Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Single-molekylet Tracking mikroskopi-et verktøy for fastsettelse av Diffusive statene cytosolic molekyler

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59387
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics, University of Virginia School of Medicine

Summary

3D single-molekylet lokalisering mikroskopi er benyttet for å granske den romlige posisjoner og bevegelse baner av fluorescensmerkete merket proteiner i levende bakterielle celler. Den eksperimentelle og dataanalyse protokollen som er beskrevet her, bestemmer den utbredte diffusive oppførselen til cytosolic proteiner basert på samlet enkelt molekyl baner.

Abstract

Single-molekylet lokalisering mikroskopi sonder posisjon og bevegelser av individuelle molekyler i levende celler med titalls nanometer romlige og millisekunder Temporal oppløsning. Disse evnene gjør single-molekylet lokalisering mikroskopi ideelt egnet til å studere molekylær nivå biologiske funksjoner i fysiologisk relevante miljøer. Her demonstrerer vi en integrert protokoll for både anskaffelse og prosessering/analyse av sporingsdata for enkelt molekyl for å trekke ut de forskjellige diffusive statene som et protein av interesse kan vise. Denne informasjonen kan brukes til å kvantifisere molekylær kompleks dannelse i levende celler. Vi gir en detaljert beskrivelse av et kamerabasert, lokaliserings eksperiment med 3D enkelt molekyl, samt de påfølgende databehandlings trinnene som gir baner til individuelle molekyler. Disse baner blir deretter analysert ved hjelp av en numerisk analyse rammeverk for å trekke ut de utbredte diffusive statene i fluorescensmerkete merket molekyler og den relative overflod av disse statene. Analysen rammeverket er basert på Stokastisk simuleringer av intracellulære Brownske diffusjon baner som er romlig begrenset av en vilkårlig celle geometri. Basert på den simulerte baner, genereres og analyseres rå bilder med ett molekyl på samme måte som eksperimentelle bilder. På denne måten er eksperimentelle presisjons-og nøyaktighets begrensninger, som er vanskelige å kalibrere eksperimentelt, eksplisitt innlemmet i analyse arbeidsflyten. Diffusion koeffisienten og relative befolkning fraksjoner av de utbredte diffusive statene er bestemt ved å tilpasse distribusjoner av eksperimentelle verdier ved hjelp av lineære kombinasjoner av simulerte distribusjoner. Vi viser nytten av vår protokoll ved å løse de diffusive statene et protein som viser ulike diffusive stater ved forming homo-og hetero-oligomer komplekser i stoffer av en bakteriell patogen.

Introduction

Undersøke diffusive atferden til biomolekyler gir innsikt i sine biologiske funksjoner. Fluorescens mikroskopi-baserte teknikker har blitt verdifulle verktøy for å observere biomolekyler i sitt eget celle miljø. Fluorescens utvinning etter photobleaching (FRAP) og fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS)1 gi ensemble-gjennomsnitt diffusive atferd. Omvendt, enkelt-molekyl lokalisering mikroskopi muliggjør observasjon av individuelle fluorescensmerkete merkede molekyler med høy romlig og tidsmessig oppløsning2,3,4. Å observere individuelle molekyler er fordelaktig siden et protein av interesse kan eksistere i forskjellige diffusive tilstander. For eksempel, to lett gjenkjennelige diffusive tilstander oppstår når en transcriptional regulator, slik som CueR i Escherichia coli, diffunderer fritt i stoffer eller binder seg til en DNA-sekvens og blir immobilisert på tidsskalaen for måling5 . Enkelt-molekyl sporing gir et verktøy for å observere disse ulike statene direkte, og sofistikerte analyser er ikke nødvendig å løse dem. Imidlertid, den blir flere utfordrende å løse mangfoldig diffusive fastslår og deres befolkning brøk inne sakene der hvor deres diffusive ratene er flere lignende. For eksempel, på grunn av størrelsen avhengighet av diffusjon koeffisienten, ulike oligomerisering tilstander av et protein manifestere seg som forskjellige diffusive stater6,7,8,9 , 10. slike saker krever en integrert tilnærming i form av datainnsamling, prosessering og analyse.

En kritisk faktor som påvirker diffusive utbredelsen av cytosolic molekyler, er effekten av å være i fangenskap ved cellegrensen. Restriksjonene plassert på molekylær bevegelse av en bakteriell cellegrensen føre til en cytosolic molekyler ' målt diffusjon rate skal vises tregere enn om den samme bevegelsen hadde skjedd i en unconfined plass. For svært langsomt spre molekyler, er effekten av cellulær fødsel ubetydelig på grunn av mangel på kollisjoner med grensen. I slike tilfeller kan det være mulig å nøyaktig løse diffusive tilstander ved å montere distribusjoner av molekylær forskyvninger, reller tilsynelatende diffusjon koeffisienter, D *, ved hjelp av analytiske modeller basert på likninger for brownske bevegelse ( tilfeldig diffusjon)11,12,13. Men for raske spre cytosolic molekyler, de eksperimentelle distribusjonene ikke lenger ligne de innhentet for unconfined Brownske bevegelse på grunn av kollisjoner av spre molekyler med celle grenser. Fødsel effekter må regnskapsføres for å nøyaktig bestemme unconfined diffusjon koeffisienter av fluorescensmerkete merket molekyler. Flere tilnærminger har nylig blitt utviklet for å ta hensyn til fødsel effekter enten (semi-) analytisk 5,14,15,16 eller numerisk gjennom Monte Carlo simuleringer av Brownske Diffusion6,10,16,17,18,19.

Her gir vi en integrert protokoll for å samle inn og analysere enkelt molekyl lokaliserings mikroskopi data med et spesielt fokus på sporing av enkelt molekyl. Målet med protokollen er å løse diffusive tilstander av fluorescensmerkete merket cytosolic proteiner inne, i dette tilfellet, Rod-formede bakterielle celler. Arbeidet vårt bygger på en tidligere protokoll for sporing av enkelt molekyl, der en DNA-polymerase, PolI, ble vist å eksistere i en DNA-bundet og ubundet tilstand ved diffusjon analyse20. Her utvider vi enkelt-molekylet sporing analyse til 3D målinger og utføre mer realistiske beregningsorientert simuleringer å løse og kvantifisere flere diffusive tilstander samtidig tilstede i cellene. Dataene er ervervet ved hjelp av en hjemmelaget 3D super-oppløsning fluorescens mikroskop som er i stand til å bestemme 3D posisjon av fluorescerende sendere ved Imaging med dobbel Helix punkt-spredning-funksjon (DHPSF)21,22. Den rå single-molekylet bilder er behandlet ved hjelp av egendefinert skrevet programvare for å trekke ut 3D single-molekylet lokaliseringer, som deretter kombineres til ett-molekyl baner. Tusenvis av baner er samlet for å generere distribusjoner av tilsynelatende diffusjon koeffisienter. I et siste trinn, er de eksperimentelle distribusjonene passer med numerisk genererte distribusjoner innhentet gjennom Monte-Carlo simuleringer av Brownske bevegelse i et trangt volum. Vi bruker denne protokollen for å løse diffusive statene av type 3 sekresjon system protein YscQ i levende Yersinia enterocolitica. På grunn av sin modulære natur, er vår protokoll vanligvis gjelder for alle typer enkelt-molekyl eller enkelt-partikkel sporing eksperiment i vilkårlig celle geometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. dobbel Helix punkt-spredning-funksjon kalibrering

Merk: bilder som er beskrevet i dette og følgende deler anskaffes ved hjelp av et spesiallaget invertert fluorescens mikroskop, som beskrevet i Rocha et al.23. Den samme fremgangsmåten gjelder for forskjellige mikroskop implementeringer som er utviklet for lokalisering og sporing av enkelt molekyl mikroskopi2,3,4. All programvare for bildeinnhenting og databehandling som er beskrevet i denne artikkelen, er tilgjengelig (https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git).

