Summary
O sequenciamento de nanopore é uma nova tecnologia que permite o sequenciamento econômico em locais remotos e configurações pobres em recursos. Aqui, nós apresentamos um protocolo para arranjar em seqüência dos mRNAs do sangue inteiro que é compatível com tais circunstâncias.
Abstract
O sequenciamento em locais remotos e configurações pobres em recursos apresenta desafios únicos. O sequenciamento de nanoporos pode ser usado com sucesso nessas condições e foi implantado na África Ocidental durante a recente epidemia do vírus Ebola, destacando essa possibilidade. Além de suas vantagens práticas (baixo custo, facilidade de transporte e uso de equipamentos), esta tecnologia também fornece vantagens fundamentais sobre as abordagens de sequenciamento de segunda geração, particularmente o comprimento de leitura muito longo, a capacidade de sequenciar diretamente RNA e disponibilidade em tempo real dos dados. A precisão de leitura bruta é menor do que com outras plataformas de sequenciamento, o que representa a principal limitação dessa tecnologia; no entanto, isso pode ser parcialmente atenuado pela alta profundidade de leitura gerada. Aqui, nós apresentamos um protocolo campo-compatível para arranjar em seqüência da codificação de mRNAs para Niemann-Pick C1, que é o receptor celular para Ebolavirus. Este protocolo abrange a extração de RNA de amostras de sangue animal, seguido por RT-PCR para enriquecimento alvo, código de barras, preparação da biblioteca, e o seqüenciamento próprio executar, e pode ser facilmente adaptado para uso com outros alvos de DNA ou RNA.
Introduction
O sequenciamento é uma ferramenta poderosa e importante na pesquisa biológica e biomédica. Permite a análise dos genomas, das variações genéticas, e dos perfis da expressão do RNA, e joga assim um papel importante na investigação das doenças humanas e animais iguais1,2. Sequenciamento de Sanger, um dos métodos mais antigos disponíveis para sequenciamento de DNA, ainda é rotineiramente usado até hoje e tem sido uma pedra de canto de biologia molecular. Ao longo dos últimos 50 anos, esta tecnologia foi melhorada para alcançar comprimentos de leitura de mais de 1.000 NT e uma precisão tão alta quanto 99,999%1. No entanto, o sequenciamento de Sanger também tem limitações. Seqüenciamento de um conjunto maior de amostras ou a análise de genomas inteiros com este método é demorado e caro1,3. Os métodos de sequenciamento de DNA de segunda geração (de última geração), como 454 pirosequenciação e tecnologia Illumina, nos permitiram reduzir significativamente o custo e a carga de trabalho necessários para o sequenciamento na última década, e levaram a um tremendo aumento na quantidade de informação de sequência biológica disponível4. No entanto, o seqüenciamento individual é executado usando essas tecnologias de segunda geração são caras, e seqüenciamento em condições de campo é desafiador, como o equipamento necessário é volumoso e frágil (semelhante a dispositivos de sequenciamento Sanger), e muitas vezes tem que ser calibrado e atendido por pessoal especialmente treinado. Além disso, para muitas das tecnologias de segunda geração, os comprimentos de leitura são bastante limitados, o que muitas vezes torna a análise de Bioinformática downstream desses dados desafiadores.
O sequenciamento de terceira geração usando dispositivos de sequenciamento de nanoporos de bolso (ver tabela de materiais) pode servir como uma alternativa para essas plataformas de sequenciamento estabelecidas. Nesses dispositivos, uma molécula de DNA ou RNA de cadeia única passa através de um nanoporo simultaneamente com uma corrente iónica que é então medida por um sensor (Figura 1). Como a vertente atravessa o nanopore, a modulação da corrente pelos nucleotídeos presentes nos poros em um determinado momento é detectada, e computacionalmente retrotraduzida para a sequência de nucleotídeo5. Devido a este princípio operacional, o sequenciamento de nanoporos permite a geração de leituras muito longas (perto de 1 x 106 nucleotídeos6) e a análise de dados de sequenciamento em tempo real. A codificação de barras é possível anexando sequências de nucleotídeo definidas aos ácidos nucleicos em uma amostra, o que permite a análise de várias amostras em uma única execução de seqüenciamento, aumentando assim a taxa de transferência da amostra e diminuindo por custos de amostragem. Devido à sua alta portabilidade e facilidade de uso, os dispositivos de sequenciamento de nanoporos têm sido usados com sucesso no campo durante a recente epidemia de doença do vírus Ebola na África Ocidental, destacando sua adequação para a implantação rápida em regiões remotas7 , a 8.
Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado campo-compatível para arranjar em seqüência da codificação do mRNA para a proteína de Niemann-Pick C1 (NPC1), que é o receptor obrigatório da entrada para Filovirus tais como Ebolavirus, e foi mostrado para limitar a susceptibilidade da espécie ao estes vírus9,10. O protocolo abrange a extração de RNA inteiro a partir de amostras de sangue, amplificação específica de NPC1 mRNA por RT-PCR, código de barras de amostras, preparação da biblioteca e sequenciamento com um dispositivo de sequenciamento de nanoporos. A análise dos dados não pode ser discutida devido a limitações espaciais, embora algumas direções básicas sejam fornecidas nos resultados representativos; no entanto, o leitor interessado é encaminhado para uma publicação anterior11 para uma descrição mais detalhada do fluxo de trabalho que utilizamos, bem como para publicações de outros12,13,14 para informações detalhadas sobre as ferramentas de análise utilizadas neste fluxo de trabalho.
Protocol
As amostras foram coletadas após o protocolo de revisão institucional da Universidade de Njala (NUIRB). IRB00008861/FWA00018924.
1. extração de RNA de amostras de sangue
- Colete 3 mL de sangue total das espécies a serem analisadas em um tubo de coleta de sangue pré-preenchido com 6 mL de reagente estabilizante de DNA/RNA (ver tabela de materiais) e misture invertendo 5 vezes. Guarde a amostra de sangue durante um mês a 4 ° c.
- Transfira o conteúdo do tubo de coleta de sangue para um tubo de coleta de 50 mL, adicione 120 μL de proteinase K e misture por vortexing por 5 s. Incubar a amostra por 30 min à temperatura ambiente.
- Adicione 9 mL de isopropanol à mistura e vórtice por 5 s.
- Coloc um reservatório em uma coluna da rotação da purificação do RNA (veja a tabela dos materiais) e coloc o conjunto em um colector de vácuo (veja a tabela de materiais). Adicione a mistura de amostras no reservatório. Aplique um vácuo até que todo o líquido tenha passado através da coluna.
- Alternativamente, se nenhum coletor de vácuo está disponível, o sangue pode ser passado através da coluna em 700 porções do μL pela centrifugação repetida por 30 s em 12.000 x g com o fluxo-através Descartado entre etapas da centrifugação. No entanto, isso exigirá aproximadamente 26 etapas de centrifugação.
- Coloque a coluna de rotação de purificação de RNA em um tubo de coleta e adicione 400 μL de tampão de preparação de DNA/RNA (ver tabela de materiais). Centrifugador em 12.000 x g por 30 s e descarte o fluxo-através de.
- Adicionar 400 μL de tampão de lavagem de ADN/RNA (ver tabela de materiais) à coluna, centrifugar a 12.000 x g por 30 s e descartar o fluxo.
- Misturar 5 μL de DNase I (1 U/μL) (ver tabela de materiais) com 75 μL de tampão de digestão de ADN (ver tabela de materiais) e adicionar a mistura na coluna. Incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 400 μL de tampão de preparação de ADN/RNA à coluna e centrifugar a 12.000 x g durante 30 s. descarte o fluxo.
- Lave a coluna com 700 μL de tampão de lavagem de ADN/RNA e centrifugue a 12.000 x g durante 30 s. descarte o fluxo.
- Repita o passo 1,9 com 400 μL de tampão de lavagem de ADN/RNA e centrifugue a 12.000 x g durante 2 min para remover todo o tampão de lavagem residual e para secar a coluna. Ao remover a coluna do tubo de coleta, certifique-se de não molhar a parte inferior da coluna com o buffer no tubo de coleta.
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Coloque a coluna num novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 70 μL de água sem nuclease. Incubar durante 1 min à temperatura ambiente e centrifugador por 30 s a 12.000 x g. Armazene o RNA em-80 ° c até o uso mais adicional (ou use-o imediatamente).
- Opcional: Para quantificar o RNA, tomar uma alíquota e determinar a concentração usando um espectrofotômetro UV (ver tabela de materiais).
2. transcrição reversa de NPC1 mRNA em cDNA
- Num tubo de reacção de 0,2 mL, adicione 8 μL de RNA de modelo (1 pg a 2,5 μg de RNA) e 1 μL cada um de 10x tampão DNase e enzima DNase (ver tabela de materiais). Incubar a 37 ° c durante 2 min. Subsequentemente, centrifugue a reacção brevemente e coloque-a no gelo.
- Adicione 4 μL de mistura mestra de transcriptase reversa (ver tabela de materiais) e 6 μL de água sem nuclease ao tubo de reacção e misture suavemente. Incubar a reacção num termocicer durante 10 min a 25 ° c (para recozimento primário), seguido de 10 min a 50 ° c (para transcrição reversa do RNA). Para inativar a enzima, incubar por 5 min a 85 ° c.
- Transfira o cDNA para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e armazene a-80 ° c até o uso posterior (ou use imediatamente).
3. amplificação do quadro de leitura aberto NPC1
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Passo de amplificação inicial
- Configurar um PCR de touchdown15,16 para amplificar o cDNA NPC1 com primer Set 1 (ver tabela 1), usando um início quente de alta fidelidade DNA polimerase (ver tabela de materiais) com o tampão de reação apropriado em uma reação de 50 μL volume com 1 μL de modelo. Se possível, configure a reacção no gelo ou num bloco frio de 4 ° c.
- Incubar a reacção num termociclorador com uma etapa inicial de desnaturação de 30 s a 98 ° c, seguida de 10 ciclos, com denaturação a 98 ° c por 10 s, recozimento primário para 20 s a 65 ° c, diminuindo a temperatura em 0,5 ° c por ciclo e alongamento por 1 min a 72 ° c. Subseqüentemente, execute uns 20 ciclos adicionais com 10 s em 98 ° c, 20 s em 60 ° c, e 1 minuto em 72 ° c, seguido por uma etapa final do alongamento de 5 minutos em 72 ° c.
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Purificação do PCR usando grânulos magnéticos
- Transfira 50 μL de produto de PCR para um tubo de reacção de ligação de ADN-baixa de 1,5 mL (ver tabela de materiais). Ressuscite grânulos magnéticos (veja a tabela de materiais) completamente vortexing e adicione 50 μL de grânulos à reação do PCR. Misture bem. Incubar a amostra num misturador rotativo (ver tabela de materiais) durante 5 min à temperatura ambiente (a 15 rpm).
- Gire momentaneamente para baixo a amostra e coloc o tubo do microcentrifugador de 1,5 mL em uma cremalheira magnética (veja a tabela dos materiais) para aglomerar os grânulos magnéticos. Aguarde até que o sobrenadante tenha sido completamente esclarecido antes de prosseguir com a próxima etapa.
- Aspirar o sobrenadante sem perturbar a pelota do grânulo e descartar.
- Pipetar 200 μL de 70% de etanol para o tubo de reacção e incubar por 30 s. Aspire o etanol sem perturbar o pellet e descarte. Repita para um total de duas lavas. Certifique-se de que nenhum etanol é deixado. Pode ser necessário aspirar primeiramente com uma pipeta maior (por exemplo, 1000 μL), e então remover todas as gotas restantes do álcool etílico com uma pipeta menor (por exemplo, 10 μL).
- Seque o pellet durante 1 min à temperatura ambiente.
- Retire o tubo de reacção da cremalheira magnética, ressuscitem o pellet em 30 μL de água sem nuclease e incubar durante 2 min à temperatura ambiente.
- Coloque o tubo de reação de volta na cremalheira magnética e aguarde até que as contas são completamente peletizadas.
- Retire o sobrenadante sem perturbar o pellet e transferi-lo para um novo tubo de reacção de 1,5 mL.
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Adição de adaptadores de código de barras por PCR aninhado
- Configurar um PCR do touchdown de 50 μL com o polymerase de alta fidelidade do ADN do começo quente com amortecedor da reação 5x e o primer ajustou 2 (veja tabela 1). Os primers neste conjunto consistem em uma região específica de sequência de destino para permitir a ligação de produtos de PCR gerados na etapa 3,2 (dentro do primer Set 1 sequências), bem como uma sequência de adaptador que é usada como alvo na reação de PCR de código barras subseqüente (cf. seção 4). Se possível, configure a reacção no gelo ou num bloco frio de 4 ° c. Utilize 1 μL do produto de PCR purificado preparado na secção 3,2 como modelo.
- Incubar a mistura da reação em um termociclador usando uma etapa inicial da desnaturação de 30 s em 98 ° c, seguido por 10 ciclos com a desnaturação em 98 ° c para 10 s, recozimento da primeira demão para 20 s em 65 ° c, abaixando a temperatura por 0,5 ° c por o ciclo e alongamento por 1 min a 72 ° c. Posteriormente, incubar a reação por mais 30 ciclos por 10 s a 98 ° c, 20 s a 71 ° c e 1 min a 72 ° c, seguidos de uma etapa final de alongamento de 5 min a 72 ° c.
- Limpe o produto do PCR usando grânulos magnéticos como descrito na seção 3,2.
4. código de barras de NPC1 amplicons
- Para cada produto do PCR gerado na seção 3, ajuste acima uma reação do PCR do código barras em um tubo da reação de 0,2 ml usando 50 μL da mistura mestra do polymerase 2x do ADN de Taq (veja a tabela dos materiais), 2 μL de um dos primers do código de barras de um jogo do código barras do PCR (veja a tabela de materiais e tabela 2) e 1 μL de produto de PCR purificado da etapa 3.3.2 como modelo. Adicionar 47 μL de água nuclease livre para obter um volume final de 100 μL.
- Incubar a reacção num termocicer a 95 ° c durante 3 min como desnaturação inicial. Em seguida, execute 15 ciclos para 15 s a 95 ° c, 15 s a 62 ° c e 1,5 min a 65 ° c. Como um alongamento final, incubar a reação a 65 ° c por 5 min.
- Purify o produto do PCR como descrito abaixo de 3,2, mas use 100 μl de grânulos magnéticos e de eluir em 30 μl da água nuclease-livre.
- Se possível, quantificar a amostra usando um espectrofotômetro UV.
5. preparação da biblioteca
- Combine uma quantidade igual de DNA codificado em cada amostra para um total de 1 μg de DNA em um volume de 45 μL (se necessário, adicione água sem nuclease) em um tubo de reação de 0,2 mL. Se nenhum espectrofotômetro UV estiver disponível, use volumes iguais de cada amostra. Para dA-tailing, adicione 7 μL de tampão de reacção de preparação final (ver tabela de materiais), 3 μL de mistura enzimática de preparação final (ver tabela de materiais) e 5 μL de água sem nuclease. Misture suavemente, sacudendo o tubo.
- Incubar a reacção durante 5 min a 20 ° c, seguida de 5 min a 65 ° c num termocicer.
- Purifique o produto de reacção conforme descrito na secção 3,2, mas utilize 60 μL de grânulos magnéticos e eluir em 25 μL de água sem nuclease.
- Opcional: tomar 1 μl para quantificar a concentração da amostra utilizando um espectrofotômetro UV. O montante total deve ser superior a 700 ng.
- Combine 22,5 μL de ADN purificado a partir do passo 5,3 com 2,5 μL de adaptador 1D2 (ver tabela de materiais) e 25 μL de mistura Master de ligase Blunt/ta (ver tabela de materiais) num novo tubo de reacção de ligação de adn-baixa de 1,5 ml, misture suavemente, e rode brevemente para baixo. Incubar por 10 min à temperatura ambiente.
- Purify o produto da reação como descrito na seção 3,2, mas use 20 μL de grânulos magnéticos, aumente o tempo da incubação para a ligação do ADN a 10 minutos, realize duas etapas da lavagem com 1 ml do ethanol cada, e eluir em 46 μl da água nuclease-livre.
- Combine 45 μL do produto da reacção da etapa 5,6 com 5 μL da mistura do adaptador do código de barras (veja a tabela de materiais) e 50 μL da mistura do mestre da ligase de Blunt/ta em um tubo de reacção de ligação do ADN-baixo. Misture suavemente, mexendo e incubar por 10 min à temperatura ambiente.
- Purify o produto da reação como descrito na seção 3,2, mas use 40 μL de grânulos magnéticos, faça duas etapas da lavagem com 140 μL do amortecedor de ABB (veja a tabela dos materiais) em vez do ethanol, ressuscite os grânulos folheando e pelota em uma cremalheira magnética. Elute em 15 μL de tampão de eluição (ver tabela de materiais). Aumente os tempos de incubação para a ligação inicial do DNA aos grânulos, bem como para a etapa de eluição a 10 min. armazene o produto resultante no gelo ou a 4 ° c até o uso.
6. verificação da qualidade da pilha de fluxo
- Realize uma verificação de qualidade na célula de fluxo antes de usar. Para esse fim, conecte o dispositivo de seqüenciamento ao computador host e abra o software.
- Insira uma célula de fluxo (consulte a tabela de materiais) no dispositivo de sequenciamento e escolha o tipo de célula de fluxo na caixa de seletor e confirme clicando em disponível.
- Clique em verificar célula de fluxo na parte inferior da tela e escolha o tipo de célula de fluxo correto.
- Clique em Iniciar teste para iniciar a verificação de qualidade. Um mínimo de 800 nanoporos ativos no total é necessário para que a célula de fluxo seja utilizável.
7. carregando a célula de fluxo e iniciando a execução de seqüenciamento
- Abra a tampa da porta de escorva deslizando-a no sentido horário. Defina uma pipeta P1000 para 200 μL e insira a ponta na porta de escorva. Ajuste a pipeta para 230 μL, mantendo a ponta na porta de escorva, para elaborar 20-30 μL de tampão e remover quaisquer bolhas de ar.
- Num novo tubo de reacção de ligação de ADN-baixa de 1,5 mL, prepare a mistura de escorva combinando 576 μL de tampão RBF (ver tabela de materiais) com 624 μL de água sem nuclease.
- Pipetar cuidadosamente 800 μL da mistura de escorva preparada para o porto de escorva e aguardar 5 min. Levante a tampa da porta da amostra e pipetar um adicional de 200 μL da mistura de escorva preparada para o porto de escorva.
- Pipetar 35 μL de tampão RBF num novo tubo de reacção de baixa ligação de 1,5 mL de ADN. Misture completamente as esferas LLB (ver tabela de materiais) introduzindo pipetagem e adicione 25,5 μL dos grânulos ao tampão RBF. Adicionar 2,5 μL de água sem nuclease e 12 μL de biblioteca de ADN do passo 5,8 e misturar com pipetagem.
- Adicionar 75 μL da mistura de amostras de forma lenta à célula de fluxo através da porta de amostra.
- Substitua a tampa da porta de amostra, feche a porta de escorva e feche a tampa do dispositivo de sequenciamento.
- No software, confirme se a célula de fluxo ainda está disponível, abra um novo experimento e configure os parâmetros de execução selecionando o kit usado. Selecione chamada de base ao vivo. Inicie a execução de sequenciamento clicando em Iniciar experimento. Continue a execução de seqüenciamento até que dados experimentais suficientes sejam coletados.
Representative Results
Em um experimento representativo para testar o protocolo apresentado, extraímos o RNA de 10 amostras de sangue diferentes de cinco espécies animais (i.e., 2 indivíduos por espécie (caprinos, ovinos, suínos, cães, bovinos)) (tabela 3). Os rendimentos do RNA e a qualidade que seguem a extração podem variar extensamente, no detalhe devido às diferenças na manipulação e no armazenamento da amostra. Em nosso experimento representativo, observamos concentrações de RNA entre 43 NG e 543 ng por μL (tabela 3). Além disso, após a amplificação por RT-PCR, a análise de gel do NPC-1 PCR-Products apresentou vários desfechos (Figura 2), com bandas marcadamente mais fracas para as amostras BC01 e BC02 (ambos caprinos). Estas diferenças foram provavelmente causadas por diferenças na qualidade da amostra, embora as diferenças na eficácia da PCR devido às diferenças na ligação da cartilha ao gene NPC1 de diferentes espécies não possam ser excluídas. No entanto, essas diferenças de rendimento e/ou eficiência de amplificação não impactam acentuadamente o desfecho geral de sequenciamento. Além disso, um produto adicional de PCR não específico ocorreu na amostra BC10 (bovinos). Em contraste com o sequenciamento de Sanger, esses produtos não específicos não influenciam negativamente os resultados do sequenciamento de nanoporos, pois essas leituras são descartadas durante o mapeamento das leituras obtidas para uma sequência de referência como parte da análise dos dados.
Antes de cada execução de sequenciamento, uma verificação de qualidade da célula de fluxo a ser usada é fortemente recomendada, com um requisito mínimo de 800 poros totais. Em nosso experimento representativo, esta verificação de qualidade retornou 1.102 poros disponíveis para seqüenciamento. Como os dados são fornecidos em tempo real e podem ser analisados imediatamente, o comprimento de uma execução de seqüenciamento pode ser ajustado para o aplicativo individual (ou seja, até que dados de seqüenciamento suficientes sejam produzidos para a análise desejada). Em nossos experimentos, as execuções de seqüenciamento geralmente são executadas durante a noite e, no caso de nosso experimento representativo, obtivemos aproximadamente 1,4 milhões leituras durante uma corrida de 14 h.
Dependendo do tipo de análise de dados a ser realizada, pode ser aconselhável processar apenas um subconjunto das leituras obtidas. No caso de nosso experimento representativo, um subconjunto de 10.000 leituras foi selecionado para posterior análise. Para este fim, os arquivos fastq gerados durante a execução de seqüenciamento foram processados em um ambiente Ubuntu 18, 4 LTS, e é usando FlexBar v 3.0.3 com parâmetros otimizados para demultiplexação de dados de sequenciamento de nanoporos (código de barras-cauda-comprimento 300 , código de barras-erro-taxa 0,2, código de barras-Gap-penalidade-1)12. Após a Desmultiplexação, o mapeamento de leitura e a geração de consensos podem ser feitos usando uma série de ferramentas diferentes, mas uma discussão detalhada sobre o aspecto da bioinformática do sequenciamento de nanoporos vai além do escopo deste manuscrito. No entanto, no caso de nossos resultados representativos, o mapeamento de leitura para uma sequência de referência foi realizado com o uso de Geneious 10.2.3. Das 10.000 leituras analisadas, 5.457 mostraram um comprimento entre 1.750 e 2.000 nucleotides, que corresponde aos tamanhos esperados para os fragmentos de PCR amplificados como parte do nosso fluxo de trabalho (1.769 NT, Figura 3). Um pico adicional na distribuição do comprimento das leituras foi observado entre 250 a 500 nucleotides, que pode ser atribuído aos produtos inespecíficos do PCR. A desultiplexação das leituras permitiu a atribuição de 87,6% das leituras a um dos 10 códigos de barras/amostras analisadas (Figura 4). A proporção de leituras desultiplexadas para cada código de barras variou de 3,4% para código de barras 1 a 16,9% para código de barras 10; no entanto, devido ao grande número geral de leituras, isso ainda permitiu um consenso significativo chamando com uma alta profundidade de leitura, mesmo para esses conjuntos de dados de código de barras de abundância inferiores. De fato, o mapeamento das leituras classificadas para uma seqüência de referência de NPC1 resultou em entre 31,7% (código de barras 2) e 100% (código de barras 7 e 8) de leituras mapeando para a referência, dando uma profundidade de leitura de mais de 90 leituras em qualquer posição para cada amostra. Isso é mais do que adequado para permitir que a base de consenso confiável de chamada com uma taxa de erro insignificante.
Figura 1: representação esquemática do sequenciamento de DNA usando tecnologia nanoporo. Uma molécula de DNA de cadeia única passa através de um nanoporo embutido em uma membrana eletricamente resistente, com uma helicase que regula a velocidade de transição. Uma corrente iónica passa simultaneamente através do poro e é medida continuamente. As modulações da corrente causada pelos nucleotídeos atuais nos poros são detectadas e computacionalmente retrotraduzidas na seqüência do nucleotide da costa do ADN. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: amplificação dos produtos de PCR de Niemann-Pick C1 do mRNA. o mRNA foi isolado de caprinos (BC01 e 02), ovinos (BC03 e 04), suínos (BC05 e 06), cães (BC07 e 08) e bovinos (BC09 e 10). Os produtos Nested do PCR foram separados em um gel do agarose de 0,8% no amortecedor de 1x TAE (preparado do amortecedor de 50x TAE: 242,28 g da base de Tris, 57,1 mL do ácido acético glacial, 100 mL do EDTA de 0,5 M, dH2o a 1 L, pH ajustado a 8,0) para 45 minutos em 100 V e manchado com SYBR safe. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: distribuição de leitura-comprimento de 10.000 leituras do experimento representativo. O número de leituras obtidas com um determinado intervalo de comprimento de leitura é indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: distribuição de leituras após demultiplexação. São mostrados o número e a percentagem de leituras desultiplexadas (cinzentas) e mapeadas (pretas) para cada código de barras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: síntese dos conjuntos de primers utilizados. A amplificação inicial das sequências alvo foi realizada com primer Set 1. Primer set 2 foi então usado para amplificação aninhada e adição de adaptador. Os adaptadores são indicados em vermelho. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela 2: visão geral das sequências de código de barras. Códigos de barras individuais foram usados para identificar cada amostra seqüenciada. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela 3: concentrações de RNA obtidas após extração de amostras de sangue seqüenciadas no experimento representativo. As concentrações de RNA de dois indivíduos de cada uma das cinco espécies são mostradas, e as proporções das densidades ópticas em 260/280 nm e 260/230 nm são indicadas. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
Nas últimas duas décadas, o sequenciamento de amostras biológicas tornou-se um aspecto cada vez mais importante dos estudos em uma ampla gama de áreas de assunto. O desenvolvimento de sistemas de sequenciamento de segunda geração com base no sequenciamento de uma matriz densa de recursos de DNA usando ciclos iterativos de manipulação enzimática e aquisição de dados baseada em imagem1 aumentou drasticamente o throughput comparado ao técnica de sequenciamento de Sanger tradicional, e permite a análise de várias amostras, bem como várias espécies de ácidos nucleicos em uma determinada amostra em paralelo4. No entanto, para a maioria dos sistemas de segunda geração comumente usados, somente leituras curtas são produzidas, e todas as plataformas dependem de equipamentos sensíveis, volumosos e caros3,4.
Em contraste com as plataformas de sequenciamento de segunda geração, o dispositivo de sequenciamento utilizado neste protocolo é baseado na tecnologia nanoporo. Aqui uma molécula de ácido nucleico de cadeia única passa através de um nanopore, resultando na modulação de uma corrente iónica que também flui através do mesmo nanopore, e que pode ser medido e retrotraduzido para inferir a seqüência da molécula de ácido nucleico. Essa abordagem de sequenciamento de terceira geração oferece uma série de vantagens em relação a outras abordagens. As principais vantagens que estão diretamente relacionadas com o princípio de funcionamento exclusivo desta tecnologia são o comprimento de leitura extremamente longo produzido (comprimentos de leitura de até 8,8 x 105 nucleotídeos foram relatados6), a capacidade de seqüência não só o DNA, mas também o RNA diretamente, que foi demonstrado recentemente para um genoma completo17do vírus da gripe, e a habilidade de analisar dados no tempo real enquanto estão sendo gerados, que permite a deteção rápida do metagenômica dos micróbios patogénicos dentro dos minutos18. Vantagens práticas adicionais são o tamanho extremamente pequeno do dispositivo de sequenciamento de nanoporos, permitindo o seu uso em qualquer laboratório ou em missões de campo para locais remotos19,20, e o baixo preço em comparação com outros sequenciamento Plataformas. Em termos de custos de funcionamento, atualmente uma nova célula de fluxo é necessária para cada execução de seqüenciamento, o que resulta em custos de cerca de $1100 por execução para a célula de fluxo e reagentes de preparação de biblioteca. Esses custos podem ser reduzidos em alguns casos, lavando e reutilizando a célula de fluxo, ou por código de barras e seqüenciamento de várias amostras em uma única execução. Além disso, um novo tipo de célula de fluxo está sendo testado beta por um pequeno número de laboratórios, o que exigirá o uso de um adaptador de célula de fluxo (chamado de "flongle"), e deve reduzir significativamente o preço da célula de fluxo e, portanto, os custos de execução.
A maior lacuna do sequenciamento de nanoporos continua sendo sua acurácia, com precisão de leitura única na faixa de 83 a 86% sendo relatada6,21,22e a maioria das imprecisões causadas por inserção/deleções ( indels)5,21. No entanto, a profundidade de leitura elevada pode compensar essas imprecisões, e um estudo recente sugerido com base em Considerações teóricas que uma profundidade de leitura de > 10 pode aumentar a precisão geral para > 99,8%21. No entanto, novas melhorias na precisão serão necessárias, especialmente se a análise deve ser realizada em um nível de molécula única, em vez de em um nível de seqüência de consenso. O uso da tecnologia 1D2 como descrito neste protocolo, que é baseado na adição dos adaptadores 1D2 e do código de barras (cf. seção 5,5) que resultam em ambas as vertentes de uma única molécula do ADN que está sendo seqüenciada pelo mesmo nanopore, aumentos lidos a exatidão desde que as informações de ambas as costas do ADN podem ser usadas para a determinação da seqüência. Além disso, uma estratégia de solução alternativa que pode ser prosseguida, a fim de combinar as vantagens do sequenciamento de nanoporos (particularmente longo comprimento de leitura) com a maior precisão de outras tecnologias de sequenciamento é usar informações de sequenciamento de nanoporos como um andaime, que é em seguida, polido usando dados de sequenciamento de outras plataformas6.
O fator mais crítico para o sucesso do protocolo aqui apresentado é a qualidade da amostra e, principalmente, a quantidade e a qualidade do RNA extraído. O armazenamento apropriado e a extração alerta do RNA ajudam em conseguir um rendimento adequado do RNA. O uso de tubos de coleta de sangue adequados permite o armazenamento de amostras de sangue por até um mês, mas a coagulação do sangue pode ser um problema, especialmente quando as amostras estão sendo armazenadas em temperaturas elevadas, o que pode ser o caso em condições de campo. A segunda etapa crítica é a amplificação das sequências alvo, e particular condições de campo as reações do PCR executam frequentemente menos poço do que circunstâncias padrão do laboratório7. Para este fim, o projeto e a optimização cuidadosos da primeira demão são primordial conseguir a amplificação robusta. Adicionalmente, as aproximações aninhadas do PCR e o PCR do touchdown, como usados neste protocolo, podem aumentar a especificidade e a sensibilidade da amplificação do gene do alvo4,7. Com efeito, na nossa experiência na Libéria e na Guiné com esta tecnologia foram necessários protocolos aninhados em condições de campo com amostras de campo, mesmo para conjuntos de primers que permitiram a amplificação de alvos de amostras laboratoriais e em condições laboratoriais com uma única rodada de PCR (7 e resultados inéditos).
Em contraste com essas etapas mais críticas, a preparação da biblioteca e a execução de sequenciamento propriamente dita são procedimentos bastante robustos. No entanto, em condições de campo, questões práticas, como a disponibilidade de certas peças de equipamentos podem ser problemáticas. Por exemplo, um espectrofotômetro UV é necessário para determinar as concentrações de DNA antes da preparação da biblioteca de amostras com código de barras. No entanto, caso tal dispositivo não esteja disponível em condições de campo, um volume igual de cada amostra pode ser simplesmente combinado para compensar os 45 μL necessários para a preparação da biblioteca, com diferenças no material de entrada da amostra, em seguida, sendo geralmente atenuada pela grande número de leituras. Da mesma forma, a necessidade de conectividade com a Internet para a execução de seqüenciamento pode ser um problema, mesmo que a chamada base não tenha mais que ser realizada online, mas pode ser feita localmente; no entanto, esta necessidade pode ser removida em determinadas circunstâncias pelo fabricante, se necessário.
Em resumo, o protocolo apresentado permite um sequenciamento relativamente baixo custo em locais sem acesso ao equipamento de sequenciamento tradicional, incluindo em locais remotos. Pode facilmente ser adaptado a todo o RNA ou ADN do alvo, assim permitindo que os investigadores respondam a perguntas biológicas numerosas.
Disclosures
TH participou do programa de acesso antecipado da Oxford Nanopore Technologies (ONT) MinION de 2014 a 2015, e recebeu dispositivos MinION e células de fluxo para um estudo anterior 7 realizado pelos institutos nacionais de saúde, EUA, gratuitamente ou a custos reduzidos . Ele foi convidado pela ONT para apresentar parte desse trabalho na London Calling 2015 reunião em Londres, Reino Unido, e ONT pago para o transporte e alojamento. Para o trabalho apresentado neste manuscrito, não foram obtidos benefícios (por exemplo, hardware ou reagentes a custo reduzido, reembolsos de viagem, etc.) do ONT. AM, KF e RS não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Allison Groseth pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Ministério Federal alemão da alimentação e da agricultura (BMEL) baseado em uma decisão do parliament da República de Germany federal através do escritório federal para a agricultura e a alimentação (BLE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beads | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK308 | 1D² Sequencing Kit |
| Blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagent | Zymo Research | R1150 | DNA/RNA Shield - Blood Collection Tube |
| Blunt/TA ligase master mix | New England Biolabs | M0367S | Blunt/TA Ligase Master Mix |
| DNA-low binding reaction tube | Eppendorf | 30108051 | DNA LoBind Tube |
| DNase buffer and DNase | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
| Flow cell | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN105.24 | flow cell R9.4 |
| Hot start high fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0493L | Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U) |
| Magnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | Agencourt AMPure XP beads |
| Magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | DynaMag-2 Magnet |
| Nanopore sequencing device | Oxford Nanopore Technologies | - | MinION Mk 1B |
| PCR barcoding kit | Oxford Nanopore Technologies | EXP-PBC001 | PCR Barcoding Kit I (R9) |
| Reverse transcriptase master mix | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
| RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion buffer | Zymo Research | R1151 | Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit |
| Rotating mixer | ThermoFisher Scientific | 15920D | HulaMixer Sample Mixer |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0287S | LongAmp Taq 2x Master Mix |
| Ultra II End-prep kit | New England Biolabs | E7546S | NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul |
| UV spectrophotometer | Implen | - | NanoPhotometer |
| Vacuum manifold | Zymo Research | S7000 | EZ-Vac Vacuum Manifold |
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