Summary
Detta manuskript beskriver ett FACS-baserat protokoll för isolering av papillär och retikulär fibroblaster från mänsklig hud. Det kringgår in vitro-kultur som var oundvikligt med det allmänt använda isolerings protokollet via explant kulturer. Den härrör fibroblast under grupper är funktionellt distinkta och Visa differential gen uttryck och lokalisering inom dermis.
Abstract
Fibroblaster är en mycket heterogen cell population inblandad i patogenesen av många sjukdomar hos människor. I mänsklig hud dermis, fibroblaster traditionellt har tillskrivits den ytliga papillär eller lägre retikulära dermis enligt deras histologiska lokalisering. I mus dermis, papillär och retikulära fibroblaster kommer från två olika linjer med skiljaktiga funktioner om fysiologiska och patologiska processer och en distinkt cell yta markör uttrycks profil som de kan särskiljas.
Viktigt, bevis från explant kulturer från ytliga och lägre hudlager tyder på att minst två funktionellt distinkta dermal fibroblaster linjer finns i mänsklig hud dermis också. Men, till skillnad från mus hud, cell ytan markörer möjliggör diskriminering av olika fibroblast under grupper har ännu inte fastställts för mänsklig hud. Vi utvecklade ett nytt protokoll för isolering av humant papillär och retikulära fibroblast populationer via Fluorescence-aktiverad cell sortering (FACS) med hjälp av de två cellytan markörer fibroblast aktiverings protein (FAP) och thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. Denna metod möjliggör isolering av rena fibroblastunder grupper utan in vitro-manipulation, vilket visades påverka gen uttrycket, vilket möjliggör noggrann funktionell analys av humana fibroblastunder grupper i fråga om vävnad homeostas eller sjukdom Patologi.
Introduction
Som den viktigaste cellulära komponenten i bindväv, fibroblaster är primärt ansvariga för deposition av kollagen och elastiska fibrer som i ändan bildar den extracellulära matrix1, och därmed deras roll i vävnad homeostas, förnyelse och sjukdomen har unders katt ATS under lång tid. Men, fibroblaster har nyligen kommit under strålkastarljuset av forskare, inte bara för att de utgör en framstående cellulär källa för inducerade pluripotenta stamceller2 utan också på grund av deras höga plasticitet och implikation i patogenesen av ett stort antal sjukdomar som organ fibros3,4,5 eller cancer6,7.
Mänsklig hud består av en flerskiktade epitel, epidermis, och dess underliggande bindväv, dermis, som kan histologiskt delas in i övre papillär och den nedre retikulära dermis och består huvudsakligen av fibroblaster och extracellulär matrix8 och hypodermis. Enligt deras placering i vävnaden, dermal fibroblaster har grovt klassificerats i papillär och retikulära fibroblaster1.
Viktigt, nyare data tyder på att dessa dermal fibroblast subpopulationer är inte bara histologiskt urskiljbara, men också att deras funktion är betydligt varierande. I mus hud, papillär och retikulära fibroblaster uppstår från två distinkta linjer under embryogenes9. Flera rader av bevis tyder på att de två linjerna utövar olika roller inte bara i vävnad homeostas, hårfollikeln morfogenes, sår reparation och fibros7,9,10, men de svarar också på olika signaler från neoplastiska epidermal stamceller11, vilket tyder på skiljaktiga roller i cancer patogenes. Bekvämt, båda linjer uttrycka en distinkt uppsättning ömsesidigt exklusiva cellulära markörer i vuxen mus hud, vilket möjliggör isolering av ren dermal fibroblast populationer och efterföljande omfattande analys av deras specifika funktioner in vitro9 , med 11.
På motsvarande sätt, minst två distinkta fibroblastunder grupper med distinkt morfologi och funktioner, inklusive divergerande spridnings tal, vävnads ombyggnad kapacitet12,13, samt förmågan att stödja tillväxten av Epidermal stamceller in vitro, har beskrivits för mänsklig hud dermis14,15. Emellertid, de flesta av de publicerade studier om mänskliga dermal fibroblaster har utförts med hjälp av blandade fibroblast populationer isolerade från explant kulturer från dermatomed hud, eftersom specifika cell ytan markör uppsättningar möjliggör isolering av ren humant papillär eller retikulära fibroblast subpopulationer i analogi med mus dermis ännu inte fastställts.
Vi har nyligen visat, att mänsklig hud papillär och retikulära fibroblaster kännetecknas av specifika cellytan markörer som möjliggör isolering av respektive subpopulationer via Fluorescence-aktiverad cell sortering (FACS)16: FAP + CD90- fibroblaster representerar papillär fibroblaster främst belägna i övre dermis, presentera högre spridnings frekvenser, en distinkt gen signatur men ingen adipogena potential. FAP+CD90+ och FAP-CD90+ fibroblaster tillhör retikulära härstamning av lägre dermal fack, som är mindre proliferativa men lätt genomgå adipogenesis-ett kännetecken för retikulära fibroblaster. Denna metod gör det möjligt att i stor utsträckning studera dessa distinkta fibroblast subpopulationer inte bara när det gäller deras specifika funktioner under fysiologiska förhållanden, men också i samband med patogenesen av kutana sjukdomar inklusive hud cancer.
Eftersom fibroblaster förändrar sin cell yta markör uttryck i tvådimensionell in vitro-kultur16,17,19, är tillämpningen av vårt protokoll begränsad till isolering av primära fibroblaster från humant dermis och tillåter inte identifiering av papillär eller retikulära fibroblaster i blandad cell kultur populationer. Viktigt, även om uttrycket av cellytan markörer förändringar in vitro-, har vi visat att fibroblast under grupper isolerade enligt protokollet som beskrivs nedan behåller sin specifika funktionalitet när odlas16, vilket möjliggör in vitro-studier av delmängd-specifika egenskaper under fysiologiska eller sjukdoms tillstånd.
Sammanfattnings vis har vi utvecklat ett protokoll för isolering av distinkta fibroblast under grupper via FACS som för första gången tillåter isolering av ren fibroblast populationer från mänsklig hud dermis i ett naivt tillstånd.
Protocol
Mänsklig hud erhölls från kaukasiska män och kvinnor i åldrarna 26 till 61 år (solskyddad hud; buk korrigering, bröst förminskning). Skriftligt informerat patient medgivande erhölls före vävnads uppbörden i enlighet med Helsingfors deklarationen och med godkännande från Wiens medicinska universitets institutions gransknings nämnd.
Anmärkning: Vi tillhandahåller ett protokoll för isolering av funktionellt distinkta fibroblast subpopulationer antingen från full tjocklek dermis (se avsnitt 1) eller efter snittning mänsklig hud dermis i sina olika lager (hoppa över avsnitt 1 och direkt hänvisa till avsnitt 2) .
1. beredning av full tjocklek dermis
- Placera en 10 cm x 10 cm mänsklig hudbit (t. ex. från buken korrigeringar eller bröst reduktioner) med epidermis nedåt på tjockt filter papper.
- Håll epidermis tätt på kanterna med pincett och skrapa bort den subkutana fett skiktet med en skalpell. Sedan skära vävnaden i 5 mm breda remsor innan du sätter dem i en petriskål.
Anmärkning: Detta underlättar penetration av Dispase II (kallat dissocierande enzym hädanefter, se avsnitt 3) och används om epidermis måste separeras från hela dermis. För denna hoppa över avsnitt 2 och direkt hänvisa till avsnitt 3. För att undvika kontaminering, hålla vävnaden steril efter kirurgiskt avlägsnande eller rengöra den grundligt med etanol eller jodlösning. Om alls, etanol behandling av hudytan orsakar endast mindre celldöd. Arbeta under sterila förhållanden i en mjuk vävnads kultur flöde huva.
2. snittning av mänsklig hud dermis i papillär och retikulära lager med en Dermatome
- Placera en 10 cm x 10 cm hudbit (t. ex. från buken korrigeringar eller bröst reduktioner) på tjockt filter papper, med epidermis vänd uppåt. Håll huden tätt på kanterna med pincett.
- Skiva huden med en elektrisk Dermatom, justeras till en styckning tjocklek/djup av 300 μm, genom att skjuta huvudet av Dermatom bort från sig själv, med bladet är i en 90 ° vinkel i förhållande till ytan av huden.
- Ta det första skiktet bestående av epidermis och papillär dermis (300 μm tjockt, "dermal Layer 1", figur 1 och figur 2) och Lägg den i en petriskål. Fortsätt omedelbart till avsnitt 3 eller tillsätt 1x PBS för att hålla vävnaden från uttorkning.
Anmärkning: För att undvika kontaminering, hålla vävnaden steril efter kirurgiskt avlägsnande eller rengöra den grundligt med etanol eller jodlösning. Arbeta under sterila förhållanden i en mjuk vävnads kultur flöde huva.
Var försiktig: Hantera Dermatom noggrant eftersom bladen är mycket vassa. - Upprepa steg 2,2 justera Dermatom till en skär tjock lek på 700 μm och skiva resterande dermis. Placera den övre skiva som definieras som den övre retikulära dermis ("dermal Layer 2", figur 2) i en separat petriskål. Fortsätt omedelbart till avsnitt 4 eller tillsätt 1x PBS för att hålla vävnaden från uttorkning.
- Skrapa bort det subkutana fett skiktet med en skalpell från det resterande nedre retikulära hud lagret (> 1000 μm) och kassera det. Samla in den nedre retikulära dermis ("dermal Layer 3", figur 2) i en annan petriskål. Fortsätt omedelbart till avsnitt 4 eller tillsätt 1x PBS för att hålla vävnaden från uttorkning.
Anmärkning: Alternativt, i stället för skrapning fettet bort med en skalpell, ta bort fett skiktet med sax. Det kan hjälpa att sätta retikulära dermis på isen innan skrapning fettet bort.
3. separation av epidermis och dermis
-
Förbered ett 3 U/mL dissocierande enzym (dvs. Dispase II) lösning i steril 1x PBS. Placera 5 mm hud ränder (från avsnitt 1), eller epidermis/papillär dermis (från steg 2,2), med epidermis uppåt i en 10 cm petriskål med 10 mL 3 U/mL dissocierande enzym lösning. Inkubera petriskål vid 37 ° c i 1 h.
- Protokollet kan vara pausat här. Inkubera epidermis/papillär dermis i proteas i kyl skåpet vid 4 ° c över natten istället. Vid behov lagra de andra lagren (dermal lager 1, 2 och 3) över natten nedsänkt i 1x PBS i 50 mL rör vid 4 ° c.
Var försiktig: Arbeta varsamt med proteas, det kan irritera hud och ögon vid kontakt.
- Protokollet kan vara pausat här. Inkubera epidermis/papillär dermis i proteas i kyl skåpet vid 4 ° c över natten istället. Vid behov lagra de andra lagren (dermal lager 1, 2 och 3) över natten nedsänkt i 1x PBS i 50 mL rör vid 4 ° c.
- Efter inkubation, överföra epidermis/papillär dermis till det torra locket på petriskål och separera epidermis från övre dermis (dermal lager 1) med två pincett vardera hålla kanten av antingen epidermis eller dermis.
4. enzymatisk nedbrytning av dermal vävnad
- Finhacka varje dermal skikt (dermal lager 1, 2 och 3) separat med sax/skalpell så grundligt som möjligt; de mindre bitarna, desto bättre vävnads nedbrytning.
Anmärkning: Den seghet av dermis kan variera beroende på kropps del det härstammar från (t. ex., buken eller överarmen huden). - Förbered mat smältningen blandningen genom att kombinera 1,25 mg/ml kollagenas i, 0,5 mg/ml kollagenas II, 0,5 mg/ml kollagenas IV och 0,1 mg/ml hyaluronidas i Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) med L-glutamin (se tabell över material), 10% Foster kalv serum ( FCS) och 1% penicillin/streptomycin (P/S).
Var försiktig: Arbeta varsamt med Kollagenaser eftersom dessa kan irritera hud och ögon vid kontakt. - Lägg varje hackad vävnad med 10 mL av den beredda mat smältningen blandningen i en 50 mL tub och inkubera i en 37 ° c varmt vatten bad för 1 h under ständig agitation. Under mat smältningen Invertera rören flera gånger.
Anmärkning: Man bör överväga att justera mat smältningen volymen beroende på storleken på den malda huden pjäs. Överbelasta inte 10 mL mat smältning blanda med för mycket vävnad annars cell avkastningen kommer att vara minimal. Mindre än en tredjedel av vävnaden inom den totala volymen rekommenderas (1:2 w/v).
5. beredning av encellig SUS pension och Erytrocytlys
- Stoppa enzymatisk vävnads nedbrytning genom att tillsätta 10 mL fibroblast medium (DMEM med L-glutamin, 10% FCS och 1% P/S) till smält vävnad. Arbeta med is härifrån.
- Häll innehållet i varje rör genom en vanlig steril rost fritt te sil och samla cell SUS pension i en ren petriskål. Tvätta sil med medium och mosa osmält vävnad bitar med kanten av en spruta-kolv.
- Efteråt, Pipettera in cell SUS pension genom en 70 μm cell sil i en 50 mL tub. Skölj cellens sil med medium och samla in flödet genom i samma tub.
- Centrifugera rören vid 500 x g vid 4 ° c i 10 min. avlägsna och Kassera supernatanten och tvätta cellpelleten med 5 ml fibroblastmedium. Upprepa centrifugeringssteget.
- Avlägsna och Kassera supernatanten och omsuspendera pelleten i 1 mL egentillverkad ACK erytrocytlysbuffert (0,15 M NH4cl, 10 mm KHCO3, 0,1 mm na2EDTA; pH 7.2 \ u 20127.4). Lämna cellerna i lyseringsbuffert i ca 1 min vid omgivnings temperatur (20 \ u201222 ° c).
- Sluta Lys genom att tillsätta 9 mL 1x PBS med 10% FCS och centrifugera rören igen vid 500 x g vid 4 ° c i 5 min. Kassera supernatanten.
Var försiktig: Inkubations tiden för erytrocytlys kan justeras om lysen verkar ofullständig (röd pellet). Emellertid, lämna inte cellerna i erytrocyt lysis buffert för länge för att undvika Lys av fibroblaster och immun celler.
6. blockering och färgning fibroblaster för FACS
- Förbered 5 μL humant FC-receptorblockerande lösning i 100 μL 1x PBS med 10% FCS och resuspendera celler i 100 μL av humant FC-blockerare. Inkubera på is i 10 min.
- Designa en FACS färgning panel för att färga mänskliga dermal fibroblaster. Blanda anti-mänsklig FAP APC (1:20), anti-human CD90 AF700 (1:30), anti-mänskliga E-cadherin PE (1:20), anti-human CD31 FITC (1:30), anti-mänskliga CD45 Pacific Blue (1:20), anti-mänskliga ITGA6 PE (1:20), anti-mänskliga CD235ab Pacific Blue (1:1000) och anti-mänskliga CD106 Pacific blått (1:100) i 1x PBS med 10% FCS.
-
Efter FC-receptorblockeringen, snurra cellerna ner vid 500 x g vid 4 ° c i 3 min. ta bort och Kassera supernatanten och omsuspendera cellerna i 100 μl av anti kropps blandningen. Inkubera cellerna i mörkret vid 4 ° c i 20 min.
- Före färgning, ta bort 20 μL av ett prov med ett högt cell nummer för obefläckade och enstaka fläckar FACS kontroller.
- Tvätta de färgade cellerna och FACS kontroller två gånger med 500 μL 1x PBS med 10% FCS och centrifugera vid 500 x g vid 4 ° c i 3 min. Under tiden, tillsätt 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) till 1x PBS med 10% FCS att göra en slutlig koncentration på 1 μg/mL.
- Avlägsna och Kassera supernatanten, suspendera cellerna i 200 μL DAPI-lösning och filtrera varje cell SUS pension genom en 70 μm cellsil till ett 5 mL FACS-rör.
Anmärkning: Om FACS kommer att utföras med fördröjning, Lägg DAPI och filter strax före inspelningen.
7. gating strategi för mänsklig dermal fibroblast delmängd isolering och FACS
- Registrera flödescytometri kontroller, ställa in rätt spännings inställningar och utföra lämplig kompensation. Gate för enstaka celler och levande (DAPI-), Pacific Blue, PE och FITC negativa celler (CD45-, CD31-, CD235ab-, CD106-, ITGA6- och E-cadherin-) för att få tre fibroblast populationer: FAP+ CD90-, FAP+CD90+ och FAP-CD90+ celler. Se figur 3.
- Sortera tre fibroblast subpopulationer i separata 1,5 mL skruv kork mikrocentrifug rör fyllda antingen med 350 μL lyseringsbuffert för RNA isolering eller fylld med 350 μL fibroblast odlings substrat (se material tabell) för cell odling. Invertera rören omedelbart efter sortering och antingen sätta lysbuffertrör i flytande kväve för Snap frysning eller sätta medel stora rör på is.
Var försiktig: Förbered lyseringsbuffert med 0,1% b-merkaptoetanol i draghuv och Undvik inandning.
8. odling av fibroblaster och Adipogenesis assay
- Efter FACS, spin celler ner på 500 x g för 3 min vid 4 ° c och Plate lika cell nummer (5000 \ u201210, 000 celler/brunn) i fibroblast odlings substrat (se material tabell) i 48-well cell kultur rätter. Låt cellerna växa tills de når 70% confluency.
- Tillsätt 5 μg/ml insulin, 5 μm troglitazone, 0,5 mm 3-isobutyl-1-metylxantin (ibmx) och 1 μM dexametason för att fibroblast tillväxt medium för att förbereda fett celler differentiering medium.
- Ersätt medium för odlade celler med fett celler differentiering medium och låt cellerna differentiera i 14 dagar. Exchange medium efter dag 2 med reducerat adipogenesis medium innehåll ande 5 μg/mL insulin och 5 μM troglitazone. Fyll på medium var tredje eller fjärde dag.
- Fix celler med 4% PFA för 20 min vid omgivnings temperatur (20 \ u201222 ° c) vid differentiering dag 14. Tvätta brunnar med 60% isopropanol och låt det avdunsta helt. Fläcken celler med 5 mM Oil Red O (filter före användning) i 20 min. tvätta färgade celler fyra gånger med destillerat vatten. Fortsätt att utföra mikroskopi.
Var försiktig: PFA är giftigt och skadligt. Hantera försiktigt.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. Fasta celler kan lagras i 1x PBS vid 4 ° c tills Oil Red O färgning utförs. Täck skålen med paraffin film före förvaring för att undvika avdunstning. - Bild celler nedsänkt i vatten med ett inverterat Mikroskop på 10x förstoring med genomlysning.
Representative Results
En översikt över de viktigaste stegen för bearbetning av hud vävnad för att få en enda cell SUS Pension visas i figur 1, visar dermatoming i huden (figur 1a), olika hud lagren (figur 1b), avlägsnande av subkutant fett skikt (figur 1c) och separation av epidermis och papillär dermis (figur 1d), liksom de olika stegen i manualen och enzymatisk vävnad dissociation (figur 1e, F). Ett schema över de tre hud lagren finns i figur 2.
Figur 3 visar en gating strategi för en flödescytometri infärgnings panel för analys av olika fibroblast under grupper från mänsklig hud. Ytterligare cellytan markörer som inte uttrycks på fibroblaster tillåter uteslutning av olika andra celler som finns i huden såsom immun celler, epidermal celler, mesenkymala stamceller (MSCs), röda blod kroppar eller endotelceller att uppnå maximal renhet i de isolerade populationerna. Det är inte viktigt att använda den identiska FACS panel som används i figur 2 för att identifiera dessa fibroblast subpopulationer, men detta är vår rekommendation. Man kan använda anti kroppar märkta med olika fluorescerande färg ämnen eller ändra kombinationen av uteslutnings markörer.
Detta protokoll gör det möjligt att identifiera tre fibroblastpopulationer i mänsklig hud som förekommer med olika intradermalt lokalisering, gen uttrycks profiler och även funktioner (figur 4). FAP+CD90- är berikad i PAPILLÄR dermis medan FAP+CD90+ och FAP-CD90+ är mer riklig i retikulära dermis (figur 4a). Alla tre subpopulationer uppvisar den typiska fibroblastmorfologin vid sortering i cell odling (figur 4b). Intressant, de skiljer sig om deras förmåga att differentiera till adipocyter som är ett kännetecken för retikulära fibroblaster. Kombinera dessa resultat med profilering av gen uttryck via polymeras-kedjereaktion i real tid (RT-PCR)16 (figur 4c), som visar att FAP+CD90- cells uttrycker höga nivåer av markörer som vanligen tillskrivs papillär fibroblaster såsom CD26, NTN och PDPN medan CD90+ celler uttrycker kända retikulära MARKÖRER såsom CD36, ACTA2 och PPARγ på höga nivåer, drar vi satsen att FAP+CD90- celler tillhör papillär och CD90+ celler tillhör den retikulära härstamning.
Figur 1: isolering av dermal encellig SUS pension från intakt mänsklig hud. (A) huden skivas med en elektrisk Dermatom i papillär och retikulära dermis. (B) papillär dermis med angränsande epidermis är 300 μm tjockt (topp) medan övre retikulära dermis är 700 μm tjock (botten). Csubkutant fett skiktet skrapas av lägre retikulära dermis med en skalpell. Defter inkubation av papillär dermis i dissociationsenzymer vid 37 ° c i 1 h, kan epidermis lätt avlägsnas med pincett. Eolika hudlager mals med en sax och överförs till en enzym uppslutnings blandning bestående av kollagenas i, II och IV och hyaluronidas. (F) efter 1 h dissociation vid 37 ° c, vävnad nedbrytning stoppas och SUS pensionen hälls genom en te sil för att ta bort osmält hud bitar. (G) cell SUS pension filtreras en gång till genom en 70 μm cell sil och centrifugeras vid 500 x G vid 4 ° c i 10 min. (H) efter centrifugering tvättas cellpelleten med 1x PBS med 10% FCS och är klar för FACS färgning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: snittning av mänsklig hud dermis i papillär och retikulära lager med en dermatome. Schema som visar de tre hudlager erhålls genom skivning full tjocklek huden i papillär dermis (inklusive epidermis, 0 \ u2012300 μm; dermal skikt 1), övre retikulära (300 \ u20121 μm; dermal nivå 2) och lägre retikulära dermis (> 1000 μm; dermal skikt 3) med en Dermatom. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: FACS-gating-strategi för humana fibroblastsubpopulationer. (A\u2012e) Först, celler är gated på singel (B) och livskraftiga (DAPI-) celler (C). Immun celler (CD45+), mesenkymala STAMCELLER (CD106+), röda blod kroppar (CD235ab+) exkluderas (C) och Pacific Blue-negativa celler läggs vidare på E-CADHERIN (ECAD) och ITGA6 dubbla negativa celler (PE-kanal, D ). E-cadherin och ITGA6 är markörer som uttrycks på Epidermal celler. Nästa, CD31-FITC positiva celler (endothelial och lymfatiska celler) är undantagna (D) vilket resulterar i tre fibroblast populationer uttrycker antingen en eller båda av de två cellytan fibroblast markörer FAP och CD90: FAP+CD90-, FAP+CD90+ och FAP-CD90+ (E). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: FAP+CD90-, FAP+CD90+ och FAP-CD90+ fibroblaster skiljer sig i dermal lokalisering, gen uttryck och funktionalitet. (A) representativa FACS tomter av gated fibroblaster isolerade från papillär, övre retikulära och nedre retikulära dermis. Gating strategi förklaras i Diagram 3. FAP+CD90- fibroblaster är berikade i papillär dermis (19,2%) jämfört med lägre retikulära dermis (0,83%). FAP+CD90+ celler kan hittas i hela dermis men deras högsta överflöd är i övre retikulära dermis (40,7%). FAP-CD90+ är berikad i den nedre retikulära dermis (64,4%). (B) notera, alla tre sorterade subpopulationer uppvisar typisk fibroblastmorfologi på kultur i 7 dagar (vänster). Intressant, de beter sig annorlunda i en adipogenesis assay. Efter 14 dagar i kulturen, FAP+CD90- inte differentieras till adipocyter medan FAP+CD90+ och FAP-CD90+ lätt genomgå adipogenesis (höger; Oil Red O fläckar lipidbärande celler röda). Skal streck = 1 000 μm. (C) direkt sorterad FAP+CD90- fibroblaster Express papillär fibroblast markörer CD26, NTN1 och pdpn, medan FAP-CD90+ cells Express CD36, ACTA2 och pparγ, känd för att vara som uttrycks av retikulära härstamning. * p ≤ 0,05; p ≤ 0,0005 jämfört med FAP+/Cd90- celler; # p ≤ 0,05; # # # p ≤ 0,0005 jämfört med FAP-/cd90+ celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
I den här artikeln beskriver vi en metod för isolering av papillär och retikulära fibroblaster från mänsklig hud. CD90 har i stor utsträckning använts för att identifiera eller isolera dermal fibroblaster18,20,21. Emellertid, vi har visat att förutom CD90 + fibroblaster, mänskliga dermis också hamnar en CD90- fibroblast befolkningen uttrycker FAP16, som har fastställts som en markör för aktive rad fibroblaster och cancer-associerade fibroblaster ( Cafs)22,23,24,25. Viktigt, vi kunde identifiera tre fibroblast subpopulationer FAP+CD90-, FAP+CD90+ och FAP-CD90+ i hudbiopsier från alla friska mänskliga donatorer. Vi drar därför satsen att FAP är inte bara en markör för aktive rad fibroblaster eller CAFs men också normal vävnad fibroblaster.
Av anmärkning, FAP-CD90- cell population som återstår efter applicering av ovan beskrivna exkludering-och gating strategi innehåller inte fibroblaster, eftersom dessa celler inte sprider sig i fibroblast odlings substrat in vitro, men de flesta sannolikt en blandad cell population inklusive lymf celler och pericyter bland andra16.
Den cell avkastning som erhålls genom användning av ovan beskrivna protokoll kan variera beroende på vilken kropps del som huddelen som används för isoleringen härstammar från. Dermis från olika kropps delar skiljer sig när det gäller dess struktur, tjocklek samt kollagen sammansättning. Till exempel, hud från ansiktet eller överarmen är mycket tunnare än hud från magen eller låret, som också ofta uppvisar en tjockare subkutant fett lager. Dessutom, ålder och kön av huddonatorer kan ytterligare inte bara påverka vävnaden dissociation effektivitet, men kan också påverka fördelningen av de tre fibroblast subpopulationer (figur 3) när isolerade från full tjocklek hud. Detta beror på det faktum att papillär dermis krymper och att totala fibroblast siffrorna minskar med åldern11,26,27,28. Dessutom, cellen pellet från papillär dermis kommer förmodligen att vara större än från retikulära dermis, eftersom den övre dermis är mer tätbefolkade av fibroblaster än retikulära dermis. Dessutom är den lägre dermis också tuffare och tätare packad med kollagen, vilket gör det svårare att separera vävnaden och att frigöra fibroblaster. Notera, cellpelleten kan verka mycket röd, varför röda blod kroppar Lys rekommenderas.
Förutom att identifiera tre subpopulationer i intakt mänsklig hud, visar vi också att i dermatomed hud, varje fibroblast delmängd är berikad antingen i papillär eller retikulära dermis16. Exakt skivning av huden med Dermatom är avgörande för att få en ordentlig berikning av varje subpopulation från olika hudlager. Eftersom papillär dermis är mycket tunn, den dermatomed skiva som representerar det bör inte överstiga en tjocklek av 300 μm. övre retikulära och lägre retikulära fibroblaster båda representerar retikulära härstamning och Visa liknande funktioner och gensignaturer, Därför kan man också överväga att inte separera dem.
Viktigt, alla tre fibroblaster populationer finns i hela dermis och är inte uteslutande närvarande i ett lager, vilket är varför explant kulturer från papillär eller retikulära dermis resultera i blandade fibroblast kulturer. Men, FAP+CD90- papillär fibroblast är vanligast i papillär dermis och följa en gradient från ytliga till lägre dermal lager medan FAP+CD90+ och FAP-CD90+ fibroblaster följa en inverterad lutning från nedre till ytliga lager16. Dessutom, majoriteten av CD90+ fibroblaster av papillär dermis nästan uteslutande finns omgivande blod kärl och uttrycka perivaskulär fibroblast markör CD14629, och därmed förmodligen uppvisar olika funktioner än kvarvarande CD146- retikulära fibroblaster16. CD146 skulle kunna användas som en ytterligare markör i gating-strategin för att utesluta denna population.
Efter dissociation av dermal skikt, de isolerade cellerna färgas med en speciellt utformad anti kropps cocktail som innehåller olika anti kroppar för uteslutning av immun celler, endotelceller och lymf celler, epidermal celler, erytrocyter och MSCS till att erhålla ren fibroblastpopulation. Att välja en markör för identifiering och uteslutning av MSCS kan vara knepigt på grund av det stora antalet publicerade MSC markörer30,31. Eftersom MSCs Express CD90 som fibroblaster, ytterligare MSC markörer såsom CD105 eller CD271 kan vara användbara för deras identifiering. MSCs utgör dock endast en mycket låg procent andel av alla hud celler och eftersom CD90+ fibroblaster uppvisar typiska morfologiska egenskaper hos fibroblaster vid sortering, kan man hävda att uteslutandet av MSCS med hjälp av distinkta cellytmarkörer kan onödiga.
Viktigt, analyserade vi FAP och CD90 gen uttryck efter att hålla cellerna i kulturen för 7-14 dagar efter sortering (data inte visas) och fann att uttryck för båda markörer är uppreglerad i respektive sorterade enda positiva (FAP+CD90- eller FAP-CD90+) celler16. Vi betonar därför att de ovan beskrivna markör uppsättningarna och protokoll tillåter isolering av primära fibroblast del mängder direkt från vävnaden men inte från tidigare odlade blandade fibroblast populationer.
Icke desto mindre visar vi att funktionaliteten hos alla tre subpopulationer bevaras i cell odling oavsett förändringen av cellytan markör uttryck, eftersom fibroblaster sorteras som FAP+CD90- papillär fibroblaster inte förvärva förmågan att genomgå adipogenesis efter en längre tid av kultur, medan fibroblaster sorteras som FAP+CD90+ eller FAP-CD90+ retikulära fibroblaster bibehålla sin förmåga att differentiera till adipocyter 16 . Viktigt, vi fann också att papillär och retikulära-specifika gener fortfarande uttrycks i högre grad i FAP+CD90- och CD90+ respektive.
Sammanfattnings vis har vi inrättat ett protokoll för isolering av funktionellt distinkta fibroblast under grupper via FACS som för första gången tillåter isolering och analys av rena och naiva fibroblast subpopulationer från mänsklig hud dermis. Denna metod etablerar en stor avancemang till den allmänt använda fibroblast explant kultur isolering protokoll från övre och nedre dermis som (i) en motsatt lutning av papillär och retikulära fibroblaster finns från hudytan till hypodermisna och (II) fibroblaster ändrar sin gensignatur in vitro.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar tacksamt för hjälp i FACS-sortering av Bärbel Reininger och Wolfgang Bauer. Detta arbete stöddes av bidrag till B. M. L. från den österrikiska Science Fund (FWF: V 525-B28), och förbundet för Europeiska biokemiska föreningar (FEBS, uppföljnings forsknings fond). S. F. är mottagare av ett DOC-stipendium från österrikiska vetenskaps akademin (OeAW). Vi tackar tacksamt för utmärkt stöd från de centrala anläggningarna vid Medicinska universitetet i Wien. Vi tackar Bernhard Gesslbauer, Christine Radtke och Martin Vierhapper för att de tillhandahåller mänskligt skinn material.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material: | |||
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Ammonium chloride | Sigma | 9718 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
| Amniomax-C100 (1x) Basal Medium | Gibco | 17001-074 | used for fibroblast growth medium |
| β-Mercaptoethanol | Scharlau | ME0095 | CAUTION |
| C100 Supplement | Thermo Scientific | 12556015 | used for fibroblast growth medium |
| Collagenase I | Thermo Scientific | 17100017 | CAUTION |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | CAUTION |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | CAUTION |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | CAUTION |
| Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
| EDTA disodium salt | Sigma | E1644 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco | 10500-064 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | CAUTION |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Isopropanol | Merck | 1,096,341,011 | |
| OilRed O | Sigma | O-0625 | |
| Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline without Ca2+ & Mg2+ | Lonza | BE17-512F | |
| Potassium bicarbonate | Sigma | 237205 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
| PureLink RNA MicroKit | Invitrogen | 12183-016 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR | Invitrogen | 11752 | |
| Taqman 2x Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4324018 | CAUTION Skin and eye irritant. |
| Troglitazone | Sigma | T2573 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry Antibodies: | |||
| anti human CD31-AF488 | Biolegend | 303109 | Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075 |
| anti human CD45-Pacific blue | Biolegend | 304029 | Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123 |
| anit human CD49f/ITGA6-PE | Serotec | MCA699PE | Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833 |
| anti human CD90/Thy-1-AF700 | Biolegend | 328120 | Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302 |
| anti human CD106-AF421 | BD | 744309 | Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x |
| anti human CD235ab-Pacific blue | Biolegend | 306611 | Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153 |
| anti-human E-cadherin-PE | Biolegend | 147304 | Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040 |
| anti human FAP-APC | R&D | FAB3715A | Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x |
| Human TruStain FcX | Biolegend | 422302 | Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| 1.4 mL micronic tubes | Thermo Scientific | 4140 | |
| 1.5 mL screw cap micro tube | Sarstedt | 72,692,405 | |
| 5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| 48-well cell culture cluster | Costar | 3548 | |
| 50 mL polypropylene canonical tubes | Falcon | 352070 | |
| 70 µm cell strainer nylon | Falcon | 352350 | |
| Aesculap Acculan 3Ti Dermatome | VWR | AESCGA670 | |
| Aesculap Dermatome blades | VWR | AESCGB228R | |
| MicroAmp Fast Optical 96well | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Primary cell culture dish | Corning | 353803 | |
| Scalpel blades | F.S.T | 10022-00 | |
| Tea strainer | x | x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibroblast growth medium: | |||
| AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10% FCS and 1% P/S |
References
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of Cell Science. 117 (Pt 5), 667-675 (2004).
- Lowry, W. E., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2883-2888 (2008).
- Kisseleva, T. The origin of fibrogenic myofibroblasts in fibrotic liver. Hepatology. 65 (3), 1039-1043 (2017).
- LeBleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nature Medicine. 19 (8), 1047-1053 (2013).
- Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulation Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
- Rinkevich, Y., et al. Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), (2015).
- Abhishek, S., Palamadai Krishnan, S. Epidermal Differentiation Complex: A Review on Its Epigenetic Regulation and Potential Drug Targets. Cell Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Mastrogiannaki, M., et al. beta-Catenin Stabilization in Skin Fibroblasts Causes Fibrotic Lesions by Preventing Adipocyte Differentiation of the Reticular Dermis. Journal of Investigative Dermatology. 136 (6), 1130-1142 (2016).
- Lichtenberger, B. M., Mastrogiannaki, M., Watt, F. M. Epidermal beta-catenin activation remodels the dermis via paracrine signalling to distinct fibroblast lineages. Nature Communications. 7, 10537 (2016).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204 (4392), 526-527 (1979).
- Hiraoka, C., et al. Two clonal types of human skin fibroblasts with different potentials for proliferation and tissue remodeling ability. Journal of Dermatological Science. 82 (2), 84-94 (2016).
- Higgins, C. A., et al. Multifaceted role of hair follicle dermal cells in bioengineered skins. Br Journal of Dermatology. 176 (5), 1259-1269 (2017).
- Korosec, A., Lichtenberger, B. M. Ch. 12. Skin Tissue Models. Marques, A. P., Pirraco, R. P., Cerqueira, M., Reis, R. L. , Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-810545-0.00012-7 279-301 (2017).
- Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. , (2018).
- Higgins, C. A., Chen, J. C., Cerise, J. E., Jahoda, C. A., Christiano, A. M. Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19679-19688 (2013).
- Philippeos, C., et al. Spatial and Single-Cell Transcriptional Profiling Identifies Functionally Distinct Human Dermal Fibroblast Subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Jiang, D., Rinkevich, Y. Defining Skin Fibroblastic Cell Types Beyond CD90. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 133 (2018).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International Review of Cell and Molecular Biology. , 161-214 (2009).
- Huang, Y., et al. Isolation of Fibroblast-Activation Protein-Specific Cancer-Associated Fibroblasts. BioMed Research International. 2017, 4825108 (2017).
- Jiang, G. M., et al. The application of the fibroblast activation protein alpha-targeted immunotherapy strategy. Oncotarget. 7 (22), 33472-33482 (2016).
- Pure, E., Blomberg, R. Pro-tumorigenic roles of fibroblast activation protein in cancer: back to the basics. Oncogene. 37 (32), 4343-4357 (2018).
- Hamson, E. J., Keane, F. M., Tholen, S., Schilling, O., Gorrell, M. D. Understanding fibroblast activation protein (FAP): substrates, activities, expression and targeting for cancer therapy. PROTEOMICS – Clinical Applications. 8 (5-6), 454-463 (2014).
- Gilchrest, B. A. A review of skin ageing and its medical therapy. Br Journal of Dermatology. 135 (6), 867-875 (1996).
- Gilchrest, B. A., Krutmann, J. Skin Aging. , Springer. 198 (2006).
- Makrantonaki, E., Zouboulis, C. C. Molecular mechanisms of skin aging: state of the art. Annals of the New York Academy of Sciences. 1119, 40-50 (2007).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Kundrotas, G. Surface markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts. Acta Medica Lituanica. 19 (2), 75-79 (2012).
- Lupatov, A. Y., Vdovin, A. S., Vakhrushev, I. V., Poltavtseva, R. A., Yarygin, K. N. Comparative analysis of the expression of surface markers on fibroblasts and fibroblast-like cells isolated from different human tissues. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 537-543 (2015).