  1. Utarbeidelse av agarose pads for montering prøver på glass deksel slips for å bli sett under mikroskopet.
    1. Tilsett 1.5-2% av vekt lavt Smeltepunkt agarose mL M2G buffer (4,9 mM na2HPO4, 3,1 mm KH2PO4, 7,5 mm NH4CL, 0,5 mM MgSO4, 10 μM FeSO4, 0,5 mm CaCl2 og 0,2% glukose). Mikrobølgeovn i flere sekunder til alle agarose er oppløst. Ikke la løsningen koke.
    2. La den agarose løsningen avkjøles i noen minutter (2-3 min).
    3. Pipetter 600 μL av agarose oppløsning på en glass deksel (22 mm x 22 mm). Plasser et annet glass deksel på toppen av agarose forsiktig. Dette skaper en tynn (~ 0,5 mm) agarose gel pad mellom de to glass deksel slips.
    4. La agarose pads sitte å stivne i ~ 20 min.
    5. Forsiktig skille glassdekselet slips. Den agarose puten vil holde seg til en av dem.
    6. Bruk et barberblad og skjær agarose puten i fire firkantede deler av samme størrelse. Hver kvadrat del kan brukes for en enkelt prøve.
  2. Pipetter 1,5 μL av fluorescerende perle løsning på en agarose pute. Bead løsningen er en 1/100000 fortynning av aksjen løsning i M2G (se tabell over materialer).
  3. Vend agarose puten og plasser på en glass deksel slip som har blitt rengjort i en ozon renere i 30 min. Rengjøringstiden er valgt for å eliminere eventuelle fluorescerende molekyler som tilhenger til coverslips.
  4. Monter prøve deksel glasset på prøve holderen til et invertert fluorescens-mikroskop og fest det på plass ved hjelp av teip eller fjær fylte klips.
  5. Legg en dråpe nedsenking olje på målet for mikroskopet.
  6. Sett prøveholderen på et mikroskop og fest den på plass.
  7. Initialiser det grafiske brukergrensesnittet (GUI) for å styre mikroskopet på kameraet, prøvefasen og eksitasjon lasere. Her er tilpasset skrevet programvare i MATLAB brukes for instrument kontroll (supplerende figur 1).
  8. Initialiser kameraprogramvaren HCImage Live. Inne det fange tab under kameraet administrere avdeling, sette det avsøring tid å 0,03 s. Klikk Live for å starte en live feed av kameraet.
  9. Slå på laseren ved å klikke åpne 514 NM laser på GUI-grensesnittet til å opphisse den fluorescerende perler på puten og vise fluorescens utslipp på kameraet ved hjelp av live-stream-modus (dvs. ingen data lagret på disk).
  10. Juster X-og Y-posisjonene til mikroskop stadiet ved å klikke på "XY-POS" pilene under "Micro-Positioning Stage" delen av GUI å plassere minst en fluorescerende perle i midten av feltet-of-view (FOV). Trinn størrelsen kan endres ved å klikke på rullegardinlisten under pilene.
  11. Juster Z-posisjonen til mikroskop stadiet ved å klikke z-POS -pilene under delen nano-Positioning Stage i det grafiske brukergrensesnittet. Still inn retningen til den doble spiral punkt sprednings funksjonen (DHPSF) til den fluorescerende perlen for å være vertikal. Denne vertikale orienteringen er definert som utgangspunkt i Z-kalibreringen. Trinn størrelsen kan endres ved å klikke på rullegardinlisten under pilene.
  12. I HCImage Live, under Capture | Trigger moduser, hastighet og registrering, endre trigger modus fra intern til ekstern nivå utløser. Dette vil tillate MATLAB GUI å styre kameraet.
  13. Under sekvens | Skanneinnstillinger, endre antall bilder som teller til 1200. Velg en mappe for lagring av mål ved å klikke på knappen merket .... Endelig Klikk Start. Antallet av rammen teller er sette å 1200 i den grad at 10 rammens kan avhentet for hver av 120 Z holdning skritt.
  14. Skann gjennom en rekke Z posisjoner (30 trinn over og under Start Z posisjon i 50 NM trinn) og spille inn 10 bilder på hvert trinn ved hjelp av en eksponeringstid på 0,03 s. Start den automatiserte prosessen ved å klikke på gå under Z-Calibration- delen av det GUI.
    Merk: parametrene for kalibrering, inkludert trinn-lengde, antall trinn, kameraets eksponeringstid, og antall bilder per trinn kan justeres her også. Ca 105 fotoner kan skaffes fra en fluorescerende perle i en enkelt ramme med 0,03 s eksponeringstider som resulterer i x, y, z lokalisering presiseringer på ca 1 NM.
  15. Slå av laser belysningen ved å klikke lukk 515 NM laser i GUI. I HCImage Live, under Capture | Trigger moduser, hastighet og registrering, endre trigger modus tilbake til intern. Under sekvens | Innstillinger for skanning endre antall bilder som teller til 200. Velg en mappe for lagring av mål ved å klikke på knappen merket .... Klikk Start for å samle 200 rammer med mørke bilder med en 0,03 s eksponeringstid.
    Merk: selv i fravær av lys som faller på detektoren, vil hver piksel lese opp et positivt tall (referert til som den mørke forskyvningsverdien), som kan variere litt mellom piksler. Den mørke forskyvningsverdien kan endres over tid. Derfor er det nødvendig å samle mørke rammer for hver kalibrering.
  16. Monter DHPSF med en dobbel-Gaussian modell ved hjelp av Easy-DHPSF programvare24 for å få X og Y posisjoner av perlen, samt en vinkel kontra Z kalibrering kurve.
    1. Initialiser Easy-DHPSF-programvare i MATLAB. Angi kanal til G og sett TILPASNINGS metode til mle med DG-modellunder Oppsett. G refererer til den grønne kanal kamera, som fluorescerende protein som brukes for datainnsamling avgir med grønne bølgelengder. Mle med DG Model refererer til maksimal sannsynlighet estimering med dobbel-Gaussian modell.
      Merk: pikselstørrelsen og konverterings forsterkningen er avhengig av det spesifikke optiske oppsettet og må kanskje endres.
    2. Klikk Kjørunder Kalibrer DHPSF -delen. Falle i staver OK på fulgte popmusikk-opp vindu å oppbevare retten innfatningene.
    3. Velg bildet stabelen lagret i trinn 1.13-1.14. Deretter velger du bildes takken med den mørke bakgrunnen som ble lagret i trinn 1,15. Til slutt, velge det. txt arkiv det var automatisk bevart i løpet av steg 1,14. Denne filen inneholder Z-posisjonen til trinnet gjennom hele skanneprosessen.
    4. I neste popup-vindu, hvis hele kameraet chip ble ikke brukt for synsfelt, input Start x0 og y0 posisjoner på brikken. Ellers input x0 = 1 og y0 = 1. denne informasjonen finnes i HCImage Live under binning og SubArrary seksjonen.
    5. I følgende vindu, endre størrelse og omplassere boksen som vises over bildet av fluorescerende perler, slik at det er ca 100 x 100 piksler i størrelse og sentrert over en enkelt fluorescerende DHPSF signal. Deretter dobbeltklikker du for å fortsette.
      Merk: den valgte DHPSF skal isoleres fra de andre DHPSF-signalene og ideelt sett være den smarteste perlen som er mulig.
    6. Klikk i midten av DHPSF signal, i mellom de to fliker, og trykk Enter. Følgende vindu viser en zoomet visning av den valgte DHPSF. Mer presist velge plasseringen av sentrum av DHPSF ved å klikke.
      Merk: programmet vil da passe DHPSF, og vise rå bildet og gjenoppbygging fra Fit. Det vil også output mal bilder fra Z kalibrering tilsvarende en DHPSF tverrsnitt på ulike Z posisjoner. Disse vil bli brukt senere for montering av eksperimentelle data. Programmet vil sende ut X-, Y-og Z-posisjonen estimert i hver ramme. I et godt justert optisk system, X og Y bør endre svært lite (~ 30 NM avvik) som Z posisjon endringer. Hvis output variasjonen er større enn 30 NM, fase masken, som ligger i Fourier-flyet av bilde systemet (figur 1), bør være realigned og trinn 1.9-1.16 gjentas.
    7. Bevare det lett-DHPSF GUI av klikker på bevare ikon inne det øvre igjen avkrok av det GUI. Dette kan senere lastes inn ved å klikke på Last -IKONET i GUI.
      Merk: Z kalibrering prosedyren bør gjennomføres på hver dag i et eksperiment for å ta høyde for justering endringer i mikroskopet som kan ha oppstått på grunn av temperatursvingninger eller mekaniske vibrasjoner.

