Summary
פרוטוקול זה מציג כיצד לחיות התמונה ולנתח את meristems apical לירות מכל מיני צמחים שונים באמצעות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר.
Abstract
הפונקציות apical meristem (SAM) לירות כמו מאגר תאי גזע שנשמרת וזה יוצר כמעט לכל רקמות מעל פני הקרקע במהלך הפיתוח postembryonic. פעילותן ואת המורפולוגיה של סאמס לקבוע תכונות אגרונומית חשובים, כגון ארכיטקטורה לירות, הגודל והמספר של איברי הרבייה, וחשוב, התשואה תבואה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח המורפולוגיה השטח והן המבנה התאי פנימי של חיים סאמס ממינים שונים דרך מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. ההליך כולו משלב הכנת המדגם רכישת תמונות תלת מימד (3D) ברזולוציה גבוהה יכול להתבצע במרחק קצר ככל 20 דקות. נדגים כי פרוטוקול זה הוא יעיל ביותר ללמוד לא רק התפרחת סאמס של המין מודל, אלא גם את meristems וגטטיבי של גידולים שונים, מתן כלי פשוט אך רב עוצמה כדי ללמוד את הארגון ואת התפתחות meristems על פני מינים שונים.
Introduction
Meristem הצמח מכיל מאגר של תאי גזע מובחן, ברציפות ומקיימת את צימוח איברים ואת פיתוח1. במהלך הפיתוח postembryonic, כמעט כל רקמות מעל פני הקרקע של צמח נגזרות של meristem apical לירות (SAM). בגידולים, פעילותן ואת גודל את סאם שלה meristems פרחוני נגזר הם קשורים בחוזקה רבים אגרונומית תכונות כגון ארכיטקטורה לירות, פירות ייצור זרע התשואה. לדוגמה, בעגבניה, סאם מוגדל גורמת עלייה הצילומים ואת תפרחת הסתעפות, ולכן התוצאות על מנת לייצר פרח נוסף ופרי איברים2. תירס, גידול בגודל סאם מוביל מספר הזרעים גבוה יותר, התשואה הכוללת3,4. סויה, indeterminacy meristem גם קשורה קשר הדוק עם הארכיטקטורה לירות, תשואה5.
מורפולוגיה של האנטומיה של סאמס יכולים להיות מאופיינת במספר שיטות, כולל היסטולוגית חלוקתה/צביעת וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)6, אשר שניהם יש קידמה מאוד את המחקר meristem באמצעות מתן תצוגת חתך או מבט תלת מימדי (3D) משטח של סאמס. אולם, שתי השיטות הן זמן רב, מעורבים מספר שלבים ניסיוני משלב הכנת המדגם אל, רכישת נתונים, שיטות אלה תלויים בעיקר מדגמים קבועים. התפתחויות אחרונות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקת לייזר היה להתגבר על מגבלות אלה ולספק לנו כלי רב עוצמה כדי לחקור את המבנה התאי ואת התהליך ההתפתחותי של הצמח רקמות ואיברים7,8. דרך אופטי ולא רקמה גופנית מיקרוסקופ קונפוקלי, אופטים מאפשר את האוסף של סדרה של תמונות z-מחסנית ושיחזור 3D עוקבות של המדגם באמצעות תוכנות ניתוח התמונה.
כאן, אנו מתארים הליך יעיל עבור חוקרים גם בפנים ולשתול משטח מבני המגורים סאמס מ שונים מינים באמצעות סריקת קונפוקלית, אשר פוטנציאל מאפשר לחוקרים לבצע כל את ניסיוני לייזר תהליך בתוך קצר ככל 20 דקות. שונה מכל שיטות נוספות שפורסמו בשידור חי הדמיה קונאפוקלית של תודרנית תפרחת סאמס9,10,11,12,13,14, 15 ו תודרנית פרחים12,13, כאן אנחנו מוכיחים כי פרוטוקול זה הוא יעיל ביותר ללמוד לא רק את תפרחת meristems של המין מודל, אלא גם את הצילומים וגטטיבי meristems apical של גידולים שונים, כגון עגבניות, סויה. בשיטה זו אין להסתמך על סמנים פלורסנט הטרנסגניים ולאחר פוטנציאלי יכול להיות מיושם ללמוד את meristems לירות מתוך שפע מינים שונים של הזנים. בנוסף, אנחנו גם מציגים את התמונה פשוט עיבוד צפייה וניתוח סאמס שונים בתצוגה תלת-ממדית. יחדיו, שיטה פשוטה זו יקל על החוקרים להבין טוב יותר את המבנה ואת תהליך התפתחותי meristems דגם אורגניזמים והן יבולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מנות מדיה והדמיה
- MS צלחות: להוסיף 0.5 x Murashige & Skoog MS בינוני, 1% אגר למים יונים ולאחר מכן התאם את ה-pH ל 5.8 שימוש אשלגן הידרוקסידי פתרון (אופציונלי: להוסיף 1% סוכרוז לגידול צמחים לטווח ארוך). אוטוקלב, יציקת פלטות.
- הדמיה מנות: מילוי פלסטיק צלחות פטרי (6 ס"מ, עומק של 1.5 ס מ) ל- 0.5-0.8 ס מ עם agarose מותכת 1.5%.
2. צימוח
-
תודרנית צמיחה
- לזרוע זרעים סטיריליים על MS צלחות והנח הצלחות מתחת לגיל 4 ° C במשך יומיים. לאחר מכן, להעביר צלחות MS יום קצר (8 שעות אור / כהה 16 h), ב 22 מעלות צלזיוס במשך שבועיים.
- השתלת השתילים אדמה ולצמוח אותם יום קצר (8 שעות אור / כהה 16 h) ב 22 מעלות צלזיוס במשך ארבעה שבועות.
- העברת מפעלים אור רציף, ב 22 ° C כדי לעודד את המעבר מ צמח לבמה הרבייה, הדמיה התפרחת סאמס.
- גידול עגבניות, סויה
- דגירה הזרעים מכוסים נייר סינון רטוב מתחת 28 ° C עד שהם לנבוט.
- השתלת השתילים אדמה ואגדל אותם ביום ארוך (16 h אור / כהה 8 שעות) 25 ° c במשך שבוע אחד או יותר עבור הדמיה סאמס וגטטיבי.
3. ניתוח השיא לירות
- דיסקציה של תפרחת לירות השיא
- חותכים את איפקס לירות תפרחת יחד עם 1-2 ס מ גזע ראשי מצמחים תודרנית שהצוקים עם סכין גילוח. . תחזיק את החלק הבזליים של הגזע המרכזי, להסיר איברים פרח בוגרים רבים ככל האפשר מן הגזע הראשי על-ידי לנתח החוצה peduncles עם מלקחיים תכשיטים.
זהירות: הימנעו חיתוך האצבעות כאשר באמצעות סכין גילוח. השלך סכיני גילוח משומשים לגורם המכיל שרפ ראוי. - להחזיק את הגבעול המצורפת של השיא לירות עם מלקחיים תכשיטים או אצבעות בתחום stereomicroscope, להמשיך בהסרת שאר הפרחים עד כמעט כל סם ניתן להציג את עיניות. הסר peduncles בבירור בצומת של הגזע המרכזי.
- חותכים את איפקס לירות תפרחת יחד עם 1-2 ס מ גזע ראשי מצמחים תודרנית שהצוקים עם סכין גילוח. . תחזיק את החלק הבזליים של הגזע המרכזי, להסיר איברים פרח בוגרים רבים ככל האפשר מן הגזע הראשי על-ידי לנתח החוצה peduncles עם מלקחיים תכשיטים.
- ניתוח איפקס צמח לירות
- כדי להציג סאמס צמח עגבניה או סויה, שווייץ פסיגי הזרע, עלים ושורשים מצמחים.
- להחזיק את hypocotyls של הצמחים תחת stereomicroscope ומנתחים נוספת החוצה primordia העלה המכסה סאמס וגטטיבי באמצעות מלקחיים תכשיטים.
4. מכתים
- כדי להמחיש ישירות בתאים סאמס, להשתמש propidium הטרי יודיד (PI) פתרון כתם קירות התא. לפזר אבקת PI במים סטרילי, יונים, הופך פתרון מכתימים 1 מ"ל PI-הריכוז של 1 מ"ג/מ"ל ולאחסן את הפתרון PI בצינור microcentrifuge מכוסה ברדיד אלומיניום.
- פיפטה 50 פתרון PI µL בסביבה נקייה ולירות הפטרי ריקים ומטבל כל גזור איפקס לתוך צבע עבור 2 דק שטיפה השיא מוכתם לירות פעמיים במים סטרילי, יונים. במהלך תהליך צביעת, לטבול התפרחת כל סם או סם וגטטיבי בתוך תמיסת PI על מנת להשיג צביעה אחידה.
5. אוסף תמונה
הערה: עבור שיטה זו, כל סאמס הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף ועם 20 x עדשת המים טובלים. כפי שמתואר אחרים פרוטוקולים9,12,13,15, זה גם ריאלי התמונה סאמס באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. בנוסף, ההדמיה חיה יכולה להיות מושגת באמצעות סוגים שונים של מיקרוסקופ קונפוקלי, עם הפעולות הכנת המדגם. במחקר זה, השלבים הדמיה מתוארים בפירוט כדוגמה.
- פירס חור במרכז צלחת הדמיה באמצעות מלקחיים, תקע את איפקס לירות מוכתם זקוף המדיום.
- למלא את הצלחת הדמיה במים סטרילי, יונים לחלוטין לטבול את הדגימה. הצגת מ סטריאו מיקרוסקופ, פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר בועות אוויר לכוד סביב meristem. לאחר מכן, להתאים את הזווית של הגזע ב אגר כדי לוודא כי סאם היא גלויה לגמרי מן ישירות מעל.
- במקום המנה הדמיה על השלב מדגם של מיקרוסקופ קונפוקלי. להוריד את עדשת המים טובלים ולגדל השלב הדגימה במיקרוסקופ לתת הקצה של מח ש עדשה לתוך המים.
- פתח את התוכנה מיקרוסקופ קונפוקלי ואתר את סאם, brightfield ב עיניות. להעביר את הזכות דוגמת סם מתחת לעדשה המטרה באמצעות התאמת הבקר XY, ואז להתמקד סאם של עיניות דרך בזהירות התאמת הבקר Z.
- להפעיל את פונקציית רכישת התוכנה מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלה של חומרים), התחל לחיות במצב להציג את הדגימה של מסך המחשב, ולהגדיר כל הפרמטרים הלייזר סריקה הניסוי.
- בעת כוונון הפרמטרים, להשתמש פונקציה מציינת טווח כדי להגדיר אם האות רווי או לא.
- באופן אופציונלי, להחיל הפונקציה חוזר רענן כל הגדרות הפרמטר מקובץ ה-קונפוקלי שנבחרו.
הערה: הציע הדמיה פרמטרים: לייזר קו (עירור): 515 ננומטר או 561 ננומטר; פליטה 570-650 ננומטר; חריר: 1 יחידה אוורירי (AU); רווח: 600-750, במצב סריקה: מסגרת; מסגרת גודל: 512 X 512 או 1024 X 1024; מהירות סריקה: 7 למקס; סריקה כיוון: כיוונים; חישוב ממוצע רגיל מספר: 2-4; ממוצע של השיטה: מתכוון; עומק סיביות: 16 סיביות; מרווח זמן סריקה: 0.5-1 מיקרומטר. יתרה מזאת, למטב כל הפרמטרים הללו מבוסס על האופי של צמחים שונים ודוגמאות על הצרכים הספציפיים הדמיה.
6. עיבוד תמונה
- להמחשת אופטי אורתוגונלית וכן רוחבי בסעיף נופים, להשתמש בתוכנה מסחרית זהה לרכישת הדמיה. פתח את קובץ קונאפוקלית המקורי, לחץ על תפריט הפעלה אורתוגרפית, בחר האורתופדיה. ואז בחר גם מיקום x, מיקום y ו- z מקמו בתמונה ולשמור את התמונות של קובצי tiff.
- לחילופין, בחר פונקציית מרחק תלת-ממד כדי להגדיר את המרחק הפיזי בין שתי נקודות אשר נבחרו מתוך הערימה של תמונות קונפוקלי.
- לחלופין, השתמש פיג ' י/תמונה J, חבילת עיבוד התמונה משאבים להמחיש התצוגות סעיף אורתוגונלית ו רוחבי.
- פתח את קובץ קונאפוקלית המקורי עם פיג'י, לחץ על תפריט ' תמונה ', בחר את סטאקס ולאחר מכן בחר תצוגות אורתוגונלית.
- בחר XY yz ימאהה, מטוסים XZ במצב האמצעי ושמור תמונות בתבנית Tiff.
- להמחשת שקוף הקרנה 3D, להשתמש בתוכנה זהה.
- פתח את קובץ קונאפוקלית המקורי, לחץ על תפריט 3Dובחר שקוף ליצירת תצוגה הקרנה תלת-ממד.
- לחלופין לחץ על תפריט תלת-ממד, בחרו מראהולאחר מכן בחר שקיפות כדי להתאים שלושה פרמטרים של ההקרנה כולל סף, השיפוע המרבי עבור השקיפות של 3D תמונה.
- לחץ על תפריט תלת-ממד, בחרו מראה, ובחרו אור כדי לכוונן את הבהירות של התמונה התלת-ממד.
- ייצוא תמונות המוקרנת ולשמור אותם של קובצי Tiff.
- להמחשת העוצמה המקסימלית 3D השלכה, לפתוח את הקבצים קונאפוקלית עם התוכנה באותו ולחץ על התפריט תלת-ממד.
- בחר תפריט התלת-ממד ובחרו המרבי.
- לחלופין, השתמש J פיג ' י/תמונה להמחיש הקרנה תלת-ממדי העוצמה המקסימלית.
- פתח את הקובץ המקורי קונאפוקלית עם פיג'י, לחץ על תפריט ' תמונה ' ובחר ערימות.
- בחר פרוייקט 3D ושמור תמונות בתבנית Tiff.
- להמחשת העומק קידוד תצוגה של תמונות 3D, להשתמש בתוכנה זהה.
- לחץ על תפריט התלת-ממד ובחרו המראה.
- בחר מיוחדת ובחר עומק קידוד.
- לחלופין, השתמש J פיג ' י/תמונה להמחיש את עומק קידוד תצוגה.
- לפתוח את קבצי וידאו, לחץ על תפריט ' תמונה ', בחרו Hyperstack.
- בחר קוד הטמפורלית-צבע ולשמור תמונות בתבנית Tiff.
הערה: עומק קידוד z-המחסנית גם יכולה להיות מושגת באמצעות התוסף מחסנית קוד Z לפיג'י.
- להמחשת 3D סיבוב התצוגה המוצגת (1 סרט , סרט 2), להשתמש בתוכנה זהה (ראה את הטבלה של חומרים).
- לפתוח את קבצי וידאו, לחץ על תפריט 3Dובחר סדרות.
- בחר רינדור סדרתובחר באחת מהאפשרויות 4 כולל תסתובב x, תסתובב y, ההתחלה והסיוםשל הרשימה מיקום.
- שמור את הסדרה רינדור קבצי AVI.
- לחלופין, השתמש J פיג ' י/תמונה להמחיש את התצוגה סיבוב תלת-ממד.
- פתח את קובץ קונאפוקלית המקורי עם פיג'י, לחץ על תפריט ' תמונה 'ובחר ערימות.
- בחר פרוייקט 3D ולשמור כקובץ וידאו בפורמט AVI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את היעילות של פרוטוקול שלנו וכדי לחקור את המורפולוגיה של meristems של מינים שונים, ערכנו הניסויים קונאפוקלית הדמיה בשידור חי את meristem תפרחת של תודרנית ו את צמח meristems מ עגבניות וגם סויה. זה מחקר, תודרנית אקוטיפ לנדסברג זקופה, עגבניות לדבורי מיקרו-טום, סויה לדבורי וויליאמס 82 שימשו כדוגמאות.
ראה בחלק אורתוגונלית דרך האמצע של תודרנית סם, זה ברור כי PI היה מסוגל כתם על הקירות אופקי של כמעט כל התאים-השכבות תא (איור 1 א'). ממקטע רשת אחד דרך הקורפוס של התפרחת סאם, התאים מהמטוס XY מוצגות גם בבירור עם תמונה (איור 1B). בתצוגה ' הקרנה תלת-ממד ', meristem תפרחת טפסים כיפה כמו מבנה והוא מוקף primordia פרח המתפתח, כאשר התאים גם מוכתמים ועם תמונה (איור 1 ג-ד) (1 סרטים).
ראיתי מהמקטע אורתוגונלית דרך האמצע של העגבניות סם, זה ברור כי PI הצליח כתם על הקירות אופקי מתאי-השכבות תא, למרות החוקר אות מן האזור פנים עמוק הוא נמוך במקצת. ממקטע רוחבי אחד דרך לרבדים עמוקים של סאם וגטטיבי, גם בבירור עם תמונה תאים מן המטוסים XY, והוא הגבול שנוצר בין meristem וגטטיבי לבין primordia עלה גם הדמיה (איור 2B). תצוגת תלת-ממד הפרוייקט יכול לספק עוד מבט מקיף על הצורה של הארגון meristem וגטטיבי של עגבניות (איור 2 C-D) (סרט 2).
בתצוגת אורתוגונלית דרך האמצע של פולי סויה. סאם, אנו יכולים לראות meristem וגטטיבי את הכיפה, כמו, הנגזרת שלה חדש עלה primordia (איור 3 א). בתצוגה ' הקרנה תלת-ממד ', הן meristem וגטטיבי של סויה ו- meristem וגטטיבי של עגבניות טופס הכיפה כמו מבנה, עם זאת, צורת meristem וגטטיבי סויה שונה של meristem את העגבניות, הארגון ואת דפוסי primordia עלה סביב סאמס שני אלה הם ברורים (איור 3B-C).
איור 1: חיים הדמיה וניתוח התפרחת סאם של תודרנית. A ו- B. אופטי אורתוגונלית (Orth) ונוף רוחבי (שקף) סעיף של מטוס האמצעי של סאם אותו, PI (propidium יודיד) כתם (סגול). C. a הקרנה תלת-ממד של אותו סם, הכתם PI (אפור). ד. עומק צבע קידוד התחזית תלת-ממד, עם כחול המציין את שכבת פני השטח העליונים ואת אדום המייצג את השכבה העמוקה ביותר. קירות התא היו מוכתמים PI. גודל ברים: 20 מיקרומטר (A, B); 50 מיקרומטר (C, D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Live הדמיה וניתוח של סאם וגטטיבי של עגבנייה. A ו- B. אופטי אורתוגונלית (Orth) ואת רוחבי (שקף) בסעיף נופים של מטוס האמצעי של צבעוניות זהה. ג. הקרנה תלת-ממד של צבעוניות זהה. ד. עומק צבע קידוד התחזית תלת-ממד, עם כחול המציין את שכבת פני השטח העליונים ואת אדום המייצג את השכבה העמוקה ביותר. קירות התא היו מוכתמים PI. גודל ברים: 20 מיקרומטר (A, B); 50 מיקרומטר (C, D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Live הדמיה וניתוח של סאם וגטטיבי של סויה. א. אופטי אורתוגונלית (Orth) במקטע מבט של המישור האמצעי של סאם וגטטיבי. B. הקרנה תלת-ממד של צבעוניות זהה. ג. עומק צבע קידוד התחזית תלת-ממד, עם כחול המציין את שכבת פני השטח העליונים ואת אדום המייצג את השכבה העמוקה ביותר. קירות התא היו מוכתמים PI. גודל ברים: 20 מיקרומטר (א); 50 מיקרומטר (ב, ג). חץ: ראשית עלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
וידאו 1: סיבוב תלת-ממד של meristem תפרחת תודרנית באיור1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
סרטון 2: סיבוב תלת-ממד של meristem וגטטיבי עגבניות באיור2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים שיטה הדמיה פשוטה שניתן להחיל בחקר לירות apical meristems מצמחים שונים עם מינימאליים, פתיחת שדרה חדש ללמוד ברגולציה meristem בשלבים הן וגטטיבי לבין הרבייה בצמחים מודל ו יבולים. בניגוד SEM ופעולות היסטולוגית מוכתמים, פרוטוקול זה יכול לעזור לחשוף בתצוגת משטח והן מבנים הסלולר פנימי של סאמס, ללא צורך קיבוע הדגימה עתירי עבודה ו/או רקמות חלוקתה צעדים. פרוטוקול זה הוא גם תואם לשיטת הדימות הוקמה עבור הכתבים פלורסצנטיות מבוסס ב סאמס, שעשוי להיות מתן החלטה סלולרית טובה אשר מאפשר לנו לקבל תצוגה תלת-ממדית של דפוסי ביטוי של גנים מרכזיים וחלבונים ב סאם16 ,17,18,19. בנוסף, תמונת המשויכת עיבוד ההליך המתואר כאן יוכלו לעזור במידה רבה חוקרים לנתח ולהשוות סאמס ממינים שונים ב- 3D, קידום לימודי ביולוגיה אבולוציונית התפתחותית וגם המחקר החקלאי.
ישנם כמה צעדים קריטיים פרוטוקול פשוט זה. ראשית, לטעום ניתוח והכנה. צמח סאם מוסתרת בדרך כלל על ידי פיתוח primordia ואיברים צעירים בקצה לירות, זה לא יכול לדימות ישירות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. לשיקוף של סאם וגטטיבי, זה הכרחי להסיר את כל העלים ואת primordia עלים בוגרים לכסות על גבי סאם באמצעות מלקחיים תכשיטים יפים. לשיקוף התפרחת, סאם, יש צורך בזהירות להסיר את כל הפרחים צעיר לחשוף את סאם, גם באמצעות מלקחיים תכשיטים יפים.
שנית, ההכתמה תא בשידור חי באמצעות הפתרון PI. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים פאי טרייה פתרון (1 מ"ג/מ"ל) כתם קירות התא ישירות לדמיין חיים סאמס, אשר הוא מהיר, יעיל וקל לביצוע. למרות הפתרון PI שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות, פתרון הטרי מספקת בדרך כלל את הטוב ביותר מכתימה את. תוצאות meristems apical לירות. למרות PI בעיקר לא עובר את הממברנה של התאים החיים זה כתמים תאים שלמים עם המתאר הסלולר ברור, זה יכול בקלות לחדור את התאים פגום/מת, כתם חזק האטום לבין מערכות אחרות ממברנה פנימית באותם אזורים פגומים, פוטנציאל להשפיע על איכות התמונות קונפוקלי. לכן, זה יהיה חיוני כדי למנוע נזקים פיזיים בעת הכנת סאם דגימות ההכתמה ולחיות הדמיה. מצד שני, PI-ריכוז גבוה מראה השפעה רעילה לשתול תאים, לפיכך, FM4-64 יכול לשמש כתחליף PI כתם על החיים סאם תאים9. עם זאת, FM4-64 תוויות קרום פלזמה, אשר ייתכן פוטנציאל שאפשר לקחת לתא הפנימי דרך אנדוציטוזה, שהופך אותו מאתגר כדי להכתים את הדגימות עם רזולוציה גבוהה הסלולר.
שלישית, הדמיה רכישה. 1). פתחים מספרית גבוהה (NA), עדשת המים טובלים הוא קריטי עבור ההדמיה בשידור חי של סאמס. מים יש אינדקס השבירה גבוה יותר מאשר אוויר ומסייעת NA גבוהה של העדשה המטרה לאסוף אות פוטונים מפוזרים בין שכבות תאים עמוק סאמס. 2). ההגדרות של עוצמת הלייזר (וואט או לכל משטח) יכול להיות משתנה מאוד בין מיקרוסקופ קונפוקלי שונים. עוצמת הלייזר גבוה עשויה לאפשר אוסף אות טוב יותר אבל שמוביל נזקי יותר / photobleaching על הדגימות. ישנם הפשרות בין רזולוציה, הלבנת והדמיה של הזמן. באופן כללי, בחירת גודל מסגרת גדולה יותר מוביל XY רזולוציה טובה יותר אבל יותר הדמיה זמן, ולאחר בחירת מרווח קטן סריקה שמוביל Z רזולוציה טובה יותר אבל גם יותר זמן הדמיה. הזמן עוד הדמיה גורם פוטנציאלי נזקי יותר / photobleaching
בשיטה זו, לפעמים זה לא יהיה קל לבחון פרטים הסלולר בשכבות רקמות עמוק יותר, ככל הנראה בגלל המגבלה של זיהוי קונאפוקלית ולא יעיל PI ההכתמה ברקמות פנימיות. מבוסס על החוויות שלנו, הגברת הריכוז של PI פתרון ו/או הזמן מכתימים יכול לעזור לנקות כתם יותר טוב. לחלופין, ניתן לבצע את השינויים שביצעת ההליך מכתימים. לדוגמה, שיטת יודיד (mPS-PI) ששונה פסאודו-שיף propidium עובד טוב בשביל לרקמות קבוע20. יש עדיין צורך למצוא צבעי אלטרנטיבית עם יותר להכתים על הרקמות החיים בעתיד. בנוסף, זה גם מעניין לבחון אם השיטה המתוארת כאן ניתן בדרך כלל ליישם את חקר סאמס של כל הצמחים פורחים אחרים, בהתחשב בעובדה שיש כמה מיני צמחים מיוחדים תוכן סלולרי או קיר התא שונה קומפוזיציות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מתקן הדמיה מרכז פרדו Bindley Bioscience לגישה הלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי סורק, לתמיכה טכנית, ומסכים המחברים מעריך את העזרה של אנדי Schaber במתקן הדמיה Bindley פרדו. פעילות זו מומן על ידי אוניברסיטת פרדו כחלק AgSEED פרשת דרכים מימון לתמוך החקלאות ופיתוח הכפר של אינדיאנה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
References
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751 (1953).
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331 (2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156 (2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773 (2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043 (2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23 (2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
