevante abordando as características imunes típicas do câncer hepatocelular (HCC) tem impedido significativamente a elucidação dos mecanismos subjacentes e o desenvolvimento de estratégias imunoterapêuticas inovadoras. Para desenvolver um modelo animal ideal que recapitulando o HCC humano, os ratos masculinos imuno-competentes de C57Bl/6J recebem primeiramente uma injeção do tetracloreto de carbono (CCL4) para induzir a fibrose do fígado, a seguir recebem hepatócitos oncogênico histològica-normais do macho novo Antígeno SV40 T (TAg)-camundongos transgênicos (MTD2) por inoculação intra-esplênica (ISPL). Andrógeno gerado em ratos machos receptores na puberdade inicia a expressão de TAg o controle de um promotor específico do fígado. Como resultado, os hepatócitos transferidos tornam-se células cancerosas e formam massas tumorais no cenário de fibrose hepática/cirrose. Este modelo novo imita a iniciação e a progressão humanas do HCC no contexto da fibrose/cirrose do fígado e reflete as características as mais típicas do HCC humano que inclui a deficiência orgânica imune.
Introduction
O câncer hepatocelular (HCC) é o tipo de câncer mais rapidamente crescente nos Estados Unidos (US)1,2,3. Todos os anos, aproximadamente 850.000casos novos são diagnosticados4,5 e 700.000 pacientes morrem desta doença letal6,7,8,9,10 , tornando-se a segunda maior causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. A gerência de HCC inclui o resection cirúrgico, a transplantação, a ablação, o chemoembolization, ou terapias sistemáticas, tais como sorafenib11. O diagnóstico e a gerência adiantados com resection cirúrgico ou transplantação têm o benefício total o mais elevado da sobrevivência4. Infelizmente, a maioria dos pacientes apresenta-se em estágio posterior e requer manejo com ablação, Quimioembolização ou sorafenib12. Sorafenib, um inibidor da tirosina quinase do receptor (rtki), foi aprovado pelo alimento e pela administração da droga em 2008 como a única terapia de droga sistemática disponível para tratar o HCC irressecável. Embora a droga só forneça um aumento modesto na sobrevida global, de 7,9 a 10,7 meses13, ele forneceu uma nova estratégia terapêutica que poderia ser utilizada para gerenciar o HCC.
Manipular o sistema imunológico para eliminar os cânceres estabelecidos é um campo de rápido crescimento na pesquisa de câncer14. Estudos imunológicos de Checkpoint têm consideravelmente avançadodesenvolvimento de fármacosimunoterapêuticos no tratamento do câncer15,16. O FDA aprovou o uso de anticorpos (ABS) contra o antígeno citotóxico T-linfócito 4 (CTLA-4), a proteína de morte celular programada 1 (PD-1), e seu ligante PD-L1 para o tratamento de melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço e câncer de bexiga17, 18 anos de , 19 anos de , 20. ensaios clínicos de monoterapia ou terapêutica combinada com um ou vários anticorpos contra PD-1, PD-L1 ou CTLA-4 para o tratamento de HCC avançado estão em curso21,22,23, e alguns testes mostraram resultados favoráveis. Em 2017, o FDA concedeu a aprovação acelerada para o anticorpo anti-PD-1 para tratar pacientes de HCC, que são resistência ao sorafenib, mas a taxa de resposta total desta terapia é somente 14,3%. Outras estratégias não foram traduzidas para a prática clínica neste momento24,25. Superando a tolerância imune profunda tumor-induzida para melhorar a terapia imune do Checkpoint26; prevendo a eficácia da terapia imune do Checkpoint; prevenção de acontecimentos adversos relacionados com a imunidade; Otimizando a rota de administração, dosagem e frequência; e encontrar combinações efetivas de terapias27,28,29 todos permanecem tarefas extremamente desafiadoras.
Existem várias abordagens convencionais usadas para induzir a HCC em modelos de mouse atualmente e são utilizadas dependendo da questão de pesquisa particular do investigador30. Os modelos quimicamente-induzidos do rato de HCC com compostos genotóxico imitam a malignidade ferimento-induzida. Os modelos de xenograft através da implantação ectópica ou transplantação orthotopic do de linhas de pilha de HCC são apropriados para a seleção da droga. Vários camundongos geneticamente modificados foram projetados para investigar a fisiopatologia da HCC. Camundongos transgênicos expressando genes virais, oncogenes e/ou fatores de crescimento permitem a identificação de vias envolvidas na hepatocarcinogênese. Devido às limitações inerentes, estes modelos não recapitulam as características imunes típicas consideradas no HCC humano, que impediu significativamente a elucidação dos mecanismos subjacentes e o desenvolvimento de estratégias imunoterápicos inovativas14 ,15. Recentemente, criamos um modelo murino clinicamente relevante. Este modelo novo não somente imita a iniciação e a progressão humanas de HCC mas igualmente reflete a maioria de características típicas da doença humana que inclui a deficiência orgânica imune. Caracterizamos suas características biológicas e imunológicas. Aproveitando este modelo novo, nós exploramos várias estratégias imunoterápicos para tratar HCC31,32,33,34,35,36, 37. esta plataforma única nos permite estudar mecanismos de imunotolerância induzida por tumor e desenvolver estratégias terapêuticas de prova de conceito para HCC em direção a eventual tradução clínica.
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Protocol
Nota: todo o procedimento, incluindo os sujeitos animais foram aprovados pelo IACUC na Universidade de Missouri. Todos os camundongos receberam cuidados humanitários de acordo com os critérios delineados no "guia para o cuidado e uso de animais de laboratório". O procedimento a seguir para isolamento e inoculação celular deve ser realizado em um capô. Todos os artistas devem usar o equipamento de proteção individual padrão para o manuseio dos camundongos e tecidos.
1. indução de fibrose hepática e cirrose com injeção de IP de tetracloreto de carbono (CCl4)
Nota: consulte a Figura 1. (CCl4 é reagente altamente perigoso, ele deve ser segurado com cuidado e com luvas químico-resistentes desgastando)
- Obter ratos machos C57BL/6J com seis a oito semanas de idade (ver tabela de materiais).
- Prepare 10% CCl4 (v/v) solução em óleo de milho em um tubo de centrífuga. Determine o volume total com base no número de camundongos a serem injetados (consulte a etapa 1,6).
- Use a técnica adequada de manuseio de camundongos para selecionar um mouse para injeção.
- Contenha manualmente o rato com o seu lado dorsal (abdómen) para cima.
- Limpe o local da injeção na parede abdominal do rato esfregando com álcool 70%.
- Injete camundongos machos C57BL/6J com 160 μL de solução de CCl4 de 10% por injeção intraperitoneal (IP) usando uma agulha descartável de 25 gauge.
- Assegure-se de que a agulha penetre apenas através da parede abdominal (aproximadamente 4-5 milímetros) com chanfrar-lado acima e ligeiramente angular em 15-20 graus.
- Injectar ratos duas vezes por semana durante um total de quatro semanas-cada rato receberá um total de oito injeções.
Nota: duas semanas após a última injeção, os camundongos tratados estão prontos para a inoculação de hepatócitos oncogênicos de ISPL de MTD2 camundongos.
2. isolando tag-hepatócitos transgênicos da linha MTD2 camundongos
Observação: consulte a tabela 1 para obter receitas de solução.
| Solução de sal equilibrado de 10x Earle sem CA ou magnésio (EBSS sem CA ou magnésio) | 4 g KCl 68 g NaCl 1,4 g NaH2PO4 · H2o 10 g de dextrose Adicione a água a 1 litro, pH a 4,32 Passar pelo filtro |
| Solução 1 | 20 mL 10x EBSS sem CA ou mg 44 g NaHCO3 1,33 mL 1.5 M HEPES 10 mL de 10 mL de EGTA Adicionar água a 200 mL |
| Solução 2 | 100 mL 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M HEPES Adicione a água a 1 litro |
| 0,75% solução de colagenase | 15 mg de colagenase tipo 1 20 mL de solução 2 |
| Meio completo | 2 O RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x penicilina-estreptomicina |
Tabela 1: receitas de soluções.
- Obter linha MTD2 camundongos38 para servir como a fonte de hepatócitos oncogênicos.
- Anestesiam ratos de 5 semanas de idade MTD2 usando 2,5% de isoflurano.
Nota: a anestesia apropriada será verificada pelo método da pitada do dedo do pé. Em resumo, usando dois dedos, dar o dedo do pé do mouse/Foot um bom aperto. Se não houver reação de abstinência, o animal é julgado profundamente o suficiente para iniciar a cirurgia. - Quando sedado adequadamente, coloc ratos em uma posição supina e fixe as extremidades com a fita para fornecer a exposição adequada da superfície abdominal.
- Realize uma incisão laparotomia Midline usando tesouras ao longo do comprimento da Linea Alba grande o suficiente para fornecer uma exposição adequada do fígado.
- Deslocar os intestinos para a esquerda para proporcionar uma melhor exposição do fígado e da Tríade Portal.
- Dissecar acima do fígado para expor a veia cava inferior (IVC).
- Ligate o IVC acima do fígado usando uma braçadeira da artéria.
- Voltando à borda inferior do fígado, use uma agulha de borboleta (ver materiais) para obter acesso IV à veia porta. Fixe o cateter à mão.
- Perfuse sucessivamente o fígado do rato usando uma seringa da injeção em 8,9 ml/min com com 15 ml da solução 1, 15 ml da solução 2 do colagenase de 0,75%, e 15 ml da solução 2 através do cateter.
- Colha o fígado perfundidos cortando e tomando a massa de tumor de MTD2 ratos em um tubo cônico de 50 ml com 10-15 ml de PBS.
- Remova o PBS e lave um tempo adicional com PBS; Não centrifugue nesta etapa.
- Corte o fígado em pedaços menores usando tesouras e depois lave novamente com PBS 2x para remover o sangue restante.
- Adicione 5 mL de meio RPMI completo ao tubo cônico e mince continuamente o fígado com tesouras para pequenas peças (< 3 mm)-o tecido deve passar suavemente por uma pipeta de 5 mL.
- Adicione RPMI completo a um volume final de 30 mL e suspenda o fígado usando uma pipeta de 5 mL.
- Filtre a solução mista com um filtro de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL.
- Lave o filtro diversas vezes com RPMI completo e ajuste o volume final a 50 mL adicionando o meio adicional de RPMI.
- Gire rapidamente a suspensão por centrifugador a um máximo de 500 rpm; uma vez que a velocidade é acelerada a 50 x g, o centrifugador deve ser parado.
- Decantar o sobrenadante e suspender as pelotas em 20 mL de PBS.
- Contagem de células usando trypan exclusão azul e um Hemocytometer, em seguida, ajustar a concentração celular para 2,5 x 106/ml para a seguinte inoculação celular.
Nota: o rendimento esperado de 5 gramas de tecido tumoral é de 80 milhões hepatócitos com viabilidade > 95%.
3. inocular os hepatócitos de camundongos MTD2 para o fígado de camundongos selvagens tipo C57BL/6J por injeção ISPL
- A técnica asséptica deve ser utilizada em todos os procedimentos
- Anestesiam os camundongos C57BL/6J machos tratados com CCl4com 2,5% de isoflurano, os camundongos devem ser tratados com lubrificante ocular para evitar que os olhos SECem.
- Preparar seringas com 200 μL de hepatócitos para injecção.
- Quando sedado adequadamente, posicione os camundongos com o lado esquerdo para cima.
- Raspar todo o flanco esquerdo dos camundongos, em seguida, esfregar a área, alternando entre 70% álcool e Betadine três vezes.
- Administrar 5 mg/kg de carprofeno subcutaneouly antes da incisão cirúrgica.
- Faça uma incisão de 1 cm no flanco esquerdo paralelo à 13ª costela do início extremo dorsal logo abaixo do músculo da coluna vertebral.
- Identifique o baço, então exteriorização-o usando fórceps Blunt-pointed.
- Grampeie o baço com dois clipes de titânio de tamanho médio. Coloque ambos os clipes entre a artéria esplênica e a veia, deixe espaço entre os clipes para cortar mais tarde após a inoculação.
Nota: o objetivo é isolar o pólo inferior do baço para reduzir o risco de semeadura. - Injete 200 μL (500.000) dos hepatócitos preparados no pólo inferior do baço utilizando uma agulha de 27 G.
- Grampeie o ramo inferior do pedículo (vasos inferiores do pólo esplênico) com um clipe de tamanho médio.
- Corte o baço entre os dois clipes colocados inicialmente.
- Retire o pólo inferior do baço que foi injetado diretamente com células tumorais.
- Use 3-0 Poliglactina 910 interrompendo a sutura para fechar a camada interna do músculo.
- Use os grampos de aço esterilizados da ferida para fechar a camada exterior da pele.
Nota: grampos de aço são preferidos sobre suturas para evitar animais mastigando suturas, deixando uma ferida escancarada. - Administrar 5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea após a sutura.
- Coloque todos os animais em recuperação em uma almofada de aquecimento controlada por temperatura e monitore de perto até que esteja totalmente recuperado da anestesia.
- Dê aos ratos acesso livre à água após a cirurgia. Se o rato se tornar desidratado durante a cirurgia, administre fluidos subcutâneos (< 1 mL).
- Remova os grampos da pele em 7-10 dias post-operatively.
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Representative Results
Hepatócitos oncogênicos isolados de camundongos TAg-transgênicos (Figura 2) foram semeados no fígado de camundongos tipo selvagem por injeção intraesplênica (Figura 3). Os hepatócitos transplantados com sucesso e de forma confiável cresceram tumores ortotópicos de HCC (Figura 4) com antígeno específico SV40 TAg do tumor (Figura 5) no cenário de inflamação e fibrose hepática (Figura 1).
Figura 1: esquemático para preparar o modelo do mouse do HCC. O projeto experimental para estabelecer um modelo murino inovativo de HCC. Os ratos de C57BL/6J são tratados primeiramente com a injeção do IP de CCl4 duas vezes semanalmente por quatro semanas para induzir a fibrose do fígado. Duas semanas após a última injeção de IP, os camundongos tratados com CCl4recebem hepatócitos isolados de camundongos machos MTD2 jovens via inoculação de ISPL. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: isolamento e purificação de hepatócitos de camundongos da linhagem MTD2. (A) os hepatócitos isolados de camundongos MTD2 foram preparados de acordo com o protocolo e corados com azul de Tripan para detectar viabilidade e pureza do isolamento celular. O painel esquerdo mostra ambos os hepatócitos (seta preta) e os linfócitos infiltrantes do tumor (setas vermelhas) que são isolados durante a extração celular. O painel direito mostra a população celular remanescente após a centrifugação de baixa velocidade, incluindo hepatócitos (seta preta) e significativamente menos linfócitos infiltrantes do tumor. Ampliação = 10x objetivo, barra de escala = 100 μm. (B) os hepatócitos isolados de camundongos MTD2 são corados com solução de azul de Tripan antes da inoculação de camundongos selvagens tipo C57Bl/6J. Isolamento celular é determinado a ser bem sucedido se a viabilidade é de > 95%. As células mortas serão manchadas com o azul de Tripan (setas vermelhas), enquanto as células viáveis não serão manchadas (seta preta). Ampliação = 10x objetivo, barra de escala = 100 μm. O gráfico à direita mostra os resultados do isolamento celular com > 95% dos hepatócitos sendo viáveis, os dados estatísticos vêm de 5 diferentes campo observado microscópio; barras de erro representam +SD. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: inoculação Intrasplenica de hepatócitos no fígado de camundongos selvagens do tipo C57Bl/6J. O delineamento experimental para inoculação da ISPL de hepatócitos induz a HCC em camundongos C57BL/6J. (1) o baço é identificado e exteriorizado. (2) o baço é cortado com dois clipes de titânio de tamanho médio. (3) os hepatócitos preparados são injetados no pólo inferior do baço. (4) o ramo inferior do pedículo (vasos inferiores do pólo esplênico) é cortado com um clipe de tamanho médio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: desenvolvimento progressivo do tumor em camundongos C57Bl/6J após inoculação com MTD2-hepatócitos. (A) o modelo do tumor transplantação orthotopic do do carcinoma hepatocelular (HCC) foi estabelecido de acordo com o protocolo. As imagens anatômicas foram realizadas antes da inoculação e em cursos de tempo subseqüenciais. (a) mostra fígado saudável antes da inoculação com hepatócitos MTD2. (b) fígado de rato 3 meses após inoculação com evidência de desenvolvimento de tumores brutos. (c) 3,5 meses após a inoculação com aumento da carga tumoral. (d) 4,5 meses após a inoculação. (e) 6 meses após a inoculação com evidência de tumor em todo o fígado. (B) os nódulos tumorais foram colhidos e pesados nos pontos temporais indicados após a inoculação com HEPATÓCITOS MTD2. As barras de erro representam +SD. * * *P < 0, 1, a análise estatística foi realizada por testes t. (C) imagens representativas de secções de fígado e MTD2-inoculadas. A coloração de hematoxilina e eosina (H & E) retrata a formação de pseudoglândulas (setas pretas). Há aglomerados nucleares, e as pilhas do tumor são Eosinophilic com índices elevados do núcleo-à-citoplasma (imagem ampliada). Ampliação = objetivo 20x, barra de escala = 50 μm. Os inserções na parte superior direita são amplificados manualmente. (D) Sirius Red mancha indicando deposição de colágeno anormal, consistente com a fibrose hepática. Ampliação: 40x objetivo, barra de escala = 20 μm. Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: deteção específica do gene do antígeno de SV40 T no tumor. (A) tecido tumoral e amostras de tecido adicionais ao longo de camundongos foram coletadas de camundongos estabelecidos por tumor. O DNA de Genomic foi isolado do tecido e os primers para SV40 T AG e p53 (controle) foram sintetizados para o PCR convencional. O gene do antígeno de SV40 T foi detectado no tecido do tumor mas não está atual no tecido normal ou no outro tecido nos ratos. (B) o tecido tumoral foi coletado de camundongos portadores de tumor e corados com anticorpos ANTIANTÍGENO SV40 T. O painel esquerdo é um controle negativo do tecido saudável do fígado coletado dos ratos ingênuos. O painel direito mostra a mancha significativa do antígeno de SV40 T do tecido do tumor coletado dos ratos do tumor-rolamento (cor marrom). Ampliação = 40x objetivo, barra de escala = 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Com este protocolo, nós estabelecemos um modelo murino de confiança e reprodutível de HCC que imita a iniciação e a progressão humanas do HCC. Clinicamente, muitos fatores de risco induzem sucessivamente lesão hepática, fibrose hepática, cirrose e a fase final da HCC. Em nosso protocolo, a injeção do IP de CCL4 é usada para produzir primeiramente a fibrose do fígado em ratos do tipo selvagem, que permite que os hepatócitos oncogênico subseqüentes Formem os tumores no ajuste da fibrose do fígado. Nós encontramos que a formação do tumor ocorreu o mais com sucesso nos ratos que receberam a inoculação do hepatócito duas semanas após o tratamento de CCL4 , comparado aos ratos que recebem injeções em outros pontos do tempo. Além, nós encontramos que a fibrose do fígado pode ser detectada até quatro meses após a injeção do CCl4 . Esta aproximação conduz a mais de 90% dos ratos que desenvolvem tumores de HCC comparados aos ratos sem exposição ao CCl4. Em nosso modelo, os hepatócitos transferidos da linha MTD2 camundongos em camundongos C57BL/6J, o tráfego para o fígado onde eles se tornam incorporados como hepatócitos que expressam TAg como um antígeno tecidual. A isolação dos hepatócitos de MTD2 é uma etapa crítica durante este protocolo. MTD2 fígados do rato são perfundidos completamente com a solução 1 e 2 para remover os glóbulos vermelhos circulantes dentro do fígado completamente. A solução da colagenase é usada para perfuse o fígado na concentração e na velocidade indicadas para gerar a digestão apropriada do fígado para liberar hepatocytes. O uso de concentrações mais baixas de colagenase é insuficiente para a digestão, resultando em aglomerantes de hepatócitos. Em contrapartida, altas concentrações são muito duras no tecido, resultando em uma redução significativa dos hepatócitos viáveis. Nós igualmente achamos que a centrifugação breve como descrita em nosso protocolo é exigida para melhorar a pureza dos hepatocytes. A rotação mais baixa que utilizamos para a centrifugação pode precipir os hepatócitos e deixar os leucócitos no sobrenadante com base na diferença de densidade destes dois tipos de células.
O próximo passo crítico é a rota para inocular hepatócitos em camundongos tipo selvagem. Em nossos estudos-piloto, exploramos várias maneiras de conduzir a inoculação de hepatócitos. O crescimento de tumor transplantação orthotopic do bem sucedido no fígado é visto melhor nos ratos que recebem a inoculação pseudoaneurysms de hepatócitos oncogênico em uma dose de meio-um milhão de pilhas por o rato, comparado aos ratos que recebem as pilhas administradas através da veia da cauda e intraperitoneal injeção em várias doses. Estes resultados sugerem que o crescimento transplantação orthotopic do de HCC seja rota e dose-dependente. A transformação maligna ocorre gradualmente e limita-se à subpopulação de hepatócitos transplantados em vez de todo o parênquima hepático. A proliferação contínua da pilha conduz aos nodules do tumor que desenvolvem durante todo o fígado.
Para o HCC ou outros cânceres para progredir deve evadir o sistema imunológico; na verdade, evitando a destruição imune é agora considerada uma marca registrada do câncer39. No entanto, a falta de antígeno específico do tumor é uma barreira crítica para elucidar os mecanismos subjacentes. Em nosso modelo, o TAg é expressado nos tumores, não em outros órgãos, que actua como um antígeno tumor-específico. Além disso, o TAg tem inúmeros resumos bem definidos que podem ser reconhecidos por células T CD8 em camundongos C57Bl/6J. A respeito do TAg epítopo mapeado-I, nós geramos os ratos da linha 416 que expressam mesmo receptores da pilha de T para este epítopo34. A TAg de segmentação para examinar a resposta imune específica do antígeno tumoral nos permite investigar a vigilância imune tumoral durante a iniciação e progressão do tumor, o que não é possível usando modelos induzidos por DEN ou manipulação genética. Elucidar os mecanismos subjacentes nos permite identificar células críticas e moléculas mediando a tolerância imune induzida por tumor. O direcionamento desses fatores-chave pode avançar significativamente no desenvolvimento de estratégias imunoterapêuticas inovadoras contra o HCC. Usando este modelo original de HCC e ferramentas estabelecidas, nós investigamos os mecanismos que subjacentes a tolerância tumor-induzida25,35 e explorámos vários imunoterapias antitumorais imunes-baseadas31,32 , 36 , 37.
Em resumo, nosso modelo murino estabelecido de HCC reflete algumas características típicas da doença humana. Em nosso artigo previamente publicado, nós pudemos estabelecer este como um modelo clìnica relevante do tumor que tivesse características típicas do HCC humano. Nós mostramos que os ratos tratados com os hepatócitos de CCL4 e de MTD2 desenvolveram os tumores que expressaram antígenos HCC-associados, AFP e GPC336. A patologia determinou que as lesões em nosso modelo murino são similares macroscopicamente e patològica ao HCC humano. Aproveitando este modelo confiável e as ferramentas desenvolvidas, podemos estudar esta complexa doença humana, incluindo a introspecção em mecanismos de desenvolvimento de HCC e tratamento clinicamente disponível.
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Disclosures
Não há nenhum para declarar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-o ' Carroll, PI) e NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu li, Kevin F. Staveley-o ' Carroll).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | VETEQUIP | IMPAC6 | anesthesia machine for surgery |
| Butterfly needle | BD | 8122963 | Needle used for liver perfusion |
| C57BL/6 mice | Jackson Lab | 000664 | mice used in prototol |
| Carprofen | CRESCENT CHEMICAL | 20402 | carprofen for pain release |
| Cell Strainer | CORNING | REF 431751 | Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | centrifuge for cell isolation |
| Clips | Teleflex Medical | REF 523700 | Titanium Clips for spleen |
| Microscope | Zeiss | Primovert | microscope for cell observation |
| Mtd2 mice | N/A | Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab | |
| Needle | BD | REF 305109 | BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm) |
| Suture | ETHICON | J303H | coated VICRYL suture |
| SV40 T Ag antibody | Abcam | ab16879 | anti-SV40 T-antigen antibody for IHC |
| Syringe | BD | REF 309626 | 1 mL TB syringe for cell injection |
| Trypan blue | SIGMA | T 8154 | Trypan blue solution for cell viability test |
| Wound clips | Reflex | reflex9, Part. No. 201-1000 | stainless steel wound clips for wound close |
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