2. bakteriell kultur forberedelse

  1. Forbered kultur medier som støtter bakterie cellevekst. For Y. enterocolitica, bruk 5 ml BHI (Brain Heart infusjon) buljong som inneholder Nalidixic syre (35 mikrogram/ml) og 2, 6-diaminopimelic syre (80 μg/ml). Her er en Y. enterocolitica stamme som brukes som har proteinet YscQ merket med fluorescerende protein eYFP23.
  2. Vaksinere medier med bakteriekulturer fra fryse aksjer eller plate kulturer.
  3. Dyrke kulturen ved 28 ° c med risting over natten.
  4. Fortynne en liten mengde (~ 250 μL) av mettet over natten kultur til 5 mL ved hjelp av ferske kultur medier.
  5. Dyrke kulturen ved 28 ° c med risting i 60-90 min.
  6. Indusere uttrykk for fluorescerende fusjons protein. For Y. enterocolitica, varme sjokk cellene til 37 ° c i en vann shaker for å indusere yop regulon.
  7. Ruge cellene for ytterligere 3 t ved 37 ° c med risting.
  8. Sentrifuger 1 mL kultur ved 5 000 x g i 3 min ved romtemperatur. Kast supernatanten.
  9. Vask pellet 3 ganger med 1 mL M2G Media.
  10. Re-suspendere pelleted bakterier i ~ 250 μL av M2G Media.
  11. Legg fluorescerende perler som fiducial markører. Fluorescerende perle løsning bør tilsettes i riktig utvannet beløp, slik at det bare er 1-2 perler per FOV sett i mikroskopet.
  12. Pipetter forsiktig eller Vortex suspensjonen for å skille aggregerte celler.
  13. Plate 1,5 μL av fjæring på en 1,5-2% agarose pad laget med M2G.
  14. Vend agarose puten og plasser den på et ozon renset mikroskop deksel slip. Dekk Seddelen skal plasseres i en ozon renere i 30 min for å redusere enhver iboende fluorescens bakgrunn.

3. innhenting av data

  1. Monter prøve deksel glasset på prøve holderen til et invertert fluorescens-mikroskop og fest det på plass ved hjelp av teip eller fjær fylte klips.
  2. Legg en dråpe nedsenking olje på målsettingen av mikroskopet, og plasser deretter prøveholderen på mikroskopet og fest den på plass.
  3. Initialiser grafisk brukergrensesnitt (GUI) for å kontrollere kameraet på mikroskopet, prøvefasen og eksitasjon lasere. Her er tilpasset skrevet programvare i MATLAB brukes for instrument kontroll.
  4. Initialiser kameraprogramvare HCImage Live. Inne det fange tab under kameraet administrere avdeling, sette det avsøring tid å 0,025 s. Klikk Live for å starte en live feed av kameraet.
  5. Juster X-og Y-posisjonene til mikroskop trinnet ved å klikke på XY-POS- piler under mikro-POSISJONERINGS fasen i GUI-en for å skanne rundt PRØVEN og finne en FOV med en riktig tett populasjon av bakterieceller.
    Merk: for å maksimere datagjennomstrømningen bør cellene være så tette som mulig, uten overlappende eller rørende celler. FOV bør også inkludere minst 1 fluorescerende perle som skal brukes som fiducial markør, fortrinnsvis plassert i et hjørne av FOV.
  6. Juster Z-posisjonen til mikroskopet scenen ved å klikke på z-POS pilene under nano-posisjonering Stage delen av GUI, slik at FLUORESCERENDE bead ' s DHPSF fliker er vertikale.
  7. Under sekvens | Skanneinnstillinger, endre antall bilder som teller til 20 000. Velg en mappe for lagring av mål ved å klikke på knappen merket .... Endelig Klikk Start for å samle opp til 20 000 kamera RAM mer ved hjelp av en kort eksponeringstid på 0,025 s. eYFP photoblinking initieres ved hjelp av høy intensitet eksitasjon lys på 514 NM19,25.
    Merk: Her er en laser intensitet på ~ 350 W/cm2 på fokalplanet brukes for innledende bleking og påfølgende Imaging av enkelt EYFP molekyler. Photoactivation av eYFP molekyler ved UV-bølgelengder under bildebehandling ble ikke brukt. Det bør være høyst ett enkelt-molekyl signal per bakterie celle. Hvis tettheten av ett-molekyl signal er for høy i utgangspunktet, fortsetter å belyse til tilstrekkelig photobleaching oppstår før du begynner datainnsamling.
  8. Slå av laser belysningen ved å klikke lukk 515 NM laser i GUI. Samle 200 rammer med mørke bilder med samme eksponeringstid.
  9. I GUI, kryss av i boksen ved siden av THORLABS LED og klikk Toggle speil opp. Dette vil endre veien fra fluorescens veien til fase kontrast veien.
  10. Initialiser datainnsamlingsprogram varen IC Capture 2,4. Dette styrer kameraet i fase kontrast veien. Trykk på Start/stop Live display- knappen for å vise en live-feed fra kameraet. Klikk på Capture | Lagre bildet for å samle inn et bilde av fase kontrasten for cellene i synsfeltet.
  11. Gjenta trinn 3,5-3.10 for ytterligere FOVs. Her, data ervervet fra ~ 500 bakterielle celler i ti forskjellige FOVs brukes til å øke antall enkelt-molekyl baner tilgjengelig for analyse.
    FORSIKTIG: celler montert på agarose pads for lange perioder av gangen kan oppføre seg annerledes enn fersk montert celler. I tillegg kan agarose puten miste sin integritet etter en tid, noe som kan ha negativ innvirkning på datakvaliteten. Vanligvis, på de fleste 3 FOV (~ 30 min på mikroskopet) brukes per eksempel lysbilde.

4. data behandling

Merk: en modifisert versjon av Easy-DHPSF programvare24 brukes i MATLAB for analysen av den rå kamera rammer for å trekke ut ett molekyl lokaliseringer. Easy-DHPSF brukes spesielt til å passe DHPSF lokaliseringer i enkelt-molekyl bildebehandling. Det ble gjort egendefinerte endringer for å implementere Maksimal sannsynlighet estimering (MLE)-basert tilpasnings rutine som står for de piksel avhengige støy egenskapene til moderne sCMOS-kameraer26. Det ble også endret for å godta bildefiltype utgang fra HCImage Live-programmet (. dcimg). For en mer detaljert forklaring av programvaren og de enkelte trinnene, kan du se Lew et al.24

