Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Визуализация Germinosomes и внутренняя мембрана в спор Bacillus subtilis

Published: April 15, 2019 doi: 10.3791/59388
Automatic Translation
1, 1, *2,3, *4, *1
1Molecular Biology and Microbial Food Safety, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 2Van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 3Confocal.nl BV., 4Dept. of Molecular Biology and Biophysics, UConn Health
* These authors contributed equally

Summary

Germinant рецептор белков кластера в «germinosomes» в внутренняя мембрана спор Bacillus subtilis . Мы описываем протокол, с помощью супер резолюции микроскопии и флуоресцентных белков репортер для визуализации germinosomes. Протокол также идентифицирует споро внутренняя мембрана доменов, которые преимущественно окрашенных краской мембраны FM4-64.

Abstract

Небольшой размер спор и относительно низкой обилие всхожесть белков, вызывают трудности в их микроскопического анализа с помощью эпифлуоресцентного. Супер-резолюции трехмерной структурированного освещения микроскопии (3D-SIM) является перспективным инструментом для преодолеть этот барьер и выявить молекулярные детали процесса прорастания спор Bacillus subtilis (B. subtilis). Здесь, мы описывают использование модифицированных SIMcheck (ImageJ)-помощник 3D визуализации процесса и флуоресцентные репортер белков для SIM микроскопии спор B. subtilis germinosomes, появление всходов белков. Мы также представляем (стандарт) 3D-SIM изображений процедура FM4-64 пятнать B. subtilis споро мембран. С помощью этих процедур, мы получили непревзойденное разрешение для germinosome локализации и показать, что > 80% B. subtilis KGB80 спящие споры, полученные после заспорение на определенный минимальный средний MOPS имеют один или два Герд-GFP и GerKB-mCherry очаги. Светлые очаги были также наблюдается в FM4-64 витражные изображения 3D-SIM споры, предполагая, что внутренняя мембрана липидов домены различных текучести вероятно существуют. Дальнейшие исследования, которые используют двойной маркировки процедур с мембраной красителей и germinosome репортер белки для оценки сотрудничества локализации и таким образом получить оптимальный обзор организации Bacillus всхожесть белков в мембраны внутренние споры возможно.

Introduction

Споры по приказу Bacillales и Clostridiales метаболически неактивных и чрезвычайно устойчивы к суровым обеззараживания режимов, но если они прорастают, не может вызывать вредное воздействие на людей1. В питательных germinant срабатывает прорастания спор Bacillus subtilis (B. subtilis) инициирование событий является germinant привязку к germinant рецепторы (гр), расположенные в споро внутренняя мембрана (IM). Впоследствии гр передают сигналы на белок канала SpoVA, также расположенный в IM. Это приводит к начала обмена споро ядро пиридин-2,6-дикарбоновых кислота (dipicolinic кислота; DPA; состоит из 20% споро основной сухой wt) для воды через SpoVA канал. Впоследствии ДПВ релиз триггеров активации коры мукопептида гидролиза, а дополнительные воды следует за2,3,4. Эти события приводят к механическим воздействиям на слои пальто, его последующие разрыв, начала нарост и, наконец, вегетативного роста. Однако по-прежнему далеки от разрешаются точные детали молекулярный процесс прорастания.

Основной вопрос о прорастания спор касается биофизических свойств липидов, окружающих IM всхожесть белков, а также белки IM SpoVA канала. Это во многом неподвижной IM липидного бислоя является основным проницаемость барьером для многих маленьких молекул, включая токсичные химические консерванты, некоторые из которых оказывают их действий в споро ядро или вегетативная клетка цитоплазме5,6. IM липидный бислой, вероятно, в состоянии геля, хотя значительная часть мобильных липидов в IM5. Споро IM также имеет потенциал для значительного расширения5. Таким образом, 1,6 раза увеличивает площадь поверхности им после прорастания без дополнительных мембраны синтеза и сопровождается потерей этой мембраны характерным низкая проницаемость и липидов неподвижность5,6.

В то время как молекулярные детали активации белков всхожесть и организация им липидов в споры являются привлекательные темы для исследования, небольшой размер спор B. subtilis и относительно низкой обилие всхожесть белков, представляют собой вызов микроскопические анализы. Гриффитс et al. неопровержимые доказательства эпифлуоресцентного микроскопа, с использованием флуоресцентных репортеров, сливается с прорастания белков, свидетельствует о том, что в спор B. subtilis эшафот белка Герд организует три подразделения GR (A, B и C) для Гера, B и K гр, в кластер7. Они придумал термин «germinosome» для этого кластера всхожесть белков и назвал ~ 300 Нм большой IM белка очагов8структур. После начала прорастания спор, флуоресцентный germinosome очагов в конечном итоге превращаются в большие разогнать флуоресцентные шаблоны, с > 75% населения споро, отображение этот шаблон в споры проросшие за 1 час с L-валин8. Обратите внимание, что упомянутые выше используется бумага среднем изображения из десятков последовательных флуоресцентных изображений, чтобы получить статистическую мощность и преодолеть барьер низкой флуоресцентные сигналов во время визуализации. Это мысленное представление этих структур в бактериальных спор был на краю того, что является технически осуществимым с классической микроскопических инструменты и ни оценки количества очагов в одном spore ни была их более подробные субцеллюлярные локализации возможно с этим подходом.

Здесь мы продемонстрировать использование структурированных освещения микроскопии (SIM) для получения подробной визуализации и количественной оценки germinosome(s) в спор B. subtilis, а также их IM липидных доменов9. Протокол также содержит инструкции для заспорение, слайд подготовки и анализа изображений, SIMcheck (v1.0, плагинов imageJ) а также ImageJ10,,1112.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. б. subtillis заспорение (сроки: 7 дней до микроскопические наблюдения)

  1. 1 день
    1. Полоска бактериальной культуры на пластине (1% Триптон, экстракт дрожжей 0,5%, 1% NaCl, 1% агар) агар бульоне Лурия Бертани (LB)13 и инкубировать на ночь при 37 ° C для получения единого колоний. Используйте штамм B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry кошка, Кан Герд gfp) и его родительский фон штамм B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) как описано выше7.
      Примечание: Использование споры с ΔcotEΔgerE фон имеет важное значение в germinosome визуализации, чтобы свести к минимуму аутофлюоресценция споро пальто слои7.
    2. Простерилизуйте все средства массовой информации, трубы, пипец и другие культуры материалы для использования с соответствующими методами.
  2. День 2
    1. Прививать единую колонию в 5 мл LB средних рано утром и инкубировать и культуре при постоянном помешивании в трубу колпачок на 200 об/мин и 37 ° C пока ОД600 достигнет 0,3-0,4 (около 7 ч).
    2. Сделать 500 мл MOPS среды (рН 7,5) содержащий 3 Нм (NH4)6Пн7O24·4H2O, 0,4 мкм H3Бо3, 30 Нм CoCl2·6H2O 10 Нм CuSO4·5H2O, 10 Нм ZnSO4·7H2O, 1.32 мм K2HPO4, 0,4 мм MgCl2·6H2O, 0,276 мм K2так4, 0,01 мм FeSO4·7H2O, O22·2H CaCl 0,14 мм, 80 мм ШВАБРЫ, 4 мм Трицин, O22·2H НКД 0,1 мм, 10 мм D-глюкоза моногидрат и 10 мм NH4Cl.
    3. Подготовить в колпачок трубы 10-1- 10-7 серийных разведений LB культуры в 5 мл MOPS среднего и инкубировать культур на ночь при постоянном помешивании в 200 об/мин и 37 ° C.
      Примечание: Серийных разведений, здесь цель получить разрежения в ранней экспоненциальной фазе на следующее утро. Этот шаг и следующий шаг необходимо позволить клетки адаптироваться к MOPS буферизации роста среднего.
  3. День 3
    1. Выберите один из разведений швабры с ОД600 0,3-0,4. Прививок 0,2 мл культуры подогретым (37 ° C) 20 мл MOPS среды в конической 250 мл флакон и инкубировать при постоянном помешивании, пока ОД600 достигнет 0,3-0,4 (~ 7 h).
    2. Прививок средство на основе заспорение МОПЫ (250 мл) с предварительно культуры 1% (v/v) из шага 1.3.1 и инкубировать в течение 3 дней при 37 ° C в колбе конические литр при постоянном помешивании. FM4-64 окрашивание PS4150 споры, добавить 2 мкг/мл FM4-64 зонд (см. Таблицу материалы) до заспорение средних 1 или 2 ч после достижения пика ОП значение600 вегетативного роста (обычно около 2) и позволяют культуры Впоследствии sporulate, защищая его от света5.
  4. День 7: Заготовка споры
    1. Определите заспорение доходность (споры против растительной клетки) с помощью Фазово-контрастная микроскопия на 100 крат различать фазы яркие споры от фазы темных клеток и спор, возможно-Зрелые. Урожайность яркий спор фазы 90% ожидается.
    2. Пелле споры на 4270 x g 15 мин при 4 ° C в круглых дно пробирок. Вымойте споро гранул 2 - 3 раза с 40 мл стерильной Ультрачистые типа 1 деминерализованной воды в 50 мл конические пробирок (см. Таблицу материалы). Спин вниз на каждой стирки на 4270 x g 15 мин (4 ° C).
  5. День 7: Spore очистки
    1. Spore очистки: приостановить споро Пелле в 750 мкл среднего градиента неионогенных плотность 20% (см. таблицу материалов) и загрузить на 800 мкл 50% неионогенных плотность градиента среды в стерилизованные microcentrifuge трубы. Центрифуги для 60 мин в 21 500 x g. Полученные гранулы содержит бесплатно споры. Приостановить споро Пелле в 200 мкл 20% неионогенных плотность градиента среды и нагрузки на 1 мл 50% неионогенных плотность градиента среды в пробки microcentrifuge и центрифуги для 15 мин на 21 500 x g.
    2. Промывание окончательный споро подготовки и хранения: Полученные гранулы содержит очищенный неактивных споры. Мыть споро гранул 2 - 3 раза с 1,5 мл стерильного Ультрачистые типа 1 воды (см. Таблицу материалы) и спин вниз между ними на 9,560 x g 15 мин при 4 ° C. Наконец приостановите Пелле в стерильных ультра-чистой воде типа 1 окончательный ОД600 примерно 30. Аликвоты споры могут храниться при температуре-80 ° C для 8 недель14.

2. удаления покрытий

  1. Лечить PS4150 споры с 0,1 М NaCl/0.1 М NaOH/1% натрия Додециловый сульфат (SDS) / 0,1 М Дитиотреитол (DTT) при 70 ° C на 1 ч. вымыть споры в 10 раз с стерилизованные Ультрачистые типа 1 воды15,16. Поступая таким образом, любой адсорбированные FM4-64 зонд в spore внешней мембраны и внешние слои будут удалены.

3. Coverslip и подготовки слайд11 (времени: 1 H перед наблюдения)

  1. Предварительно чистой высокой точности coverslips (см. таблицу материалов) с HCl 1 M в слегка покачивая водяной бане 30 мин. Мыть coverslips дважды в ультра-чистой воде типа 1 и хранить их в 100% (vol/vol) EtOH. Пусть они сухие и проверить их ясности перед использованием. Предварительно очистить стекла слайды в 70% EtOH. Пусть они сухие и проверить их ясности перед использованием.

4. отбор проб флуоресцентные микросферы или споры в рамках гена слайд10 (сроки 15 мин)

  1. Предварительно теплой две 70% EtOH мыть и воздуха сушеные стеклянных скольжениях (см. таблицу материалов) на несколько секунд на Отопление блока 70 ° C, падение 65 мкл стерилизовать 2% агарозном состоявшейся в 70 ° C на вершине слайд один стакан и место на другой слайд стекла сверху для распространения b агарозы etween слайды. Патч агарозы высохнет примерно 5 мин.
  2. Нарезать 1 x 1 см раздел агарозы патч после удаления одной из стеклянных скольжениях, добавить 0.4 мкл образца (флуоресцентные микросферы или споры8~ 10/мл) и передачи, поместив coverslip на патч патч на высокой точности coverslip и сдвинув ее покинуть.
  3. Исправьте ген кадр (1.5 x 1.6 см2, 65 мкл) на сушеные слайд, на который помещается coverslip закрытия всех углах кадра, тем самым завершив слайд для использования в микроскопии.

5. Визуализация11,17(времени: 1 H)

  1. Захвата, передачи и флуоресценции изображений споры, а также смесь красного и желто зеленый карбоксилат модифицированные флуоресцентные микросфер на микроскопом структурированного освещения (см. таблицу материалов) оснащены 100 x объективных (масло Числовая апертура = 1,49), CCD камеры и изображений программное обеспечение для анализа (см. таблицу материалов). Генерировать все изображения при комнатной температуре без нарушения окружающего света. Убедитесь в том, чтобы всегда очищайте 100 x цель и слайд с 75% этанола до изображений.
  2. Сосредоточиться на 100 Нм (диаметр) флуоресцентных микросферы и оптимизировать точки распространения функция (ФСФ), регулируя коррекции кольцо на 100 x цели пока не получается симметричной ПСФ, таким образом к минимуму размытие изображения. Psf-импульсной или ответ съемочной системы точечного источника или объект point.
  3. Выберите поле зрения, с приблизительно 10 раунда флуоресцентные микросфер. Применить решетки сосредоточиться регулировки для обоих 561 Нм и 488 нм длины волны возбуждения как руководство для программного обеспечения для анализа изображения.
  4. Основное внимание споры с передачи света и передачи света образа в среднем режиме 16 × с экспозицией 200 мс для каждого изображения.
  5. Захват 3D-SIM флуоресцентных изображений raw спор с режимом освещения «3D-SIM», настройки камеры в режим индикации умножения электрона (EM) получить 10 МГц в 14-битный и получить EM в 175. Возбуждают FM4-64 зонд в PS4150 споры с 561 Нм лазерного света на 20% мощности лазера и освещение время 400 мс.
  6. Возбуждают GerKB-mCherry и Герд-ГФП в KGB80 споры с, соответственно, 561 Нм лазерного света на мощность лазера 30% для 1 s и 488 нм лазерный свет на 60% мощность лазера для 3 s. Z-стек параметры находятся в верхней к нижней режим, 0,2 мкм / шаг, 7 шагов и 20 шагов для germinosome и IM анализа, соответственно.
    Примечание: Эти параметры лазерного были применены с целью обеспечения максимальной яркости значение гистограмма около 4000.

6. Восстановление Raw изображений 3D-SIM FM4-64, окрашенных PS4150 споры

  1. Выполнение реконструкции ломтик N-SIM FM4-64, окрашенных PS4150 споры необработанных данных. Нажмите кнопку Param Реконструировать фрагмента на N-SIM площадку вкладку лист, чтобы открыть окно N-SIM срез реконструкции.
  2. Задайте параметры восстановления в окне N-SIM срез реконструкции . Чтобы получить идеальный восстановленные изображения, следовать предложение инструкции N-SIM и нажмите на соответствующие элементы управления в окне Срез реконструкции N-SIM установить Авто, высокий Контраст модуляция подсветки (IMC) Подавление шума резолюции (грн) 1.00 и Из подавления размытости фокус (OFBS) до 0,05 в качестве отправной точки.
  3. Нажмите кнопку Восстановить фрагмент в окне Срез реконструкции N-SIM для реконструкции изображения. Оцените качество восстановленных изображений путем быстрого преобразования Фурье (БПФ) изображения и реконструкции оценка, которая после реконструкции12.
  4. Отрегулируйте грн от 0,10 до 5.00 и OFBS от 0.01 до 0,50, нажав на соответствующие элементы управления в окне Срез реконструкции N-SIM пока получаются лучшие настройки параметров.
  5. Нажмите на кнопку Применить в окне Срез восстоновительные N-SIM применять измененные параметры. Нажмите кнопку Закрыть , чтобы закрыть окно.
  6. Сделайте FM4-64 PS4150 споры raw изображений активных и нажмите кнопку Восстановить фрагмент на вкладку лист N-SIM Pad выполнить Срез реконструкции. Сохраните восстановленные изображения.

7. анализ

  1. Преобразовать изображения псевдо-Widefield KGB80 germinosome
    1. Преобразование 3D-SIM raw изображений KGB80 в псевдо-Widefield изображения путем активации с левой кнопкой мыши плагинов ImageJ Утилита Необработанных данных SI SIMcheck Псевдо-Widefield12. Псевдо-Widefield среднем изображения из необработанных данных SIM и собирает, для сравнения, эквивалентен обычным widefield освещения12изображения. ImageJ сам см https://imagej.net/Welcome. Случайным образом выберите ~ 25 споры в каждом Перевернутый передачи изображения для последующего анализа germinosome в флуоресцентного изображения псевдо-Widefield.
    2. Выберите всего около 350 (в этом примере, 346) KGB80 споры в 14 полей зрения два слайда. Герд-GFP и GerKB-mCherry числа флуоресцентные очагов в отдельных KGB80 споры должны учитываться независимо друг от друга два исследователями. Исследователь может вернуться к raw изображений 3D-SIM всякий раз, когда вы сомневаетесь присутствия отдельных флуоресцентный germinosome очагов в спор.
    3. Оценка максимальной интенсивности каждого Герд-GFP и GerKB-mCherry направленность и интенсивность комплексной 3D изображения каждого KGB80 спор с ImageJ.
  2. Анализ изображения псевдо-Widefield KGB80 germinosome
    1. Используйте значение средняя интенсивность комплексной 7 стеков как интенсивность комплексной сигнала KGB80 споро. Определите интенсивность фона изображения фона штамм PS4150 с использованием одинаковых параметров. Считают флуоресцентные пятна в отдельных KGB80 спорами очагов germinosome когда они четко отличить от фона.
    2. Примените односторонний дисперсионный анализ тесты для определения значимости с программным обеспечением происхождения 9.0. Учитывая P значений < 0,05 как статистически значительным. Используйте ранга коэффициента корреляции Спирмена18 оценить соотношение числа очагов Герд-GFP и GerKB-mCherry и измерения интенсивности комплексного сигнала.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Текущий протокол представляет SIM Микроскоп изображений процедура для бактериальных спор. Процедуры подготовки заспорение и слайд были проведены, как показано на рисунке 1 до изображений. Позже, были применены процедуры обработки изображений и анализа как для dim (помечены всхожесть белки флуоресцентный белок) и яркий спор (витражи IM липофильного зонда) образцов, как показано в следующем тексте.

Локализация germinosomes в B. subtilis споры

Герд и GerKB, как сообщается, быть ~ 3500 и ~ 700 молекул в споро, соответственно, основанный на Вестерн-блот анализ экстрактов из спор, подготовленный в богатой заспорение средний19. GerKB-mCherry , так и Герд gfp генов в штамм KGB80 находятся под контролем их родной promotor. Относительное обилие синтез белков, привели к низким флуоресцентного сигнала во время визуализации, поэтому было трудно реконструировать такие тусклом изображений raw SIM SIM алгоритм реконструкции для низкой. Однако Микроскоп SIM по-прежнему применялась для захвата изображений germinosome, хотя изображений raw SIM были преобразованы в изображения псевдо-Widefield, SIMcheck (ImageJ плагин). Кроме того чтобы получить лучшее представление о этот IM фокус был реализован семь стека 3D визуализации. Как показано в левой панели Рисунок 2, два очагов Герд-GFP появился в различных стеков. , В общей сложности три Герд-GFP очагов обозначаются белые стрелки в столбце композитный Z3 стека. Правой панели Рисунок 2 показывает спор с только одной Герд-ВВП координационным центром в spore как подтверждается белой стрелкой в столбце составного Z4 стека. В общей сложности, около 40% и 50% спор имел два или один Герд-GFP и GerKB-mCherry кластер, соответственно (Таблица 1). Среди 346 споры изучены два были 4 Герд-GFP очагов, и один спор даже 5 Герд-GFP очагов. Заметно в наших руках, число очагов Герд-GFP и GerKB-mCherry в том же spore были не всегда же18. Как Микроскоп SIM не вариант контраст фазы, мы использовали передачи световой микроскопии для локализации споро. Таким образом споры появляются с ядро темная и плотная, окруженный светлого ореола.

ImageJ был измерен интенсивность комплексной флуоресценции KGB80 споры. Споры, которые были 0, 4 или 5 очагов не были включены в наш статистический анализ из-за их низкой частоты. Существует высокая положительная корреляция между Герда-GFP и GerKB-mCherry интегрированных интенсивности (коэффициент корреляции Спирмена ранга = 0,73). Хотя интенсивность комплексной белка лески Герд-GFP отличается между различными группами населения (рис. 3 c), интенсивность комплексной GerKB-mCherry был о том же в различных популяциях (рис. 3D). Максимальная флуоресценции интенсивности Герд-GFP и GerKB-mCherry очагов, как правило, уменьшается, когда спор имел несколько очагов (рис. 3а, B). Максимальная флуоресценции всех ярких пятен, рассматривается как germinosome очагов, был выше, чем максимальная auto флуоресценции PS4150 споры (споры из штамма фон KGB80; На рисунке 3A Б).

Организация внутренней мембраны

Как уже упоминалось во введении, germinosome белки расположены в споро IM. Однако известны некоторые детали о биофизических свойствах этой во многом неподвижной мембраны. Изучения больше детали, такие как IM местные организации, будет содействовать пониманию Организации IM белков, в частности ГР и источник белков. B. subtilis споры имеют структуру, включающий несколько концентрических слоев, и липофильных зондов не может легко проходить через эти несколько слоев пятно IM, окружающих ядро споро. Принятие таких зондов скорее препятствует слои богатых белком Пальто и возможно также внешней мембраны20,21. Для преодоления этой проблемы, краситель липофильных мембраны FM4-64 был добавлен к PS4150 культуре во время заспорение. Поступая таким образом, PS4150 растительных клеточной мембраны была запятнана FM4-64, и таким образом мембраны в forespores, полученные от этой культуры в асимметричной заспорение клеточного деления и последующего forespore сплошным хорошо запятнаны5. Следовательно Зрелые споро мембраны могут быть визуализированы. Предыдущие исследования указал, что большинство, если не все из FM4-64 находится в IM в очищаемой споры5. Примерно 2 недели период инкубации и процедуры очистки споро Стиральная процедур, применяемых удалить любые FM4-64 из внешней мембраны, последний эффективно удаляется после удаления покрытий лечения и обширные мытья шаги 5. Однако, удаления покрытий процедура удаляет не FM4-64 из IM, не имеет никакого влияния на germinosome очагов5,6. Что возбужденных нас, что яркие пятна FM4-64 похож на germinosome очагов появилась в обоих нетронутыми (Рисунок 4A, B) и decoated PS4150 спор спор (рис. 4 c, D). Эти яркие пятна FM4-64 могут быть вовлечены в кластеризации germinosome белков в IM.

Figure 1
Рисунок 1: обзор подготовки заспорение и слайд. Общий обзор Просмотр первоначальные шаги, требуемые до изображений. Подробная информация приведена в протоколе. (A) схема заспорение процедуры в определенной минимальной MOPS среднего. B. subtilis PS4150 (PS832 ΔГир::НПЦ ΔКот::тет) или KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry кошка, Кан Герд gfp) единой колонии был культивировали в 5 мл LB богатые среды и адаптированы в 5 мл и 20 мл швабры Средний в свою очередь и, наконец, sporulated в 250 мл среды MOPS. В ранней экспоненциальной фазе культуры (OD600, 0,3-0,4) используется в всех промежуточных культур. FM4-64 (2 мкг/мл) был добавлен в средство заспорение PS4150 для ползучих мембраны окрашивания 1 или 2 ч после достижения пикового значения ОД600 . (B) метод уборки споры из MOPS заспорение культуру и очистки споры по плотности градиентного центрифугирования. (C) процедура стабилизации споры на клавиатуре агарозы 1% в камере кадра ген. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Представитель псевдо-Widefield (PWF) 3D изображения очагов Герд-GFP и GerKB-mCherry в двух KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry кошка, Кан Герд gfp) неактивные споры 3D-SIM raw изображений были взяты с двухканальной возбуждения (561nm, мощность лазера 30%, мощность, 3 лазера 1 сек и 488nm, 60% s) с использованием 7 шагов сверху вниз Z-стеки. Впоследствии raw изображений SIM были преобразованы в 3D изображения псевдо-Widefield плагинов ImageJ SIMcheck. Слева направо, 3D изображения (Z2-Z5) Герд-GFP (зеленый) GerKB-mCherry (красный) и соответствующего составного изображения двух KGB80 споры (i и ii) отображаются на панели. Передачи (Транс) легкие образы двух споры (i и ii) указывается расположение споры, которые появляются как темные густые изображения, окруженный светлого ореола. Шкалы бар = 1 мкм и все панели находятся в том же масштабе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Максимальная флуоресценции интенсивность Герд-ГФП в KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry кошка, Кан Герд gfp) неактивные споры и максимальная auto флуоресценции интенсивность PS4150 споры в произвольных единицах. Все споры были освещены параметров указывается протокол. Панели (A) и (B) показывают интенсивность максимум флюоресценции очагов Герд-GFP и GerKB-mCherry, соответственно, в KGB80 спящие споры, а также как в обоих случаях максимальная auto флуоресценции интенсивность родительского PS4150 споры. Панели (C) и (D) показывают интенсивность комплексной флуоресценции очагов Герд-GFP и интенсивность комплексной флуоресценции очагов GerKB-mCherry, соответственно, в B. subtilis KGB80 спящие споры. Мы использовали односторонний дисперсионный анализ тесты для определения значимости различий в интенсивности максимальная координационным центром и интенсивностью флюоресценции комплексной спор с программным обеспечением происхождения 9.0 рассматривает P значений < 0,05 как значительный. Споры с 4 или 5 очагов были исключены из анализа из-за их низкой изобилия. Данные представлены в зубчатый boxplots. Пазы в участки находятся вокруг медиана значений с их ширина пропорциональна межквартильный диапазон (ИКР). Усы показано представляют максимум 1,5 икр. Звездочки показывают существенное различие медиана значений. Герд-GFP и интенсивностью флюоресценции интегрированных GerKB-mCherry есть сильная положительная корреляция (коэффициент корреляции Спирмена = 0,73)18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Представитель псевдо-Widefield (PWF) изображения (A и C) и восстановленные изображения SIM (B и D) FM4-64 окрашенных IM B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) споры. FM-464 была включена в споры во время заспорение. 3D-SIM сырые изображения нетронутыми споры (A и B) и decoated спор (C и D) были взяты с одного канала возбуждения (561 Нм лазер, мощность лазера 20%, 400 мс) с помощью 25 шаг сверху донизу Z-стека. Впоследствии, необработанные данные SIM был реконструирован, Микроскоп, изображений (см. Таблицу материалы) в 3D-SIM изображения, или преобразованы в PWF по SIMcheck (ImageJ плагин). Голубой стрелки указывают FM4-64 очагов в IM в группе B и D. Шкалы бар = 1 мкм и все панели находятся в том же масштабе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Штамм Подсчет спор Очагов Очагов в споро (%)
0 1 2 3 4 5
KGB80 346 Герд GFP 2 46 40 11 1 0
GerKB-mCherry 2 53 40 5 0 0

Таблица 1: Наличие очагов в споры KGB80. Germinosome очагов номер в споро в популяции двойной маркировкой B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB- ГердmCherry кошка -gfp Кан) неактивные споры. Флуоресценции в спор был подсчитан как germinosome очагов, когда фокус максимальная интенсивность была выше, чем auto флуоресценции интенсивности, которая была максимальная интенсивность PS4150 (PS832 ΔГир::НПЦ ΔКот::тет) Спящие спор возбуждается те же параметры освещения как KGB80 споры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Представил протокол содержит стандартный 3D-SIM процедуры для анализа FM4-64 окрашенных B. subtilis споры, включающий заспорение, подготовка слайдов и визуализации процессов. Кроме того, протокол описывает изменение SIMcheck (ImageJ)-при содействии 3D визуализации процесса для SIM микроскопии B. subtilis споро germinosomes помечены флуоресцентные журналистам. Последняя процедура позволила нам наблюдать этот тусклый каркаса с расширенной контраст. Путем соединения двух изображений процедур, можно визуализировать дискретных вложенные структуры в же spore с же SIM микроскопа, улучшая нашу основу для механистического понимания процесса прорастания. Обратите внимание, что процедура работает на латеральное разрешение ~ 100 Нм и осевой разрешение ~ 200-250 Нм. Это лучше, чем контраст дифференциальной помехи (DIC)-поля микроскопии подход, используемый Гриффит7. Время решить, что желаемый следующим шагом будет анализ germinosome внешний вид после начала прорастания. К сожалению хотя SIM микроскопии в принципе совместим с жить изображений, Дим ввиду germinosome сигналы такие время решена SIM, анализы не возможны из-за быстрое отбеливание образцов во время захвата изображений. Для того чтобы получить достаточно споры для анализа, важно, чтобы убедиться, что заспорение эффективно проходит. