Summary
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är ett kraftfullt verktyg för att förstå de molekylära mekanismerna för genreglering. Metoden innebär dock svårigheter att få reproducerbar kromatinfragmentering genom mekanisk klippning. Här ger vi ett förbättrat protokoll för en ChIP-analys med enzymatisk matsmältning.
Abstract
För att uttrycka cellulära fenotyper i organismer, levande celler utföra genuttryck i enlighet därmed, och transkriptionella program spelar en central roll i genuttryck. Den cellulära transcriptionella maskiner och dess kromatin modifiering proteiner samordna för att reglera transkription. För att analysera transkriptionell reglering på molekylär nivå finns flera experimentella metoder såsom elektroforetisk rörlighet Skift, övergående reporter och kromatin immunoprecipitation (ChIP) analyser. Vi beskriver en modifierad chip analys i detalj i denna artikel på grund av dess fördelar i direkt visar Histon modifieringar och samspelet mellan proteiner och DNA i celler. En av de viktigaste stegen i en lyckad ChIP-analys är kromatin klippning. Även ultraljudsbehandling används ofta för klippning kromatin, det är svårt att identifiera reproducerbara förhållanden. Istället för klippning kromatin av ultraljudsbehandling, utnyttjade vi enzymatisk matsmältning med micrococcal Nuclease (mnase) för att få mer reproducerbara resultat. I den här artikeln ger vi en enkel ChIP assay protokoll med MNase.
Introduction
Genuttryck i däggdjursceller är tätt och dynamiskt reglerad, och transkription är en av de viktigaste stegen. Gentranskription regleras huvudsakligen av transkriptionsfaktorer och histones. En transkriptionsfaktor är ett protein som binder till specifika DNA-sekvenser och kontrollerar gentranskription. Dessa faktorer antingen främja eller hämma rekryteringen av RNA-polymeras II (polii), som initierar mRNA syntes från genomisk DNA som mall1. Histonmodifikationer såsom acetylering och metylering av histonstjärtrester positivt och negativt påverka gentranskription genom att ändra kromatin struktur2. Eftersom förändringar i genuttryck påverkar det cellulära sammanhanget är det viktigt att undersöka de molekylära mekanismer genom vilka transkription regleras.
Hittills finns det flera metoder för att undersöka regleringen av gentranskription. Electrophoretic Mobility Shift assay (EMSA), även kallad en gel Skift analys, används för att analysera en protein-DNA interaktion3. Ett kärn extrakt från celler av intresse inkuberas med en radioaktiv isotop (till exempel 32P)-märkt DNA-sond och electrophoresed på en polyakrylamidgel. Dess autoradiogram visar att DNA-proteinkomplexet migrerar långsammare än sonden i en gel. I närvaro av en antikropp mot proteinet, DNA-protein-antikroppskomplexet migrerar i en gel långsammare än DNA-proteinkomplexet. Detta superskiftade band avslöjar specifik bindning mellan DNA och protein. Emellertid, EMSA endast bestämmer en specifik DNA-proteininteraktion i ett cellfritt system, och därför är det fortfarande okänt om interaktionen styr transkription i levande celler. Transitorisk reporter analys, vanligen kallad luciferas reporter assay, utvecklades för att hantera gen uttrycks reglering i celler. Typiskt, en uppströms genomisk region av en gen av intresse sätts in i en reporter plasmid, transitivt transfekterade i celler, och reporter aktiviteten mäts. En mängd olika raderingsmutanter gör det möjligt att identifiera regioner som är ansvariga för genreglering. Även om en reporter analys är ett användbart verktyg för att identifiera transkriptionsfaktorer och bindande DNA-sekvenser kontrollera transkription, denna metod har en stor nackdel i att en reporter plasmid är fri från kromatin struktur och inte återspeglar "riktiga" maskiner för transkription. Dessutom kan ändringar i histonmodifieringar inte bestämmas av systemet.
Utvecklingen av kromatin immunoprecipitation (chip) metoden baserades på Jackson och chalkley rapporter att "hela cellen" fixering med formaldehyd bevarade kromatin struktur4,5. Sedan dess har många relaterade tekniker utvecklats och förbättrats6. I Spånanalyser fixeras celler med formaldehyd för att korslänka DNA och proteiner. Den kromatin är fragmenterad och sedan immunopreciated med antikroppar av intresse. Immun komplexet tvättas och DNA renas. PCR-förstärkning med primers riktade till en viss region av genomet avslöjar beläggning av proteiner av intresse i genomet.
Även chip är ett kraftfullt verktyg för att identifiera samspelet mellan proteiner som transkriptionsfaktorer och modifierade histoner med DNA, metoden innebär vissa svårigheter, såsom en kromatin fragmentering steg, i praktiken. Ultraljudsbehandling har ofta används för klippning kromatin; Det är dock besvärligt att identifiera reproducerbara förhållanden. Micrococcal Nuclease (MNase) behandling är en alternativ metod för kromatin klippning. MNase är en endo-exonukleas som smälter dubbelsträngad, enkelsträngad, cirkulär och linjär DNA och RNA. Det är relativt lätt att bestämma villkoren, inklusive mängden kromatin och enzym, temperatur, och inkubering tid, för optimal kromatin fragmentering. Vi ändrade och förenklade de befintliga protokollen, och vi etablerade en enkel och reproducerbar metod. Detta dokument innehåller protokollet för en ChIP-analys med hjälp av MNase i däggdjursceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av reagenser
- Gör 18,5% PARAFORMALDEHYD (PFA) lösning. Tillsätt 0,925 g PFA, 4,8 mL vatten (Använd ultrapurified vatten i hela protokollet) och 35 μL av 1 M KOH i en 50 mL konisk plaströr. Stäng locket tätt och värm röret i en 400-600 mL glasbägare som innehåller cirka 200 mL vatten med hjälp av en mikrovågsugn. Ta bort röret innan vattnet börjar koka och Vortexblanda röret för att lösa upp PFA. Låt PFA svalna till rumstemperatur och förvara på isen.
Anmärkning: Upprepa upphettning och mixning tills PFA löses upp helt. Förbered PFA-lösningen omedelbart före crosslinking (steg 2.1.3). - Gör 1,25 M glycin lösning. Lös 14,07 g glycin i 150 mL vatten och filtrera genom ett filter med porstorlek 0,22 μm. Förvaras vid 4 ° c.
- Gör ChIP cell lysis buffert. Lös 378 mg av RÖREN, 10,6 mL 2 M KCl, och 1,25 g Grenade oktylfenoxi poly (etylenoxi) etanol i vatten. Justera pH till 8,0 med 1 M KOH vid 4 ° c och gör upp till 250 mL. Filtrera genom ett filter i porstorlek 0,22 μm och förvara vid 4 ° c.
- Gör micrococcal Nuclease (MNase) rötnings buffert. För att göra 1 mL, blanda 0,1 mL 10X MNase digestionsbuffert, 10 μL 100x BSA-lösning, 10 μL 0,1 M ditiothreitol och 0,88 mL vatten.
- Gör 1 M NaHCO3. Lös 4,2 g NaHCO3 i 50 ml vatten och filtrera genom ett filter med porstorlek 0,22 μm. Förvaras i rumstemperatur.
- Gör 10% natriumdodecylsulfat (SDS). Lös 5 g SDS i 50 mL vatten. Förvaras i rumstemperatur.
- Gör elueringbuffert. Blanda 15 μL av 1 M NaHCO3, 15 μl 10% SDS och 120 μl vatten för att erhålla 150 μl elueringbuffert för ett prov.
Anmärkning: Öka volymerna proportionellt beroende på antalet prover. - Gör 3 M natriumacetat (pH 5,2) lösning. Lös upp 24,6 g natriumacetat i vatten. Justera pH till 5,2 med ättiksyra och gör upp 100 mL. Filtrera genom ett pore-filter på 0,22 μm och förvara i rumstemperatur.
2. bestämning av MNase Digestionsförhållanden
Anmärkning: I steg 2 av protokollet, ett exempel med hjälp av VCaP, mänskliga prostatacancerceller presenteras. Alla däggdjurs cellinjer kan användas. Se anmärkning vid stegen.
- Beredning av tvärbunden kromatin
- Bibehålla VCaP-celler i DME-högt glukos kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° c i en koldioxidinkubator. Seed VCaP celler vid 4 x 106 celler i sex 6 cm rätter i 4 ml kultur media och kultur i 3 dagar.
Anmärkning: Använd lämpliga Odlingsmedier för varje cellinje. Upp till 10 x 106 celler kan seedas i en 6 cm eller 10 cm skålen. För suspenderade celler, frö celler i T25 kolvar. Antalet rätter eller flaskor beror hur många doser testas för MNase matsmältning. Om 4 doser testas, Förbered 6 rätter eller flaskor. Se även steg 2,2. - Ta bort VCaP-celler från en maträtt med trypsin och räkna cellen. Beräkna cell nummer i en skål. För suspenderade celler, ta bort en liten mängd cellsuspension från en kolv och räkna cell nummer.
- Tillsätt 0,229 mL 18,5% PFA till en 6 cm skål i 4 mL odlingsmaterial med en slutkoncentration på 1%. Sakta men grundligt snurra en skål eller kolv för att fördela PFA jämnt. Inkubera vid rumstemperatur i exakt 10 minuter.
Anmärkning: I detta steg är kromatin och proteiner tvärbundna. Eftersom PFA är giftigt, utföra detta steg i en kemisk rök huva och använda ordentlig personlig skyddsutrustning. - Efter 10 min, tillsätt 0,47 mL 1,25 M glycin lösning vid en slutkoncentration av 125 mM. Inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
Anmärkning: Glycin neutraliserar överskott PFA att stoppa ytterligare crosslinking. - Aspirera formaldehyd/glycin/kultur media. Tvätta cellerna genom att tillsätta 4 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) två gånger. För suspenderade celler, överför cellsuspensionen till ett 15 mL koniskt rör och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Aspirera på supernatanten och tillsätt en medelstor volym PBS och helt suspendera. Upprepa det här steget. Kassera flytande avfall ordentligt eftersom de innehåller formaldehyd.
- Förbered PBS som innehåller proteas och fosfatas hämmare cocktail (PIC) genom att tillsätta 1/100 volym 100x pic till PBS. Aspirera PBS från en maträtt och tillsätt 1 mL per fat av PBS som innehåller PIC. Skrapa cellerna och överför cellsuspensionen till ett 1,5 mL microcentrifugerör. För suspenderade celler, helt enkelt överföra suspensionen till en 1,5 mL rör.
- Centrifugera rören vid 3 000 x g i 5 min vid rumstemperatur för att återvinna cellpelleten. Ta bort PBS helt med hjälp av en pipett. Anteckna cellnumret per tub och förvara cellpelleten vid-80 ° c.
- Bibehålla VCaP-celler i DME-högt glukos kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° c i en koldioxidinkubator. Seed VCaP celler vid 4 x 106 celler i sex 6 cm rätter i 4 ml kultur media och kultur i 3 dagar.
- Cell Lys och MNase matsmältning
Anmärkning: Reagensmedels volymen i följande steg baseras på ett rör som innehåller 6 x 106 celler. Justera reagensvolymen proportionellt beroende på cell nummer; När ett rör innehåller 2 x 106 celler, Använd 100 μl av spåncellslysbufferten (steg 2.2.1), mnase-rötnings buffert (steg 2.2.3) och chip utspädnings buffert (steg 2.2.5) och 10 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0) (steg 2.2.4).- Tina den lagrade cellpelleten (VCaP-celler, innehållande 6 x 106 celler per tub) som bereds i steg 2.1.7 på is. Förbered ChIP cell lysis buffert kompletteras med PIC genom att lägga till 1/100 volym 100x PIC till bufferten. Tillsätt 300 μL av Spåncellslysbufferten kompletterad med PIC och Omsuspendera pelleten grundligt. Vortex röret för 15 s och inkubera suspensionen på is i 10 min.
- Centrifugera vid 9 000 x g i 3 min vid 4 ° c och avlägsna supernatanten helt. Omsuspendera pelleten i 300 μL av MNase-rötnings bufferten.
- Späd MNase (2 000 gel enhet/μL) med MNase digestionsbuffert för att ge 50 gel enheter/μL. Tillsätt 0, 0,5, 1, 2, 4 μL av 50 gel enheter/μL av MNase till suspensionen och inkubera vid 37 ° c för exakt 10 min, blandning av inversion varje 2,5 min.
Anmärkning: tabell 1 visar optimala mängder av mnase i flera cellinjer. - Tillsätt 30 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0) för att avsluta MNase-nedbrytning och virvel kort. Inkubera i 5 minuter på isen. Centrifugera vid 9 000 x g i 5 min vid 4 ° c och avlägsna supernatanten helt.
- Förbered ChIP utspädnings buffert kompletteras med PIC genom att lägga 1/100 volym 100x PIC till bufferten. Omsuspendera pelleten i 300 μL av ChIP utspädnings buffert kompletterad med PIC.
- Sonikera suspensionen på isen med en sonikator utrustad med en mikrotip sond. Använd följande ultraljudsbehandling villkor: amplitud 2, bearbetas tid 15 s, puls på 5 s, puls av 30 s. Ta 1 μL av suspensionen och fläck på ett glid glas och observera dem med hjälp av ett mikroskop. Se till att cellstrukturen är nästan bruten.
Anmärkning: Figur 1a visar representativa mikrofotografier av VCAP cellsuspensionen före och efter ultraljudsbehandling. Detta steg är för att frigöra smält kromatin i supernatanten genom att bryta nukleära membran. En effektinställning bör justeras till mindre än 5% av maximal effekt och prova ultraljudsbehandling för 5 s tre gånger med mer än 30 s intervall. Om wattal kontroll är tillgänglig, justera effekt inställningen till 5 W och bearbeta proverna för totalt 15 s som nämnts ovan för att ge total effekt på 70-75 J. Kontrollera om cellstrukturen är bruten som nämnts ovan. Om inte tillräckligt, upprepa en gång till. Villkoret som beskrivs ovan är praktiskt taget tillämpas på alla cellinjer testas. - Centrifugera vid 9 000 x g i 10 min vid 4 ° c, överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml microcentrifugerör och spara 20 μl av den smälta kromatin för steg 2,3. Förvara återstoden vid-80 ° c.
- Omvänd crosslinking, rening av DNA, och analys av smält kromatin
- Tillsätt 75 μl vatten, 4 μl 5 M NaCl och 1 μl proteinas K till ett 1,5 ml skruv rör. Tillsätt 20 μL smält kromatin från olika MNase-digestionsförhållanden som bereds i steg 2.2.7 till rör som innehåller vatten, NaCl och proteinas K. Stäng locket tätt, blanda helt och Inkubera röret vid 65 ° c över natten.
Anmärkning: Detta steg är för avlägsnande av tvärbindning mellan protein och DNA. - Bered två 1,5 mL-mikrocentrifugrör per tillstånd. Tillsätt 100 μL fenol: kloroform: isoamylalkohol (25:24:1) (PCI) till en 1,5 mL tub. Tillsätt 10 μL 3 M natriumacetat (pH 5,2) och 2 μL glykogen till ett annat rör.
Anmärkning: Bruket av Chloroform: isoamylalcohol är inte nödvändig7. Ökande volym kan resultera i låg DNA återhämtning efter etanol nederbörd8. - Centrifugera röret som innehåller smält kromatin från steg 2.3.1 kort och tillsätt 100 μL PCI. Stäng locket tätt och skaka kraftigt för att bilda emulsion. Centrifugera röret med maximal hastighet (t. ex. 20 000 x g) i 30 s vid rumstemperatur.
- Ta försiktigt den övre fasen som innehåller DNA och tillsätt i röret som innehåller PCI berett i steg 2.3.2. Vortex kraftigt och centrifugera röret som steg 2.3.3.
Anmärkning: Om lägre fas är förorenad, Centrifugera röret igen, eller ta bort det mesta av den nedre fasen först, Centrifugera röret, och ta den övre fasen. - Ta försiktigt den övre fasen enligt beskrivningen i steg 2.3.4 och tillsätt i röret som innehåller natriumacetat och glykogen berett i steg 2.3.2. Tillsätt 250 μL etanol. Blanda med inversion och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Centrifugera röret med maximal hastighet (t. ex. 20 000 x g) i 30 minuter vid 4 ° c.
Anmärkning: Inkubation av lösningen vid rumstemperatur påverkar inte DNA-återhämtningen8,9. - Kontrollera pellets på undersidan av röret. Ta försiktigt bort supernatanten för att inte störa pelleten och tillsätt 500 μL 70% etanol. Centrifugera röret med maximal hastighet (t. ex. 20 000 x g) i 5 min vid 4 ° c.
- Ta bort supernatanten helt och torka pelleten i ca 5 min vid rumstemperatur. Lös upp pelleten i 20 μL 10 mM Tris · HCl/1 mM EDTA (pH 8,0) (TE). Mät DNA-koncentrationen med en UV-spektrofotometer.
- Blanda 0,5 μg DNA med ett gel laddnings färgämne och applicera på 2% agaros gel. Elektroforese proverna vid 100 V i Tris-acetat-EDTA buffert tills lila färg flyttas till två tredjedel av gelen och fläcken en gel med 0,5 μg/ml etidiumbromid bromid för 10 min. Ta en bild av gelen.
Anmärkning: Se figur 2 för detaljer.
- Tillsätt 75 μl vatten, 4 μl 5 M NaCl och 1 μl proteinas K till ett 1,5 ml skruv rör. Tillsätt 20 μL smält kromatin från olika MNase-digestionsförhållanden som bereds i steg 2.2.7 till rör som innehåller vatten, NaCl och proteinas K. Stäng locket tätt, blanda helt och Inkubera röret vid 65 ° c över natten.
3. Kromatinimmunoprecipitation
- Beredning av smält kromatin
- Förbered cellerna. För anhängare celler, utsäde 2-10 x 106 celler per maträtt i 2 rätter (6 cm eller 10 cm) per behandlingsgrupp och låta cellerna att fästa på botten av rätter för mer än 1 dag. För suspenderade celler, utsäde i 2 T25 flaskor per behandlingsgrupp. Behandla cellerna som önskat.
- Ta en maträtt eller kolv från varje grupp och räkna cell nummer enligt beskrivningen i steg 2.1.2. Förbered tvärbunden kromatin som nämns i steg 2.1.3-2.1.7.
- Lyse cellpelleten och MNase-nedbrytning enligt beskrivningen i steg 2.2.1-2.2.7. Använd den optimala mängden MNase att smälta kromatin som bestäms i steg 2. Förvara smält kromatin vid-80 ° c.
- Omvänd tvär länk 20 μL smält kromatin och rena DNA enligt beskrivningen i steg 2.3.8. Mät DNA-koncentrationen enligt beskrivningen i steg 2.3.7. Elektroforese proverna i 2% aguppstod gel för att kontrollera storleken på smält kromatin som nämns i steg 2,3.
Anmärkning: DNA-koncentrationen är identisk med den för lagrad smält kromatin som bereds i steg 3.1.3. - Späd ett omvänt tvärbunden smält kromatinprov från steg 3.1.4 för att ge 10 ng/μL med vatten och seriellt spädas för att göra koncentrationer av 1, 0,1 och 0,01 ng/μL. förvaras vid-20 ° c.
Anmärkning: Dessa prover används för realtids PCR-standarder.
- Immunoprecipitation
Anmärkning: i steg 3.2-3.5 i protokollet, anti-trimetylerade Histon H3 lysin 4 (H3K4me3) beläggning i VCAP celler bestäms. Se även figur 3.- Tina smält kromatin från steg 3.1.3. Förvara alla prover på isen.
- Förbered ChIP utspädnings buffert kompletteras med PIC genom att lägga 1/100 volym 100x PIC till bufferten. Späd i smält kromatin till 5 μg/500 μL med en ChIP-utspädnings buffert kompletterad med PIC. Förbered 1 000 μL plus extra för (1) IP med nonimmuna IgG (Control IgG), (2) IP med H3K4me3.
- Tillsätt 5 μL 5 μg/500 μL smält kromatin till ett 1,5 mL-skruvrör som ett inmatnings prov (1% av en IP). Förvara provet vid-80 ° c.
- Tillsätt 500 μL vardera av 5 μg/500 μL nedbrutet kromatin till ett 1,5 mL skruv rör som ett IP-prov. Tillsätt 2 μg antikropp till röret. Stäng locket och Inkubera röret vid 4 ° c över natten med skonsam blandning med en gungande plattform.
Anmärkning: Även om optimal antikropps mängd bör bestämmas empiriskt, rekommenderas 2 μg per IP först. - Tillsätt 30 μL ChIP-grade protein G magnetiska pärlor per IP. Inkubera röret vid 4 ° c i 2 timmar med skonsam blandning med en gungande plattform.
Anmärkning: Förtvätt av magnetiska pärlor är inte nödvändigt.
- Tvättning immunkomplex och reverserande tvärbindning
- Snurra snabbt ner röret från steg 3.2.5. Placera röret i en polyeten som innehåller neodinium magneter för 1 min. Ta försiktigt bort supernatanten genom aspiration.
- Tillsätt 0,5 mL per tub med låg salt immunkomplex tvättbuffert. Skingra pärlorna genom att försiktigt knacka eller kort vortexa röret. Inkubera röret vid 4 ° c i 5 minuter med skonsam blandning med en gungande plattform. Efter 5 min, upprepa steg 3.3.1.
- Tillsätt 0,5 mL hög salt immunkomplex tvättbuffert per tub. Skingra och tvätta pärlorna som steg 3.3.2. Efter tvättning, upprepa steg 3.3.1.
- Tillsätt 0,5 mL LiCl immunkomplex tvättbuffert per tub. Skingra och tvätta pärlorna som steg 3.3.2. Efter tvättning, upprepa steg 3.3.1.
- Placera röret i ett magnetiskt rack i 1 min. ta bort återstående supernatanten helt.
- Tillsätt 150 μL elueringbuffert i röret. Vortex röret för att skingra pärlorna helt. Stäng locket och Inkubera röret vid 65 ° c i 30 min, blandning av inversion eller vortexa var 5 min att skingra pärlorna grundligt.
- Under inkuberingen, Förbered ett 1,5 ml skruv rör och tillsätt 6 μl 5 M NaCl och 2 μl proteinas K. Tina 1% inmatnings prov berett i steg 3.2.3. Tillsätt 150 μl elueringbuffert, 6 μl 5 M NaCl och 2 μl proteinas K till 1% instick prov.
- Efter inkubationen, snurra ner röret. Placera röret i ett magnetiskt rack i 1 min och överför supernatanten till skruv röret som innehåller NaCl och proteinas K som bereds i steg 3.3.7.
- Stäng locket och Vortex alla IP-och input prover att blanda helt. Inkubera röret vid 65 ° c över natten.
- DNA-rening
- Bered röret enligt beskrivningen i 2.3.2 och tillsätt 150 μL PCI i stället för 100 μL. Tillsätt 12 μL 3 M natriumacetat (pH 5,2) och 2 μL glykogen i ett annat rör.
- Ta bort röret från inkubatorn. Snurra ner röret och tillsätt 150 μL PCI.
- Vortex kraftigt röret för att bilda emulsion. Centrifugera röret med maximal hastighet (t. ex. 20 000 x g) i 30 s vid rumstemperatur.
- Överför försiktigt 140 μL av den övre fasen till röret som innehåller PCI berett i steg 3.4.1. Upprepa steg 3.4.3.
Anmärkning: Se även anmärkning i steg 2.3.4. - Överför försiktigt 120 μL av den övre fasen till röret som innehåller natriumacetat och glykogen berett i steg 3.4.1.
Anmärkning: Se även anmärkning i steg 2.3.4. - Tillsätt 300 μL etanol. Blanda med inversion och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera röret med maximal hastighet (t. ex. 20 000 x g) i 30 minuter vid 4 ° c. Tvätta pelleten enligt beskrivningen i steg 2.3.6.
- Efter torkning av pelleten enligt beskrivningen i steg 2.3.7, lös upp pelleten i 50 μL TE. Förvaras vid-20 ° c.
- Detektion av DNA-fragment med hjälp av realtids PCR
- Tina följande prover: (1) IP med kontroll-IgG, (2) IP med anti-H3K4me3, (3) 1% input Sample. Tina också 4 doser av standarder som utarbetats i steg 3.1.5 (totalt 7 prover).
Anmärkning: Använda standarder från samma grupp för kvantifiering av DNA-mängder i indata-och IP-proverna. - Gör en PCR-arbetslösning för 8 prover. Blanda 40 μL av 2x realtid PCR Supermix, 8 μL vardera av 4 μM framåt och bakåt primers, och 8 μL vatten.
Anmärkning: En PCR-reaktionsblandning innehåller 5 μL 2x Real-time PCR Supermix, 1 μL vardera av 4 μM framåt-och omvänd primers och 1 μL vatten. Primer-sekvenser listas i tabell 2. - Alikvot 8 μL av PCR-arbetslösning till en brunn av en PCR-platta. Tillsätt 2 μL prover från steg 3.4.8 eller standarder från steg 3.1.5.
- Försegla PCR-plattan och kör PCR med följande villkor: 1) 95 ° c i 3 min för initial denaturering, 2) 95 ° c för 10 s för denaturering, 3) 56 ° c i 30 s för glödgning, 4) 72 ° c i 30 s för förlängning och datainsamling , upprepa steg 2) till 4) för 55 cykler. Efter Cykling, mät en smält kurva för PCR-produkten. Analysera data.
Anmärkning: Rådata för figur 3 visas i tabell 3. Beräkna startkvantiteten (SQ) av proverna med en standardkurva. Multiplicera SQ i 1% input med 100 för att justera ett SQ av 1% inmatnings prov till en IP för att ge justerad SQ in ingång (EQ. 1). Dividera SQ i IP-prov med justerade SQ in input för att ge% input Value (procent inmatningsmetod, EQ. 2). För att beräkna veck anrikning, dividera SQ i IP med anti-H3K4me3 med SQ i IP med kontroll IgG (fold anriknings metod, EQ. 3).
Justerad SQ in-ingång = (SQ in 1% ingång) x 100 (1)
Procent inmatning av H3K4me3 = 100 x (SQ in IP med anti-H3K4me3)/(justerad SQ in input) (2)
Vik anrikning av H3K4me3 = (SQ i IP med anti-H3K4me3)/(SQ i IP med kontroll IgG) (3)
- Tina följande prover: (1) IP med kontroll-IgG, (2) IP med anti-H3K4me3, (3) 1% input Sample. Tina också 4 doser av standarder som utarbetats i steg 3.1.5 (totalt 7 prover).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Smälta kromatin är en av de viktigaste stegen för en ChIP-analys. Vi använde MNase att smälta kromatin för att få en blandning av nukleosome oligomerer. I MNase uppslutning steg, MNase kan gå igenom kärn membranet och smälta kromatin. Men den smälta kromatin kan inte gå igenom membranet och förblir i kärnorna. För att frigöra den smälta kromatin från atomkärnor, kort ultraljudsbehandling behövs. Figur 1a visar mikrofotografier före och efter ultraljudsbehandling av VCAP cellsuspension. Utan ultraljudsbehandling, cellstrukturen förblir intakt, vilket indikerar att kromatin finns i atomkärnor. En kort ultraljudsbehandling bryter cellstrukturen, och kontrollera cellerna i mikrofotografier hjälper till att bestämma den korta ultraljudsbehandling villkor. Vi representerade också andra exempel för kort ultraljudsbehandling i 293T celler (figur 1b) den mänskliga B-cellen akut lymfatisk leukemi cellinjer, Reh celler (figur 1c) och den mänskliga prostatacancer cellinjer, LNCaP (figur 1d).
Figur 2A visar kromatinfragmentering efter behandling med olika mängder mnase i VCAP-celler. Vi behandlade 6 x 106 tvärbunden VCAP cell pellets med 0, 50, 100, 200 gel enheter av mnase i 300 μl av digestionsbuffert för 10 min vid 37 ° c. Efter rening av smält kromatin, 500 ng av DNA analyserades på 2% aguppstod gel och färgas med etidiumbromid bromid. Utan att tillsätta MNase, ett utstryk mönster med en mycket hög molekylvikt dök upp (Lane 1). Tillsatsen av MNase gav en stege mönster (N; en mononukleosome enhet), visar att MNase smälter internucleosome (körfält 2-5). Figur 2b visar ett olämpligt rötnings mönster. Överrötning resulterade främst i mononukleosome produktion (figur 2b, Lane 7). Vi bör hitta de rätta villkor som producerar kromatin fragment upp till 900 BP (en till fem nukleosomer; t. ex., Lane 5).
För att kontrollera om Spånanalysen utförs på rätt sätt är det viktigt att ha lämpliga kontroller i analysen. För immunoprecipitation används nonimmuna IgGs från samma art som antikroppar av intresse som en kontroll som visar icke-specifik bindning till samma region (se diskussion). Dessutom rekommenderas att mäta bindningen av proteiner (beläggning) i både positiva och negativa regioner. Det har varit allmänt accepterat att H3K4me3 beläggning fördelas mellan cirka en kilobase (KB) uppströms och nedströms av transkription startplatser10,11. Vi mätte H3K4me3 beläggning i AR-genomet som spänner över ca 20 KB uppströms genom 12 kB nedströms från ar-TSS-startplatsen (ar) i AR-positiva VCaP-celler. Nedbrytnings mönstret av kromatin i VCaP-celler som används i detta experiment visades i figur 3a, vilket indikerar korrekt nedbrytning av kromatin. Den högsta beläggningen på H3K4me3 observerades runt AR-TSS och 0,5 KB och 1 KB uppströms från AR-TSS (figur 3b). Så länge gener är transkriptionellt aktiva kan TSSs vara "positiva regioner". Regioner som ligger på 19 KB och 8 KB uppströms och 12 kB nedströms AR-TSS hade dock liten beläggning på H3K4me3 (figur 3b), vilket indikerar att dessa kan användas som "negativa regioner".
Det har visats att en androgen ökar RNA-polymeras II beläggning i PSA promotorn och förstärkare i LNCaP celler med klippt kromatin av ultraljudsbehandling12,13. Vi testade därför giltigheten av vårt protokoll genom att mäta aktiv RNA-polymeras II beläggning (fosforylerade RNA-polymeras II på Serine 5; PolII (pS5)) i cellerna. Vi utförde samma experiment för att kontrollera reproducerbarheten av vår metod. LNCaP celler var odlade i steroid-svalt medium för 3 dagar och stimuleras med ett fordon eller 10 nM dihydrotestosteron (DHT) för 4 h. aktiv RNA-polymeras II beläggningen mättes genom immunoprecipitation med anti-PolII (pS5), följt av realtids PCR. Figur 4a visar en reproducerbar matsmältning mönster av kromatin från LNCaP celler i tre oberoende experiment. Som visas i figur 4b, DHT ökade signifikant Polii (pS5) beläggning i PSA promotorn och förstärkare när du använder procent inmatningsmetod. Vi har också beräknat beläggningen med hjälp av vik anriknings metoden (figur 4c) och funnit att ingen signifikant skillnad i Polii (pS5) i PSA-promotorn observerades med eller utan DHT behandling. DHT påverkade inte beläggningen i GAPDH-promotorn som tidigare publicerade14. Viktigare, våra data liknade den som erhålls från ultraljudsbehandling-klippt kromatin prover12,13.
Figur 1: Representativa mikrofotografier av tvärbunden cell pellets före och efter ultraljudsbehandling. Tvärbunden VCaP (a), 293T (B), Reh (C) och LNCaP (D) cell pellets behandlades med mnase, och pellets återsuspenderas i chip utspädning buffert. Före och efter ultraljudsbehandling, bilder av suspensioner togs. Scale bar = 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativ aguppstod gel analys av smält kromatin. (A) tvärbunden kromatin bereddes från VCAP-celler och smältes med olika mängder av mnase som beskrivs i steg 2,2. Smält kromatin var omvänd tvärbunden, renas, och analyseras i en 2% aguppstod gel. N en mononukleosome enhet. B) kromatin av VCAP-celler smältes med 250 gel enheter av mnase per 2 x 106 celler vid 37 ° c i 20 minuter och analyserades (enligt beskrivningen i A). Större mängder MNase och längre inkubationstider orsakade nästan fullständig nedbrytning av kromatin för att bilda mononukleosomes (150 BP). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: H3K4me3 beläggning i ar genomet. Smält kromatin bereddes från VCaP celler. (A) digestionsmönstret analyserades med hjälp av en agaros gel. (B) 5 μg nedsmält kromatin immunoprecierades med 2 μg antingen normalt kanin-IgG eller anti-H3K4me3-antikropp som nämns i steg 3,1 och steg 3,2. Immunkomplex tvättades och eluerades från pärlor, och omvänd tvärbunden. Renade DNA-fragment analyserades med hjälp av realtids PCR med de primer-uppsättningar som anges i tabell 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Androgen ökade aktiv RNA-polymeras II beläggning i PSA promotor och förstärkare. Steroid-svalt LNCaP celler behandlades med eller utan 10 nM DHT för 4 h, och smält kromatin var beredd. (A) matsmältning mönster av kromatin från LNCaP celler i tre oberoende experiment. (B,C) Smält kromatin immunoprecierades med en anti-PolII (pS5) antikropp, och DNA-fragment renades enligt beskrivningen för figur 3. Beläggningen av aktivt RNA-polymeras II hos promotorn PSA promotor, förstärkare och GAPDH som en procentuell insats (B) och veck berikning (C) bestämdes med hjälp av realtids PCR med de primer-uppsättningar som anges i tabell 2. De resultat som visas är medelvärdet ± SE av tre oberoende experiment. (*); p < 0,05, (* *); p < 0,01 jämfört med 0 nM DHT behandling. NS inte signifikant jämfört med 0 nM DHT. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Cellinjer | gel enheter per 2 000 000 celler i 100 μL buffert, 37 ° c i 10 min |
| LNCaP | 267 |
| VCaP | 66,7 |
| 293T | 450 |
| REH | 134 |
| 22Rv1 | 400 |
Tabell 1: Optimal mängd micrococcal Nuclease i olika cellinjer. Värdet representerar mängden MNase per 2 x 106 celler i 100 μl buffert, 37 ° c i 10 min.
| Namn på primer | Sekvens | |
| AR (-18,8 KB) | Fwd | ATTTGGAACTGGGAACATCT |
| Rev | CACCTTCTCTCCTCCACTCT | |
| AR (-8.8 KB) | Fwd | TAACAGCTTTGCATCCAAGT |
| Rev | TGAAATCTGGGACTAAAGCA | |
| AR (-8.2 kB) | Fwd | CAGTGCTATTCCCTTGTGAC |
| Rev | TTGGACTGGCTCTATCTTGA | |
| AR-TSS (0 KB) | Fwd | GCAAACTGTTGCATTTGCTC |
| Rev | GGCCCTTTTTCCCTCTGTC | |
| AR (0,6 KB) | Fwd | CACGACCCGCCTGGTTAG |
| Rev | TGAAGACCTGACTGCCTTTTC | |
| AR (+ 1,0 KB) | Fwd | CCGCAAGTTTCCTTCTCTGG |
| Rev | CTTCCCAGCCCTAACTGCAC | |
| AR (+ 11.8 KB) | Fwd | CCTTGCTTGTGGAACTGTAG |
| Rev | TTTATTGTCTGGTGCTAGGC | |
| PSA-promotor | Fwd | CCTAGATGAAGTCTCCATGAGCTACA |
| Rev | GGGAGGGAGAGCTAGCACTTG | |
| PSA-förstärkare | Fwd | GCCTGGATCTGAGAGAGATATCATC |
| Rev | ACACCTTTTTTTTTCTGGATTGTTG | |
| GAPDH | Fwd | TACTAGCGGTTTTACGGGCG |
| Rev | Mer från TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA |
Tabell 2: Ihopkopplade primer-sekvenser som används för spånanalys.
| AR (-18,8 KB) | Cq | Sq | Justerat till en IP- | % Input | Veck berikning |
| 1% ingång | 23,49 | 0,815 | 81,5 | 100 | |
| IP med kontroll-IgG | 27,68 | 0,051 | 0,051 | 0,062 | 1 |
| IP med anti-H3K4me3 | 22,48 | 1,590 | 1,590 | 1,951 | 31,4 |
| AR (-8.8 KB) | Cq | Sq | Justerat till en IP- | % Input | Veck berikning |
| 1% ingång | 23,22 | 0,586 | 58,6 | 100 | |
| IP med kontroll-IgG | 26,81 | 0,052 | 0,052 | 0,088 | 1 |
| IP med anti-H3K4me3 | 23,74 | 0,414 | 0,414 | 0,706 | 8,0 |
| AR (-8.2 kB) | Cq | Sq | Justerat till en IP- | % Input | Veck berikning |
| 1% ingång | 23,19 | 0,643 | 64,3 | 100 | |
| IP med kontroll-IgG | 26,99 | 0,048 | 0,048 | 0,075 | 1 |
| IP med anti-H3K4me3 | 23,63 | 0,477 | 0,477 | 0,742 | 9,9 |
| AR-TSS (0 KB) | Cq | Sq | Justerat till en IP- | % Input | Veck berikning |
| 1% ingång | 25,06 | 0,657 | 65,7 | 100 | |
| IP med kontroll-IgG | 28,63 | 0,050 | 0,050 | 0,077 | 1 |
| IP med anti-H3K4me3 | 20,70 | 15,064 | 15,064 | 22,944 | 299,8 |
| AR (0,6 KB) | Cq | Sq | Justerat till en IP- | % Input | Veck berikning |
| 1% ingång | 23,86 | 0,716 | 71,6 | 100 | |
| IP med kontroll-IgG | 26,67 | 0,106 | 0,106 | 0,147 | 1 |
| IP med anti-H3K4me3 | 19,15 | 17,787 | 17,787 | 24,840 | 168,6 |
| AR (+ 1,0 KB) | Cq | Sq | Justerat till en IP- | % Input | Veck berikning |
| 1% ingång | 23,51 | 0,730 | 73,0 | 100 | |
| IP med kontroll-IgG | 25,94 | 0,125 | 0,125 | 0,171 | 1 |
| IP med anti-H3K4me3 | 19,06 | 18,486 | 18,486 | 25,335 | 147,8 |
| AR (+ 11.8 KB) | Cq | Sq | Justerat till en IP- | % Input | Veck berikning |
| 1% ingång | 24,54 | 0,876 | 87,6 | 100 | |
| IP med kontroll-IgG | 29,14 | 0,033 | 0,033 | 0,037 | 1 |
| IP med anti-H3K4me3 | 24,47 | 0,918 | 0,918 | 1,048 | 27,97 |
Tabell 3: Rådata från kvantitativ PCR-analys för diagram 3. CQ: tröskelvärde cykel nummer, SQ: startkvantitet beräknas med hjälp av en standardkurva, justerad till en IP: multiplicera SQ i 1% input med 100 som 1% provvolym på en IP används för PCR,% input: dividera SQ i IP-prov genom justerad SQ in ingång, veck anrikning : dividera SQ i IP med anti-H3K4me3 med SQ i IP med kontroll IgG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även ultraljudsbehandling används ofta för att få fragmenterad kromatin, det är tidskrävande och besvärligt att identifiera reproducerbara förhållanden. I detta protokoll, vi använde MNase matsmältning eftersom enzym nedbrytning bör vara lättare att identifiera reproducerbara villkor. En kort ultraljudsbehandling steg efter MNase matsmältning (se steg 2,2) var nödvändigt att bryta cellmembranet och att frigöra den smälta kromatin. Därför bör ultraljudsbehandling makten i vårt protokoll vara så låg som möjligt. Vi använder samma ultraljudsbehandling villkor för alla celler vi använde (se figur 1 och tabell 1) för att få fullständig nedbrytning av membranet.
Nedbrytning av kromatin av MNase är ett kritiskt steg i vårt protokoll, och därmed har vi utövat stora ansträngningar för att optimera villkoren för nedbrytning av kromatin inuti celler. Digestionsaktiviteten bestäms av mängden enzym och substrat (kromatin) och inkubationstiden. Dessutom, eftersom ploidi varierar mellan olika celler, de optimala förutsättningarna för MNase matsmältning måste identifieras för varje celltyp. En gång etablerad, samma villkor kan tillämpas oberoende av cell behandlingar. Vi kontrollerar alltid kromatin rötnings mönster i varje experiment för att säkerställa att matsmältningen mönster är lämpliga för ChIP analyser, som visas i figur 2A, Lane 5.
Vissa faktorer påverkar resultatet av Spånanalyser. Det är viktigt att använda rätt mängd smält kromatin i vårt protokoll. I många protokoll, cell nummer men inte mängden kromatin för en IP visas15,16. Dessa experimentella förhållanden ger hög variation i mängden kromatin bland celler på grund av ploiditeten skillnader. Vi använder 5 μg kromatin och 2 μg antikropp per en IP i analysen, vilket innebär att vårt protokoll är mer enkelt och tydligare än andra protokoll, även om det kan behövas optimala mängder antikroppar för IP. Valet av antikroppar är också viktigt; Använd ChIP assay-validerade antikroppar.
Det finns två metoder för att analysera ChIP PCR-data: procent inmatningsmetod och vika anriknings metod. I procent inmatningsmetod, signaler från IP-prover divideras med signaler från total kromatin i IP-provet. I veck anriknings metoden, signaler från IP med en specifik antikropp som H3K4me3 divideras med signaler från IP med kontroll IgG. Den senare metoden är endast tillämplig när signaler från IP med kontroll-IgG är likartade och reproducerbara på flera mål eller identiska mål under de olika fysiologiska förhållandena. I praktiken varierar signalnivåerna så att det anrikning svärdet har hög variabilitet som visas i figur 4c. Därför rekommenderar vi inte att använda metoden Fold berikning för att representera ChIP data i vår metod.
MNase gynnar en euchromatin "öppna" miljö och är inte tillgänglig för en Heterokromatin struktur, vilket tyder på att MNase matsmältningen kan producera vissa bias. Det har rapporterats att anrikning av Lamin A-samverkande kromatin domäner är olika i mellan ultraljudsbehandling-skjupade och MNase-smält kromatin preparat17. Sålunda, MNase nedbrytning i ChIP-analysen kanske inte lämpar sig för att analysera nukleära struktur-associerade molekyler såsom Lamin A/C och särskilda AT-Rich sekvens bindande protein 1 (SATB1).
I ChIP assay protokoll avsedda för nedströms microarray (ChIP-on-chip) eller sekvensering (ChIP-SEQ) analyser, är RNase används under DNA reningssteg, men inte i protokoll avsedda för PCR-analyser18. Vi har inte testat om vårt protokoll är kompatibelt med ChIP-on-chip och ChIP-SEQ analyser, men vi utgår från att vårt protokoll är tillämpligt när prover behandlas med RNase. Om RNase behandling behövs, Använd 2 μL av 10 mg/mL DNase-fri RNase A istället för proteinas K i steg 3,3 och inkubera vid 65 ° c över natten. Före rening av DNA (steg 3,4), tillsätt proteinas K och inkubera i ytterligare 1 h vid 60 ° c.
Vi utför rutinmässigt chip analyser med modifierade Histon och transkriptionsfaktorer med hjälp av den metod som beskrivs här och har visat att den kromatin remodeling faktorn, at-Rich interaktion domän 5b, reglerar ar genuttryck genom att ändra beläggning av polii ( pS5) och H3K4me3 i AR-promotorn19. Vi tror att vårt protokoll är tekniskt lättare än andra ChIP analyser och är allmänt acceptabelt i molekylärbiologi forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av Genentech royalties till City of Hope. Detta arbete stöds inte helt eller delvis av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2x iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 at 25 °C) and 100x BSA (10 mg/mL) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
- Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , Second Edition, Unit 2.1, 2-4 (1992).
- Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
- Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
- Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
- Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
- Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
- Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).
