Summary
枯草菌胞子の内膜で 'germinosomes' の germinant 受容体蛋白質クラスター。超解像顕微鏡と蛍光レポーターのタンパク質を使用して germinosomes を視覚化するプロトコルについて述べる。プロトコルはまた、FM4 64 膜色素で染色が優先的に胞子内膜ドメインを識別します。
Abstract
胞子のサイズが小さく、発芽蛋白質の比較的低い豊かな落射蛍光顕微鏡を用いた顕微鏡分析の難しさを引き起こします。超解像 3次元構造化照明顕微鏡法 (3 D SIM) は、このハードルを克服し、枯草菌(枯草) 胞子の発芽の過程の分子の詳細を明らかにする有望なツールです。ここでは、変更された SIMcheck (ImageJ) の使用を述べる-アシスタント 3 D イメージング プロセスと枯草胞子 germinosomes、発芽蛋白質のクラスターの SIM 顕微鏡蛍光レポーター蛋白質。FM4 64枯草胞子膜の汚損のため (スタンダード) 3 D SIM イメージング手順を提案する.これらの手順を使用して、我々 は germinosome のローカリゼーションのための卓越した解像度を得られるし、示す > 休眠胞子は胞子形成培最小限モップの後得られた枯草KGB80 の 80% ある逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の 1 つまたは 2 つ巣。明るい巣も観察した FM4 64 ステンド胞子 3 D シム画像可能性があります異なる流動性の内膜脂質ドメインが存在することを示唆しています。更なる研究の共局在を評価し、このように内部胞子膜の菌発芽蛋白質の組織の最適な概観を得るダブル レポーター蛋白質膜色素と germinosome 手順をラベリングを使用するが可能。
Introduction
注文 Bacillales と Clostridiales の胞子は休眠代謝と過酷な除染体制に非常に抵抗力があるが、彼らは発芽する、しない限り、人間1に有害な影響を引き起こすことはできません。枯草菌(枯草) 胞子の栄養 germinant トリガー発芽、開始イベント、germinant 受容体 (GRs) 胞子の内膜 (IM) に位置する germinant のバインディングです。その後、GRs は IM にもある SpoVA チャネル蛋白質に信号を変換します。これは、結果、胞子コア ピリジン-2, 6-ジカルボン酸 (ジピコリン酸; exchange の発症DPA;胞子コア乾燥重量の 20% を構成する) SpoVA チャネル経由で水のため。その後、DPA リリース トリガー皮質ペプチドグリカン加水分解の活性化、追加吸水2,3,4に従います。これらのイベントは、コート層、その後破断伸長の発症に機械的ストレスにつながる、そして最後に、生長します。ただし、発芽過程の分子の正確な詳細はまだ遠くから解決されています。
胞子の発芽についての主要な質問にかかわる周囲の IM SpoVA チャネル蛋白質と同様に、IM の発芽タンパク質脂質の生物物理プロパティ。この主不動 IM 脂質二分子膜は胞子コアまたは細胞細胞質5,6で彼らの行動を出すいくつかの毒性の化学防腐剤を含む多くの小さい分子の主な関門です。IM の脂質二重膜は、モバイル IM5脂質の大部分はあるもののゲル状態の可能性が高いです。胞子の IM も大幅な拡大5の可能性があります。したがって、IM の表面積増加 1.6 追加膜の合成することがなく発芽し、この膜の特性低透磁率および脂質不動5,6の損失と一緒に伴われます。
B. 枯草菌胞子のサイズが小さいと発芽蛋白質の比較的低い豊かさが課題を提起発芽蛋白の活性化と胞子の IM 脂質の組織の分子の詳細は学習の魅力的なテーマが、顕微鏡解析。B. 枯草菌芽胞の足場蛋白質逆流性食道炎整理ゲラ、B と K GRs のための 3 つの GR サブユニット (A、B および C) グリフィスら落射蛍光顕微鏡証拠を魅力的な発芽蛋白質に溶ける蛍光レポーターを使用して示唆しています。クラスター7。彼らは発芽蛋白質のこのクラスターの 'germinosome' という言葉し、~ 300 nm 大 IM タンパク質巣8として構造を説明しました。胞子の発芽の開始、時に巣最終的に変更に大きな蛍光 germinosome 分散蛍光パターンと > L-バリン8で 1 h の胞子でこのパターンを表示する胞子人口の 75% が発芽しました。上記の使用紙平均統計的検出力を得るために、イメージング中に観測された低蛍光信号のハードルを克服するための連続した蛍光画像の数十からの画像であることに注意してください。細菌の胞子のこれらの構造のこの可視化された古典的な顕微鏡ツールとも単胞子の巣量評価と技術的に実現可能なものの端になかったより詳細な局在この方法で可能です。
ここでは、詳細な可視化を取得する構造化照明顕微鏡 (SIM) の使用とその IM 脂質ドメイン9のと同様、枯草胞子で germinosome(s) の定量化を紹介します。プロトコルには、ImageJ10、11,12だけでなく、胞子形成、スライドの準備および SIMcheck (v1.0、imageJ プラグイン) による画像解析手順も含まれています。
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Protocol
1 B. subtillis胞子形成 (タイミング: 顕微鏡観察する前に 7 日間)。
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日 1
- ルリア ベルターニカミラ スープ (LB) 寒天培地プレート (1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、1% 食塩水, 1% 寒天)13に細菌培養を連勝し、シングル コロニーを取得する 37 ° C で一晩インキュベートします。B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB mCherry 猫、逆流性食道炎 gfp 菅) ひずみとその親株背景に枯草PS4150 を使用 (PS832 ΔgerE::spc、ΔcotE::tet)7を前述のよう。
注:ΔcotEΔgerEの背景を持つ胞子の使用は胞子コート レイヤー7の自発蛍光を最小限にするために germinosome 可視化に不可欠です。 - すべてのメディア、チューブ、pipets、適切な方法で使用される他の文化の資料を殺菌します。
- ルリア ベルターニカミラ スープ (LB) 寒天培地プレート (1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、1% 食塩水, 1% 寒天)13に細菌培養を連勝し、シングル コロニーを取得する 37 ° C で一晩インキュベートします。B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB mCherry 猫、逆流性食道炎 gfp 菅) ひずみとその親株背景に枯草PS4150 を使用 (PS832 ΔgerE::spc、ΔcotE::tet)7を前述のよう。
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日 2
- 早朝に 5 mL の LB 培地に単一コロニーを接種して OD600 0.3 から 0.4 (約 7 時間) に達するまでに 200 回転/分、37 ° C でスクリュー キャップ チューブの連続撹拌下で文化を孵化させなさい。
- モップ媒体 (pH 7.5) 500 ml ペットボトル 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O、0.4 μ M H3を含んでいる BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O、10 nMZnSO4·7H2O、1.32 ミリメートル K2HPO4、0.4 mM MgCl2·6H2O、0.276 mM K24、0.01 mM FeSO4·7H2O、0.14 mM CaCl2·2H2O、80 mMモップ、4 mM 0.1 mM MnCl2·2H2O、トリシン 10 mM D-グルコース-一水和物、および 10 mM NH4Cl。
- スクリュー キャップ チューブ 10-1- 5 mL の LB 文化 10-7シリアル希薄でモップの培地を準備し、一晩 200 回転/分、37 ° C で連続攪拌下で文化を孵化させなさい
注:ここで用意されるシリアルの希薄は翌朝早い指数段階の希釈を取得を目指します。このステップと次のステップ モップ バッファー成長媒体に適応するセルを許可に必要です。
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日 3
- 0.3 0.4 の OD600モップ希釈液のいずれかを選択します。予め温めておいた (37 ° C) モップ培地 20 mL 円錐形の 250 mL のフラスコの中に文化の 0.2 mL を接種して OD600に達する 0.3 から 0.4 (〜 7 h) まで連続攪拌下で孵化させなさい。
- 1.3.1 のステップから 1% (v/v) 前培養とモップ ベース胞子形成培地 (250 mL) を接種して連続攪拌下の円錐形のリットルのフラスコで 37 ° C で 3 日間インキュベートします。FM4 64 PS4150 胞子の染色、2 μ G/ml FM4 64 プローブ (材料表参照) 胞子形成培地 1 または 2 h に OD600値 (一般に約 2) 栄養生長のピークに達した後を追加し、許可する文化その後感受性光5から保護しながら。
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7 日目: 胞子の収穫
- 位相暗細胞から段階明るい胞子とおそらく成熟した胞子を区別するために、100 倍の倍率で位相差顕微鏡を使用して胞子形成収率 (胞子対栄養細胞) を決定します。90% 相明るい胞子収量が期待されます。
- 4,270 x g丸底遠心チューブの 4 ° C で 15 分間で胞子をペレットします。50 mL コニカル遠沈管 (材料の表を参照) で 2-3 回滅菌超純水タイプ 1 脱水 40 mL で胞子ペレットを洗浄します。4,270 × gで 15 分 (4 ° C) で洗うたびにスピンダウンします。
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7 日目:胞子浄化
- 浄化を胞子: 20% 非イオン密度勾配媒体の 750 μ L で胞子ペレットを中断 (材料の表参照) し 800 μ L の滅菌マイクロ遠心チューブ用で 50% 非イオン密度勾配媒体に読み込みます。21,500 x gで 60 分間遠心します。得られたペレットには、無料の胞子が含まれています。20% 非イオン密度勾配媒体を 200 μ l 添加の胞子ペレットを中断し、1 mL 遠心チューブで 21,500 × gで 15 分遠心分離 50% 非イオン密度勾配媒体の上にロードします。
- 最終的な胞子準備・洗浄: 得られたペレットには精製の休眠胞子が含まれています。洗浄滅菌超純水タイプ 1 の 1.5 mL で 2-3 回胞子ペレット (材料の表を参照) を水と 4 ° C で 15 分間 9,560 x gで間にスピン ・ ダウン最後に、約 30 の最終の OD600滅菌超純水タイプ 1 水でペレットを中断します。胞子の因数は、8 週間14-80 ° C で保存できます。
2. decoating
- PS4150 胞子を扱うと 0.1 M 塩化ナトリウム/0.1 M NaOH/1% ナトリウム dodecyl 硫酸 (SDS)/1 h. の 70 ° C で 0.1 M ジチオトレイトール (DTT) 洗浄滅菌超純水水タイプ 115,16で 10 倍胞子。これによりいずれかは胞子の外膜で FM4 64 プローブを吸着し、外側の層が削除されます。
3. Coverslip とスライド準備11 (タイミング: 観察する前に 1 H)
- クリーン前高精度 coverslips は、優しく揺れ水浴中で 30 分間 1 M HCl で (材料の表を参照)。超純水の種類 1 水で 2 回 coverslips を洗浄し、100% (巻/巻) 江藤に保存します。乾燥し、使用する前に彼らの明快さを確認しましょう。中古 70% でスライド ガラスをきれい江藤。乾燥し、使用する前に彼らの明快さを確認しましょう。
4. サンプリング蛍光マイクロスフィアまたは胞子遺伝子フレーム スライド10 (15 分タイミング)
- 前 2 つ 70 %etoh 掃除を暖かいと 70 ° C 加熱ブロックでは数秒の空気の乾燥したガラス スライド (材料の表を参照)、65 μ L 1 つのガラス スライド上に 70 ° C で開催された滅菌の 2% の agarose をドロップしてアガロース b を普及する上で他のガラス スライドを配置etween スライド。アガロースのパッチは約 5 分で乾燥します。
- ガラス スライドの 1 つを削除した後に 1 × 1 cm 断面 agarose パッチをカット サンプル (蛍光マイクロスフィアまたは 10 〜8/mL の胞子)、0.4 μ を追加して、パッチに coverslip を配置することによって高精度の coverslip にパッチを転送し、オフにスライド。
- 従って完了顕微鏡用スライド、フレームのすべてのコーナーを終了、coverslip を配置先、乾燥したスライド上に遺伝子のフレーム (1.5 x 1.6 cm2、65 μ L) を修正します。
5. イメージング11,17(タイミング: 1 H)
- 胞子の伝送と蛍光画像だけでなく、赤の混合物をキャプチャし、構造化照明顕微鏡黄緑色のカルボン酸修飾微粒子蛍光は油客観的 (x 100 装備 (材料の表参照)開口数 = 1.49)、CCD カメラと画像解析ソフトウェア (材料の表を参照)。周囲の光の妨害することがなく室温ですべての画像を生成します。目的とイメージングの前に 75% エタノール スライド x 100 を常にきれいにすることを確認します。
- 100 nm (直径) 蛍光マイクロスフィアに焦点を当てるし、対称の psf が得られる、画像のぶれを最小限に抑えるまで 100 x 目的の補正リングを調整することによって点拡がり関数 (psf) を最適化します。Psf は、インパルス応答またはイメージング システムの点光源または point オブジェクトへの応答。
- 約 10 ラウンド蛍光マイクロスフィアとビューのフィールドを選択します。回折格子を適用ピント調整の両方 561 nm と画像解析ソフトウェアのためのガイドとして 488 nm 励起波の長さ。
- 透過光で胞子を集中し、イメージごとに 200 ミリ秒のエクスポー ジャーを持つ 16 × 平均モードで透過光像をキャプチャします。
- 照明モード読み出しモード電子乗算 (EM) 利得 10 MHz にカメラ設定「3 D シム」では、14 ビットと 175 で EM ゲインと胞子の 3D SIM raw 蛍光画像をキャプチャします。レーザー出力の 20% で 561 nm のレーザー光で PS4150 胞子で FM4 64 プローブと照明時間 400 ms を刺激します。
- エキサイト GerKB mCherry と KGB80 で逆流性食道炎 GFP 胞子、それぞれ、561 nm レーザー光で 30% レーザー パワーで 1 s、および 488 nm レーザー光 60% で 3 s. Z スタック設定は/ステップのモードでは、0.2 μ m を下へ、7 つのステップ、germinosome の 20 の手順で電源をレーザーとIM 解析、それぞれ。
注:これらのレーザーのパラメーターは、約 4,000 のヒストグラム ウィンドウの明るさの最大値を保証するために適用されました。
6. 3D SIM FM4-64 PS4150 の胞子を染色の Raw 画像を再構築します。
- PS4150 胞子の生データを染色 FM4 64 N SIM スライス再構成を実行します。N-シム スライス再構成ウィンドウを開く N SIM パッド] タブ シートに再構成スライス Paramボタン クリックします。
- N SIM スライス再構成ウィンドウで復元パラメーターを設定します。最適な再構成画像を得るため N SIM 命令の提案に従うし、照明変調コントラスト (IMC)を自動高に設定するN SIM スライス再構成ウィンドウに適切なコントロールをクリックしてください解像度ノイズ抑制 (HRNS) 1.00、焦点ぼかし抑制 (OFBS) から開始点として 0.05 〜。
- イメージを再構築するN SIM スライス再構成ウィンドウで再構成スライス] ボタンをクリックします。高速フーリエ変換 (FFT) 画像と復興12後表示復興のスコアによる再構成画像の品質を評価します。
- 0.10 からHRNSを調整 5.00 そしてのOFBSには 0.01 から 0.50 によって最適なパラメーター設定が得られるまでN SIM スライス再構成ウィンドウ内の適切なコントロールをクリックします。
- 変更されたパラメーターを適用するN SIM スライス再構築] ウィンドウで [適用] ボタンをクリックします。ウィンドウを閉じるに [閉じる] ボタンをクリックします。
- [FM4-64 ステンド PS4150 の胞子の raw 画像のアクティブなN SIM パッド] タブ シートのスライスの再構築ボタンをクリックしてスライス再構成を実行するを確認します。再構築された画像を保存します。
7. 画像解析
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KGB80 germinosome の擬似広視野画像を変換します。
- ImageJ プラグインSIMcheckユーティリティRaw データ SI 擬似広視野12左クリックでアクティブにして擬似広視野画像に 3 D SIM KGB80 の raw 画像を変換します。擬似広視野生 SIM データから画像の平均値し、の比較のため、従来の広視野照明12と同等のイメージを組み立てます。ImageJ 自体は、https://imagej.net/Welcome を参照してください。蛍光の擬似広視野画像で後で germinosome 分析の各逆透過像の ~ 25 胞子がランダムに選択します。
- 2 枚のスライドからの眺めの 14 のフィールド (この例では、346) の合計約 350 KGB80 胞子で選択します。選択した KGB80 の胞子の逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry 蛍光巣番号は、2 つの研究者によって独立してカウント必要があります。研究者胞子で別蛍光 germinosome 巣の存在を疑うときは常に 3 D SIM の raw 画像を参照できます。
- 各逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry フォーカスの最大強度と ImageJ で各 KGB80 胞子の 3 D 画像の強度を評価します。
-
KGB80 germinosome の擬似広視野画像を分析します。
- KGB80 胞子の統合された信号強度として 7 スタックの平均強度値を使用します。同一の設定を使用してバック グラウンドひずみ PS4150 イメージングによるバック グラウンド強度を決定します。背景と明確に区別している場合 germinosome 巣として個々 の KGB80 の胞子の輝点を考えてください。
- ソフトウェアの起源 9.0 と意義を決定するため一方通行 ANOVA テストを適用します。P 値を考慮した < 0.05 として統計的に重要な。スピアマンの順位相関係数18を使用して、逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の巣数の相関は、信号強度の測定を評価します。
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Representative Results
現在のプロトコルは細菌の胞子の SIM 顕微鏡イメージング手順を示します。胞子形成とスライドの準備手順は、イメージングの前に図 1に示すように、行われました。イメージングおよび分析手順が適用された後で、両方の点心 (発芽タンパク質を標識蛍光タンパク質) と明るい (脂溶性プローブ染色 IM) 胞子サンプル次のテキストのよう。
B. 枯草菌芽胞の germinosomes の局在
逆流性食道炎と GerKB のレベルは、胞子、あたり 3,500 〜 と 〜 700 の分子が、それぞれに報告された豊富な胞子形成培地19の準備の胞子からの抽出物の西部のしみの分析に基づきます。KGB80 ひずみで逆流性食道炎 gfpとgerKB mCherryの両方の遺伝子がそのネイティブのプロモーターの制御下で。SIM 再構成アルゴリズムによってこのような薄暗い生シムの画像を再構築することは困難だったので、融合蛋白質の低い個体は、イメージング中に蛍光信号につながった。しかし、その germinosome イメージ獲得のため SIM の raw 画像は、SIMcheck (ImageJ プラグイン) で擬似-広視野画像に変換されたが SIM 顕微鏡が適用されました。さらに、7 スタック 3 D イメージングは、この IM フォーカスのよりよい概観を得るために実装されました。図 2の左側のパネルのように、逆流性食道炎 GFP の 2 つの焦点は異なるスタックで登場。合計で 3 つの逆流性食道炎 GFP 巣、先ず列の Z3 スタックで白い矢印で示されます。図 2の右側のパネルは、複合列の Z4 スタックの白色の矢印によって証明されるよう胞子で逆流性食道炎 GDP 焦点ポイントの 1 つだけを持つ胞子を示しています。合計では、約 40% と 50% の胞子のいた 2 つまたは 1 つの逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry クラスターそれぞれ (表 1)。検査 346 胞子間 4 逆流性食道炎 GFP 巣があった 2 つと 1 つの胞子も 5 逆流性食道炎 GFP の巣があった。著しく、私たちの手で同じ胞子で逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の巣の数なかった常に同じ18。SIM 顕微鏡は、位相コントラスト オプションがなかったので、我々 は胞子のローカリゼーションのため光顕微鏡を使用しました。したがって、胞子は明るいハローに囲まれた暗い、密度の高いコアと表示されます。
ImageJ で KGB80 胞子の統合の蛍光強度を測定しました。胞子は、0、4、または 5 の巣があったが、低周波による統計分析に含まれていません。逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の統合された強度の高い正の相関があった (スピアマン順位相関係数 0.73 を =)。逆流性食道炎 GFP 足場蛋白質の統合の強さが異なる集団 (図 3) 間違っていた、GerKB mCherry の統合された強度の異なる集団 (図 3 D) 同じ頃でした。逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の巣の最大蛍光強度胞子複数巣 (図 3 a, B) を持っていたとき、減少傾向を示した。Germinosome 巣とみなされるすべての明るいスポットの最大蛍光は PS4150 (KGB80; 背景の緊張から胞子胞子の最大自動蛍光より高かった図 3AB)
内膜の組織
導入で述べたように、胞子の IM の germinosome 蛋白質があります。ただし、いくつかの詳細は、この主不動膜の生物物理プロパティについて知られています。IM のローカル組織などの詳細を探索 IM 蛋白質、特定大赤斑とチャネル蛋白質の組織の理解を促進します。B. 枯草菌の胞子は、複数の同心円状の層を構成する構造を持つ、脂溶性プローブできません胞子核を囲んで IM を染色する複数層これらを通過簡単に。このようなプローブの通路は最も可能性の高いタンパク質豊富なコート層、そしておそらくまた外膜20,21によって妨げられます。この問題を克服するためには、胞子形成期 PS4150 文化に親油性膜色素 FM4 64 をされました。そう PS4150 植物の細胞膜は FM4-64 によって汚された、従って非対称胞子形成細胞分裂とその後胞子呑食文化から得られた forespores の膜がよく5を染色します。その結果、成熟した胞子の膜を視覚化できます。前の研究は、ほとんどない FM4 64 のすべての場合では、洗浄の胞子5で IM を示されました。インキュベーションと胞子浄化療法の約 2 週間、適用洗浄手順から削除して任意の FM4 64 外膜、decoating 治療の後削除されて効果的に後者と広範な洗浄の手順5します。 ただし、decoating プロシージャは、IM からいいえ FM4 64 を除去また germinosome 巣5,6に影響を及ぼす。何が私たちを興奮、germinosome の巣に似た明るい FM4 64 スポット両方そのまま (図 4 a, B) で登場 PS4150 胞子の胞子 (図 4D) 。これらの明るい FM4 64 スポットは、IM の germinosome 蛋白質のクラスタ リングに関与する可能性があります。
図 1: 分生胞子形成とスライドの準備の概要。イメージングの前に必要な初期手順を表示する概要。詳細については、プロトコルで与えられます。定義された最小限の MOPS の胞子形成手順の概略図 (A) 中。B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc Δコート::テト) または KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB mCherry 猫逆流性食道炎 gfp 菅) 単一コロニー培養 LB 豊富な培地 5 mL と 5 mL と 20 mL の MOPS の適応媒体、順番、最後にモップの中の 250 mL の同属。指数早期文化 (外径 φ600、0.3 0.4) はすべて中間文化であります。FM4 64 (2 μ g/mL) は、胞子膜外径600のピーク値に達した後、1 または 2 h を染色用 PS4150 胞子形成培地に追加されました。(B) モップ胞子形成文化から胞子を収穫し、胞子を密度勾配遠心による浄化法(C) 遺伝子フレーム室で 1% アガロースゲル パッドの胞子を安定化の手順。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:代表的な擬似広視野 (PWF) 3 D 画像 2 KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB mCherry 猫逆流性食道炎 gfp 菅) 休眠胞子 3 D SIM raw 画像で逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の巣のデュアル チャネル励起 (561 nm、30% レーザー パワーで撮影されました。1 の s、および 488 nm, 60% レーザー パワー、3 s) 下 Z スタック トップから 7 の手順を使用して。その後、SIM の raw 画像は、ImageJ プラグイン SIMcheck で擬似広視野 3 D 画像に変換されました。左から右、3 D 画像 (Z2 Z5) 逆流性食道炎-GFP (緑) に、GerKB mCherry (赤) と 2 つの KGB80 の胞子 (i および ii) の対応する複合イメージがパネルに表示されます。2 つの胞子 (i および ii) の伝送 (トランス) 光のイメージには、明るいハローに囲まれた暗いの密な画像として表示される胞子の場所が示されます。スケール バー = 1 μ m とすべてのパネルは、同じ倍率。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB mCherry 猫逆流性食道炎 gfp 菅) 休止状態の胞子で逆流性食道炎 GFP の最大蛍光強度と PS4150 任意の単位胞子の最大自動蛍光強度。すべて胞子に照らされた設定にプロトコルが示されています。パネル (A) と (B) それぞれを示して、逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の病巣の最大蛍光強度、両方の例のように KGB80 休眠胞子を同様に親 PS4150 胞子の最大自動蛍光強度。パネル (C) と (D) で枯草KGB80 休眠胞子で逆流性食道炎 GFP 巣の統合の蛍光強度と GerKB mCherry 巣の蛍光強度をそれぞれ表示します。意義最大焦点強度と起源 9.0 ソフトウェアと統合された胞子蛍光強度の違いによる一方通行 ANOVA テストを用いて P 値を考慮した < 重要である 0.05。4 または 5 をもつ胞子は、低生息のため分析から除外しました。データは、切欠きひげで表されます。プロットの切り込みは、四分位範囲 (IQR) に比例幅を観察中央値の周りです。示されているひげは、IQR 1.5 の最大値を表しています。アスタリスクは、中央値の差を示しています。逆流性食道炎 GFP および統合 GerKB mCherry 蛍光強度強い正の相関がある (スピアマン相関係数 = 0.73)18。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:代表的な擬似広視野 (PWF) 画像 (A、C) と SIM 像 (B、D) の FM4 64 ステンド枯草PS4150 の IM (PS832 ΔgerE::spc、ΔcotE::tet) の胞子します。FM 464 は、胞子形成期の胞子に組み込まれました。3D SIM そのまま胞子 (AおよびB) および (CとD) ただの胞子の raw 画像は、1 つのチャネルの励起 (561 nm レーザー、20% のレーザー パワー、400 ms) で撮影された 25 ステップ上から下 Z スタックを使用します。生の SIM データが顕微鏡イメージング ソフトウェアによって再建された後、(材料の表を参照してください) 3 D シム画像にまたは SIMcheck (ImageJ プラグイン) で PWF に変換されます。水色の矢印はBとDパネルで IM で FM4 64 病巣をポイントします。スケール バー = 1 μ m とすべてのパネルは、同じ倍率。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ひずみ | 胞子カウント | 巣 | 巣胞子 (%) | |||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||||
| KGB80 | 346 | 逆流性食道炎 GFP | 2 | 46 | 40 | 11 | 1 | 0 | ||
| GerKB mCherry | 2 | 53 | 40 | 5 | 0 | 0 | ||||
表 1:KGB80 胞子で巣の存在。Germinosome 巣デュアル ラベル枯草KGB80 の人口の胞子数 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry 猫逆流性食道炎-gfp 菅) 休眠胞子。胞子で蛍光が germinosome 巣としてカウントされ、フォーカスの最大強度が高かった自動蛍光強度は、PS4150 の最大輝度をされたとき (PS832 ΔgerE::spc Δコート::テト)休眠胞子 KGB80 の胞子と同じ照明設定で興奮しています。
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Discussion
提示されたプロトコルには、FM4-64 B. 枯草菌芽胞をステンド胞子形成、スライドの準備、画像形成プロセスの解析のための標準 3D SIM プロシージャが含まれています。さらに、プロトコルが変更された SIMcheck (ImageJ) について説明します-3 D イメージング蛍光レポーターの付いた菌胞子 germinosomes の SIM 顕微鏡のためのプロセスを支援します。後者の手順では、拡張されたコントラストと薄暗いこの部分構造を観察することができました。2 つの画像処理手順を結合することによって発芽過程のメカニズムの理解のための私達の基礎を向上させる、同じ SIM 顕微鏡と同じ胞子の離散構造を可視化することが可能です。〜 100 の水平解像度で動作する手順メモ nm と 200 〜 250 の軸解像度 nm。これは、グリフィス7で使用される差動干渉の対照 (DIC) 広視野顕微鏡のアプローチよりも優れています。時間分解 germinosome 発芽の開始時に外観の解析目的次のステップになります。残念ながら、SIM 顕微鏡は、原則として互換性ライブ イメージング、薄暗い性質、germinosome の信号のような時分割 SIM、画像集録中にサンプルの迅速な漂白のため解析が実現できません。分析のための十分な胞子を得るためにその胞子形成が効率的に行われていることを確認することが重要です。研究者は従ってターゲットとして 90% の効率で細かいところまで胞子形成効率をチェックしなければなりません。代表的な結果に休眠胞子でそれぞれ 〜 50% と 40% すべての胞子のある逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の巣 (表 1) の 1 つまたは 2 つ2 つの巣を胞子の割合はグリフィスによって報告されたよりもはるかに高い以前7。現在の仕事の別の結果を説明することがいくつかの理由があります。まず、3 D イメージング プロセスより病巣の検出が容易に可能性があります。同じ胞子のさまざまな焦点は図 1に示すように、垂直方向の別の場所にあります。第二に、CCD カメラ (材料表) と SIM 顕微鏡に搭載したレーザー統一イメージングの結果に大きく貢献.第三に、グリフィスのアプローチ7連続した画像より良い画像解析のための平均の数十のよう、germinosome の擬似広視野画像生 SIM 画像 (5 段階や 3 方向画像) から平均イメージがあったも。最後に、胞子形成培地と胞子形成条件、胞子のプロパティを決定する上で重要な変数は、以前使用したから我々 の仕事で異なっています。グリフィスら7使用リッチ 2 シェーファーのグルコース x (2 SG x) 定義された最小限のモップ中の胞子形成培地の緩衝液に採用されたここで。いくつかの論文は、胞子形成培地と条件抵抗、タンパク質組成に大きな効果、枯草の発芽胞子22,23,24に示されています。,25。 確かに、それが GR サブユニットのレベルが 3 〜 8 倍低い豊富な媒体で得られるものと貧しい中で得られる胞子で示されています。逆流性食道炎レベルも約 3.5 貧しい中胞子の下、これらの胞子胞子発芽26を起動に時間がかかりました。しかし、それは胞子形成条件も観察された germinosome の巣の数に影響を与えるかどうかは不明です。
ラミレス ペラルタら.'s 結果26胞子人口レベルでの栄養素の発芽率が発芽蛋白質と逆流性食道炎のレベルによって大きく左右されて示されています。あたり統合蛍光強度から胞子蛍光レポーター、逆流性食道炎と GerKB の融合蛋白質のレベルに正比例、前作との合意である KGB80 胞子で両方の融合蛋白質のレベルが異なります7です。 このタンパク質レベルの多様性は単一胞子レベルで観察される胞子発芽の不均一性に関連するかもしれない、germinosome 巣数の胞子発芽不均一性に貢献するもう一つの要因があります。Germinosome 巣数可能な効果の分析にさらに実験を当てるし、発芽の不均一性に巣発芽蛋白質サブユニット組成の (すべてではない germinosomes が発芽蛋白質組成に等しいかもしれません) 可能性があります。データを含む現在の研究の質問の数に上昇を与えた: 私) im で GRs のクラスタ リングで逆流性食道炎の役割は何ですii) 2 つの方法が他の大赤斑、ゲラおよび GerB、胞子 IM で編成され?
ぼんやりと明るい胞子サンプル提示プロトコルでは、SIM 顕微鏡による同じ胞子の離散部分構造を可視化することが可能。胞子の観察された明るい FM4 64 イム27の折り畳み式の広範な可能性があります。また、我々 は、染料より簡単に増加ローカル IM 流動性のためにアクセスできる IM の領域をこれらの地域には仮説します。このような地域の増加流動 (RIFs) は主催アクチン細胞骨格ホモログ MreB、流体短いアシル鎖脂質28,29の集中した事でよく知られていることがあります。著しく、野生型枯草に同じ手順を適用する胞子はまた明るい FM4 64 (未発表察) の同様のパターンにつながるのです。枯草栄養細胞,折りたたまれた膜電位の MreB、RIFs29のクラスタ リングの結果します。休眠胞子可能性の内膜は、相対的な低膜潜在的な20,21 MreB30高流動29 の大規模なドメインに RIFs のクラスタ リングにつながる可能性がありますの検出可能なレベルが含まれています.このようなドメインが germinosomes の存在と一致するかどうかは現在調査中です。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
著者はクリスティアーン ・ Zeelenberg の SIM イメージング中に彼の援助をありがちましょう。JW は中国奨学金博士課程フェローシップ委員会を認識し、アイリーン Stellingwerf とイメージングの第一次段階の間に彼女の助けをありがちましょう。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| ImageJ | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
References
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