  1. Initialiser Easy-DHPSF GUI i MATLAB (supplerende figur 2). Last inn filen som er lagret i trinn 1.16.8.
  2. Bestemme terskelverdier for hver av de 7 malene utdata i trinn 1.16.7
    1. Under delen KALIBRER SM-identifikasjon klikker du Kjør. Klikk OK på følgende to popup-vinduer for å beholde standardinnstillingene.
    2. Åpne bildes takken som inneholder dataene fra den første FOV når du blir bedt om det.
    3. Velg et lite utvalg av rammer for å matche maler. Vanligvis rammer 1001-2000 brukes for å unngå tette overlappende signaler i de første flere hundre rammer. Falle i staver OK på fulgte popmusikk-opp vindu å oppbevare retten innfatningene. Klikk Avbryt når du blir bedt om sekvens loggfilen i følgende vindu.
    4. Åpne bildes takken med den mørke bakgrunnen lagret i trinn 3,8. Klikk "OK" i følgende popup-vindu for å la parametrene for bakgrunnen estimering satt til standard. Standarden er å estimere bakgrunnen ved hjelp av et median filter27 som dekker 100 påfølgende kamera RAM mer rundt gjeldende ramme.
    5. I det neste vinduet, endre størrelsen på boksen kledde på bildet for å dekke hele FOV, dobbeltklikk deretter for å fortsette.
    6. Definer området av interesse ved å klikke på flere punkter på bildet for å opprette et polygon. Regionen av interesse bør inkludere så mye av synsfeltet som mulig, samtidig som at eventuelle fluorescerende perler (veldig lyse gjenstander) i bildet ikke lå innenfor polygon, og dobbeltklikk for å fortsette.
      Merk: programvaren vil da forsøke å matche malene til bildet, og vil vise et bilde med mulige matcher sirkel.
    7. Når programvaren har stoppet, vil det spare mange bilder av funnet mal kamper og vise tilsvarende terskelverdi i en forhåndsdefinert mappe. En høyere terskelverdi tilsvarer en bedre match. For hvert malnummer undersøker du eksempel treffene og bestemmer den laveste terskelen som viser et bilde av en DHPSF. Input disse terskler for hver av de 7 malene under KALIBRER SM Identification delen i Easy-DHPSF GUI.
      Merk: programmet vil forsøke å automatisk velge og input terskler, men disse er ofte upålitelige og bør sjekkes manuelt. Terskler er valgt slik at noen sanne single-molekylet signaler er savnet, men antall falske positive kandidater for montering forblir beregningsmessig håndterlig.
    8. Lagre Easy-DHPSF GUI igjen ved å klikke på Lagre -ikonet i øvre venstre hjørne.
  3. Montering av fluorescerende perle i FOV å bruke som en fiducial markør
    1. Klikk Kjørunder spor forvaltere -delen av Easy-DHPSF GUI. Klikk OK på følgende to popup-vinduer for å beholde standardinnstillingene.
    2. Dra boksen overlappet på bildet og midtstille den over DHPSF signalet fra fluorescerende perle, dobbeltklikk deretter.
    3. Klikk i midten av DHPSF signalet, på midtpunktet mellom de to fliker, og trykk ENTER. Klikk Avbryt når du blir bedt om sekvens loggfilen i følgende vindu.
      Merk: programvaren vil passe DHPSF i alle kamera RAM mer, og vise rå bildet og rekonstruert bilde. Når programvaren er ferdig, vil den utgang tall med X, Y, og Z posisjoner av fluorescerende perle over varigheten av bildet oppkjøpet.
    4. Merk av i boksen ved siden av Bruk forvaltere og lagre Easy-DHPSF GUI igjen ved å klikke på Lagre-ikonet i øvre venstre hjørne.
  4. Finn og Tilpass alle lokaliseringer i alle kamera RAM mer ved hjelp av mal terskler innhentet i trinn 4,2.
    1. Under LOKALISERE DHPSF SMs delen av Easy-DHPSF GUI, klikk Kjør. Falle i staver OK på fulgte popmusikk-opp Vinduer å oppbevare retten innfatningene. Klikk Avbryt når du blir bedt om sekvens loggfilen i følgende vindu.
      Merk: programvaren vil finne og tilpasse DHPSF ved hjelp av en dobbel-Gaussian modell hvis kvaliteten på kampen er over den brukerdefinerte terskelen. Den ville utfoldelse det ømt punkt image med sirklene i nærheten mal passer til likeledes idet en image av det rekonstruert DHPSF monterer.
    2. Lagre Easy-DHPSF GUI igjen ved å klikke på Lagre -ikonet i øvre venstre hjørne.
  5. Visning av enkelt molekyl lokaliseringer og filtrering av uønsket eller upålitelig lokaliseringer
    1. Under delen output DHPSF SM lokaliseringer klikker du på Filtrer utdata.
    2. Falle i staver OK inne det fulgte tre Vinduer å utføre en interpolering av det fiducial X, Y, og Z posisjoner over tid. I de fleste tilfeller er standardalternativene tilstrekkelig. Hvis den svarte interpolert linjen ikke reflekterer et rimelig interpolering av den røde posisjons linjen, endrer du interpolering-parameterne i popup-vinduet.
      Merk: den interpolert linjen brukes til fase-drift korrigere enkelt molekyl lokaliseringer.
    3. Åpne det tilsvarende fase kontrast bildet for FOV som analyseres når du blir bedt om det. Klikk OK på følgende to popup-vinduer for å beholde standardinnstillingene.
    4. I følgende to popup-vinduer, kan du endre filterverdiene for å tillate mer strenge eller mildere enkelt molekylet lokalisering krav, og klikk deretter OK.
    5. I vinduet som vises, drar eller endrer du størrelsen på boksen overlappet på bildene for å vise ønsket interesseområde og dobbeltklikker for å fortsette.
    6. En 3D-rekonstruksjon av lokaliseringer med ett molekyl vises. Bruk figuren verktøy for å manipulere gjenoppbygging (rotere, zoome, etc). Klikk Fortsett for å vise en annen dialogbokssom spør ' vil du Replot med et annet parametersett?'. Hvis resultatene er tilfredsstillende, klikker du Nei. Hvis de ikke er det, klikker du Ja.
      Merk: vanlige årsaker til utilfredsstillende resultater inkluderer fase kontrast bildet ikke er riktig kledde med lokalisering data eller den opprinnelige malen terskler var for lav skaper mange falske positive lokaliseringer. Hvis Ja ble valgt, vil programvaren gå tilbake til trinn 4.5.4 slik at nye parameterverdier kan defineres. Hvis Nei ble valgt, blir resultatene lagret.

5. etterbehandling av data

  1. Ved hjelp av egendefinert programvare i MATLAB beskjærer du fase kontrast bildet slik at bare området som inneholder celler som ble avbildet under det fluorescens mikroskopet, forblir uendret. Dette trinnet er nødvendig fordi fase kontrast bildet dekker et område som er mye større enn det fluorescens bildet. Beskjæring av bildet forenkler neste trinn.
  2. Segmentere enkeltceller ved å behandle fase kontrast bildet med OUFTI28 -programvaren (supplerende figur 3)
    1. Initialiser OUFTI i MATLAB. Legg det beskjæres fase kontrast bildet fra forrige trinn ved å klikke på Last fasen.
    2. Klikk på fil for å velge og navngi en lagringsplassering for utdatafilen.
    3. Velg uavhengige rammer under gjenkjennings-og analyse overskriften.
    4. Klikk Last inn parametere for å laste inn parametere for celle gjenkjenning. Eksempler på parametere er akseptabelt celleområde, cellebredde og en celle Delings terskel.
      Merk: alle disse parametrene bør justeres for å maksimere ytelsen for de spesifikke celle størrelsene og bildekvaliteten som brukes. Viktigere, algoritmen parameteren bør settes til underpiksel å tillate presis måling av celle omriss.
    5. Klikk denne rammen for å starte celle segmentering. Celle omriss vises over fase kontrast bildet når prosessen er fullført.
    6. Bruk kontrollene under manuell inndeling, del celler, Legg til celler eller Finjuster celle omriss for å få disposisjoner for celler som ble unøyaktig segmentert under den automatiserte prosessen.
    7. Utdata celle konturene ved å klikke Lagre analyse.
  3. Bruk egendefinert skriftlig programvare i MATLAB til presist overlegg konturene innhentet i forrige trinn med single-molekylet lokaliseringer. Følgende substeps detalj trinnene i programvaren.
    1. Velg manuelt 5 kontrollpunkt par i popup-vinduet ved å beregne og klikke på posisjonen til celle polene av de samme fem cellene i både enkelt molekyl lokaliseringsdata og celle omriss, som genereres i forrige trinn. Plasseringen av celle stangen kan grovt anslås ved mentalt å tegne en konveks skrog rundt single-molekylet lokaliseringer som tilhører en celle og velge punkt høyeste krumning (supplerende figur 4).
    2. Generer en 2D-affine transformerings funksjon ved hjelp av cp2tform -funksjonen i MATLAB, og bruk den til å generere en grov overlapping av celle konturene og enkelt molekyl lokaliseringer.
    3. Slette celler som inneholder færre enn 10 lokaliseringer, og fjerne celler som er plassert delvis utenfor feltvisningen. Slett eventuelle ekstra uønskede celler manuelt i popup-vinduet ved å klikke på innsiden av celle disposisjonen (supplerende figur 5).
    4. Bruk sentrum av massen for alle gjenværende celle omriss og Single-molekylet lokaliseringer i dem til å danne et større sett med kontrollpunkt parene, re-beregne 2D transformasjon funksjon, og bruke den til å generere en endelig overlegg av celle skisserer og Single-molekyl lokaliseringer.
    5. Tilordne lokaliseringer som befinner seg innenfor grensen til en celle disposisjon til denne cellen. Kast eventuelle lokaliseringer som ikke finnes i noen celle omriss (figur 2a, supplerende figur 6).

6. sporing av enkelt molekyl

Merk: følgende del er fullført ved hjelp av egendefinert skriftlig programvare i MATLAB. Denne delen beskriver trinnene programvaren utfører.

  1. For lokaliseringer som er tilordnet til samme celle og i etterfølgende kamera RAM mer, beregner du euklidsk avstanden mellom lokaliseringer. Hvis avstanden mellom lokaliseringer er under en terskel på 2,5 μm, kobler du lokaliseringer ved å tilordne dem til samme enkelt molekyl bane.
    Merk: det er viktig å bare vurdere lokaliseringer innenfor en enkelt celle, slik at lokaliseringer i tilstøtende celler som tilfeldigvis oppfyller romlige og timelige terskel kravene ikke er koblet sammen. Terskelen for 2,5 μm ble valgt som maksimums avstand et svært raskt molekyl (30 μm2/s) kunne reise i lengden av eksponeringstiden (0,025 s) pluss en 20% buffer.
  2. Kast baner kortere enn 4 lokaliseringer. Hvis to eller flere lokaliseringer (dvs. to eller flere fluorescerende sendere) er samtidig til stede i en celle, forkaste den tilknyttede baner. Hvis du angir spor lengden minimum til 4 lokaliseringer, kan flere avstandsmålinger i gjennomsnitt gir et mer nøyaktig anslag over diffusjon koeffisienter.
  3. Beregn gjennomsnittlig kvadrat forskyvning (MSD) for en gitt bane ved å:
    Equation 11
    der n er det totale antallet lokaliseringer i banen og xN er plasseringen av molekylet på time Point N.
  4. Beregn den tilsynelatende diffusjon koeffisienten, D * av
    Equation 22
    der m = 2 eller 3 er dimensionality av målingen og Δt er kameraets eksponeringstid.
    Merk: et typisk eksperiment vil produsere ~ 5000-100000 baner totalt, noe som resulterer i en tilsynelatende diffusjon koeffisient fordeling med så mange tellinger.

7. Monte-Carlo simulering av Brownske bevegelse i et trangt volum

Merk: Opprett biblioteker med simulerte tilsynelatende diffusjon koeffisient distribusjoner ved å utføre Monte Carlo-simuleringer av Brownske bevegelse som er begrenset til et sylindrisk volum, ved hjelp av 64 verdier i området 0,05 – 20 μm2/s som inndataparametere (programvare tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel). Dette området ble valgt til å dekke rekkevidden av tidligere anslått diffusjon koeffisienter av fluorescerende (fusjon) proteiner i bakterier. 64 diffusjon koeffisienter brukes til å prøve dette området tilstrekkelig. Denne delen utføres ved hjelp av egendefinert skriftlig programvare i MATLAB og beskriver trinnene programvaren tar automatisk. De stang-formede Y. enterocolitica cellene som brukes her, er rundet av med et sylindrisk volum av lengde l = 5 μm og diameter d = 0,8 μm.

  1. Initiere individuelle baner på en tilfeldig posisjon i sylindriske volum, og simulere sine tilfeldige (dvs. Brownske) diffusjon trinnene ved hjelp av et tidsintervall på 100 NS (tidsintervallet bør være mye kortere enn kameraets eksponeringstid for å muliggjøre tilstrekkelig prøvetaking av posisjonen i løpet av en kamera ramme). Eksempel på hvert Forskyvnings trinn for en inn data D fra den tilsvarende Gaussian Distribution-funksjonen ved omorganisering av eqn. 2 og legge den til forrige posisjon:
    Equation 33
    der randn -funksjonen i MATLAB prøver et tilfeldig tall fra en normalfordeling. Hvis et trinn fører til at molekylet forskyves utenfor volumet av sylinderen, reflekterer molekylet tilbake inne i sylinderen i en tilfeldig vinkel.
  2. For hvert tidsintervall kan du generere en DHPSF-avbildning som tilsvarer den øyeblikkelige x, y, z- posisjonen til den simulerte emitter.
    1. For å matche eksperimentelle forhold, kan du simulere bilder som inneholder 1 000 fotoner per lokalisering, med en laser bakgrunn på 13 fotoner per piksel, og Poisson-støy. I tillegg legger mørk offset av ~ 50 fotoner per piksel og Gaussian lese støy (σ ~ 1,5 fotoner), i samsvar med eksperimentelle kameraet kalibrering målinger. Til slutt multipliserer du bildet med eksperimentelt målte piksel avhengig gevinst på sCMOS-kameraet for å få bildet i enheter med detektor antall.
      Merk: etter disse manipulasjoner er signal-til-støy-forholdet til det endelige bildet ~ 2.
    2. Generer Motion-uskarpe bilder som reflekterer den skiftende posisjonen til molekylene ved å summere 50 DHPSF-bilder som er simulert under eksponeringstiden som brukes under eksperimentell datainnhenting. For å begrense beregningsorientert bekostning, bare 50 periodisk samplet posisjoner ble valgt til å generere et bilde (i stedet for alle 250 000 stillinger samplet under en 0,025 s eksponeringstid ved et samplings intervall på 100 NS).
      Merk: lengden (antall bilder) av simulert baner skal samsvare med den gjennomsnittlige lengden på eksperimentell baner. I dette tilfellet er antall bilder per bane 6.
  3. Generer 5 000-baner for hver av de 64 simulerte inn data sprednings koeffisienter.
  4. Analyser simulerte kamera RAM mer som beskrevet i avsnittet data behandling .
  5. Link lokaliseringer til baner som beskrevet i seksjonen for enkelt molekyl sporing .
  6. Interpolere den kumulative fordelingsfunksjonen (CDF) for hver simulert distribusjon ved hjelp av B-spline interpolering av rekkefølge 25. Interpolert distribusjoner er nødvendig, slik at de kan spørres på vilkårlig poeng.
  7. Interpolere de resulterende B-spline-kurvene langs D-aksen (d er den sanne unconfined Diffusion koeffisienten som styrer bevegelsen til de simulerte senderne) ved hjelp av scatteredInterpolant -funksjonen i MATLAB (angi ' naturlig ' interpolering metode). Dette gir en kontinuerlig 2D-funksjon der enhver åpenbar diffusjon koeffisient fordeling tilsvarende en sann diffusjon koeffisient verdi i området 0,05-20 μm2/s kan spørres.

8. eksperimentell tilsynelatende diffusjon koeffisient distribusjon montering

Merk: Fit eksperimentelt målt distribusjoner av tilsynelatende diffusjon koeffisienter ved hjelp av lineære kombinasjoner av simulerte distribusjoner generert i forrige avsnitt (Monte-Carlo simulering av brownske bevegelse i et trangt volum). Denne delen utføres ved hjelp av egendefinert skriftlig programvare i MATLAB og beskriver trinnene programvaren tar automatisk. For mer informasjon og eksempler på anvendelse, vennligst se Rocha et al.29

  1. Utfør en begrenset lineær minste kvadrater Fit (ved hjelp av lsqlin -funksjonen i MATLAB) av eksperimentell CDF ved hjelp av en periodisk samplet rekke simulerte CDFs fra biblioteket opprettet i § 7. Utdataene for dette trinnet er en parameter vektor som inneholder diffusjon koeffisienter og befolknings brøker av utbredt diffusive tilstander i den eksperimentelle distribusjonen.
  2. Kombiner diffusive tilstander med diffusjon koeffisient verdier innen 20% av hverandre i en enkelt diffusive tilstand etter vekt gjennomsnitt basert på relative befolknings brøk. Dette er start parameteren vektor.
    Merk: for å redusere modellens kompleksitet, kan diffusive tilstander med diffusjon koeffisienter under 0,5 μm2/s holdes konstant under alle de følgende trinnene.
  3. Opprette matriser med prøve tilpassing parameter vektorer med ulike antall diffusive tilstander, fra en enkelt diffusive tilstand til en brukerdefinert maksimalt antall tilstander.
    1. Ved hjelp av Start parameteren vektor, kombinere tilstøtende diffusive tilstander gjennom vektet gjennomsnitt og splitte diffusive stater i to stater med samme befolkning fraksjoner og diffusjon koeffisienter 20% over og under den opprinnelige verdien. Gjenta for alle statlige kombinasjons-og delingsmuligheter.
  4. Bruk hver prøve tilpassing parameter vektor til å initialisere en ikke-lineær minste kvadrat montering av 5 separate delsett av dataene (ved hjelp av fmincon -funksjonen i MATLAB). Bestem kvaliteten på passformen ved å finne rest summen av kvadratene mellom tilpasningen og fordelingen som tilsvarer de resterende delsett (data kryss validering).
  5. Bruk gjennomsnittlig rest summen av kvadratene av de 5 separate beslag for hver prøve vektor som den generelle kvaliteten på passform, bestemme rettssaken vektor med den beste kvaliteten på passer for hvert antall diffusive stater.
  6. Bestem det optimale antall stater ved å identifisere rettssaken vektoren som legger en ekstra tilstand ikke resulterer i minst en 5% forbedring i kvaliteten på passform.
  7. Bruk denne prøve vektor å initialisere den ikke-lineære minst kvadrater montering av hele datasettet.
  8. Estimat feil for de enkelte parameterne ved å oppdatere dataene etter bootstrapping og montering med samme prøve vektor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under de eksperimentelle forholdene som er beskrevet her (20 000 rammer, banelengde minimum 4 lokaliseringer) og avhengig av uttrykket nivåer av fluorescensmerkete merket Fusion proteiner, ca 200-3000 lokaliseringer gir 10-150 baner kan genereres per celle (figur 2a, b). Et stort antall baner er nødvendig for å produsere en godt samplet fordeling av tilsynelatende diffusjon koeffisienter. Størrelsen på FOV samlet her er ~ 55 x 55 μm, med 10 FOV samlet per eksperiment. Derfor bør for å få > 5000 baner per eksperiment hver FOV inneholde minst 50 celler. Ideelt sett bør cellen befolkning gjøres så tett som mulig, men uten at cellene berører hverandre. Hvis celle tettheten er for høy, så tilstedeværelsen av rørende eller overlappende celler gjør det utfordrende å segmentere dem med hell ved hjelp OUFTI (28), som beskrevet i data post Processing. Dårlig segmentering kan føre til lokaliseringer og baner tildelt feil mellom celler.

Her presenterer vi tilsynelatende diffusjon koeffisient data på Y. enterocolitica type 3 sekresjon protein YscQ, som vi N-uhelbredelig merket med fluorescerende protein eYFP. YscQ er en strukturell komponent i en membran-spenner molekylær maskin, kalt injectisome. Injectisome består av over 20 forskjellige proteiner, hvorav mange er til stede i flere kopi tall. Type 3 sekresjon injectisomes er bredt utnyttet av patogene gram-negative bakterier for å levere ondartet effektor proteiner direkte i verts cellen under smitte. YscQ binder og frigir dynamisk til og fra cytosolic IDen av injectisome. Som et resultat, YscQ er også funnet fritt spre i stoffer. Ved å anvende protokollen for datainnsamling, behandling og analyse som beskrevet ovenfor, fant vi ut at ubundne YscQ finnes i minst 3 distinkte diffusive tilstander (Figur 3). Disse 3 diffusive statene tilsvarer ulike homo-og hetero-oligomer komplekser av YscQ og andre type 3 sekresjon proteiner23.

Figure 1
Figur 1: optisk diagram av mikroskop trasé. Mikroskopet har en sti for påvisning av fluorescens signal og en egen vei for å ta et fase kontrast bilde. En motorisert "flip-Mirror" brukes til å bytte mellom veiene. Kameraet detektorer, eksitasjon lasere, LED, og flip-Mirror ' styres eksternt av datamaskinen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: single-molekyl lokaliseringer og baner. (A). 3D enkelt-molekyl lokaliseringer av eYFP-YscQ i en Y. enterocolitica celle innhentet i forskjellige rammer (1 766 lokaliseringer). Lokaliseringer er overlappet på et fase kontrast bilde av cellen. Den grønne linjen angir celle disposisjonen basert på fase kontrast bildet. (B). 3D single-molekyl baner av EYFP-YscQ Hentet fra lokaliseringer vist i panel A (142 baner). Forskjellige farger representerer forskjellige enkelt molekyl baner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: synlig diffusjon koeffisient fordeling av eYFP-YscQ i Y. enterocolitica. Den åpenbare diffusjon koeffisient fordelingen for eYFP-YscQ i Y. enterocolitca var best egnet med 3 diffusive tilstander. Legg merke til at funksjonen for sannsynlig tetthet (PDF) vises her, mens data tilpasningen ble gjort ved å montere den kumulative fordelingsfunksjonen (CDF, eksperimentell, tilsynelatende sprednings koeffisient fordeling). Figur tilpasset fra Rocha et al23. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1. Mikroskop kontroll GUI. Den grafiske mikroskopet styrer micropositioner av scenen, eksitasjon lasere, LED, og kameraer for fluorescens utslipp. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2. Easy-DHPSF GUI. Easy-DHPSF-programvaren brukes til å trekke ut enkelt molekyl lokaliseringer fra DHPSF-signalene. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3. Oufti segmentering. Åpen kildekode-programvaren OUFTI28 brukes til å sement cellene. Her vises resultatene av celle segmentering i grønt. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 4 . Valg av kontrollpunkter. Fem punkt velges både i celle disposisjonsdata og lokaliseringsdata. Celle polene brukes som referansepunkt. Disse punktene brukes til å transformere dataene slik at celle konturene og lokaliseringer er riktig overlappet. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 5 . Slett uønskede celler. Etter celle overlegget slettes uønskede celler manuelt. Celler med uvanlig lave/høye mengder lokaliseringer bør slettes, samt eventuelle celler som er på kanten av FOV. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 6 . Endelig overlegg av celle omriss og lokaliseringer. Etter sletting av uønskede celler, cellen skisserer og Single-molekylet lokaliseringer er fint forvandlet for å få den endelige overlegg. Lokaliseringer utenfor celle omriss slettes. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende MOV. 1: rådata for en enkelt-molekyl banen. Eksempel på påvisning av eYFP-YscQ på sCMOS-kameraet. I ramme 1 er det ikke noe fluorescens signal. I rammer 2-10 oppdages fluorescens fra et enkelt molekyl. I hvert påfølgende delbilde endres posisjonen og orienteringen til DHPSF, noe som indikerer spredningen av dette molekylet. Til slutt, i ramme 11, er det igjen et fravær i fluorescens signal, noe som indikerer slutten av banen. Hver piksel er 108 x 108 NM. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende MOV. 2: rådata for en savnet enkelt-molekyl banen. Rammer 1-3 viser fluorescens signal for en enkelt emitter. Men rammer 4-6 viser tilstedeværelsen av to overlappende DHPSFs, indikerer tilstedeværelsen av to sendere i umiddelbar nærhet. I slike tilfeller kan det hende at den enkelte DHPSFs ikke passer riktig på grunn av overlappingen. Selv om begge DHPSFs er vellykket passer, enhver bane observert som inneholder disse lokaliseringer ville bli forkastet. To eller flere lokaliseringer i samme celle kan føre til feil tildelinger av lokaliseringer til en gitt bane. Hver piksel er 108 x 108 NM. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En kritisk faktor for vellykket anvendelse av den presenterte protokollen er å sikre at single-molekylet signalene er godt adskilt fra hverandre (dvs. de må være sparsom i rommet og i tid (supplerende MOV. 1)). Hvis det er mer enn ett fluorescerende molekyl i en celle på samme tid, så lokalisering kan være feil tilordnet til en annen molekyler ' bane. Dette kalles linking problem30. Eksperimentelle forhold, slik som protein uttrykk nivåer og eksitasjon laser intensitet kan velges for å unngå linking problem. Imidlertid bør forsiktighet tas for å få vill-type protein uttrykk nivåer for å sikre representative resultater. Her brukte vi allel erstatninger under kontroll av de innfødte arrangører i stedet for kjemisk induserbart uttrykk, for å sikre native uttrykk nivåer av de merkede proteiner. Således, det eksitasjon laser intensiteten (for eYFP glimtet) eller aktiviseringen laser intensiteten (for foto-activatable fluorescerende sonder) kan brukes å administrere konsentrasjonen av aktiv utsendt i tid. Alternativt, når kjemisk fargestoff merking brukes sammen med Halo-og snap-koder31,32, kan farge konsentrasjonen reduseres til fluorescerende signaler er sparsommelig nok til å spore enkelt molekyler33. Protokollen som presenteres her, eliminerer tilkoblingsproblemet ved å forkaste eventuelle baner der to eller flere lokaliseringer samtidig finnes i samme celle (tilleggs-MOV. 2). Således, hvis enkelt-molekyl signaler er for tette, en stor mengde data blir automatisk forkastet under behandling. Under de eksitasjon forholdene som brukes her (λex = 514 nm ved 350 W/cm2), fikk vi 10-150 baner per bakteriell celle når anskaffe 20 000 rammer i løpet av 8 min. På den annen side, hvis eksperimentelle forhold er valgt slik at single-molekylet signaler er sparsom, så data oppkjøpet gjennomstrømming kan være lav, slik at å få et tilstrekkelig stort antall enkelt-molekyl baner ville kreve Imaging flere celler i flere felt-av-visning. Anskaffe et stort antall baner er gunstig, fordi feilene i de monterte parametrene (den diffusjon koeffisienter og befolkningen fraksjoner) nedgang som antall baner som er analysert økning29.

Å oppnå et stort antall baner med ett molekyl krever høy gjennomstrømming for datainnhenting. Som en bred-feltet teknikk, enkelt-molekyl lokalisering mikroskopi kjøperdata for hver celle i FOV samtidig, og forskere har begynt å dra nytte av nye sCMOS detektorer som har råd til store FOVs26,34, 35. imidlertid er eksitasjon laser krefter av flere watt nødvendig for å oppnå ensartet intensitet tilstrekkelig for enkelt-molekylet lokalisering mikroskopi gjennom så store FOVs. Slike laser krefter kan være over skade terskelen til kommersielt tilgjengelige objektiv linser. Lenslet arrays ansatt for å gjøre eksitasjon laser intensitet uniform i store FOVs kan være i stand til å omgå dette problemet34. I tillegg blir optiske avvik uttalt ved bildebehandling langt borte fra den optiske aksen. Som et resultat, kan formen på DHPSF bli for forvrengt til å være vellykket passer med en dobbel Gaussian modell ansatt i lett DHPSF. Når Imaging i en ultrawide FOV, mer sofistikerte romlig-varierende PSF modeller er nødvendig36. For å unngå disse kompliserer faktorene, ble dataene som ble presentert her anskaffet i en relativt liten FOV (diameter = 55 μm), og data fra 10 FOVs ble samlet for å oppnå mer enn 75 000 enkelt molekyl baner.

Montering av eksperimentelt målte tilsynelatende diffusjon koeffisient distribusjoner med simulerte distribusjoner krever realistisk simulering av eksperimentelle data. Statiske og dynamiske lokaliserings feil i kamerabasert sporing kan påvirke kvaliteten på målingen11,13. Statisk lokalisering feil skyldes det endelige antall fotoner samlet per fluorescens emitter, som resulterer i en unøyaktig PSF form og dermed resultere i single-molekyl lokaliseringer av begrenset presisjon2,37, 38. Dynamic lokalisering feil oppstår på grunn av bevegelige sendere som genererer uklare PSFs39. Når en algoritme brukes for å passe formen på PSF, Motion-uskarpe bilder gir lokaliseringer med begrenset nøyaktighet og presisjon39. I alvorlige tilfeller av raske molekyl bevegelse, kan bildet være for forvrengt til å passe, noe som resulterer i en mislykket passform og dermed ingen registrert lokalisering. Simulere romlig uskarpt PSFs med realistiske signal til-støy prosenter og lokalisere med samme montering algoritme som eksperimentelle data står for både statisk og dynamisk lokalisering feil. For det andre kan raskt spre molekyler være sterkt begrenset til små volumer, for eksempel stoffer av en bakterie celle. Som et resultat av den tilsynelatende diffusjon koeffisienter er mindre, i gjennomsnitt, enn de som forventes for unconfined bevegelse. Romlig fødsel resulterer i en samlet venstre forskyvning av fordelingen mot mindre diffusive verdier. Viktigere er formen på fordelingen ikke lenger uttrykkes som en analytisk funksjon. Ved eksplisitt regnskap for statiske og dynamiske lokalisering feil på grunn av bevegelse uskarphet og fødsel effekter gjennom Stokastisk simuleringer, kan realistiske distribusjoner fås23.

Den beskrevne diffusjon analysen er avhengig av to viktige forutsetninger om den dynamiske atferden til molekylene i det biologiske miljøet. Det forutsetter at diffusive stater er beskrevet av trange Brownske bevegelse og at de ikke interkonverterer på tidsskalaen av en enkelt-molekyl banen. Vi har eksperimentelt bekreftet at forutsetningen om trange Brownske bevegelse er berettiget for gratis eYFP diffusjon i Y. enterocolitica23. Disse resultatene er enige med en rekke studier i ulike bakteriearter som har fastslått at bevegelsen av cytosolic proteiner, fusjons proteiner og Biomolecular komplekser mindre enn 30 NM kan beskrives ved Brownske Motion18, 40,41,42,43,44,45. Ikke-spesifikke kollisjoner av små fluorescensmerkete merket proteiner med andre cellulære komponenter kan forsinke diffusjon priser,45,46 men ikke føre til avvik fra brownske diffusjon. Til sammenligning kan spesifikk interaksjon med beslektet bindende partnere produsere en endring i diffusjon koeffisienten, som nylig vist for Y. enterocolitica type 3 sekresjon protein YscQ23. Gyldigheten av den andre forutsetningen er vanskelig å vurdere, spesielt for systemer som hverken de diffusive statene eller bindingen Kinetics er kjent. Situasjonen er videre komplisert fordi noen oligomerisering stater og bindende Kinetics målt in vitro, kan ikke gjenspeile strukturer og dynamikk som oppstår i vivo. En fersk teoretisk studie basert på analyse rammeverket som presenteres her antyder at det kan være mulig å trekke ut staten bytte Kinetics i tillegg til diffusjon koeffisienter og befolkning fraksjoner29.

Oppsummert presenterer vi en integrert protokoll for å løse de diffusive statene fluorescensmerkete merket molekyler basert på enkelt-molekyl baner målt i levende bakterielle celler. Som presentert her, er protokollen brukes til 3D single-molekylet lokalisering mikroskopi bruker dobbel-Helix PSF for Imaging i Y. enterocolitica, en bakteriell patogen. Men med bare noen få modifikasjoner, kan protokollen brukes til alle typer 2D eller 3D single-molekylet lokalisering mikroskopi og prøven geometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Alecia Achimovich og ting Yan for kritisk lesning av manuskriptet. Vi takker Ed Hall, senior ansatte forsker i Advanced Research Computing Services gruppe ved University of Virginia, for hjelp med å sette opp optimalisering rutiner som brukes i dette arbeidet. Finansiering for dette arbeidet ble gitt av University of Virginia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,6-diaminopimelic acid Chem Impex International 5411 Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses Thorlabs AC508-080-A f = 80mm, 2"
514 nm laser Coherent Genesis MX514 MTM Use for fluorescence excitation
agarose Inivtrogen 16520100 Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 M2G ingredient.
bandpass filter Chroma ET510/bp Excitation pathway.
Brain Heart Infusion Sigma Aldrich 53286 Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride Sigma Aldrich 223506 M2G ingredient.
camera Imaging Source DMK 23UP031 Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask Double Helix, LLC N/A Produces DHPSF signal.
disodium phosphate Sigma Aldrich 795410 M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror Newport 8892-K Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres Invitrogen F8792 Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip VWR 16004-302 #1.5, 22mmx22mm
glucose Chem Impex International 811 M2G ingredient.
immersion oil Olympus Z-81025 Placed on objective lens.
iron(II) sulfate Sigma Aldrich F0518 M2G ingredient.
long pass filter Semrock LP02-514RU-25 Emission pathway.
magnesium sulfate Fisher Scientific S25414A M2G ingredient.
microscope platform Mad City Labs custom Platform for inverted microscope.
nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens Olympus 1-U2B991 60X, 1.4 NA
Ozone cleaner Novascan PSD-UV4 Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate Sigma Aldrich 795488 M2G ingredient.
Red LED Thorlabs M625L3 Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V2 Camera for fluorescence imaging.
short pass filter Chroma ET700SP-2P8 Emission pathway.
Tube lens Thorlabs AC508-180-A f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd N/A N/A Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate Thorlabs WPQ05M-514 Excitation pathway.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  4. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  5. Chen, T. Y., et al. Quantifying Multistate Cytoplasmic Molecular Diffusion in Bacterial Cells via Inverse Transform of Confined Displacement Distribution. Journal of Physical Chemistry B. 119 (45), 14451-14459 (2015).
  6. Mohapatra, S., Choi, H., Ge, X., Sanyal, S., Weisshaar, J. C. Spatial Distribution and Ribosome-Binding Dynamics of EF-P in Live Escherichia coli. mBio. 8 (3), (2017).
  7. Stracy, M., et al. Single-molecule imaging of UvrA and UvrB recruitment to DNA lesions in living Escherichia coli. Nature Communications. 7, 12568 (2016).
  8. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  9. Bakshi, S., Choi, H., Weisshaar, J. C. The spatial biology of transcription and translation in rapidly growing Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 6, 636 (2015).
  10. Mustafi, M., Weisshaar, J. C. Simultaneous Binding of Multiple EF-Tu Copies to Translating Ribosomes in Live Escherichia coli. mBio. 9 (1), (2018).
  11. Michalet, X., Berglund, A. J. Optimal diffusion coefficient estimation in single-particle tracking. Physical Review E. 85 (6), (2012).
  12. Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4 Pt 1), 041914 (2010).
  13. Backlund, M. P., Joyner, R., Moerner, W. E. Chromosomal locus tracking with proper accounting of static and dynamic errors. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 91 (6), 062716 (2015).
  14. Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
  15. Plochowietz, A., Farrell, I., Smilansky, Z., Cooperman, B. S., Kapanidis, A. N. In vivo single-RNA tracking shows that most tRNA diffuses freely in live bacteria. Nucleic Acids Research. 45 (2), 926-937 (2017).
  16. Koo, P. K., Mochrie, S. G. Systems-level approach to uncovering diffusive states and their transitions from single-particle trajectories. Physical Review E. 94 (5-1), 052412 (2016).
  17. Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8063-8068 (2013).
  18. Bakshi, S., Bratton, B. P., Weisshaar, J. C. Subdiffraction-Limit Study of Kaede Diffusion and Spatial Distribution in Live Escherichia coli. Biophysical Journal. 101 (10), 2535-2544 (2011).
  19. Bakshi, S., Siryaporn, A., Goulian, M., Weisshaar, J. C. Superresolution imaging of ribosomes and RNA polymerase in live Escherichia coli cells. Molecular Microbiology. 85 (1), 21-38 (2012).
  20. Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. JoVE. (85), e51177 (2014).
  21. Pavani, S. R. P., Piestun, R. Three dimensional tracking of fluorescent microparticles using a photon-limited double-helix response system. Optics Express. 16 (26), 22048-22057 (2008).
  22. Pavani, S. R. P., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 2995-2999 (2009).
  23. Rocha, J. M., et al. Single-molecule tracking in live Yersinia enterocolitica reveals distinct cytosolic complexes of injectisome subunits. Integrative Biology. 10 (9), 502-515 (2018).
  24. Lew, M. D., von Diezmann, A. R. S., Moerner, W. E. Easy-DHPSF open-source software for three-dimensional localization of single molecules with precision beyond the optical diffraction limit. Protocol Exchange. , (2013).
  25. Biteen, J. S., et al. Super-resolution imaging in live Caulobacter crescentus cells using photoswitchable EYFP. Nature Methods. 5 (11), 947-949 (2008).
  26. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nature Methods. 10 (7), 653-658 (2013).
  27. Hoogendoorn, E., et al. The fidelity of stochastic single-molecule super-resolution reconstructions critically depends upon robust background estimation. Scientific Reports. 4, 3854 (2014).
  28. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
  29. Rocha, J. M., Corbitt, J., Yan, T., Richardson, C., Gahlmann, A. Resolving Cytosolic Diffusive States in Bacteria by Single-Molecule Tracking. bioRxiv. , 483321 (2018).
  30. Lee, A., Tsekouras, K., Calderon, C., Bustamante, C., Presse, S. Unraveling the Thousand Word Picture: An Introduction to Super-Resolution Data Analysis. Chemical Reviews. 117 (11), 7276-7330 (2017).
  31. Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chemical Biology. , (2008).
  32. Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  33. Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
  34. Douglass, K. M., Sieben, C., Archetti, A., Lambert, A., Manley, S. Super-resolution imaging of multiple cells by optimised flat-field epi-illumination. Nature Photonics. 10 (11), 705-708 (2016).
  35. Zhao, Z., Xin, B., Li, L., Huang, Z. L. High-power homogeneous illumination for super-resolution localization microscopy with large field-of-view. Optics Express. 25 (12), 13382-13395 (2017).
  36. Yan, T., Richardson, C. J., Zhang, M., Gahlmann, A. Computational Correction of Spatially-Variant Optical Aberrations in 3D Single Molecule Localization Microscopy. bioRxiv. , 504712 (2018).
  37. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  38. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Mol Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  39. Berglund, A. J. Statistics of camera-based single-particle tracking. Physical Review E. 82 (1), 011917 (2010).
  40. Parry, B. R., et al. The bacterial cytoplasm has glass-like properties and is fluidized by metabolic activity. Cell. 156 (1-2), 183-194 (2014).
  41. English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), E365-E373 (2011).
  42. Niu, L. L., Yu, J. Investigating intracellular dynamics of FtsZ cytoskeleton with photoactivation single-molecule tracking. Biophysical Journal. 95 (4), 2009-2016 (2008).
  43. Coquel, A. S., et al. Localization of protein aggregation in Escherichia coli is governed by diffusion and nucleoid macromolecular crowding effect. PLoS Computational Biology. 9 (4), e1003038 (2013).
  44. Nenninger, A., Mastroianni, G., Mullineaux, C. W. Size Dependence of Protein Diffusion in the Cytoplasm of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 192 (18), 4535-4540 (2010).
  45. Dix, J. A., Verkman, A. S. Crowding effects on diffusion in solutions and cells. Annual Review of Biophysics. 37, 247-263 (2008).
  46. Elliott, L. C., Barhoum, M., Harris, J. M., Bohn, P. W. Trajectory analysis of single molecules exhibiting non-brownian motion. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (10), 4326-4334 (2011).

Tags

Biokjemi fysisk kjemi organismer bakterier kjemi og materialer uorganisk økologisk og fysisk kjemi biovitenskap Life Sciences (generelt) matematisk og informatikk numerisk analyse super-oppløsning Enkelt molekyl fluorescens sporing diffusjon Live-celle
Single-molekylet Tracking mikroskopi-et verktøy for fastsettelse av Diffusive statene cytosolic molekyler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rocha, J. M., Gahlmann, A.… More

Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. J. Vis. Exp. (151), e59387, doi:10.3791/59387 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter