Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Isolering af Papillar og Rekulære fibroblaster fra menneskehud ved fluorescens-aktiveret celle sortering

Published: May 7, 2019 doi: 10.3791/59372
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Skin, Endothelium Research Division, Department of Dermatology, Medical University of Vienna
* These authors contributed equally

Summary

Dette manuskript beskriver en FACS-baseret protokol til isolering af papillar og rekulære fibroblaster fra menneskehud. Det omgår in vitro-kultur, som var uundgåelig med den almindeligt anvendte isolation protokol via eksplantat kulturer. De udstammede fibroblast undersæt er funktionelt adskilte og udviser differentialgenekspression og lokalisering inden for dermis.

Abstract

Fibroblaster er en meget heterogen cellepopulation impliceret i patogenesen af mange menneskelige sygdomme. I human hud dermis, fibroblaster har traditionelt blevet tilskrevet den overfladiske papillar eller lavere rekulære dermis i henhold til deres histologiske lokalisering. I muse dermis stammer papillar og rekulære fibroblaster fra to forskellige lineager med divergerende funktioner vedrørende fysiologiske og patologiske processer og en særskilt celleoverflade markør udtryks profil, som de kan skelnes fra.

Det er vigtigt, at evidens fra de forskellige kulturer fra overfladiske og nedre hudlag antyder, at der findes mindst to funktionelt adskilte Dermal fibroblaster-slægter i menneskelige huddermis. I modsætning til muse skind er celleoverflade markører, der muliggør forskelsbehandling af forskellige fibroblast undersæt, dog endnu ikke fastlagt for menneskers hud. Vi har udviklet en ny protokol til isolering af humane papillar og rekulære fibroblast populationer via fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) ved hjælp af de to celleoverflade markører fibroblast Activation protein (FAP) og Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. Denne metode gør det muligt at isolere rene fibroblast undersæt uden in vitro-manipulation, hvilket har vist sig at påvirke genekspression, hvilket muliggør nøjagtig funktionel analyse af humane dermal fibroblast undersæt med hensyn til vævs homøostase eller sygdom Patologi.

Introduction

Som den vigtigste cellulære komponent af bindevæv, fibroblaster er primært ansvarlig for aflejring af kollagen og elastiske fibre, der i sidste ende danner den ekstracellulære matrix1, og dermed deres rolle i vævs homøostase, regenerering og sygdom har været undervurderet i lang tid. Men, fibroblaster er for nylig kommet under rampelyset af forskere, ikke kun fordi de repræsenterer en fremtrædende cellulære kilde til induceret pluripotente stamceller2 , men også på grund af deres høje plasticitet og konsekvenser i patogenesen af en lang række sygdomme såsom organ fibrose3,4,5 eller kræft6,7.

Menneskehud består af et flerlags epitel, epidermis og det underliggende bindevæv, dermis, som kan være histologisk opdelt i det øvre papillar og den nedre rekulære dermis og hovedsageligt består af fibroblaster og ekstracellulær matrix8 og hypodermis. Ifølge deres placering i vævet, er Dermal fibroblaster stort set blevet klassificeret i papillar og rekulære fibroblaster1.

Det er vigtigt, at de seneste data indikerer, at disse dermal fibroblast subpopulationer ikke kun er histologisk identificerbar, men også at deres funktion er betydeligt forskelligartet. I muse skind opstår papillar og rekulære fibroblaster fra to forskellige slægter under embryogenese9. Flere linjer af beviser tyder på, at de to slægter udøve forskellige roller ikke kun i væv homøostase, hårfollikel morfogenese, sårreparation og fibrose7,9,10, men de også reagere på forskellige signaler fra neoplastiske epidermal stamceller11, hvilket tyder på divergerende roller i kræft patogenesen. Bekvemt, begge slægter udtrykke et særskilt sæt af gensidigt eksklusive cellulære markører i voksne mus hud, hvilket gør det muligt isolering af ren dermal fibroblast populationer og efterfølgende omfattende analyse af deres specifikke funktioner in vitro9 , 11. der er

Tilsvarende, mindst to særskilte fibroblast undersæt med distinkte morfologi og funktioner, herunder divergerende sprednings rater, væv remodeling kapaciteter12,13, samt evnen til at støtte væksten af epidermal stamceller in vitro, er blevet beskrevet for menneskehud dermis14,15. De fleste af de publicerede undersøgelser af humane Dermal fibroblaster er imidlertid blevet gennemført ved hjælp af blandede fibroblast populationer isoleret fra eksplorations kulturer fra hudhuden, da specifikke celleoverflade markeringssæt muliggør isolering af rent humant papillar eller rekulære fibroblast subpopulationer i analogi med muse dermis var endnu ikke fastlagt.

Vi har for nylig demonstreret, at human hud papillar og rekulære fibroblaster er karakteriseret ved specifikke celleoverflade markører, der muliggør isolering af de respektive subpopulationer via fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS)16: FAP + CD90- fibroblaster repræsenterer papillær fibroblaster primært placeret i den øvre dermis, præsenterer højere sprednings hastigheder, en særskilt gen signatur, men ingen adipogent potentiale. FAP+CD90+ og FAP-CD90+ fibroblaster hører til den rekulære afstamning af de nedre dermal rum, som er mindre proliferativ, men let undergår adipogenesis-et kendetegn for rekulære fibroblaster. Denne metode gør det muligt at studere disse særskilte fibroblast delpopulationer ikke kun med hensyn til deres specifikke funktioner under fysiologiske forhold, men også i forbindelse med patogenesen af kutane sygdomme, herunder hudkræft.

Men da fibroblaster ændrer deres celleoverflade markør udtryk i todimensionel in vitro-kultur16,17,19, er anvendelsen af vores protokol begrænset til isolering af primære fibroblaster fra humane dermis og tillader ikke identifikation af papillar eller rekulære fibroblaster i populationer med blandet cellekultur. Det er vigtigt, at selvom udtrykket af celleoverflade markører ændrer sig in vitro, har vi påvist, at de fibroblast-delmængder, der er isoleret i henhold til den nedenfor beskrevne protokol, bevarer deres specifikke funktionalitet, når de dyrkes16, hvilket gør in vitro-undersøgelser af delmængde specifikke egenskaber under fysiologiske eller patologiske tilstande.

Afslutningsvis har vi udviklet en protokol til isolering af særskilte fibroblast undersæt via FACS, der for første gang tillader isolering af rene fibroblast populationer fra menneskehud dermis i en naiv tilstand.

Protocol

Human hud blev indhentet fra kaukasiske mænd og kvinder i alderen 26 til 61 år (solbeskyttet hud; abdominale korrektioner, bryst reduktioner). Skriftlig informeret patientsamtykke blev indhentet før vævs indsamling i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen, og med godkendelse fra Wien Medical University institutionelle Review Board.

Bemærk: Vi leverer en protokol til isolering af funktionelt adskilte fibroblast subpopulationer enten fra fuld tykkelse dermis (Se afsnit 1) eller efter skæring menneskelige hud dermis i sine forskellige lag (springe afsnit 1 og direkte henvise til afsnit 2) .

1. forberedelse af fuld tykkelse dermis

  1. Anbring en 10 cm x 10 cm menneskehud (f. eks. fra abdominale korrektioner eller bryst sænkninger) med epidermis vendt nedad på tykt filtrerpapir.
  2. Hold epidermis stramt på kanterne med pincet og skrabe det subkutane fedtlag af med en skalpel. Skær derefter vævet i 5 mm brede strimler, før du sætter dem i en Petri skål.
    Bemærk: Dette letter penetration af Dispase II (kaldes dissocierende enzym fremover, se punkt 3) og anvendes, hvis epidermis skal adskilles fra hele dermis. For dette springe afsnit 2 og direkte henvise til afsnit 3. For at undgå kontaminering skal vævet være sterilt efter kirurgisk fjernelse eller rengøres grundigt med ethanol-eller jod-opløsning. Hvis overhovedet, ethanol behandling af hudens overflade forårsager kun mindre celledød. Arbejde under sterile forhold i en vævskultur flow hætte.

2. skæring af menneskehud dermis i Papillar og Rekulære lag med en Dermatome

  1. Anbring en 10 cm x 10 cm huddel (f. eks. fra abdominale korrektioner eller bryst sænkninger) på tykt filtrerpapir, hvor epidermis vender opad. Hold huden stramt på kanterne med pincet.
  2. Skær huden med en elektrisk dermatom, justeret til en klippe tykkelse/dybde på 300 μm, ved at skubbe hovedet af dermatomet væk fra sig selv, med klingen er i en 90 ° vinkel i forhold til overfladen af huden.
  3. Tag det første lag bestående af epidermis og papillar dermis (300 μm tyk, "dermal lag 1", figur 1 og figur 2) og læg det i en Petri skål. Fortsæt straks til punkt 3 eller tilsæt 1x PBS for at holde vævet fra udtørring.
    Bemærk: For at undgå kontaminering skal vævet være sterilt efter kirurgisk fjernelse eller rengøres grundigt med ethanol-eller jod-opløsning. Arbejde under sterile forhold i en vævskultur flow hætte.
    Forsigtig: Håndter dermatomet forsigtigt, da knivene er meget skarpe.
  4. Gentag trin 2,2 for at justere dermatomet til en klippe tykkelse på 700 μm og skær resten af dermis. Den øvre skive, der er defineret som den øvre rekulære dermis ("dermal lag 2", fig. 2), anbringes i en separat Petri skål. Fortsæt straks til punkt 4 eller tilsæt 1x PBS for at holde vævet væk fra udtørring.
  5. Det subkutane fedtlag skrabes væk med en skalpel fra det resterende nedre rekulære dermal lag (> 1000 μm), og det kasseres. Den nedre rekulære dermis ("dermal lag 3", figur 2) opsamles i en anden Petri skål. Fortsæt straks til punkt 4 eller tilsæt 1x PBS for at holde vævet væk fra udtørring.
    Bemærk: Alternativt, i stedet for at skraber fedtet af med en skalpel, skal du fjerne fedtlaget med en saks. Det kan bidrage til at sætte den rekulære dermis på is før skrabning fedtet væk.

3. separation af epidermis og dermis

  1. Forbered en 3 U/mL dissocierende enzym (dvs., Dispase II) opløsning i steril 1x PBS. Anbring de 5 mm hudstriber (fra punkt 1) eller epidermis/papillar dermis (fra trin 2,2), hvor epidermis vender opad i en 10 cm Petri skål med 10 mL dissocierende enzym opløsning på 3 e/mL. Petri skålen inkubeeres ved 37 °C i 1 time.
    1. Protokollen kan være sat på pause her. Der inkuieres epidermis/papillar dermis i proteasehæmmere i køleskabet ved 4 °C i stedet. Efter behov opbevares de andre lag (dermal lag 1, 2 og 3) natten nedsænket i 1x PBS i 50 mL rør ved 4 °C.
      Forsigtig: Arbejd forsigtigt med protease, det kan irritere hud og øjne ved kontakt.
  2. Efter inkubationen overføres epidermis/papillar dermis til det tørre låg på Petri skålen, og epidermis adskilles fra den øvre dermis (dermal lag 1) med to pincet, der hver holder kanten af enten epidermis eller dermis.

4. Enzymatisk nedbrydning af dermal væv

  1. Der hakkekød hvert dermal lag (dermal lag 1, 2 og 3) separat med saks/skalpel så grundigt som muligt; jo mindre stykkerne er, jo bedre er vævs fordøjelsen.
    Bemærk: Den sejhed af dermis kan variere afhængigt af den kropsdel, det stammer fra (f. eks, abdominal eller øvre arm hud).
  2. Fordøjelses blandingen tilberedes ved at kombinere 1,25 mg/ml kollagenase i, 0,5 mg/ml kollagenase II, 0,5 mg/ml kollagenase IV og 0,1 mg/ml hyaluronidase i dulbeccos modificerede eagle's medium (DMEM) med L-glutamin (Se tabel over materialer), 10% føtale kalveserum ( (FCS) og 1% penicillin/streptomycin (P/S).
    Forsigtig: Arbejd forsigtigt med kollagenaser, da disse kan irritere hud og øjne ved kontakt.
  3. Hver af de hakkede væv tilsættes 10 mL tilberedt fordøjelsesmix til et 50 mL rør og inkuperes i et 37 °C varmt vandbad i 1 time under permanent agitation. Under fordøjelsen vendes rørene flere gange.
    Bemærk: Man bør overveje at justere fordøjelsen volumen i henhold til størrelsen af den hakkede hud stykke. Må ikke overbelaste 10 mL fordøjelse mix med for meget væv ellers celle udbyttet vil være minimal. Mindre end en tredjedel af vævet i det totale volumen anbefales (1:2 w/v).

5. klargøring af enkelt celle suspension og erythrocyt lysis

  1. Stop enzymatisk vævs fordøjelse ved at tilsætte 10 mL fibroblast medium (DMEM med L-glutamin, 10% FCS og 1% P/S) til det fordøjet væv. Arbejd på is herfra.
  2. Hæld indholdet af hvert rør gennem en regelmæssig steril rustfri te si og indsamle cellesuspension i en ren Petri skål. Vask sien med medium og mash ufordøjet væv stykker med kanten af en sprøjte-stempel.
  3. Efterfølgende pipettes opsamlet cellesuspension gennem en 70 μm celle filter i et 50 mL rør. Skyl celle sien med medium og saml flow igennem i det samme rør.
  4. Centrifuge rørene ved 500 x g ved 4 °c i 10 min. Fjern og kassér supernatanten og vask celle pellet med 5 ml fibroblast medium. Gentag Centrifugerings trinnet.
  5. Supernatanten fjernes og kasseres, og pellet opslæmtes i 1 mL egenlavet ACK erythrocyt lysis-buffer (0,15 M NH4CL, 10 mm KHCO3, 0,1 mm na2EDTA; pH 7.2 \ u 20127.4). Efterlad celler i lysis buffer i ca. 1 min ved omgivelsestemperatur (20 \ u201222 °C).
  6. Stop lysis ved at tilsætte 9 mL 1x PBS med 10% FCS og centrifuge rørene igen ved 500 x g ved 4 °c i 5 min. kassér supernatanten.
    Forsigtig: Inkubationstid ved erytrocyt lysis kan justeres, hvis lysis synes ufuldstændig (rød pellet). Men, ikke efterlade cellerne i erythrocyt lysis buffer for længe for at undgå lysis af fibroblaster og immunceller.

6. blokering og farvning af fibroblaster til FACS

  1. Der tilberedes 5 μL Human FC-receptor blokerende opløsning i 100 μL 1x PBS med 10% FCS og resuspension af celler i 100 μL af human FC-blokker. Inkube på is i 10 min.
  2. Design et FACS farvnings panel til at plette humane Dermal fibroblaster. Bland anti-humant FAP APC (1:20), anti-Human CD90 AF700 (1:30), anti-Human E-cadherin PE (1:20), anti-Human CD31 FITC (1:30), anti-Human CD45 Pacific Blue (1:20), anti-humane ITGA6 PE (1:20), anti-menneskelige CD235ab Pacific Blue (1:1000) og anti-menneskelige CD106 Pacific blå (1:100) i 1x PBS med 10% FCS.
  3. Efter FC receptor blokering, spin celler ned ved 500 x g ved 4 °c i 3 min. Fjern og kassér supernatanten og gensuspender cellerne i 100 μl af antistof mikset. Cellerne inkueres i mørke ved 4 °C i 20 min.
    1. Før farvning fjernes 20 μL af en prøve med et højt celle nummer for ufarvede og enkelt plettede FACS-kontrolelementer.
  4. De farvede celler og FACS-kontrollerne vaskes to gange med 500 μL 1x PBS med 10% FCS og centrifugeres ved 500 x g ved 4 °c i 3 min. I mellemtiden tilsættes 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til 1x PBS med 10% FCS at lave en endelig koncentration på 1 μg/mL.
  5. Fjern og kassér supernatant, gensuspender cellerne i 200 μL DAPI-opløsning og Filtrer hver cellesuspension gennem en 70 μm celle filter i et 5 mL FACS-rør.
    Bemærk: Hvis FACS skal udføres med forsinkelse, skal du tilføje DAPI og filtrere kort før optagelsen.

7. gating strategi for humane dermal fibroblast delmængde isolation og FACS

  1. Optage flow cytometri kontrol, indstille korrekte spændings indstillinger og udføre den passende kompensation. Gate for enkeltceller og levende (DAPI-), Pacific Blue, PE og FITC negative celler (CD45-, CD31-, CD235ab-, CD106-, ITGA6- og E-cadherin-) for at få tre fibroblast populationer: FAP+ CD90-, FAP+CD90+ og FAP-CD90+ celler. Se figur 3.
  2. Sorter tre fibroblast delpopulationer i separate 1,5 mL-mikrocentrifuge glas, der er fyldt enten med 350 μL lysis-buffer til RNA-isolation eller fyldt med 350 μL fibroblast vækstmedium (Se tabellen over materialer) for cellekultur. Inverter rørene umiddelbart efter sorteringen og enten sætte lysis buffer rør i flydende kvælstof til snap frysning eller sætte medium rør på is.
    Forsigtig: Forbered lysis buffer med 0,1% b-mercaptoethanol i røg hætte og undgå indånding.

8. dyrkning af fibroblaster og Adipogenesis assay

  1. Efter FACS, spin celler ned på 500 x g i 3 min ved 4 °c og Plate lige cellenumre (5000 \ u201210, 000 celler/brønd) i fibroblast vækstmedium (Se tabellen af materialer) i 48-Well cellekultur retter. Lad cellerne vokse, indtil de når 70% confluency.
  2. Tilsæt 5 μg/mL insulin, 5 μM troglitazone, 0,5 mM 3-isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) og 1 μM dexametason til fibroblast vækstmedium til at forberede adipocyt differentierings medium.
  3. Udskift medium af de dyrkede celler med adipocyt differentierings medium og lad cellerne differentiere i 14 dage. Ombytnings medium efter dag 2 med reduceret adipogenesis medium indeholdende 5 μg/mL insulin og 5 μM troglitazone. Genopfyld medium hver 3Rd eller 4th dag.
  4. Fastgør celler med 4% PFA i 20 min ved omgivelsestemperatur (20 \ u201222 °C) ved differentierings dag 14. Vask brønde med 60% isopropanol og lad det fordampe fuldstændigt. Pletter celler med 5 mM Oil Red O (filter før brug) i 20 min. vask farvede celler fire gange med destilleret vand. Fortsæt med at udføre mikroskopi.
    Forsigtig: PFA er giftigt og skadeligt. Håndtag forsigtigt.
    Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. Faste celler kan opbevares i 1x PBS ved 4 °C, indtil Oil Red O farvningen udføres. Dæk skålen med paraffin folie før opbevaring for at undgå fordampning.
  5. Billed celler nedsænket i vand med et inverteret mikroskop ved 10x forstørrelse med overført lys.

Representative Results

En oversigt over de vigtigste trin til behandling af hudvæv for at opnå en enkelt cellesuspension er vist i figur 1, der viser hudens hudkløe (figur 1a), forskellige dermal lag (figur 1b), fjernelse af det subkutane fedt (figur1c) og separationen af epidermis og papillar dermis (figur 1d) samt de forskellige trin i den manuelle og enzymatiske vævs afkobling (figur 1E, F). En ordning af de tre dermal lag er angivet i figur 2.

Figur 3 viser gating-strategien for et flowcytometrisk farvnings panel til analyse af forskellige fibroblast undersæt fra menneskehud. Yderligere celleoverflade markører, der ikke udtrykkes på fibroblaster, tillader udelukkelse af forskellige andre celler, der er til stede i huden, såsom immunceller, Epidermal celler, mesenchymale stamceller (MSCs), røde blodlegemer eller endotelceller for at opnå maksimal renhed i de isolerede populationer. Det er ikke afgørende at bruge det identiske FACS panel, der anvendes i figur 2 til identifikation af disse fibroblast subpopulationer, men dette er vores anbefaling. Man kan bruge antistoffer mærket med forskellige fluorescerende farvestoffer eller ændre kombinationen af udelukkelses markører.

Bemærk, at denne protokol gør det muligt at identificere tre fibroblast populationer i menneskehud, som præsenterer forskellige intradermal lokalisering, genekspressions profiler og også funktioner (figur 4). FAP+CD90- er beriget i papillar dermis mens FAP+CD90+ og FAP-CD90+ er mere rigelige i den rekulære dermis (figur 4a). Alle tre underpopulationer udviser den typiske fibroblast morfologi ved sortering i cellekultur (figur 4b). Interessant, de adskiller sig med hensyn til deres evne til at differentiere i adipocytter, som er et kendetegn for rekulære fibroblaster. Ved at kombinere disse resultater med genekspressions profilering via polymerasekæde reaktion i realtid (RT-PCR)16 (figur 4c), der viser, at FAP+CD90- celler udtrykker høje niveauer af markører, der almindeligvis tilskrives papillær fibroblaster såsom CD26, NTN og PDPN, mens CD90+ celler udtrykker de kendte rekulære MARKØRER såsom CD36, ACTA2 og PPARγ ved høje niveauer, konkluderer vi, at FAP+CD90- celler tilhører papillar og CD90+ celler tilhører den rekulære slægt.

Figure 1
Figur 1: isolering af dermal enkelt cellesuspension fra intakt menneskehud. (A) huden er skåret med en elektrisk dermatom til papillar og rekulær dermis. (B) papillar dermis med tilstødende epidermis er 300 μm tyk (top), mens øvre rekulære dermis er 700 μm tyk (bund). C) det subkutane fedtlag er skrabet af lavere rekulære dermis med en skalpel. (D) efter inkubation af papillar dermis i dissociations enzym opløsning ved 37 °c i 1 time kan epidermis let fjernes med pincet. E) forskellige dermal lag er hakket med saks og overført til et enzym nedbrydnings mix bestående af kollagenase i, II og IV og hyaluronidase. (F) efter 1 h afkobling ved 37 °c stoppes vævs fordøjelsen, og suspensionen hældes gennem en testrainer for at fjerne ufordøjet hud stykker. (G) cellesuspension filtreres en gang mere gennem en 70 μm celle filter og centrifugeres ved 500 x G ved 4 °c i 10 min. (H) efter centrifugering vaskes celle pellet med 1X PBS med 10% FCS og er klar til FACS STAINING. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: skæring af menneskehud dermis i papillar og rekulære lag med en dermatome. Skema, der viser de tre dermal lag opnået ved udskæring af huden i fuld tykkelse i papillar dermis (inklusive epidermis; 0 \ u2012300 μm; dermal lag 1), øvre rekulære (300 \ u20121, 000 μm; dermal lag 2) og lavere rekulær dermis (> 1000 μm; dermal lag 3) med en dermatom. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: FACS gating strategi for humane dermal fibroblast subpopulationer. (A\u2012E) Først er cellerne indhegnet på enkelte (B) og levedygtige (dapi-) celler (C). Immunceller (CD45+), mesenkymale stamceller (CD106+), røde blodlegemer (CD235ab+) er undtaget (C) og Stillehavs blå negative celler er gated yderligere på E-cadherin (ECAD) og ITGA6 dobbelt negative celler (PE kanal, D ). E-cadherin og ITGA6 er markører, der udtrykkes på Epidermal celler. Næste, CD31-FITC positive celler (Endothelial og lymfeceller) er udelukket (D) resulterer i tre fibroblast populationer, der udtrykker enten en eller begge af de to celleoverflade fibroblast MARKØRER FAP og CD90: FAP+CD90-, FAP+CD90+ og FAP-CD90+ (E). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: FAP+CD90-, FAP+CD90+ og FAP-CD90+ fibroblaster er forskellige med hensyn til dermal lokalisering, genekspression og funktionalitet. (A) repræsentative FACS-parceller af gated fibroblaster isoleret fra papillar, øvre rekulær og lavere rekulært dermis. Gating-strategi er forklaret i figur 3. FAP+CD90- fibroblaster er beriget i papillar dermis (19,2%) sammenlignet med lavere rekulære dermis (0,83%). FAP+CD90+ celler kan findes i hele dermis, men deres højeste overflod er i den øvre rekulære dermis (40,7%). FAP-CD90+ er beriget i den nedre rekulære dermis (64,4%). (B) Bemærk, at alle tre sorterede underpopulationer udviser typisk fibroblast morfologi på kultur i 7 dage (venstre). Interessant, de opfører sig forskelligt i en adipogenesis assay. Efter 14 dage i kultur, FAP+CD90- ikke differentiere i adipocytter mens FAP+CD90+ og FAP-CD90+ let gennemgår adipogenesis (højre; Olie rød O pletter lipid-bærende celler rød). Skala stænger = 1.000 μm. (C) direkte sorteret FAP+CD90- fibroblaster udtrykke de PAPILLÆR fibroblast markører CD26, NTN1 og pdpn, mens FAP-CD90+ celler Express CD36, ACTA2 og pparγ, der vides at være udtrykt af den rekulære slægt. * p ≤ 0,05; p ≤ 0,0005 sammenlignet med FAP+/Cd90- celler; # p ≤ 0,05; # # # p ≤ 0,0005 sammenlignet med FAP-/CD90+ celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I denne artikel beskriver vi en metode til isolering af papillar og rekulære fibroblaster fra menneskehud. CD90 er blevet almindeligt anvendt til identifikation eller isolering af Dermal fibroblaster18,20,21. Men, vi har vist, at udover CD90 + fibroblaster, humane dermis også havne en CD90- fibroblast befolkning udtrykker FAP16, som er blevet etableret som en markør for aktiverede fibroblaster og kræft-associerede fibroblaster ( Cafs)22,23,24,25. Vigtigere, vi var i stand til at identificere tre fibroblast subpopulationer FAP+CD90-, FAP+CD90+ og FAP-CD90+ i huden biopsier fra alle raske menneskelige donorer. Vi konkluderer derfor, at FAP ikke kun er en markør for aktiverede fibroblaster eller CAFs, men også normale vævs fibroblaster.

Af Bemærk, at FAP-CD90- cellens population tilbage efter anvendelse af den ovenfor beskrevne udelukkelses-og gating-strategi ikke indeholder fibroblaster, da disse celler ikke formere sig i fibroblast dyrkningsmedium in vitro, men de fleste sandsynligvis en blandet cellepopulation, herunder lymfatiske celler og pericytter blandt andre16.

Celle udbyttet opnået ved brug af den ovenfor beskrevne protokol kan variere afhængigt af den kropsdel, som hudstykket, der anvendes til isoleringen, stammer fra. Dermis fra forskellige kropsdele adskiller sig med hensyn til dens struktur, tykkelse samt kollagen sammensætning. For eksempel, hud fra ansigtet eller overarmen er meget tyndere end huden fra maven eller låret, som også ofte viser et tykkere subkutant fedtlag. Desuden, alder og køn af huden donorer kan yderligere ikke kun påvirke vævs afkobling effektivitet, men kan også påvirke fordelingen af de tre fibroblast subpopulationer (figur 3), når isoleret fra fuld tykkelse hud. Dette skyldes det faktum, at papillar dermis krymper, og at det totale fibroblast tal falder med alderen11,26,27,28. Desuden vil celle pellet fra papillar dermis sandsynligvis være større end fra rekulær dermis, da den øvre dermis er mere tæt befolket af fibroblaster end den rekulære dermis. Desuden er den lavere dermis også hårdere og tætpakket med kollagen, hvilket gør det sværere at adskille vævet og frigive fibroblaster. Af Bemærk, celle pellet kan fremstå meget rødt, hvilket er grunden til, at røde blodlegemer lysis anbefales.

Ud over identifikationen af tre delpopulationer i intakt menneskehud, viser vi også, at i hudhuden, hver fibroblast delmængde er beriget enten i papillar eller rekulær dermis16. Præcis skæring af huden med dermatomet er afgørende for at opnå en ordentlig berigelse af hver delpopulation fra forskellige dermal lag. Da papillar dermis er meget tynd, bør den dermaterede skive, der repræsenterer den, ikke overskride en tykkelse på 300 μm. øvre rekulære og lavere rekulær fibroblaster både repræsentere den rekulale afstamning og vise lignende funktioner og gensigna turer, man kunne derfor også overveje ikke at adskille dem.

Vigtigere er, alle tre fibroblaster populationer findes i hele dermis og er ikke udelukkende til stede i et lag, hvilket er grunden til, at der er fremvist kulturer fra papillar eller rekulær dermis, der resulterer i blandede fibroblast kulturer. FAP+CD90- papillar fibroblast er dog mest rigelige i papillar dermis og følger en gradient fra overfladiske til lavere dermal lag, mens FAP+CD90+ og FAP-CD90+ fibroblaster følger en inverse gradient fra den nedre til den overfladiske lag16. Desuden er størstedelen af CD90+ fibroblaster af papillar dermis næsten udelukkende fundet omkring blodkarrene og udtrykker den perivaskulære fibroblast markør CD14629, og dermed sandsynligvis udviser forskellige funktioner end den resterende CD146- rekulære fibroblaster16. CD146 kunne bruges som en yderligere markør i den gating strategi for at udelukke denne population.

Efter dissociationen af dermal lag, er de isolerede celler plettet med en specielt designet antistof cocktail indeholder forskellige antistoffer til udelukkelse af immunceller, endotel og lymfeceller, Epidermal celler, erythrocytter og MSCS til opnå rene fibroblast populationer. Bemærk, at vælge en markør til identifikation og udelukkelse af MSCS kan være tricky på grund af det høje antal publicerede MSC markører30,31. Da MSCs Express CD90 ligesom fibroblaster, kan yderligere MSC markører som CD105 eller CD271 vise sig nyttige for deres identifikation. MSC'er repræsenterer imidlertid kun en meget lav procentdel af alle dermal celler, og da CD90+ fibroblaster udviser typiske morfologiske træk ved fibroblaster ved sortering, kan man hævde, at udelukkelsen af MSC'er ved brug af særskilte celleoverflade markører kan være unødvendige.

Vigtigere, vi analyserede FAP og CD90 genekspression efter at have holdt cellerne i kultur for 7-14 dage efter sortering (data ikke vist) og fandt, at udtrykket af begge markører er upreguleret i den respektive sorteres enkelt positiv (FAP+CD90- eller FAP-CD90+) celler16. Vi understreger derfor, at de ovenfor beskrevne markeringssæt og protokol tillader isolering af primære fibroblast undersæt direkte fra vævet, men ikke fra tidligere dyrkede blandede fibroblast populationer.

Ikke desto mindre viser vi, at funktionaliteten af alle tre delpopulationer bevares i cellekulturen, uanset ændringen af celleoverflade markør udtrykket, da fibroblaster, der sorteres som FAP+CD90- papillar fibroblaster, ikke erhverve evnen til at gennemgå adipogenesis efter en længere periode med kultur, mens fibroblaster sorteret som FAP+CD90+ eller FAP-CD90+ rekulære fibroblaster opretholde deres evne til at differentiere i adipocytter 16 . Vigtigt, vi fandt også, at papillar og rekulære-specifikke gener stadig udtrykkes i højere grad i FAP+CD90- og CD90+ hhv.

Afslutningsvis har vi etableret en protokol til isolering af funktionelt adskilte fibroblast undersæt via FACS, der for første gang tillader isolering og analyse af rene og naive fibroblast subpopulationer fra menneskehud dermis. Denne metode etablerer en større avancement til den almindeligt anvendte fibroblast kultur isolations protokol fra øvre og nedre dermis som (i) en modsat rettet gradient af papillar og rekulære fibroblaster findes fra hudens overflade til hypodermis og (II) fibroblaster ændrer deres gensignatur in vitro.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender taknemmeligt assistance i FACS-sortering af Bärbel Reininger og Wolfgang Bauer. Dette arbejde blev støttet af tilskud til B. M. L. fra Østrigs videnskabs fond (FWF: V 525-B28) og sammenslutningen af europæiske biokemiske selskaber (FEBS, opfølgnings forskningsfonden). S. F. er modtager af et DOC-stipendium fra det østrigske Videnskabsakademi (OeAW). Vi anerkender taknemmeligt fremragende støtte fra de centrale faciliteter på Medical University of Vienna. Vi takker Bernhard Gesslbauer, Christine Radtke og Martin Vierhapper for at levere humant hudmateriale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material:
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
Ammonium chloride Sigma 9718 used for selfmade ACK Lysis Buffer
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium Gibco 17001-074 used for fibroblast growth medium
β-Mercaptoethanol Scharlau ME0095 CAUTION
C100 Supplement Thermo Scientific 12556015 used for fibroblast growth medium
Collagenase I Thermo Scientific 17100017 CAUTION
Collagenase II Gibco 17101015 CAUTION
Collagenase IV Sigma C5138 CAUTION
DAPI Thermo Scientific 62248
Dexamethasone Sigma D8893
Dispase II Roche 4942078001 CAUTION
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX Gibco 31966-021
EDTA disodium salt Sigma E1644 used for selfmade ACK Lysis Buffer
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco 10500-064
Hyaluronidase Sigma H4272 CAUTION
Insulin Sigma I5500
Isopropanol Merck 1,096,341,011
OilRed O Sigma O-0625
Paraformaldehyd Sigma 158127 CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care.
Penicillin/Streptomycin Gibco 15070-063
Phosphate-buffered saline without Ca2+ & Mg2+ Lonza BE17-512F
Potassium bicarbonate Sigma 237205 used for selfmade ACK Lysis Buffer
PureLink RNA MicroKit Invitrogen 12183-016
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR Invitrogen 11752
Taqman 2x Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4324018 CAUTION Skin and eye irritant.
Troglitazone Sigma T2573
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry Antibodies:
anti human CD31-AF488 Biolegend 303109 Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075
anti human CD45-Pacific blue Biolegend 304029 Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123
anit human CD49f/ITGA6-PE Serotec MCA699PE Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833
anti human CD90/Thy-1-AF700 Biolegend 328120 Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302
anti human CD106-AF421 BD 744309 Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x
anti human CD235ab-Pacific blue Biolegend 306611 Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153
anti-human E-cadherin-PE Biolegend 147304 Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040
anti human FAP-APC R&D FAB3715A Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x
Human TruStain FcX Biolegend 422302 Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x
Name Company Catalog Number Comments
Equipment:
1.4 mL micronic tubes Thermo Scientific 4140
1.5 mL screw cap micro tube Sarstedt 72,692,405
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap Falcon 352235
48-well cell culture cluster Costar 3548
50 mL polypropylene canonical tubes Falcon 352070
70 µm cell strainer nylon Falcon 352350
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome VWR AESCGA670
Aesculap Dermatome blades VWR AESCGB228R
MicroAmp Fast Optical 96well Applied Biosystems 4346906
Primary cell culture dish Corning 353803
Scalpel blades F.S.T 10022-00
Tea strainer x x
Name Company Catalog Number Comments
Fibroblast growth medium:
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10% FCS and 1% P/S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of Cell Science. 117 (Pt 5), 667-675 (2004).
  2. Lowry, W. E., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2883-2888 (2008).
  3. Kisseleva, T. The origin of fibrogenic myofibroblasts in fibrotic liver. Hepatology. 65 (3), 1039-1043 (2017).
  4. LeBleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nature Medicine. 19 (8), 1047-1053 (2013).
  5. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulation Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  6. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
  7. Rinkevich, Y., et al. Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), (2015).
  8. Abhishek, S., Palamadai Krishnan, S. Epidermal Differentiation Complex: A Review on Its Epigenetic Regulation and Potential Drug Targets. Cell Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
  9. Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
  10. Mastrogiannaki, M., et al. beta-Catenin Stabilization in Skin Fibroblasts Causes Fibrotic Lesions by Preventing Adipocyte Differentiation of the Reticular Dermis. Journal of Investigative Dermatology. 136 (6), 1130-1142 (2016).
  11. Lichtenberger, B. M., Mastrogiannaki, M., Watt, F. M. Epidermal beta-catenin activation remodels the dermis via paracrine signalling to distinct fibroblast lineages. Nature Communications. 7, 10537 (2016).
  12. Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204 (4392), 526-527 (1979).
  13. Hiraoka, C., et al. Two clonal types of human skin fibroblasts with different potentials for proliferation and tissue remodeling ability. Journal of Dermatological Science. 82 (2), 84-94 (2016).
  14. Higgins, C. A., et al. Multifaceted role of hair follicle dermal cells in bioengineered skins. Br Journal of Dermatology. 176 (5), 1259-1269 (2017).
  15. Korosec, A., Lichtenberger, B. M. Ch. 12. Skin Tissue Models. Marques, A. P., Pirraco, R. P., Cerqueira, M., Reis, R. L. , Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-810545-0.00012-7 279-301 (2017).
  16. Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. , (2018).
  17. Higgins, C. A., Chen, J. C., Cerise, J. E., Jahoda, C. A., Christiano, A. M. Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19679-19688 (2013).
  18. Philippeos, C., et al. Spatial and Single-Cell Transcriptional Profiling Identifies Functionally Distinct Human Dermal Fibroblast Subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
  19. Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
  20. Jiang, D., Rinkevich, Y. Defining Skin Fibroblastic Cell Types Beyond CD90. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 133 (2018).
  21. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International Review of Cell and Molecular Biology. , 161-214 (2009).
  22. Huang, Y., et al. Isolation of Fibroblast-Activation Protein-Specific Cancer-Associated Fibroblasts. BioMed Research International. 2017, 4825108 (2017).
  23. Jiang, G. M., et al. The application of the fibroblast activation protein alpha-targeted immunotherapy strategy. Oncotarget. 7 (22), 33472-33482 (2016).
  24. Pure, E., Blomberg, R. Pro-tumorigenic roles of fibroblast activation protein in cancer: back to the basics. Oncogene. 37 (32), 4343-4357 (2018).
  25. Hamson, E. J., Keane, F. M., Tholen, S., Schilling, O., Gorrell, M. D. Understanding fibroblast activation protein (FAP): substrates, activities, expression and targeting for cancer therapy. PROTEOMICS – Clinical Applications. 8 (5-6), 454-463 (2014).
  26. Gilchrest, B. A. A review of skin ageing and its medical therapy. Br Journal of Dermatology. 135 (6), 867-875 (1996).
  27. Gilchrest, B. A., Krutmann, J. Skin Aging. , Springer. 198 (2006).
  28. Makrantonaki, E., Zouboulis, C. C. Molecular mechanisms of skin aging: state of the art. Annals of the New York Academy of Sciences. 1119, 40-50 (2007).
  29. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  30. Kundrotas, G. Surface markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts. Acta Medica Lituanica. 19 (2), 75-79 (2012).
  31. Lupatov, A. Y., Vdovin, A. S., Vakhrushev, I. V., Poltavtseva, R. A., Yarygin, K. N. Comparative analysis of the expression of surface markers on fibroblasts and fibroblast-like cells isolated from different human tissues. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 537-543 (2015).

Tags

Genetik FACS celleoverflade markører fibroblast heterogenitet fibroblast lineages menneskehud papillar og rekulære fibroblaster
Isolering af Papillar og Rekulære fibroblaster fra menneskehud ved fluorescens-aktiveret celle sortering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Korosec, A., Frech, S.,… More

Korosec, A., Frech, S., Lichtenberger, B. M. Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (147), e59372, doi:10.3791/59372 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter