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Bioengineering

Visualisierung von Germinosomes und die innere Membran in Bacillus Subtilis Sporen

Published: April 15, 2019 doi: 10.3791/59388
Automatic Translation
1, 1, *2,3, *4, *1
1Molecular Biology and Microbial Food Safety, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 2Van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 3Confocal.nl BV., 4Dept. of Molecular Biology and Biophysics, UConn Health
* These authors contributed equally

Summary

Germinant Rezeptor-Proteine-Cluster in "Germinosomes" in der inneren Membran der Bacillus Subtilis Sporen. Wir beschreiben ein Protokoll mit Superresolution Mikroskopie und Leuchtstoffröhren Reporter Proteine, um Germinosomes zu visualisieren. Das Protokoll zeigt auch Spore innere Membrandomänen, die bevorzugt mit dem Membran-Farbstoff FM4-64 gefärbt sind.

Abstract

Die geringe Größe der Sporen und der relativ geringen Fülle der Keimung Proteine, Schwierigkeiten in ihrer mikroskopischen Analysen mittels Epifluoreszenz Mikroskopie. Höchstauflösung dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) ist ein viel versprechendes Instrument, diese Hürde zu überwinden und die molekularen Details den Prozess der Keimung der Sporen von Bacillus Subtilis (B. Subtilis) zeigen. Hier beschreiben wir die Verwendung einer modifizierten SIMcheck (ImageJ)-Assistent 3D imaging-Prozess und fluoreszierende Reporter Proteine für SIM-Mikroskopie von B. Subtilis Sporen Germinosomes, Transaktionskonflikten der Keimung Proteine. Außerdem präsentieren wir ein (standard) 3D-SIM bildgebendes Verfahren für FM4-64 Färbung von B. Subtilis Sporen Membranen. Mithilfe dieser Verfahren wir unübertroffene Auflösung für die Lokalisierung der Germinosome erhalten und zeigen, dass > 80 % der B. Subtilis KGB80 Sporen nach der Sporenbildung auf definierten minimalen MOPS Medium erhalten haben, ein oder zwei GerD-GFP und GerKB-mCherry Brennpunkte. Helle Herde waren auch bei FM4-64 gefärbten Sporen 3D-SIM Bilder darauf hindeutet, dass innere Membran Lipid Domänen wahrscheinlich unterschiedliche Flüssigkeit vorhanden sein. Sind weitere Studien, mit denen doppelte Kennzeichnung Verfahren mit Membran Farbstoffe und Germinosome Reporter Proteine Co Lokalisierung zu bewerten und erhalten so einen optimalen Überblick über die Organisation des Bacillus Keimung Proteine in der inneren Spore-Membran möglich.

Introduction

Sporen der Aufträge Bacillales und Clostridiales sind metabolisch ruhenden und außerordentlich widerstandsfähig gegen raue Dekontamination Regime, aber es sei denn, sie Keimen, können nicht dazu führen, dass schädliche Auswirkungen im Menschen1. In nährstoffreichen germinant ausgelöste Keimung der Sporen von Bacillus Subtilis (B. Subtilis) ist die Einleitung Veranstaltung germinant Bindung an germinant Rezeptoren (GRs) befindet sich in der Spore innere Membran (IM). Anschließend transduzieren die GRs Signale an den SpoVA-Kanal-Protein befindet sich auch in der IM. Dies führt bei der Entstehung des Austauschs von Spore Kern Pyridin-2,6-dicarboxylic Säure (Dipicolinic Säure; DPA; bestehend aus 20 % der Spore Kern trocken wt) für Wasser über den SpoVA Kanal. Anschließend die DSG-Version löst die Aktivierung der Hirnrinde Peptidoglycan Hydrolyse und zusätzliche Wasseraufnahme folgt2,3,4. Diese Ereignisse führen zu mechanischen Belastungen auf die Schichten, seine spätere Ruptur, Beginn der Auswuchs und schließlich vegetative Wachstum. Die genauen molekularen Details der Keimungsprozess werden jedoch noch weit von aufgelöst.

Eine wichtige Frage zu Spore Keimung betrifft die biophysikalischen Eigenschaften der Lipide IM Keimung Proteine sowie die IM SpoVA-Kanal-Proteine. Diese weitgehend unbeweglich IM Lipid Bilayer ist die wichtigste Permeabilitätsbarriere für viele kleine Moleküle, einschließlich giftige chemische Konservierungsmittel, von die einige ihr Handeln in die Spore Kern oder vegetativen Zelle Zytoplasma5,6ausüben. IM Lipid Bilayer dürfte in einem Gel-Zustand gibt es zwar ein erheblicher Anteil der mobilen Lipide in der IM5. Die Spore IM hat auch das Potenzial für signifikante Erweiterung5. Somit erhöht sich die Fläche der IM 1,6-fache bei der Keimung ohne zusätzliche Membran Synthese und geht einher mit dem Verlust dieser Membran charakteristische niedrige Permeabilität und Lipid Unbeweglichkeit5,6.

Während die molekularen Details der Aktivierung von Proteinen, Keimung und Organisation IM Lipide in Sporen sind attraktive Themen für das Studium, Herausforderung die geringe Größe von B. Subtilis Sporen und die relativ geringen Fülle der Keimung Proteine, eine mikroskopische Analysen. Griffiths Et Al. zwingende Beweise dafür Epifluoreszenz Mikroskop, mit fluoreszierenden Reporter verschmolzen zu Keimung Proteine, legt nahe, dass das Gerüst Protein GerD B. Subtilis Sporen drei GR-Untereinheiten (A, B und C) für GerA, B und K GRs organisiert, in einer Cluster-7. Sie prägte den Begriff "Germinosome" für diesen Cluster der Keimung Proteine und die Strukturen als ~ 300 nm großen IM Protein Brennpunkte8beschrieben. Bei der Initiation der Spore Keimung, fluoreszierende Germinosome Brennpunkte letztlich verwandeln sich in größeren disperse fluoreszierende Muster mit > 75 % der Spore Bevölkerungen Anzeigen dieses Muster in Sporen gekeimt für 1 h mit L-Valin-8. Beachten Sie, dass das Papier oben verwendeten genannten Bilder aus Dutzenden von aufeinander folgenden fluoreszierenden Bilder gemittelt, um statistische Aussagekraft gewinnen und die Hürde niedrig fluoreszierende Signale beobachtet während der Bildgebung. Diese Visualisierung dieser Strukturen in Bakteriensporen war am Rande des technisch mit klassischen mikroskopischen Tools und weder eine Bewertung der Höhe der Herde in einem einzigen Spore Machbaren auch ihre ausführlichere subzelluläre Lokalisation mit diesem Ansatz möglich.

Hier zeigen wir den Einsatz von strukturierten Beleuchtung Mikroskopie (SIM), eine detaillierte Visualisierung zu erhalten und Quantifizierung der Germinosome(s) in Sporen von B. Subtilissowie ihre IM Lipid Domänen9. Das Protokoll enthält auch Anleitungen für die Sporenbildung, Folie Vorbereitung und Bildanalyse von SIMcheck (v1. 0, eine ImageJ-Plugin) sowie ImageJ10,11,12.

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Protocol

1. B. Subtillis Sporenbildung (Timing: 7 Tage vor der mikroskopischen Beobachtung)

  1. Tag1
    1. Eine Bakterienkultur auf ein Luria-Bertani Brühe (LB) Agar-Platte (1 % Tryptone, Hefeextrakt 0,5 %, 1 % NaCl, 1 % Agar)13 Streifen und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, einzelne Kolonien zu erhalten. Verwenden der B. Subtilis -KGB80 (PS4150 GerKA GerKC GerKB-mCherry Katze, GerD-Gfp kan) Stamm und seinen Hintergrund Elternstamm B. Subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) bereits7beschrieben.
      Hinweis: Der Einsatz von Sporen mit ΔcotEΔgerE Hintergrund ist in Germinosome Visualisierung, um die Autofluoreszenz des Spore Mantel Schichten7zu minimieren.
    2. Sterilisieren Sie alle Medien, Rohre, Mehrkanalpipette und andere Kultur-Materialien mit geeigneten Methoden verwendet werden.
  2. Tag2
    1. Impfen Sie eine einzige Kolonie in 5 mL LB-Medium in den frühen Morgenstunden zu und inkubieren Sie die Kultur unter ständige Unruhe in einem Schraubverschluss Rohr bei 200 u/min/min und 37 ° C, bis die OD600 0,3-0,4 (ca. 7 h) erreicht.
    2. 500 mL MOPS Medium (pH 7,5) zu machen, enthält 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1,32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O 0,276 mM K2SO4, 0,01 mM FeSO4·7H2O 0,14 mM CaCl2·2H2O, 80 mM MOPS, 4 mM Tricine, 0,1 mM MnCl2·2H2O, 10 mM D-Glukose-Monohydrat und 10 mM NH4Cl.
    3. Schraubverschluss Röhren 10-1- 10-7 Verdünnungsreihen der LB-Kultur in 5 mL MOPS Medium vorbereiten und die Kulturen über Nacht unter ständigen Unruhe bei 200 u/min/min und 37 ° c inkubieren
      Hinweis: Die serielle Verdünnungen hier wollen eine Verdünnung in frühen exponentielle Phase am nächsten Morgen zu gewinnen. Diesen und den nächsten Schritt sind erforderlich, damit die Zellen zur Anpassung an den MOPS gepufferten Wachstumsmedium.
  3. Tag3
    1. Wählen Sie eines der MOPS Verdünnungen mit einem OD-600 von 0,3 bis 0,4. Impfen Sie 0,2 mL der Kultur auf vorgewärmten (37 ° C) 20 mL MOPS Medium in eine konische 250 mL Flasche zu und inkubieren Sie unter ständigen Unruhe bis OD600 0,3-0,4 (~ 7 h) erreicht.
    2. Beimpfen der MOPS basierend Sporenbildung Medium (250 mL) mit 1 % (V/V) Vorkultur ab Schritt 1.3.1 und inkubieren Sie für 3 Tage bei 37 ° C in einem konischen Liter Kolben unter ständige Unruhe. FM4-64 Färbung von PS4150 Sporen, fügen Sie 2 µg/mL FM4-64 Sonde (siehe Tabelle der Materialien), die Sporenbildung Medium 1 oder 2 h nach dem Gipfel OD600 Wert des vegetativen Wachstums (in der Regel etwa 2) und ermöglichen die Kultur zu Anschließend sporulate während es schützt vor Licht5.
  4. 7. Tag: Ernte von Sporen
    1. Bestimmen Sie die Sporenbildung Ausbeute (Sporen Vs vegetativen Zellen) mit Phasenkontrastmikroskopie bei 100 X Vergrößerung, um die Phase hellen Sporen aus Phase dunklen Zellen und evtl. reifen Sporen zu unterscheiden. Eine 90 % Phase hell Spore Ausbeute wird erwartet.
    2. Pellet-die Sporen bei 4.270 X g für 15 min bei 4 ° C im Rundboden Zentrifuge Röhren. Waschen Sie die Spore Pellet 2-3 Mal mit 40 mL sterilem hochreine Typ1 demineralisiertes Wasser in 50 mL konische Zentrifuge Röhren (siehe Tabelle der Materialien). Spin-Down bei jedem Waschgang 4.270 x g für 15 min (4 ° C).
  5. Tag 7: Spore-Reinigung
    1. Spore Reinigung: Spore Pellet in 750 µL 20 % nichtionische Dichte Gradienten Medium aussetzen (siehe Tabelle der Materialien) und laden auf 800 µL 50 % nichtionische Dichte Gradienten Medium in sterilisierten Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 60 min bei 21.500 X g. Das Pellet erhalten enthält die kostenlose Sporen. Aussetzen der Spore Pellet in 200 µL 20 % nichtionische Dichte Gradienten Medium und laden auf 1 mL 50 % nichtionische Dichte Gradienten Medium in einem Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge für 15 min bei 21.500 X g.
    2. Waschen Sie die endgültige Spore Zubereitung und Lagerung: das Pellet erhalten enthält gereinigten Sporen. Waschen das Spore-Pellet 2-3 Mal mit 1,5 mL sterile Reinstwasser Typ1 (siehe Tabelle der Materialien) und Spin-Down zwischen 9.560 x g für 15 min bei 4 ° c Zu guter Letzt das Pellet in sterilen Typ1 Reinstwasser auf eine endgültige OD600 von rund 30 aussetzen. Aliquote der Sporen können bei-80 ° C für 8 Wochen14gespeichert werden.

(2) Entschichten

  1. PS4150 Sporen zu behandeln mit 0,1 M NaCl/0,1 M NaOH/1% Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) / 0,1 M Dithiothreitol (DTT) bei 70 ° C für 1 h waschen die Sporen 10 Mal mit sterilisierten Reinstwasser Typ1 Wasser15,16. Auf diese Weise einer FM4-64-Sonde in der Spore äußeren Membran adsorbiert und äußere Schichten entfernt werden.

3. Deckglas und Vorbereitung der Folie11 (Timing: 1 H vor Beobachtung)

  1. Pre-clean hochpräzise Deckgläsern (siehe Tabelle der Materialien) mit 1 M HCl für 30 min im Wasserbad vorsichtig schütteln. Waschen der Deckgläsern zweimal in Reinstwasser Typ1, und speichern sie in 100 % (Vol/Vol) EtOH. Lassen Sie sie trocknen und ihre Klarheit vor der Verwendung zu überprüfen. Pre-reinigen Sie den Objektträger in 70 % EtOH. Lassen Sie sie trocknen und ihre Klarheit vor der Verwendung zu überprüfen.

(4) Sampling fluoreszierenden Mikrosphären oder Sporen in der gen-Rahmen Folie10 (Timing-15 Min)

  1. Vorwärmen zwei 70 % EtOH gereinigt und Luft getrockneten Objektträger (siehe Tabelle der Materialien) für einige Sekunden auf einem Heizblock 70 ° C, 65 μL der sterilisierten 2 % Agarose statt bei 70 ° C auf einem Objektträger fallen und legen Sie die anderen Glas-Folie an der Spitze die Agarose-b zu verbreiten Wischen der Folien. Die Agarose-Patch wird in ca. 5 min trocknen.
  2. Schneiden den Agarose-Patch in einem 1 x 1cm-Abschnitt nach dem Entfernen der Glas-Folien 0.4 μl der Probe (fluoreszierenden Mikrosphären oder Sporen von ~ 10-8-/mL), und den Patch auf die hohe Präzision Deckglas zu übertragen, indem man das Deckglas auf den Patch und Abrutschen.
  3. Befestigen Sie einen Gene Frame (1,5 x 1,6 cm2, 65 µL) auf die getrocknete Folie, die das Deckglas schließen alle Ecken des Rahmens aufgesetzt ist, womit sich die Folie für den Einsatz in der Mikroskopie.

(5) Imaging11,17(Timing: 1 H)

  1. Erfassen die Übertragungs- und Fluoreszenz Bilder von Sporen sowie eine Mischung aus rot und gelb-grün Carboxylat-modifizierte fluoreszierende Mikrosphären auf eine strukturierte Beleuchtung-Mikroskop (siehe Tabelle der Materialien) ausgestattet mit 100 x Objektiv (Öl) Numerische Apertur = 1.49), eine CCD-Kamera und Bild-Analyse-Software (siehe Tabelle der Materialien). Alle Bilder bei Raumtemperatur ohne die Störung des Umgebungslichts zu generieren. Achten Sie darauf, immer das 100 x Objektiv und die Folie mit 75 % Ethanol vor Bildgebung zu reinigen.
  2. Fokus auf 100 nm (Durchmesser) fluoreszierenden Mikrosphären und optimieren Sie die Point-spread-Funktion (Psf) durch die Anpassung des Korrektur-Ring auf das 100 X Objektiv, bis eine symmetrische Psf minimiert Unschärfe des Bildes erreicht ist. Die Psf ist die Impulsantwort oder die Reaktion ein bildgebendes System auf eine Punktquelle oder Point-Objekt.
  3. Wählen Sie eine Sichtfeld mit ca. 10 Runden fluoreszierenden Mikrosphären. Wenden Sie ein Gitter Fokuseinstellung für beide 561 nm und 488 nm Erregung Wellenlängen als Leitfaden für die Bildanalyse-Software.
  4. Konzentrieren Sie sich die Sporen mit dem Getriebe-Licht und erfassen Sie eine Übertragung Lichtbild in die 16 × durchschnittliche Modus mit 200 ms Belichtungen für jedes Bild zu.
  5. 3D-SIM fluoreszierende Rohbilder der Sporen mit Beleuchtung-Modus "3D-SIM", die Kamera-Einstellungen Auslesen Modus Elektron Multiplikation (EM) Gain 10MHz bei 14-Bit- und EM-Gewinn bei 175 zu erfassen. Begeistern Sie die FM4-64-Sonde in PS4150 Sporen mit 561 nm Laserlicht an 20 % Laserleistung und eine Leuchtdauer von 400 ms.
  6. GerKB-mCherry zu begeistern und GerD-GFP in KGB80 Sporen mit, bzw. 561 nm Laserlicht bei 30 % Laserleistung für 1 s und 488 nm Laserlicht an 60 % Leistung laser für 3 S. Z-Stapel-Einstellungen sind in der von oben nach unten Modus, 0,2 µm / Schritt, 7 Schritte und 20 Schritten für Germinosome und IM Analyse, beziehungsweise.
    Hinweis: Diese Laserparameter wurden angewandt, um einen maximalen Helligkeitswert im Histogramm-Fenster von rund 4.000 zu gewährleisten.

6. rekonstruieren Sie 3D-SIM Raw-Bilder von FM4-64 gebeizt PS4150 Sporen

  1. Durchführen Sie die N-SIM Scheibe Rekonstruktion für den FM4-64 gebeizt PS4150 Sporen raw-Daten. Klicken Sie auf Param für Rekonstruieren Slice auf der N-SIM Pad Registerblatt, N-SIM Scheibe Wiederaufbau-Fenster zu öffnen.
  2. Legen Sie die Wiederaufbau-Parameter im Fenster N-SIM Scheibe Wiederaufbau . Um perfekte rekonstruierten Bilder, folgen Sie den Vorschlag der N-SIM Anweisungen und klicken Sie auf die entsprechenden Steuerelemente im Fenster N-SIM Scheibe Rekonstruktion der Beleuchtung Modulation Kontrast (IMC) auf Auto, hoch eingestellt Auflösung Noise Suppression (HRNS) 1.00 und Aus dem Fokus verwischen Unterdrückung (OFBS) auf 0,05 als Ausgangspunkte.
  3. Klicken Sie auf Scheibe zu rekonstruieren , im Fenster N-SIM Scheibe Wiederaufbau , das Bild zu rekonstruieren. Bewerten Sie die Qualität der rekonstruierten Bilder durch die schnelle Fourier umgewandelt (FFT) Bilder und Wiederaufbau-Score, der nach der Rekonstruktion12angezeigt.
  4. Passen Sie die HRNS von 0,10 bis 5.00 und OFBS von 0,01 bis 0,50 durch Klick auf die entsprechenden Steuerelemente im Fenster " N-SIM Scheibe Rekonstruktion ", bis die besten Parametereinstellungen abgerufen werden.
  5. Klicken Sie auf die Schaltfläche im Fenster N-SIM Scheibe Bildinventars , geänderte Parameter anzuwenden . Klicken Sie auf die Schaltfläche Schließen , um das Fenster zu schließen.
  6. Machen Sie eine FM4-64 gebeizt PS4150 Sporen raw-Bild aktiv und klicken Sie Rekonstruieren Slice auf der N-SIM Pad Registerblatt Slice Rekonstruktionausführen. Speichern Sie das rekonstruierte Bild.

7. die Bildanalyse

  1. Konvertieren Sie Pseudo-Weitfeld-Bilder von der KGB80 germinosome
    1. Umwandeln Sie 3D-SIM raw-Bilder von KGB80 durch die Aktivierung mit einem Linksklick ImageJ Plugins SIMcheck Dienstprogramm Raw Daten SI zu Pseudo-Weitfeld12in Pseudo-Weitfeld-Bilder. Pseudo-Weitfeld Bilder aus SIM-Rohdaten im Durchschnitt und montiert, zum Vergleich ein Bild konventionellen Weitfeld Beleuchtung12entspricht. ImageJ selbst finden Sie unter https://imagej.net/Welcome. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie aus ~ 25 Sporen in jedem Bild invertierte Übertragung für eine spätere Analyse der Germinosome in den fluoreszierenden Pseudo-Weitfeld-Bildern.
    2. Wählen Sie aus insgesamt rund 350 (in diesem Beispiel, 346) KGB80 Sporen in 14 Sichtfelder aus zwei Folien. Die GerD-GFP und GerKB-mCherry fluoreszierende Herde Zahlen in ausgewählten KGB80 Sporen sollte unabhängig von den beiden Forschern gezählt werden. Die Forscher kann auf die 3D-SIM-raw-Bilder wann immer im Zweifel an die Anwesenheit von separaten fluoreszierende Germinosome Brennpunkte in Sporen zurückgreifen.
    3. Bewerten Sie die maximalen Intensitäten der jeder GerD-GFP und GerKB-mCherry Schwerpunkt und die integrierte Intensität der einzelnen KGB80 Spore 3D-Bild mit ImageJ.
  2. Analysieren Sie Pseudo-Weitfeld-Bilder von der KGB80 germinosome
    1. Verwenden Sie die mittlere integrierte Intensitätswert 7 Stacks als die integrierte Signalintensität KGB80 Spore. Bestimmen Sie Hintergrund-Intensitäten von imaging-Hintergrund-Stamm PS4150 mit identischen Einstellungen. Betrachten Sie fluoreszierende Flecken in einzelnen KGB80 Sporen als Germinosome Herde wenn sie aus dem Hintergrund deutlich unterscheidbar sind.
    2. One-Way ANOVA-Tests zur Bestimmung der Bedeutung mit Software Origin 9.0 anwenden. in Anbetracht der P-Werte < 0,05 als statistisch signifikante. Verwenden der Spearman Rank Korrelationskoeffizient18 , die Korrelation von GerD-GFP und GerKB-mCherry Schwerpunkte-Reihe und die Messungen der integrierten Signalintensität zu bewerten.

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Representative Results

Das aktuelle Protokoll stellt ein SIM-Mikroskop bildgebendes Verfahren für bakterielle Sporen. Die Sporenbildung und Folie Vorbereitung Verfahren wurden durchgeführt, wie in Abbildung 1 gezeigt, vor der Bildgebung. Später wurden die Bildverarbeitung und Analyse Verfahren angewandt sowohl für dim (fluoreszierendes Protein mit der Bezeichnung Keimung Proteine) und hell (lipophile Sonde IM gebeizt) Spore zu Proben, wie im folgenden Text dargestellt.

Lokalisierung von Germinosomes in B. Subtilis Sporen

Ebenen von GerD und GerKB werden berichtet, ~ 3.500 und ~ 700 Moleküle pro Spore, bzw. basierend auf Western-Blot Analysen von Auszügen aus Sporen in eine reiche Sporenbildung mittlere19vorbereitet. Die GerD-Gfp und GerKB-mCherry Gene in der KGB80 Belastung sind unter der Kontrolle ihrer nativen Promotor. Relative geringe Häufigkeit von Fusionsproteinen führte zu einer geringen Fluoreszenzsignal während imaging, so war es schwierig, solche dim SIM Rohbilder von der SIM Rekonstruktionsalgorithmus zu rekonstruieren. Das SIM-Mikroskop wurde jedoch weiterhin für die Bildaufnahme Germinosome angewendet, obwohl die Rohbilder SIM von SIMcheck (ImageJ Plugins) in Pseudo-Weitfeld-Bilder konvertiert wurden. Darüber hinaus wurde ein sieben Stapel 3D-Bildgebung implementiert, um eine bessere Übersicht über dieses IM Fokus zu bekommen. Wie im linken Bereich der Abbildung 2gezeigt, erschienen zwei Brennpunkte der GerD-GLP in verschiedenen Stapeln. Die insgesamt drei GerD-GFP Brennpunkte sind durch die weißen Pfeile in die kompositorische Kolonnenstapel Z3 gekennzeichnet. Die rechten Panel von Abbildung 2 zeigt eine Spore mit nur ein Brennpunkt der GerD-BIP in der Spore ausweislich der weiße Pfeil in der zusammengesetzten Spalte Z4 Stapel. Insgesamt rund 40 % und 50 % der Sporen hatte zwei oder einem GerD-GFP und GerKB-mCherry-Cluster, bzw. (Tabelle 1). Unter die 346 Sporen untersucht zwei hatten 4 GerD-GFP Brennpunkte, und eine Spore hatte sogar 5 GerD-GFP Brennpunkte. Merklich, waren in unseren Händen, die Anzahl der GerD-GFP und GerKB-mCherry Schwerpunkte in der gleichen Spore nicht immer die gleichen18. Da die SIM-Mikroskop keine Phase Kontrast Option hatte, verwendet wir Lichtmikroskopie Übertragung für die Spore Lokalisierung. So erscheinen Sporen mit einem dunklen und dichten Kern, der von einem helleren Halo umgeben.

Der integrierte Fluoreszenzintensität von KGB80 Sporen wurde von ImageJ gemessen. Sporen, die 0, 4 oder 5 Schwerpunkte hatte wurden nicht in die statistische Analyse aufgrund ihrer niedrigen Frequenz enthalten. Es gab eine hohe positive Korrelation zwischen GerD-GFP und GerKB-mCherry integriert Intensitäten (Spearman Rank Korrelationskoeffizient = 0,73). Während die integrierte Intensität der GerD-GFP Gerüst Protein unterschiedlich zwischen verschiedenen Populationen (Abbildung 3) war, war die integrierte Intensität der GerKB-mCherry ungefähr das gleiche in verschiedenen Populationen (Abbildung 3D). Die maximale Fluoreszenzintensität der GerD-GFP und GerKB-mCherry Brennpunkte tendenziell abnehmen, wenn die Spore mehrere Brennpunkte (Abb. 3A, B hatte). Die maximale Fluoreszenz der alle Lichtblicke, als Germinosome Herde, war höher als die maximale Auto-Fluoreszenz des PS4150 Sporen (Sporen aus dem Hintergrund-Stamm KGB80; Abbildung 3A " B).

Organisation der inneren Membran

Wie in der Einleitung erwähnt, befinden sich in der Spore IM Germinosome Proteine. Jedoch sind einige Details über die biophysikalischen Eigenschaften dieser weitgehend unbeweglich Membran bekannt. Erkunden weitere Details, wie die IM lokalen Organisation, würde das Verständnis der Organisation IM Proteine in bestimmten GRs und Kanalproteinen fördern. B. Subtilis Sporen haben eine Struktur, bestehend aus mehreren konzentrischen Schichten und eine lipophile Sonde kann nicht einfach durchlaufen diese mehrere Schichten, um die rund um die Spore-Kern IM Flecken. Im Laufe der solche Sonden wird höchstwahrscheinlich durch die Protein-reiche Schichten und vielleicht auch die äußere Membran20,21behindert. Um dieses Problem zu überwinden, wurde eine PS4150 Kultur während der Sporenbildung lipophile Membran Farbstoff FM4-64 hinzugefügt. Auf diese Weise PS4150 vegetative Zelle Membrane war voller Flecken von FM4-64 und somit Membranen in Forespores erhalten aus dieser Kultur an der asymmetrischen Sporenbildung Zellteilung und anschließende Forespore Engulfment sind gut gefärbt,5. Infolgedessen können der Reifen Spore Membranen visualisiert werden. Eine frühere Studie darauf hingewiesen, dass die meisten wenn nicht alle der FM4-64 ist in der IM gereinigten Sporen5. Während einen Zeitraum von ca. 2 Wochen Inkubation und Spore Reinigung Behandlungen entfernen die Waschverfahren angewendet alle FM4-64 von der äußeren Membran, die letzteren effektiv entfernt wird, nach der decoating Behandlung und umfassende Waschschritte 5. jedoch das decoating Verfahren entfernt keine FM4-64 aus der IM, noch hat keinen Einfluss auf die Germinosome Brennpunkte5,6. Was uns begeistert ist, dass heller FM4-64 Spots ähnlich Germinosome Brennpunkte in beide intakt (Abbildung 4A, B erschien) und decoated Sporen (Abbildung 4, D) PS4150 Sporen. Diese helleren FM4-64 Flecken könnte das clustering von Germinosome Proteinen in der IM beteiligt werden.

Figure 1
Abbildung 1: Übersicht der Sporenbildung und Folie Vorbereitung. Eine Übersicht zeigt die ersten Schritte vor Bildgebung erforderlich. Detaillierte Angaben im Protokoll. (A) schematische Darstellung der Sporenbildung Verfahren in definierten minimalen MOPS Medium. Ein B. Subtilis PS4150 (PS832 ΔGerE::Spc ΔCotE::Tet) oder KGB80 (PS4150 GerKA GerKC GerKB-mCherry Katze GerD-Gfp kan) einzige Kolonie war in 5 mL LB-Medium Reich kultiviert und in 5 mL und 20 mL MOPS angepasst Medium haben wiederum, und schließlich in 250 mL MOPS Medium. Eine exponentielle Frühphase Kultur (OD600, 0,3-0,4) ist in allen zwischen-Kulturen verwendet. FM4-64 (2 µg/mL) wurde hinzugefügt, um das PS4150 Sporenbildung Medium für Spore Membran 1 oder 2 Stunden nach erreichen den Spitzenwert OD600 Färbung. (B) Methode der Ernte Sporen von MOPS Sporenbildung Kultur und Sporen durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung zu reinigen. (C) Verfahren Sporen auf 1 % Agarose Pad in einer gen-Frame-Kammer zu stabilisieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Pseudo-Weitfeld (PWF) 3D Bilder von GerD-GFP und GerKB-mCherry Schwerpunkte in zwei KGB80 (PS4150 GerKA GerKC GerKB-mCherry Katze GerD-Gfp kan) Sporen 3D-SIM raw-Bilder wurden mit dual-Channel-Anregung (561nm, 30 % Laserleistung, 1 s und 488nm, 60 % Laserleistung, 3 s) mit 7 Schritten von oben nach unten Z-Stapel. Anschließend wurden die Rohbilder SIM in Pseudo-Weitfeld 3D-Bilder von ImageJ Plugins SIMcheck umgewandelt. Von links nach rechts, 3D Bilder (Z2-Z5) der GerD-GLP (grün) werden GerKB-mCherry (rot) und die entsprechenden zusammengesetzte Bilder von zwei KGB80 Sporen (i und Ii) in der Systemsteuerung angezeigt. Übertragung (Trans) Lichtbilder von zwei Sporen (i und Ii) angegebenen Standort von Sporen, die als dunkle Dichte Bilder von einem helleren Halo umgeben erscheinen. Maßstabsleiste = 1 µm und alle Platten sind mit der gleichen Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Die maximale Fluoreszenzintensität der GerD-GFP im KGB80 (PS4150 GerKA GerKC GerKB-mCherry Katze GerD-Gfp kan) Sporen, und die maximale Auto-Fluoreszenz-Intensität der PS4150 Sporen in beliebigen Einheiten. Alle Sporen waren beleuchtet durch die Einstellungen des Protokolls angezeigt. Seitenteile (A) und (B) der maximale Fluoreszenzintensität der GerD-GFP und GerKB-mCherry Brennpunkte, bzw. in KGB80 Sporen sowie in beiden Fällen zeigen die maximale Auto-Fluoreszenz-Intensität der übergeordneten PS4150 Sporen. Seitenteile (C) und (D) der integrierten Fluoreszenzintensität der GerD-GFP Brennpunkte und der integrierten Fluoreszenzintensität der GerKB-mCherry Brennpunkte, bzw., in B. Subtilis KGB80 Sporen zeigen. Wir haben One-Way ANOVA-Tests zur Bestimmung der Bedeutung der unterschiedlichen maximalen Brennpunkt Intensität und integrierte Spore-Fluoreszenz-Intensitäten mit Software Origin 9.0 unter Berücksichtigung P Werte < 0,05 als signifikant. Sporen mit 4 oder 5 Schwerpunkte wurden wegen ihrer geringen Fülle von der Analyse ausgeschlossen. Die Daten werden im gekerbten Boxplots dargestellt. Die Kerben in den Parzellen sind rund um die mittlere Werte mit ihrer Breite proportional zu der Interquartilbereich (IQR) beobachtet. Die Schnurrhaare gezeigt repräsentieren maximal 1,5 die IQR. Sternchen zeigen einen signifikanten Unterschied des Medians. GerD-GFP und GerKB-mCherry integriert-Fluoreszenz-Intensität haben eine starke positive Korrelation (Spearman Korrelationskoeffizient = 0,73)18. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Pseudo-Weitfeld (PWF) Bilder (A und C) und rekonstruierten SIM (B und D) des FM4-64 gebeizt IM der B. Subtilis -PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) Sporen. FM-464 wurde während der Sporenbildung Sporen eingegliedert. 3D-SIM raw-Bilder von intakten Sporen (A und B) und decoated Sporen (C und D) wurden mit einem Kanal Erregung (561 nm Laser, 20 % Laserleistung, 400 ms) mit einer 25 Schritt von oben nach unten Z-Stapel. Anschließend wurde die Rohdaten der SIM-Karte durch das Mikroskop imaging-Software rekonstruiert (siehe Tabelle der Materialien) in 3D-SIM Bilder oder PWF von SIMcheck (ImageJ Plugins) umgewandelt. Die blaugrünen Pfeile zeigen auf FM4-64 Brennpunkte in der IM im Bedienfeld " B und D. Maßstabsleiste = 1 μm und alle Platten sind mit der gleichen Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Stamm Sporen gezählt Brennpunkte Brennpunkte pro Spore (%)
0 1 2 3 4 5
KGB80 346 GerD-GFP 2 46 40 11 1 0
GerKB-mCherry 2 53 40 5 0 0

Tabelle 1: Anwesenheit von Brennpunkte in KGB80 Sporen. Die Germinosome-Herde-Anzahl pro Spore in einer Population von Dual B. Subtilis KGB80 beschriftet (PS4150 GerKA GerKC GerKB-mCherry Katze GerD-Gfp kan) Sporen. Fluoreszenz in Sporen wurde als Germinosome Brennpunkte gezählt, wenn ein Fokus maximale Intensität höher als die Auto-Fluoreszenz-Intensität, das war die maximale Intensität der PS4150 (PS832 ΔGerE::Spc ΔCotE::Tet) angeregt durch die gleichen Beleuchtung-Einstellungen wie die KGB80 Sporen Sporen.

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Discussion

Das Protokoll präsentiert enthält ein standard-3D-SIM-Verfahren zur Analyse von FM4-64 gebeizt B. Subtilis Sporen, die Sporenbildung, Folie Vorbereitung und bildgebende Verfahren enthält. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll eine modifizierte SIMcheck (ImageJ)-unterstützt 3D imaging-Prozess für die SIM-Mikroskopie von B. Subtilis Spore Germinosomes beschriftet mit fluoreszierenden Reportern. Die letztere Vorgehensweise konnten wir diese dim Unterkonstruktion mit verbesserten Kontrast zu beobachten. Durch die Kopplung von zwei bildgebender Verfahren, ist es möglich, diskrete Sub-Strukturen in der gleichen Spore mit der gleichen SIM-Mikroskop, verbessert so den Grundstein für ein mechanistisches Verständnis der Keimungsprozess zu visualisieren. Beachten Sie, das das Verfahren mit einer lateralen Auflösung von ~ 100 arbeitet nm und einer axialen Auflösung von ~ 200-250 nm. Das ist besser als die Differential Interferenz Kontrast (DIC) Weitfeld-Mikroskopie Ansätze von Griffith7. Zeitaufgelöste, Analyse der Germinosome Erscheinung nach Einleitung der Keimung eine gewünschte nächste Schritt wäre. Leider, wenn SIM-Mikroskopie im Prinzip vereinbar ist live-Imaging, aufgrund der dim die Germinosome Signale solcher zeitaufgelösten SIM, Analysen sind nicht machbar, weil schnelle Bleichen der Proben während der Bildaufnahme. Um ausreichende Sporen für die Analyse zu erhalten, ist es wichtig, um sicherzustellen, dass die Sporenbildung effizient stattfindet. Forscher müssen daher Sporenbildung Effizienz akribisch mit 90 % Wirkungsgrad als Ziel überprüfen. In die repräsentativen Ergebnisse haben in Sporen, bzw. ~ 50 % und 40 % von allen Sporen ein oder zwei GerD-GFP und GerKB-mCherry-Herde (Tabelle 1). Der Prozentsatz der Sporen mit zwei Schwerpunkten ist viel höher als die von Griffiths berichtete zuvor7. Es gibt mehrere Gründe, die das unterschiedliche Ergebnis bei den laufenden Arbeiten erklären konnte. Erstens könnte die 3D imaging-Prozess die Erkennung von mehr Brennpunkte erleichtern. Unterschiedliche Schwerpunkten in der gleichen Spore befinden sich an verschiedenen Orten in vertikaler Richtung, wie in Abbildung 1dargestellt. Zweitens: die CCD-Kamera (Table of Materials) und Laser-Einheit ausgestattet, um die SIM-Mikroskop tragen wesentlich zur bildgebenden Ergebnisse. Dritte, ähnlich wie Griffithss Ansatz7 bis durchschnittliche Dutzende von aufeinander folgenden Bildern für eine bessere Bildanalyse, die Pseudo-Weitfeld-Bild von der Germinosome war auch eine durchschnittliche Bild von SIM Rohbilder (5 Phasen und 3 Ausrichtungen Bilder). Schließlich unterscheiden sich die Sporenbildung Medium und Sporenbildung Bedingungen, eine wichtige Variable bei der Bestimmung der Spore Eigenschaften in unserer Arbeit, die zuvor verwendet. Griffiths Et Al.7 verwendet reichen 2 x Schaeffer es Glukose (2 x SG) Mittel für die Sporenbildung, während einer definierten minimalen MOPS gepufferten Medium war hier beschäftigt. Mehrere Veröffentlichungen haben gezeigt, dass Sporenbildung Medium und Bedingungen erhebliche Auswirkungen auf die Proteinzusammensetzung, Widerstand haben, und Keimung von B. Subtilis 22,23,24 Sporen , 25. in der Tat wurde nachgewiesen, dass GR Untereinheiten 3 bis 8 fache niedriger in Sporen auf einem armen Medium im Vergleich zu denen, die auf reiche-Medium erhalten sind. GerD Ebenen wurden auch in armen mittlere Sporen rund 3.5-fold niedriger, und diese Sporen brauchte länger, um Spore Keimung26starten. Es ist jedoch unklar, ob Sporenbildung Bedingungen auch die Anzahl der beobachteten Germinosome Brennpunkte beeinflussen.

Ramirez-Peralta Et Al." s Ergebnisse26 darauf hingewiesen, dass die Preise der Nährstoff Keimung von Sporen auf Bevölkerung Ebenen durch die Keimung Proteine und GerD erheblich beeinflusst werden. Wenn die integrierten fluoreszierenden Intensitäten pro von spore die fluoreszierenden Reporter sind direkt proportional zu den Ebenen von GerD und GerKB Fusionsproteine, Ebenen der beiden Fusionsproteine sind sehr unterschiedlich in KGB80 Sporen, die ist in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten 7. diese Protein-Ebene-Heterogenität könnte im Zusammenhang mit Spore Keimung Heterogenität der Ebene der einzelnen Spore beobachtet und Germinosome Brennpunkte Anzahl möglicherweise ein weiterer Faktor für Spore Keimung Heterogenität. Weitere Experimente konzentriert sich auf eine Analyse der möglichen Auswirkungen dieser Germinosome Brennpunkte Zahl und Brennpunkte Keimung Proteinzusammensetzung (nicht alle Germinosomes gleich in der Keimung Proteinzusammensetzung sein kann) könnte auf Keimung Heterogenität. Die Daten gab Anlass zu einer Reihe von aktuellen Forschungsfragen einschließlich: ich) Was ist die Rolle des GerD in das clustering der GRs in der IM; und Ii) wie sind die beiden anderen GRs, GerA und GerB, organisiert in der Spore IM?

Das Protokoll für dunkle und helle Spore Proben präsentiert ermöglicht es, diskrete Sub-Strukturen in der gleichen Spore durch SIM-Mikroskopie zu visualisieren. Die FM4-64-Lichtblicke, die in Sporen beobachtet wurden möglicherweise durch umfangreiche Faltung IM27. Alternativ, vermuten wir, dass diese Regionen die IM sind wo der Farbstoff leichter auf aufgrund erhöhten lokalen IM Fließfähigkeit zugreifen könnte. Solche Regionen erhöhte Fließfähigkeit (RIFs) kann durch das Zellskelett Aktin homolog MreB, bekannt für seine Konzentration der Flüssigkeit kurz Acyl Kette Lipide28,29organisiert werden. Spürbar, Anwendung das gleiche Verfahren zu Wildtyp B. Subtilis Sporen auch führt zu ein ähnliches Muster der FM4-64 Lichtblicke (unveröffentlichten Beobachtungen). In B. Subtilis vegetativen Zellen, ergibt ein eingestürzten Membran-Potential das clustering von MreB und südvietnamesischen29. Die innere Membran der Sporen wahrscheinlich hat eine relative geringe Membran potenzielle20,21 und enthält nachweisbare Konzentrationen von MreB30 die führen könnte, um die Cluster-Bildung des RIFs in größeren Bereichen hohe Fließfähigkeit29 . Ob solche Domänen mit der Anwesenheit von Germinosomes zusammenfallen könnte werden derzeit untersucht.

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Disclosures

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Acknowledgments

Die Autoren danken Christiaan Zeelenberg für seine Unterstützung während der SIM-Bildgebung. JW anerkennt der China Scholarship Council für ein Promotionsstipendium und Dank Irene Stellingwerf für ihre Hilfe in der primären Phase der Bildgebung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air dried glass slides Menzel Gläser 630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 L Sigma-Aldrich Z567868
Erlenmeyer flasks 250 mL Sigma-Aldrich Z723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres Invitrogen, 0.1 μm F8803
FM4-64 Thermo Fisher Scientific F34653
Histodenz nonionic density gradient medium Sigma-Aldrich D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera Andor Technology https://imagej.net/Welcome
LB Agar Sigma-Aldrich L2897
Microfuge tubes 1.5 mL Thermo Fisher Scientific 3451PK
Microscope imaging software Nikon, Japan NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water Millipore Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL Thermo Fisher Scientific 75003800
Precision Coverslips Paul Marienfeld 117650
Round Bottom tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM
Screw cap tubes 50 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM

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References

  1. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
  2. Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
  3. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
  4. Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
  5. Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
  6. Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
  7. Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
  8. Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
  9. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
  10. Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
  11. Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
  12. Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
  13. Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
  14. Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
  15. Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
  16. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
  17. Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
  18. Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
  19. Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
  20. Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
  21. Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
  22. Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
  23. Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
  24. Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
  25. Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
  26. Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
  27. Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
  28. Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
  29. Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
  30. Swarge, B. N., et al. "One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).

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