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Biochemistry

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59387
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics, University of Virginia School of Medicine

Summary

3D 단일 분자 국소화 현미경 검사법은 살아있는 세균 세포에서 형광표지된 단백질의 공간 위치 및 운동 궤적을 조사하는 데 사용됩니다. 본원에 기재된 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 풀화된 단일 분자 궤적에 기초하여 세포성 단백질의 널리 퍼진 확산 거동을 결정한다.

Abstract

단 하나 분자 현지화 현미경 검사법은 수십 나노미터 공간 및 밀리초 측두력 해결책으로 살아있는 세포에 있는 개별 분자의 위치 그리고 운동을 조사합니다. 이러한 기능은 생리학적으로 관련된 환경에서 분자 수준의 생물학적 기능을 연구하는 데 이상적으로 적합한 단일 분자 국소화 현미경 검사법을 만듭니다. 여기서, 우리는 관심 있는 단백질이 나타낼 수 있는 상이한 확산 상태를 추출하기 위해 단일 분자 추적 데이터의 획득 및 처리/분석을 위한 통합 프로토콜을 입증한다. 이 정보는 살아있는 세포에 있는 분자 복합체 대형을 정량화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 우리는 카메라 기반의 3D 단일 분자 국소화 실험뿐만 아니라 개별 분자의 궤적을 산출하는 후속 데이터 처리 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 궤적은 형광표지된 분자및 이 상태의 상대적인 풍부의 널리 퍼진 확산 상태를 추출하기 위하여 수치 분석 프레임워크를 사용하여 분석됩니다. 분석 프레임워크는 임의의 셀 기하학에 의해 공간적으로 제한된 세포 내 브라우니안 확산 궤적의 스토시 시뮬레이션을 기반으로 합니다. 시뮬레이션된 궤적을 기반으로 원시 단일 분자 이미지가 실험 이미지와 동일한 방식으로 생성되고 분석됩니다. 이러한 방식으로 실험적으로 교정하기 어려운 실험 정밀도와 정확도 제한은 해석 워크플로우에 명시적으로 통합됩니다. 널리 사용되는 확산 상태의 확산 계수 및 상대 모집단 분율은 시뮬레이션된 분포의 선형 조합을 사용하여 실험 값의 분포를 피팅하여 결정됩니다. 우리는 세균성 병원체의 시토솔에서 호모- 및 이종 올리고머 복합체를 형성할 때 다른 확산 상태를 나타내는 단백질의 확산 상태를 해결함으로써 프로토콜의 유용성을 입증합니다.

Introduction

생체 분자의 확산 거동을 검사하면 생물학적 기능에 대한 통찰력을 제공합니다. 형광 현미경 검사법 기반 기술은 그들의 모국적인 세포 환경에서 생체 분자를 관찰하기위한 귀중한 도구가되었습니다. 광표백(FRAP) 및 형광 상관분광법(FCS)1 후형광 회복은 앙상블 평균 확산 거동을 제공합니다. 반대로, 단 하나 분자 현지화 현미경 검사법은 높은 공간 및 시간분해능을가진 개별형질 표를 붙인 분자의 관찰을 가능하게 합니다2,3,4. 관심 있는 단백질이 다른 확산 상태에 존재할 수 있기 때문에 개별 분자를 관찰하는 것은 유리합니다. 예를 들어, 대장균의CueR과 같은 전사 조절기가 시토솔에서 자유롭게 확산되거나 DNA 서열에 결합하여 측정 시간 척도에 고정될 때 두 가지 쉽게 구별할 수 있는 확산 상태가발생합니다 5 . 단일 분자 추적은 이러한 서로 다른 상태를 직접 관찰하기 위한 도구를 제공하며 이를 해결하기 위해 정교한 분석이 필요하지 않습니다. 그러나, 그들의 확산 비율이 더 유사한 경우에 다중 확산 상태 및 그들의 인구 분수를 해결하는 것이 더 어려워집니다. 예를 들어, 확산 계수의 크기 의존성으로 인해, 단백질의 상이한 올리고머화 상태는 상이한 확산 상태6,7,8,9로 나타난다. , 10. 이러한 경우 데이터 수집, 처리 및 분석 측면에서 통합 된 접근 방식이 필요합니다.

세포질 분자의 확산 속도에 영향을 미치는 중요한 요소는 세포 경계에 의한 감금의 효과입니다. 세균 세포 경계에 의한 분자 운동에 대한 제한으로 인해 세포 분자의 측정된 확산 속도가 제한된 공간에서 동일한 움직임이 발생한 경우보다 느리게 나타납니다. 매우 천천히 확산 되는 분자에 대 한, 세포 감금의 효과 경계와 충돌의 부족으로 인해 무시할 수 있다. 이러한 경우 Brownian 모션 방정식에 기반한 분석 모델을 사용하여 분자 변위, r또는 명백한 확산 계수 D*의분포를 피팅하여 확산 상태를 정확하게 해결할 수 있습니다. 임의 확산)11,12,13. 그러나, 빠른 확산 cytosolic 분자를 위해, 실험 분포는 더 이상 세포 경계와 확산 분자의 충돌 때문에 제한되지 않은 Brownian 운동을 위해 얻은 것과 유사하지 않습니다. 감금 효과는 형광표지된 분자의 제한되지 않은 확산 계수를 정확하게 결정하기 위해 고려되어야 한다. 몬테카를로 시뮬레이션을 통해 (반)5, 14,15,16 또는 수치학적으로 감금 효과를 설명하기 위해 최근 여러 가지 접근법이 개발되었습니다. 브라우니안 확산6,10,16,17,18,19.

여기에서는 단일 분자 추적에 중점을 둔 단일 분자 국소화 현미경 데이터를 수집하고 분석하기 위한 통합 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜의 최종 목표는 형광 표지된 세포질 단백질의 확산 상태를 해결하는 것입니다.이 경우, 막대 모양의 세균 세포. 우리의 연구는 DNA 중합효소, PolI가 확산 분석20에의해 DNA 결합 및 언바운드 상태로 존재하는 것으로 나타난 단일 분자 추적을 위한 이전 프로토콜을 기반으로 합니다. 여기서는 단일 분자 추적 분석을 3D 측정으로 확장하고 보다 현실적인 계산 시뮬레이션을 수행하여 세포에 동시에 존재하는 여러 확산 상태를 해결하고 정량화합니다. 데이터는 이중 나선 점 확산 기능(DHPSF)21,22를사용하여 이미징을 통해 형광 방출기의 3D 위치를 결정할 수 있는 가정용 3D 초고해상도 형광 현미경을 사용하여 수집됩니다. 원시 단일 분자 이미지는 사용자 정의 작성 소프트웨어를 사용하여 3D 단일 분자 국소화를 추출한 다음 단일 분자 궤적으로 결합됩니다. 수천 개의 궤적이 풀려져 명백한 확산 계수의 분포를 생성합니다. 마지막 단계에서 실험 분포는 몬테카를로 모션의 몬테카를로 시뮬레이션을 통해 얻은 수치로 생성된 분포와 제한된 볼륨으로 적합합니다. 우리는 살아있는 Yersinia enterocolitica에있는 타입 3 분비 시스템 단백질 YscQ의 확산 상태를 해결하기 위하여 이 프로토콜을 적용합니다. 모듈식 특성으로 인해 당사의 프로토콜은 일반적으로 임의의 세포 기하학적 구조에서 모든 유형의 단일 분자 또는 단일 입자 추적 실험에 적용할 수 있습니다.

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Protocol

1. 이중 나선 점 확산 기능 교정

참고: 이에 기재된 이미지 및 이하의 섹션은 Rocha 등23에기재된 바와 같이 맞춤형 거꾸로 된 형광 현미경을 사용하여 획득된다. 동일한 절차는 단일 분자 국소화 및 추적 현미경 검사법2,3,4를 위해 설계된 다른 현미경 구현에 적용 할 수있습니다. 이 문서에 설명된 이미지 수집 및 데이터 처리를 위한 모든 소프트웨어를 사용할 수 있습니다(https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git).

  1. 현미경으로 볼 수있는 유리 커버 전표에 샘플을 장착하기위한 아가로즈 패드의 준비.
    1. M2G 완충액의 5 mL에 1.5-2 중량 % 낮은 융점을 첨가하십시오 (4.9 mM Na2HPO4,3.1 mM KH2PO4,7.5 mM NH4Cl, 0.5 mM MgSO4,10 μM FeSO4,0.5 mM CaCl2 및 0.2 % 포도당). 모든 아가로즈가 녹을 때까지 몇 초간 전자레인지에 돌리자. 용액이 끓지 않도록하십시오.
    2. 아가로즈 용액을 몇 분 동안 식힙니다 (2-3 분).
    3. 유리 커버 슬립에 아가로즈 용액의 파이펫 600 μL (22mm x 22mm). 아가로즈 위에 두 번째 유리 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 이것은 두 개의 유리 커버 슬립 사이에 얇은 (~ 0.5 mm) 아가로즈 젤 패드를 만듭니다.
    4. 아가로즈 패드를 20분 동안 굳게 합니다.
    5. 유리 커버 슬립을 부드럽게 분리합니다. 아가로즈 패드는 그 중 하나에 충실합니다.
    6. 면도날을 사용하여 아가로즈 패드를 동일한 크기의 4개의 정사각형 섹션으로 자른다. 각 정사각형 섹션은 단일 샘플에 사용할 수 있습니다.
  2. 하나의 아가로즈 패드에 형광 비드 용액의 피펫 1.5 μL. 비드 용액은 M2G의 스톡 용액의 1/100000 희석입니다(재료 표참조).
  3. 아가로즈 패드를 뒤집어 30분 동안 오존 클리너에서 세척한 유리 커버 슬립에 놓습니다. 세척 시간은 커버슬립에 부착된 형광 분자를 제거하기 위해 선택됩니다.
  4. 샘플 커버 유리를 거꾸로 된 형광 현미경의 샘플 홀더에 장착하고 점착 테이프 또는 스프링 로드 샘플 홀더 클립을 사용하여 제자리에 고정하십시오.
  5. 현미경 목표에 침지 오일 한 방울을 추가합니다.
  6. 샘플 홀더를 현미경에 놓고 제자리에 고정합니다.
  7. 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 초기화하여 현미경의 카메라, 샘플 단계 및 여기 레이저를 제어합니다. 여기서 MATLAB의 사용자 정의 소프트웨어는 계측기 제어에 사용됩니다(추가그림 1).
  8. 카메라 소프트웨어 HCImage 라이브를 초기화합니다. 카메라 제어 섹션 아래의 캡처 탭에서 노출 시간을 0.03초로 설정합니다. 라이브를 클릭하여 카메라의 라이브 피드를 시작합니다.
  9. GUI 인터페이스에서 514nm 레이저 열기를 클릭하여 레이저를 켜면 패드의 형광 비드를 자극하고 라이브 스트림 모드를 사용하여 카메라의 형광 방출을 볼 수 있습니다(즉, 디스크에 저장된 데이터는 없음).
  10. GUI의 '마이크로 위치 단계' 섹션 아래에 있는 'XY-Pos' 화살표를 클릭하여 현미경 스테이지의 X 및 Y 위치를 조정하여 시야(FOV)의 중앙에 하나 이상의 형광 비드를 배치합니다. 화살표 아래의 드롭다운 상자를 클릭하여 단계 크기를 변경할 수 있습니다.
  11. GUI의 나노 위치 단계 섹션 아래에 있는 Z-Pos 화살표를 클릭하여 현미경 스테이지의 Z 위치를 조정합니다. 형광 비드의 이중 나선 점 확산 함수(DHPSF)의 방향을 수직으로 설정합니다. 이 수직 방향은 Z 보정의 시작점으로 정의됩니다. 화살표 아래의 드롭다운 상자를 클릭하여 단계 크기를 변경할 수 있습니다.
  12. HCImage 라이브에서 캡처 에서 | 트리거 모드, 속도 및 등록,트리거 모드를 내부 에서 외부 수준 트리거로변경합니다. 이렇게 하면 MATLAB GUI가 카메라를 제어할 수 있습니다.
  13. 시퀀스 미만 | 설정 스캔,프레임 개수를 1200으로변경합니다. 레이블이 지정된 단추를 클릭하여 대상 폴더 저장을 선택합니다.. . 마지막으로 시작을 클릭합니다. 프레임 개수는 1200개로 설정되어 각 120Z 위치 단계마다 10프레임을 수집할 수 있습니다.
  14. 다양한 Z 위치(50nm 단위로 시작 Z 위치 위와 아래 30단계)를 스캔하고 노출 시간을 사용하여 각 단계에서 10프레임을 기록합니다. GUI를 참조하십시오.
    참고: 스텝 길이, 단계 수, 카메라 노출 시간 및 단계당 프레임 수를 포함한 교정에 대한 매개변수도 여기에서 조정할 수 있습니다. 0.03s 의 노출 시간을 사용하여 단일 프레임에서 형광 비드에서 약 10개의 광자를 획득 할 수 있으며 x, y, z 국소화 정밀도는 약 1 nm입니다.
  15. GUI에서 515nm 레이저 닫기를 클릭하여 레이저 조명을 끕니다. HCImage 라이브에서 캡처 에서 | 트리거 모드, 속도 및 등록,트리거 모드를 다시 내부로변경합니다. 시퀀스 미만 | 스캔 설정은 프레임 수를 200개로 변경합니다. 레이블이 지정된 단추를 클릭하여 대상 폴더 저장을 선택합니다.. . 0.03초의 노출 시간으로 어두운 이미지 의 200 프레임을 수집하려면 시작을 클릭합니다.
    참고: 검출기에 빛이 떨어지는 경우에도 각 픽셀은 픽셀마다 약간 다를 수 있는 양수(어두운 오프셋 값이라고 함)를 판독합니다. 어두운 오프셋 값은 시간이 지남에 따라 변경될 수 있습니다. 따라서 각 보정에 대해 어두운 프레임을 수집해야합니다.
  16. Easy-DHPSF소프트웨어(24)를 사용하여 이중 가우시안 모델로 DHPSF를 장착하여 비드의 X 및 Y 위치와 각도 대 Z 보정 곡선을 얻을 수 있습니다.
    1. MATLAB에서 Easy-DHPSF 소프트웨어를 초기화합니다. 설정에서 채널을 G로 설정하고 DG 모델을 사용하여 피팅 방법을 MLE로 설정합니다. G는 데이터 수집에 사용되는 형광 단백질이 녹색 파장으로 방출되기 때문에 녹색 채널 카메라를 말합니다. DG 모델이 있는 MLE는 이중 가우시안 모델을 사용하여 최대 우도 추정을 나타냅니다.
      참고: 픽셀 크기 및 변환 게인은 특정 광학 설정에 따라 달라지며 변경해야 할 수 있습니다.
    2. DHPSF 보정 섹션에서 실행을클릭합니다. 다음 팝업 창에서 확인을 클릭하여 기본 설정을 유지합니다.
    3. 1.13-1.14 단계에 저장된 이미지 스택을 선택합니다. 다음으로 1.15단계에서 저장된 어두운 배경이 있는 이미지 스택을 선택합니다. 마지막으로 1.14단계에서 자동으로 저장된 .txt 파일을 선택합니다. 이 파일에는 스캔 프로세스 전반에 걸쳐 스테이지의 Z 위치가 포함되어 있습니다.
    4. 다음 팝업 창에서 전체 카메라 칩이 시야에 사용되지 않은 경우 칩에 시작 x0 및 y0 위치를 입력합니다. 그렇지 않으면 입력 x0 = 1 및 y0 = 1.이 정보는 Binning 및 subAary 섹션 아래의 HCImage Live에서 찾을 수 있습니다.
    5. 다음 창에서 형광 구슬 이미지 위에 나타나는 상자의 크기를 조정하고 재배치하여 크기가 약 100 x 100 픽셀이고 단일 형광 DHPSF 신호 위에 가운데에 배치됩니다. 그런 다음 두 번 클릭하여 계속합니다.
      참고: 선택한 DHPSF는 다른 DHPSF 신호와 격리되어야 하며 가능한 가장 밝은 비드일 수 있습니다.
    6. DHPSF 신호의 중심을 클릭하고 두 로브 사이에 있는 다음 Enter를누르고 있습니다. 다음 창에는 선택한 DHPSF의 확대 보기가 표시됩니다. 클릭하여 DHPSF 중심의 위치를 보다 정확하게 선택합니다.
      참고: 프로그램은 DHPSF에 맞게 표시하고, 원시 이미지와 맞춤에서 재구성을 표시합니다. 또한 다른 Z 위치에서 DHPSF 횡단면에 해당하는 Z 보정에서 템플릿 이미지를 출력합니다. 이들은 실험 데이터의 피팅을 위해 나중에 사용됩니다. 프로그램은 각 프레임에서 추정된 X, Y 및 Z 위치를 출력합니다. 잘 정렬된 광학 시스템에서 X와 Y는 Z 위치가 변경될 때 거의 변경되지 않습니다(~30nm 편차). 출력 변동이 30 nm보다 큰 경우, 이미징 시스템의 푸리에 평면에 위치한 위상마스크(그림 1)를다시 정렬하고 1.9-1.16단계를 반복해야 합니다.
    7. GUI의 왼쪽 상단 모서리에 있는 저장 아이콘을 클릭하여 Easy-DHPSF GUI를 저장합니다. 나중에 GUI의 로드 아이콘을 클릭하여 로드할 수 있습니다.
      참고: Z 교정 절차는 온도 변동 또는 기계적 진동으로 인해 발생할 수 있는 현미경의 정렬 변화를 고려하여 실험의 각 날에 수행되어야 합니다.

2. 세균 배양 준비

  1. 세균성 세포 성장을 지지하는 배양 배지를 준비한다. Y. 장내,사용 5 BHI의 mL (두뇌 심장 주입) nalidixic 산 (35 μg/mL) 및 2,6-디아미노 피멜산 (80 μg/mL)를 포함 하는 국물. 여기서, Y. 엔테로콜리카 균주는 형광 단백질 eYFP23으로태그된 단백질 YscQ를 가지는 데 사용된다.
  2. 냉동고 또는 플레이트 배양에서 세균 배양물로 매체를 접종합니다.
  3. 밤새 흔들어 28°C에서 배양을 성장시다.
  4. 포화 배양액의 소량(~250 μL)을 신선한 배양 배지를 사용하여 5 mL로 희석한다.
  5. 60-90 분 동안 흔들어 28 °C에서 배양성장.
  6. 형광 융합 단백질의 발현을 유도합니다. Y. enterocolitica의경우, 요콘귤론을 유도하기 위해 물 셰이커에서 세포를 37°C로 가열한다.
  7. 37°C에서 추가로 3시간 동안 세포를 배양하고 흔들어.
  8. 원심 분리기 5,000 x g에서 배양 1 mL에서 실온에서 3 분 동안. 상급제는 버리십시오.
  9. M2G 용지 1 mL로 펠릿을 3 회 씻으십시오.
  10. M2G 미디어의 ~250 μL에서 펠릿 박테리아를 다시 중단시켰다.
  11. 형광 비드를 신탁 마커로 추가합니다. 형광 비드 용액은 현미경으로 볼 때 FOV 당 1-2 구슬만 있도록 적절하게 희석 된 양으로 첨가해야합니다.
  12. 부드럽게 피펫 또는 와류 는 응집 된 세포를 분리하기 위해 현탁액을.
  13. M2G로 만든 1.5-2 % 아가로즈 패드에 서스펜션 플레이트 1.5 μL.
  14. 아가로즈 패드를 뒤집어 오존 세척 현미경 커버 슬립에 놓습니다. 커버 슬립은 내재된 형광 배경을 줄이기 위해 30분 동안 오존 클리너에 보관해야 합니다.

3. 데이터 수집

  1. 샘플 커버 유리를 거꾸로 된 형광 현미경의 샘플 홀더에 장착하고 점착 테이프 또는 스프링 로드 샘플 홀더 클립을 사용하여 제자리에 고정하십시오.
  2. 현미경 대물렌즈에 침지 오일 한 방울을 추가한 다음 샘플 홀더를 현미경에 놓고 제자리에 고정합니다.
  3. 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 초기화하여 현미경의 카메라, 샘플 단계 및 여기 레이저를 제어합니다. 여기서 MATLAB의 맞춤형 소프트웨어는 계측기 제어에 사용됩니다.
  4. 카메라 소프트웨어 HCImage 라이브초기화. 카메라 제어 섹션 아래의 캡처 탭에서 노출 시간을 0.025초로 설정합니다. 라이브를 클릭하여 카메라의 라이브 피드를 시작합니다.
  5. GUI의 마이크로 포지셔닝 스테이지 섹션 아래에 있는 XY-Pos 화살표를 클릭하여 현미경 단계의 X 및 Y 위치를 조정하여 샘플 주위를 스캔하고 세균 세포의 적절한 밀도가 높은 집단을 가진 FOV를 찾습니다.
    참고: 데이터 처리량을 최대화하려면 셀이 겹치거나 닿지 않고 가능한 한 조밀해야 합니다. FOV는 또한 적어도 1개의 형광 비드를 수탁 마커로서 사용할 수 있어야 하며, 바람직하게는 FOV의 구석에 위치한다.
  6. 형광 비드의 DHPSF 로브가 수직이 되도록 GUI의 나노 위치 단계 섹션 아래에 있는 Z-Pos 화살표를 클릭하여 현미경 스테이지의 Z 위치를 조정합니다.
  7. 시퀀스 미만 | 설정 검색,프레임 개수를 20,000개로 변경합니다. 레이블이 지정된 단추를 클릭하여 대상 폴더 저장을 선택합니다.. . 마지막으로 0.025 s. eYFP 포토블링킹은 514 nm19,25에서고강도 여기광을 사용하여 시작되는 0.025 s. eYFP 포토블링을 사용하여 최대 20,000개의 카메라 프레임을 수집하기 위해 시작을 클릭합니다.
    참고: 여기에서, 초점 측에서 ~350W/cm2의 레이저 세기는 단 하나 EYFP 분자의 초기 표백 그리고 후속 화상 진찰을 위해 이용됩니다. 이미징 동안 UV 파장에서 eYFP 분자의 광 활성화는 사용되지 않았다. 세균 세포 당 적어도 하나의 단일 분자 신호가 있어야합니다. 단일 분자 신호의 밀도가 처음에 너무 높으면 데이터 수집을 시작하기 전에 충분한 광표백이 발생할 때까지 계속 조명하십시오.
  8. GUI에서 515nm 레이저 닫기를 클릭하여 레이저 조명을 끕니다. 동일한 노출 시간을 사용하여 어두운 이미지의 200 프레임을 수집합니다.
  9. GUI에서 Thorlabs LED 옆의 확인란을 확인하고 미러 업 을 클릭합니다. 이것은 단계 대조 통로에 형광 통로에서 통로를 전환할 것입니다.
  10. 데이터 수집 소프트웨어 IC 캡처 2.4초기화. 이렇게 하면 위상 대비 경로에서 카메라가 제어됩니다. 라이브 디스플레이 시작/중지 버튼을 눌러 카메라에서 라이브 피드를 봅니다. 캡처 | 이미지를 저장하여 뷰 필드에서 셀의 위상 대비 이미지를 수집합니다.
  11. 추가 FOV의 경우 3.5-3.10 단계를 반복합니다. 여기서, 10개의 상이한 FOV에서 ~500개의 박테리아 세포로부터 획득한 데이터는 분석에 이용가능한 단일 분자 궤적의 수를 증가시키는 데 사용된다.
    주의: 아가로즈 패드에 장시간 장착된 세포는 갓 장착된 세포와 다르게 행동할 수 있습니다. 또한, 아가로즈 패드는 몇 시간 후 무결성을 잃을 수 있습니다. 전형적으로, 적어도 3 FOV (현미경에 30 분)에서 견본 슬라이드 당 이용됩니다.

4. 데이터 처리

참고: Easy-DHPSF소프트웨어(24)의 수정된 버전은 단일 분자 지역화를 추출하기 위해 원시 카메라 프레임을 분석하기 위해 MATLAB에서 사용됩니다. Easy-DHPSF는 단일 분자 이미징에서 DHPSF 국소화에 적합하도록 특별히 사용됩니다. 현대 sCMOS카메라(26)의픽셀 의존적 노이즈 특성을 차지하는 최대 가능성 추정(MLE) 기반 피팅 루틴을 구현하기 위해 사용자 정의변경이 이루어졌습니다. 또한 HCImage 라이브 프로그램(.dcimg)에서 이미지 파일 형식 출력을 허용하도록 수정되었습니다. 소프트웨어 및 개별 단계에 대한 자세한 설명은 Lew 등24를 참조하십시오.

  1. MATLAB에서 Easy-DHPSF GUI를 초기화합니다(추가그림 2). 1.16.8 단계에서 저장된 파일의 로드.
  2. 1.16.7단계에서 7개의 템플릿 출력 각각에 대한 임계값 결정
    1. 캘리브레이트 SM 식별 섹션에서 실행을클릭합니다. 다음 두 팝업 창에서 확인을 클릭하여 기본 설정을 유지합니다.
    2. 메시지가 표시되면 첫 번째 FOV의 데이터가 포함된 이미지 스택을 엽니다.
    3. 템플릿과 일치하는 작은 범위의 프레임을 선택합니다. 일반적으로 프레임(1001-2000)은 처음 수백 개의 프레임에서 조밀한 중첩 신호를 피하기 위해 사용됩니다. 다음 팝업 창에서 확인을 클릭하여 기본 설정을 유지합니다. 다음 창에서 시퀀스 로그 파일에 대한 메시지가 표시되면 취소를 클릭합니다.
    4. 3.8단계에서 저장된 어두운 배경이 있는 이미지 스택을 엽니다. 다음 팝업 창에서'확인'을클릭하여 배경 추정에 대한 매개 변수를 기본값으로 설정합니다. 기본값은 현재 프레임 주위의 100개의 후속 카메라 프레임을 덮는 중앙값필터(27)를 사용하여 배경을 추정하는 것입니다.
    5. 다음 창에서 전체 FOV를 덮기 위해 이미지에 겹쳐진 상자의 크기를 조정한 다음 두 번 클릭하여 계속합니다.
    6. 이미지에서 여러 점을 클릭하여 다각형을 만들어 관심 영역을 정의합니다. 관심 영역은 이미지의 형광 비드(매우 밝은 물체)가 다각형 내에 놓이지 않도록 하는 동시에 가능한 한 많은 시야를 포함해야 하며, 계속하려면 두 번 클릭해야 합니다.
      참고: 소프트웨어는 템플릿을 이미지와 일치시키려고 시도하고 동그라미가 있는 일치 항목이 있는 이미지를 표시합니다.
    7. 소프트웨어가 중지되면 발견된 템플릿 일치의 많은 이미지를 저장하고 미리 정의된 폴더에 해당 임계값을 표시합니다. 임계값이 높을수록 더 나은 일치값에 해당합니다. 각 템플릿 번호에 대해 일치하는 예제를 검사하고 DHPSF 이미지를 나타내는 가장 낮은 임계값을 결정합니다. Easy-DHPSF GUI의 교정 SM 식별 섹션 아래의 7가지 템플릿 각각에 대해 이러한 임계값을 입력합니다.
      참고: 프로그램은 임계값을 자동으로 선택하고 입력하려고 시도하지만, 이러한 임계값은 신뢰할 수 없는 경우가 많으며 수동으로 확인해야 합니다. 임계값은 몇 가지 진정한 단일 분자 신호를 놓치게 되도록 선택되지만 피팅을 위한 거짓 긍정 후보의 수는 계산적으로 관리 할 수 있습니다.
    8. 왼쪽 상단 모서리에 있는 저장 아이콘을 클릭하여 Easy-DHPSF GUI를 다시 저장합니다.
  3. FIDUCIAL 마커로 사용하기 위해 FOV의 형광 비드 피팅
    1. Easy-DHPSF GUI의 트랙 수탁자 섹션에서 실행을클릭합니다. 다음 두 팝업 창에서 확인을 클릭하여 기본 설정을 유지합니다.
    2. 이미지에 겹쳐진 상자를 드래그하여 형광 비드의 DHPSF 신호 위에 놓은 다음 두 번 클릭합니다.
    3. DHPSF 신호의 중심을 클릭하고 두 로브 사이의 중간점에 있는 다음 enter를 누르고 있습니다. 다음 창에서 시퀀스 로그 파일에 대한 메시지가 표시되면 취소를 클릭합니다.
      참고: 소프트웨어는 모든 카메라 프레임에 DHPSF를 맞추고 원시 이미지와 재구성된 이미지를 표시합니다. 소프트웨어가 완료되면 이미지 수집 기간 동안 형광 비드의 X, Y 및 Z 위치로 수치를 출력합니다.
    4. 수탁자 사용 옆의 확인란을 확인하고 왼쪽 상단 모서리에 있는 저장 아이콘을 클릭하여 Easy-DHPSF GUI를 다시 저장합니다.
  4. 4.2단계에서 얻은 템플릿 임계값을 사용하여 모든 카메라 프레임에서 모든 지역화를 찾아 맞춥습니다.
    1. Easy-DHPSF GUI의 지역화 DHPSF SMs 섹션에서 실행을클릭합니다. 다음 팝업 창에서 확인을 클릭하여 기본 설정을 유지합니다. 다음 창에서 시퀀스 로그 파일에 대한 메시지가 표시되면 취소를 클릭합니다.
      참고: 일치 품질이 사용자 정의 임계값을 초과하는 경우 소프트웨어는 이중 가우시안 모델을 사용하여 DHPSF를 찾아 맞출 수 있습니다. 템플릿 일치 주위에 원이있는 원시 이미지와 재구성 된 DHPSF 피팅 이미지가 표시됩니다.
    2. 왼쪽 상단 모서리에 있는 저장 아이콘을 클릭하여 Easy-DHPSF GUI를 다시 저장합니다.
  5. 단일 분자 지역화 보기 및 원치 않거나 신뢰할 수 없는 지역화 필터링
    1. 출력 DHPSF SM 지역화 섹션에서 필터 출력을클릭합니다.
    2. 다음 세 창에서 확인을 클릭하여 시간이 지남에 따라 Fiducial X, Y 및 Z 위치의 보간을 수행합니다. 대부분의 경우 기본 옵션으로 충분합니다. 검은색 보간선이 빨간색 위치 선의 적절한 보간을 반영하지 않는 경우 팝업 창에서 보간 매개변수를 변경합니다.
      참고: 보간된 선은 단일 분자 지역화를 보정하는 스테이지 드리프트에 사용됩니다.
    3. 메시지가 표시되면 분석중인 FOV에 대한 해당 위상 대비 이미지를 엽니다. 다음 두 팝업 창에서 확인을 클릭하여 기본 설정을 유지합니다.
    4. 다음 두 팝업 창에서 필터 값을 변경하여 보다 엄격하거나 더 관대한 단일 분자 지역화 요구 사항을 허용한 다음 확인을클릭합니다.
    5. 표시되는 창에서 이미지에 겹쳐진 상자를 드래그하거나 크기를 조정하여 원하는 관심 영역을 보고 두 번 클릭하여 계속합니다.
    6. 단일 분자 지역화의 3D 재구성이 표시됩니다. 그림 도구를 사용하여 재구성(회전, 확대/축소 등)을 조작합니다. '다른매개 변수 집합으로 다시 플롯하시겠습니까?'묻는 다른 대화 상자를 표시하려면 계속을 클릭합니다. 결과가 만족스런 경우 아니요를 클릭합니다. 그렇지 않은 경우 예.
      참고: 만족스럽지 못한 결과의 일반적인 원인으로는 위상 대비 이미지가 지역화 데이터와 올바르게 겹쳐지지 않거나 초기 템플릿 임계값이 너무 낮아 많은 거짓 긍정 지역화가 생성되는 것이 포함됩니다. 예를 선택하면 새 매개 변수 값을 정의할 수 있도록 소프트웨어가 4.5.4 단계로 돌아갑니다. 아니요를 선택하면 결과가 저장됩니다.

5. 데이터 후처리

  1. MATLAB에서 사용자 정의 작성 소프트웨어를 사용하여 형광 현미경으로 이미지 된 세포를 포함하는 영역만 유지되도록 위상 대비 이미지를 잘라내있습니다. 위상 대비 이미지가 형광 이미지보다 훨씬 큰 영역을 커버하기 때문에 이 단계가 필요합니다. 이미지를 자르면 다음 단계가 간소화됩니다.
  2. OUFTI28 소프트웨어로 위상 대비 이미지를 처리하여 개별 셀을 분할합니다(추가그림 3)
    1. MATLAB에서 OUFTI를 초기화합니다. 로드 단계를클릭하여 이전 단계에서 잘라진 위상 대비 이미지를 로드합니다.
    2. 파일을 클릭하여 출력 파일의 저장 위치를 선택하고 이름을 지정합니다.
    3. 감지 및 분석 제목 아래에서 독립 프레임을 선택합니다.
    4. 셀 검색을 위해 매개변수로드를 클릭하여 매개변수를 로드합니다. 파라미터의 예로는 허용 가능한 셀 영역, 셀 폭 및 셀 분할 임계값이 포함됩니다.
      참고: 사용 중인 특정 셀 크기와 이미지 품질에 대한 성능을 최대화하도록 이러한 모든 매개 변수를 조정해야 합니다. 중요한 것은 셀 윤곽선을 정확하게 측정할 수 있도록 알고리즘 매개 변수를 하위 픽셀로 설정해야 한다는 것입니다.
    5. 셀 세분화를 시작하려면 이 프레임을 클릭합니다. 프로세스가 완료되면 위상 대비 이미지 위에 셀 윤곽선이 나타납니다.
    6. 수동 섹션 아래의 컨트롤을 사용하여 셀을 분할하거나 셀을 추가하거나 셀 윤곽선을 구체화하여 자동화된 프로세스 중에 부정확하게 분할된 셀에 대한 윤곽선을 얻습니다.
    7. 분석 저장을클릭하여 셀 윤곽을 출력합니다.
  3. MATLAB에서 사용자 지정 작성된 소프트웨어를 사용하여 이전 단계에서 얻은 윤곽선을 단일 분자 지역화와 정확하게 오버레이할 수 있습니다. 다음 하위 단계는 소프트웨어의 단계를 자세히 설명합니다.
    1. 팝업 창에서 5개의 제어점 쌍을 수동으로 선택하여 이전 단계에서 생성된 단일 분자 국소화 데이터 및 셀 윤곽선 모두에서 동일한 5개의 셀의 세포 극의 위치를 대략적으로 추정하고 클릭합니다. 세포 극의 위치는 한 세포에 속하는 단일 분자 국소화 주위에 볼록한 선체를 정신적으로 그리고 가장 높은 곡률의 지점을 선택함으로써 대략 추정될 수있다(보충 도 4).
    2. MATLAB에서 cp2tform 함수를 사용하여 2D affine 변환 함수를 생성하고 이를 사용하여 세포 윤곽선과 단일 분자 국소화의 대략적인 오버레이를 생성합니다.
    3. 10개 미만의 지역화를 포함하는 셀을 삭제하고 뷰 필드 외부에 부분적으로 배치된 셀을 제거합니다. 팝업 창에서 셀 윤곽선 내부를 클릭하여 원치 않는 추가 셀을 수동으로 삭제합니다(추가그림 5).
    4. 남은 모든 세포 윤곽선과 단일 분자 국소화에 질량 중심을 사용하여 더 큰 제어점 쌍 세트를 형성하고, 2D 변환 함수를 다시 계산하고, 이를 사용하여 셀 윤곽선과 단일 분자 지역화.
    5. 셀 윤곽선 의 경계 내에 있는 지역화를 해당 셀에 할당합니다. 셀 개요 내에 없는 지역화를 폐기합니다(그림2a, 추가 그림 6).

6. 단 하나 분자 추적

참고: 다음 섹션은 MATLAB에서 사용자 지정 소프트웨어를 사용하여 완료됩니다. 이 섹션에서는 소프트웨어가 수행하는 단계를 설명합니다.

  1. 동일한 셀과 후속 카메라 프레임에 할당된 지역화의 경우 지역화 사이의 유클리드 거리를 계산합니다. 지역화 사이의 거리가 임계값 2.5 μm 미만이면 동일한 단일 분자 궤적에 할당하여 지역화를 연결합니다.
    참고: 공간 및 시간 임계값 요구 사항을 충족하는 인접 셀의 지역화가 연결되지 않도록 단일 셀 내에서만 지역화를 고려하는 것이 중요합니다. 2.5 μm 임계값은 매우 빠른 분자(30 μm2/s)가 노출 시간(0.025s)의 길이와 20% 버퍼의 길이에서 이동할 수 있는 최대 거리로 선택되었다.
  2. 4지역화보다 짧은 궤적을 폐기합니다. 둘 이상의 지역화(즉, 둘 이상의 형광 방출기)가 동시에 세포에 존재하는 경우 관련 궤적을 폐기합니다. 트랙 길이를 최소 4개의 지역화로 설정하면 여러 거리 측정을 평균화하여 확산 계수를 보다 정확하게 예측할 수 있습니다.
  3. 지정된 궤적에 대한 평균 제곱 변위(MSD)를 다음과 같은 값으로 계산합니다.
    Equation 1(1)
    여기서 N은 궤적 내의 국소화의 총 개수이고 xn은 시간 포인트 n에서분자의 위치이다.
  4. 별차 확산 계수, D*를 계산합니다.
    Equation 2(2)
    여기서 m = 2 또는 3은 측정치이며 Δt는 카메라 노출 시간입니다.
    참고: 일반적인 실험은 총 ~5,000-100,000개의 궤적을 생성하여 많은 카운트와 함께 명백한 확산 계수 분포를 생성합니다.

7. 몬테카를로의 브라운 모션 시뮬레이션

참고: 0.05-20μm2/s의 범위에서 64값을 입력 매개변수(소프트웨어)로 사용하여 원통형 체적으로 제한된 브라운 모션의 몬테 카를로 시뮬레이션을 수행하여 시뮬레이션된 명백한 확산 계수 분포 라이브러리 생성 요청 시 작성자로부터 구할 수 있습니다). 이 범위는 박테리아에 있는 형광성 (융합) 단백질의 이전에 추정된 확산 계수의 범위를 커버하기 위하여 선택되었습니다. 64 개의 확산 계수가이 범위를 충분히 샘플링하는 데사용됩니다. 이 섹션은 MATLAB에서 사용자 지정 소프트웨어를 사용하여 수행되며 소프트웨어가 자동으로 수행하는 단계를 설명합니다. 여기서 사용되는 막대 형 Y. 장산염 세포는 길이 l = 5 μm 및 직경 d = 0.8 μm의 원통형 부피에 의해 근사화된다.

  1. 원통형 볼륨에서 임의의 위치에서 개별 궤적을 시작하고 100 ns의 시간 간격을 사용하여 임의(즉, Brownian) 확산 단계를 시뮬레이션합니다(시간 간격은 카메라 노출 시간보다 훨씬 짧아야 충분한 양을 활성화해야 함) 카메라 프레임의 과정을 통해 위치샘플링)을 참조하십시오. Eqn. 2의 재배열을 통해 해당 가우시안 분포 함수에서 입력 D에 대한 각 변위 단계를 샘플링하고 이전 위치에 추가합니다.
    Equation 3(3)
    여기서 MATLAB의 randn 함수는 정규 분포에서 난수를 샘플링합니다. 한 단계로 인해 분자가 실린더의 부피 바깥쪽으로 변위되는 경우, 분자를 실린더 내부의 임의 각도로 반사합니다.
  2. 각 시간 간격에 대해 시뮬레이션된 방사체의 순간 x, y, z 위치에 해당하는 DHPSF 이미지를 생성합니다.
    1. 실험 조건에 맞게 지역화당 1,000개의 광자가 포함된 이미지를 픽셀당 13광자의 레이저 배경과 푸아송 노이즈를 시뮬레이션합니다. 또한 픽셀당 ~50광자의 어두운 오프셋과 실험용 카메라 보정 측정과 일치하는 가우시안 읽기 노이즈(σ ~1.5 광자)를 추가합니다. 마지막으로, sCMOS 카메라의 픽셀 의존적 게인을 실험적으로 측정하여 이미지를 곱하여 검출기 수 단위로 이미지를 얻습니다.
      참고: 이러한 조작 후 최종 이미지의 신호 대 잡음 비율은 ~2입니다.
    2. 실험 데이터 수집 중에 사용되는 노출 시간 동안 시뮬레이션된 50개의 DHPSF 이미지를 합산하여 분자의 변화하는 위치를 반영하는 모션 흐림 이미지를 생성합니다. 계산 비용을 제한하기 위해 주기적으로 샘플링된 위치 50개만 선택되어 이미지를 생성했습니다(100ns의 샘플링 간격으로 0.025s 노출 시간 동안 샘플링된 모든 250,000개의 위치 대신).
      참고: 시뮬레이션된 궤적의 길이(프레임 수)는 실험 궤적의 평균 길이와 일치해야 합니다. 이 경우 궤적당 프레임 수는 6입니다.
  3. 시뮬레이션된 64개의 입력 확산 계수 각각에 대해 5,000개의 궤적을 생성합니다.
  4. 데이터 처리 섹션에 설명된 대로 시뮬레이션된 카메라 프레임을 분석합니다.
  5. 단일 분자 추적 섹션에 설명된 대로 지역화를 궤적으로 연결합니다.
  6. 주문 25의 B-스판 보간을 사용하여 각 시뮬레이션된 분포에 대한 누적 분포 함수(CDF)를 보간합니다. 보간된 분포는 임의의 지점에서 쿼리할 수 있도록 필요합니다.
  7. MATLAB의 산란된 인터폴란트 함수를 사용하여 D축(D는 시뮬레이션된 이미터의 모션을 제어하는 진정한 밀폐되지 않은 확산 계수)을 따라 생성된 B-스프라인 곡선을 보간합니다(지정합니다. 자연 '보간 방법). 이는 0.05-20 μm2/s의 범위에서 진정한 확산 계수 값에 대응하는 임의의 명백한 확산 계수 분포를 질의할 수 있는 연속 2D 함수를 제공한다.

8. 실험적 명백한 확산 계수 분포 피팅

참고: 이전 섹션에서 생성된 시뮬레이션 된 분포의 선형 조합을 사용하여 명백한 확산 계수의 실험적으로 측정 된 분포를 맞춥니다(제한된 볼륨에서 브라운 모션의 몬테 카를로 시뮬레이션). 이 섹션은 MATLAB에서 사용자 지정 소프트웨어를 사용하여 수행되며 소프트웨어가 자동으로 수행하는 단계를 설명합니다. 응용 프로그램의 자세한 내용은 Rocha 등29를 참조하십시오.

  1. 섹션 7에서 작성된 라이브러리에서 주기적으로 샘플링된 시뮬레이션된 CDF 배열을 사용하여 실험 CDF의 제한된 선형 최소 제곱 맞춤(MATLAB의 lsqlin 함수 사용)을 수행합니다. 이 단계의 출력은 실험 분포에서 널리 퍼진 확산 상태의 확산 계수 및 인구 분율을 포함하는 파라미터 벡터입니다.
  2. 상대 모집단 분율을 기준으로 평균화중량으로 서로 20% 이내의 확산 계수 값과 확산 상태를 단일 확산 상태로 결합합니다. 시작 매개변수 벡터입니다.
    참고: 모델 복잡성을 줄이기 위해 확산 계수가 0.5μm2/s미만인 확산 상태를 다음 모든 단계에서 일정하게 유지될 수 있습니다.
  3. 단일 확산 상태에서 사용자 정의 최대 상태 수에 이르는 다양한 수의 확산 상태를 사용하여 평가판 피팅 매개 변수 벡터의 배열을 만듭니다.
    1. 시작 매개변수 벡터를 사용하여 가중치가 있는 평균화 및 분할 확산 상태를 동일한 모집단 분율과 확산 계수를 원래 값보다 20% 위와 아래에 두는 두 상태로 결합합니다. 모든 상태 조합 및 분할 가능성에 대해 반복합니다.
  4. 각 평가판 피팅 매개변수 벡터를 사용하여 MATLAB의 fmincon 함수를 사용하여 데이터의 5개의 개별 하위 집합의 비선형 최소 제곱 피팅을 초기화합니다. 나머지 하위 집합에 해당하는 피팅과 분포 사이의 잔차 제곱 합을 찾아 피팅품질을 결정합니다(데이터 교차 유효성 검사).
  5. 각 평가판 벡터에 대해 5개의 개별 피팅의 평균 잔류 합을 전체 맞춤 품질로 사용하고, 각 확산 상태에 대해 가장 적합한 품질로 평가판 벡터를 결정합니다.
  6. 추가 상태를 추가하는 것이 맞춤의 품질이 5% 이상 향상되지 않는 평가판 벡터를 식별하여 최적의 상태 수를 결정합니다.
  7. 이 평가판 벡터를 사용하여 전체 데이터 집합의 비선형 최소 제곱 피팅을 초기화합니다.
  8. 동일한 시행착화 벡터로 부트스트래핑 및 재장착하여 데이터를 리샘플링하여 개별 매개 변수에 대한 오차를 추정합니다.

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Representative Results

여기에 설명된 실험 조건(20,000프레임, 최소 4개의 국소화)과 형광 표지된 융합 단백질의 발현 수준에 따라 약 200-3,000개의 국소화가 10-150개 궤적은 셀당 생성될 수있습니다(그림 2a,b). 명백한 확산 계수의 잘 샘플링된 분포를 생성하려면 많은 수의 궤적이 필요합니다. 여기서 수집된 FOV의 크기는 ~55 x 55 μm이며, 실험당 10개의 FOV가 수집됩니다. 따라서, 실험당 >5,000 궤적을 얻으려면 각 FOV는 적어도 50개의 세포를 포함해야 한다. 이상적으로, 세포 집단은 세포가 서로 접촉하지 않고 가능한 한 조밀하게 만들어져야 합니다. 셀 밀도가 너무 높으면 만지거나 겹치는 셀이 있으면 데이터 후처리에설명된 대로 OUFTI(28)를 사용하여 성공적으로 분할하기가 어려워집니다. 분할이 불량하면 세포 간에 잘못 할당된 지역화 및 궤체가 발생할 수 있습니다.

여기서, 우리는 Y. enterocolitica 타입 3 분비 단백질 YscQ에 명백한 확산 계수 데이터를 제시하고, 이는 우리가 형광 단백질 eYFP로 N-말단 표지. YscQ는 인젝티좀이라고 불리는 막 에 걸친 분자 기계의 구조 적 구성 요소입니다. 주조는 20개 이상의 다른 단백질로 이루어져 있으며, 그 중 많은 단백질이 여러 개의 카피 수로 존재합니다. 타입-3 분비 주사제는 감염 도중 숙주 세포로 직접 악성 이펙터 단백질을 전달하기 위하여 병원성 그람 음성 박테리아에 의해 광범위하게 이용됩니다. YscQ는 주사의 세포학적 측과 동적으로 결합하고 바인딩해제합니다. 그 결과, YscQ는 또한 시토솔에서 자유롭게 확산되는 것으로 밝혀졌다. 위에서 설명한 데이터 수집, 처리 및 분석 프로토콜을 적용하여 언바운드 YscQ가 적어도 3개의 별개의 확산 상태에 존재한다는 것을 확인했습니다(그림3). 이들 3가지 확산 상태는 YscQ 및 다른 타입-3 분비단백질(23)의상이한 호모-및 이종-올리고머 복합체에 대응한다.

Figure 1
그림 1: 현미경 통로의 광학 다이어그램. 현미경은 형광 신호의 검출을 위한 통로 및 위상 대조 심상을 취하기를 위한 별도의 통로가 있습니다. 전동식 '플립 미러'는 통로 사이를 전환하는 데 사용됩니다. 카메라 감지기, 여기 레이저, LED 및 '플립 미러'는 컴퓨터로 원격으로 제어됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 단일 분자 지역화 및 궤적. (A). 다른 프레임에서 수득된 Y. 장균질 세포에서 eYFP-YscQ의 3D 단일 분자 국소화(1,766국 국소화). 지역화는 셀의 위상 대비 이미지에 중첩됩니다. 녹색 선은 위상 대비 이미지를 기반으로 셀 윤곽선을 나타냅니다. (b). 패널 A(142 궤적)에 도시된 국소화로부터 수득된 eYFP-YscQ의 3D 단일 분자 궤적. 다른 색상은 다른 단일 분자 궤적을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: Y. 엔테로콜리티카에서eYFP-YscQ의 명백한 확산 계수 분포 피팅. Y. enterocolitca에서 eYFP-YscQ에 대한 명백한 확산 계수 분포는 3 개의 확산 상태에 가장 적합했습니다. 확률 밀도 함수(PDF)는 여기에 표시되며, 데이터 피팅은 누적 분포 함수(CDF, 실험적 확산 계수 분포 피팅)를피팅하여 수행되었습니다. 로차 외23에서적응 그림 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보조 그림 1. 현미경 제어 GUI. 현미경 GUI는 형광 방출을 위한 단계, 여기 레이저, LED 및 카메라의 마이크로포지셔터를 제어합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보조 그림 2. 쉬운 DHPSF GUI. Easy-DHPSF 소프트웨어는 DHPSF 신호에서 단일 분자 지역화를 추출하는 데 사용됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보조 그림 3. 오프티 세분화. 오픈 소스 소프트웨어 OUFTI28은 세포를 세포를 세포질화하는 데 사용된다. 여기서, 세포 분절의 결과는 녹색으로 도시된다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보조 그림 4 . 제어점 선택. 셀 윤곽선 데이터와 지역화 데이터 모두에서 5개의 점이 선택됩니다. 셀 극은 참조점으로 사용됩니다. 이러한 점은 셀 윤곽선과 지역화가 올바르게 중첩되도록 데이터를 변환하는 데 사용됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보조 그림 5 . 원치 않는 셀을 삭제합니다. 셀 오버레이 후 원치 않는 셀이 수동으로 삭제됩니다. 비정상적으로 낮은/높은 양의 지역화가 있는 셀뿐만 아니라 FOV 의 가장자리에 있는 모든 셀도 삭제해야 합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보조 그림 6 . 셀 윤곽선 및 지역화의 최종 오버레이. 원치 않는 세포를 삭제한 후, 세포 윤곽선과 단일 분자 국소화는 최종 오버레이를 얻기 위해 미세하게 변형됩니다. 셀 윤곽선 외부의 지역화는 삭제됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 Mov. 1: 단일 분자 궤적에 대한 원시 데이터. sCMOS 카메라에서 eYFP-YscQ 검출의 예. 프레임 1에는 형광 신호가 없습니다. 프레임 2-10에서, 형광은 단일 분자에서 검출된다. 각 연속프레임에서, DHPSF의 위치 및 배향은 변화하여, 이 분자의 확산을 나타낸다. 마지막으로, 프레임 11에서, 형광 신호의 부재가 다시 한번 있어, 궤적의 끝을 나타낸다. 각 픽셀은 108 x 108 nm입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 Mov. 2: 누락된 단일 분자 궤적에 대한 원시 데이터. 프레임 1-3은 단일 방출기에 대한 형광 신호를 표시합니다. 그러나 프레임 4-6은 두 개의 중첩된 DHPSF의 존재를 나타내며, 이는 근접한 두 개의 이미터의 존재를 나타낸다. 이러한 경우 개별 DhPSF가 겹치기 때문에 올바르게 맞지 않을 수 있습니다. 두 DHPSF가 모두 성공적으로 맞더라도 이러한 지역화를 포함하는 관측된 궤적은 폐기됩니다. 동일한 셀에서 둘 이상의 지역화가 지정된 궤적에 대한 지역화를 잘못 할당할 수 있습니다. 각 픽셀은 108 x 108 nm입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

제시된 프로토콜의 성공적인 적용을 위한 중요한 요소는 단일 분자 신호가 서로 잘 분리되도록 하는 것입니다(즉, 공간과 시간에 희소해야합니다(보충 Mov.1)). 세포에 동시에 하나 이상의 형광 분자가 있는 경우, 국소화는 다른 분자의 궤적에 잘못 할당될 수 있습니다. 이를 링크 문제30이라고합니다. 단백질 발현 수준 및 여기 레이저 강도와 같은 실험 조건은 연결 문제를 피하기 위해 선택될 수 있다. 그러나, 대표적인 결과 보장 하기 위해 야생 형 단백질 발현 수준을 얻기 위해 주의 해야 한다. 여기서, 우리는 표지된 단백질의 네이티브 발현 수준을 보장하기 위해 화학적으로 유도성 발현 대신 에네이티브 프로모터의 통제 하에 모든 것을 대체했습니다. 따라서, 여기 레이저 강도(eYFP 깜박임) 또는 활성화 레이저 강도(광-활성 형광 프로브의 경우)는 활성 방출기의 농도를 제 시간에 제어하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 화학염료 표지가 HALO 및 SNAP태그(31,32)와함께 사용될 때, 형광 신호가 단일분자(33)를추적하기에 충분히 희소해질 때까지 염료 농도를 감소시킬 수 있다. 여기에 제시된 프로토콜은 두 개 이상의 지역화가 동시에 동일한 셀에 존재하는 궤적을 폐기함으로써 연결 문제를 더욱 제거한다(보충Mov. 2). 따라서 단일 분자 신호가 너무 조밀하면 처리 중에 많은 양의 데이터가 자동으로 삭제됩니다. 여기에 사용되는 여기 조건하에서 (λex = 350 W /cm2에서514 nm), 우리는 8 분의 과정을 통해 20,000 프레임을 획득 할 때 세균 세포 당 10-150 궤적을 얻었다. 다른 한편으로는, 실험 조건이 단 하나 분자 신호가 희소하다는 것을 선택되는 경우에, 그 때 데이터 수집 처리량은 충분히 많은 수의 단 하나 분자 궤적을 얻는 것은 화상 진찰을 요구할 것이다 그래야, 낮을 지도 모릅니다 추가 보기 필드에 추가 셀이 있습니다. 많은 수의 궤적을 획득하는 것은 적합 파라미터(확산 계수 및 모집단 분수)의 오차가 증가함에 따라 감소하기 때문에유익하다(29).

많은 수의 단일 분자 궤적을 달성하려면 높은 데이터 수집 처리량이 필요합니다. 광분야 기술로서, 단일 분자 국소화 현미경 검사법은 FOV의 각 세포에 대한 데이터를 동시에 획득하고, 연구자들은 대형 FOV 26,34를감당할 수있는 새로운 sCMOS 검출기를 활용하기 시작했습니다. 35. 그러나, 여러 와트의 여기 레이저 힘은 이러한 큰 FOV에 걸쳐 단일 분자 국소화 현미경 검사법에 충분한 균일 한 강도를 달성하는 데 필요합니다. 이러한 레이저 파워는 시판되는 객관적렌즈의 손상 임계값을 초과할 수 있다. 대형 FOV에서 여기 레이저 강도를 균일하게 만들기 위해 채택된 렌즈틀릿 어레이는 이 문제를 우회할 수있다(34). 또한 광축에서 멀리 떨어진 이미징을 할 때 광학 수차가 두드러집니다. 그 결과, DHPSF의 형상이 너무 왜곡되어 쉬운 DHPSF에 사용되는 이중 가우시안 모델에 의해 성공적으로 장착될 수 있습니다. 초광범위 FOV에서 이미징할 때 보다 정교한 공간 변화 PSF 모델이36이필요합니다. 이러한 복잡한 요인을 피하기 위해 여기에 제시된 데이터는 비교적 작은 FOV(직경 = 55 μm)에서 수집되었고 10개의 FOV로부터의 데이터를 75,000개 이상의 단일 분자 궤적을 얻기 위해 풀링되었습니다.

실험적으로 측정된 명백한 확산 계수 분포를 시뮬레이션된 분포와 피팅하려면 실험 데이터의 현실적인 시뮬레이션이 필요합니다. 카메라 기반 추적의 정적 및 동적 지역화 오류는 측정 품질에 영향을 줄 수 있습니다11,13. 정적 국소화 오류는 형광 방출기당 수집된 광자의 유한 수로 인해 부정확한 PSF 형상을 생성하여 제한된 정밀도 2,37, 38. 흐리게 된PSFs 39를생성하는 이동 이미터로 인해 동적 지역화 오류가 발생합니다. PSF의 모양에 맞게 알고리즘을 적용하면 모션 흐림 이미지는 제한된 정확도와 정밀도39로지역화를 제공합니다. 빠른 분자 운동의 심한 경우 이미지가 너무 왜곡되어 적합하지 않아 서 기록된 국소화가 없을 수 있습니다. 공간적으로 흐린 PSF를 사실적인 신호 대 잡음 비율로 시뮬레이션하고 정적 및 동적 지역화 오류를 모두 차지하는 실험 데이터와 동일한 피팅 알고리즘으로 지역화합니다. 둘째, 빠르게 확산되는 분자는 세균 세포의 시토졸과 같은 소량에 강하게 국한될 수 있다. 결과적으로, 명백한 확산 계수는 제한되지 않은 모션에 대해 예상되는 것보다 평균적으로 더 작습니다. 공간 제한은 더 작은 확산 값으로 분포의 전체 왼쪽 이동을 초래합니다. 중요한 것은 분포의 모양이 더 이상 분석 함수로 표현되지 않는다는 것입니다. 정전 시뮬레이션을 통해 모션 흐림 및 감금 효과로 인한 정적 및 동적 지역화 오류를 명시적으로 고려하면 현실적인분포를 23.

기술된 확산 분석은 생물학 환경에서 분자의 동적 거동에 관한 두 가지 주요 가정에 의존합니다. 그것은 확산 상태는 제한된 Brownian 운동에 의해 기술되고 단 하나 분자 궤적의 시간 척도에 상호 변환하지 않는다는 것을 가정합니다. 우리는 실험적으로 제한된 브라운 운동의 가정이 Y. enterocolitica23에서무료 eYFP 확산을 위해 정당화된다는 것을 확인했습니다. 이러한 결과는 30 nm 보다 작은 세포질 단백질, 융합 단백질 및 생체 분자 복합체의 움직임이 Brownian motion18에의해 설명될 수 있다는 것을 확립한 다양한 세균 종에 있는 많은 연구 결과와일치합니다, 40,41,42,43,44,45. 다른 세포 성분과 작은 형광 표지 된 단백질의 비 특이적 충돌은 확산 속도를 느리게 할 수 있습니다,45,46 하지만 브라운 확산에서 편차로 이어질하지 않습니다. 대조적으로, 동종 결합 파트너와의 특이적 상호작용은 Y. 엔테로콜리카 타입 3 분비 단백질 YscQ23에대해 최근에 나타난 바와 같이 확산 계수의 변화를 생성할 수 있다. 두 번째 가정의 유효성은 평가하기 어렵고, 특히 확산 상태나 결합 역학이 알려져 있지 않은 시스템의 경우 특히 중요합니다. 임의의 올리고머화 상태 및 생체외에서 측정된 결합 역학이 생체 내에서 발생하는 구조 및 역학을 반영하지 않을 수 있기 때문에 상황은 더욱 복잡하다. 여기에 제시된 분석 프레임워크에 기초한 최근의 이론적 연구는 확산 계수 및 인구분획(29)이외에 상태 스위칭 역학을 추출하는 것이 가능할 수 있음을 시사한다.

요약하면, 우리는 살아있는 세균 세포에서 측정된 단 하나 분자 궤적에 근거를 둔 형광표지된 분자의 확산 상태를 해결하기 위한 통합된 프로토콜을 제시합니다. 여기에 제시된 바와 같이, 프로토콜은 세균성 병원균인 Y. enterocolitica에서이미징을 위한 이중 나선 PSF를 사용하여 3D 단일 분자 국소화 현미경 검사법에 적용된다. 그러나, 단지 몇몇 수정으로, 프로토콜은 2D 또는 3D 단 하나 분자 현지화 현미경 검사법 및 견본 기하학의 어떤 모형든지에 적용될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

알레시아 아치모비치와 팅 얀에게 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 감사드립니다. 버지니아 대학의 고급 연구 컴퓨팅 서비스 그룹의 선임 직원 인 Ed Hall에게 이 작업에 사용되는 최적화 루틴을 설정하는 데 도움을 주셔서 감사합니다. 이 작업에 대한 자금은 버지니아 대학에 의해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,6-diaminopimelic acid Chem Impex International 5411 Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses Thorlabs AC508-080-A f = 80mm, 2"
514 nm laser Coherent Genesis MX514 MTM Use for fluorescence excitation
agarose Inivtrogen 16520100 Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 M2G ingredient.
bandpass filter Chroma ET510/bp Excitation pathway.
Brain Heart Infusion Sigma Aldrich 53286 Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride Sigma Aldrich 223506 M2G ingredient.
camera Imaging Source DMK 23UP031 Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask Double Helix, LLC N/A Produces DHPSF signal.
disodium phosphate Sigma Aldrich 795410 M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror Newport 8892-K Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres Invitrogen F8792 Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip VWR 16004-302 #1.5, 22mmx22mm
glucose Chem Impex International 811 M2G ingredient.
immersion oil Olympus Z-81025 Placed on objective lens.
iron(II) sulfate Sigma Aldrich F0518 M2G ingredient.
long pass filter Semrock LP02-514RU-25 Emission pathway.
magnesium sulfate Fisher Scientific S25414A M2G ingredient.
microscope platform Mad City Labs custom Platform for inverted microscope.
nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens Olympus 1-U2B991 60X, 1.4 NA
Ozone cleaner Novascan PSD-UV4 Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate Sigma Aldrich 795488 M2G ingredient.
Red LED Thorlabs M625L3 Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V2 Camera for fluorescence imaging.
short pass filter Chroma ET700SP-2P8 Emission pathway.
Tube lens Thorlabs AC508-180-A f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd N/A N/A Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate Thorlabs WPQ05M-514 Excitation pathway.

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Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. J. Vis. Exp. (151), e59387, doi:10.3791/59387 (2019).

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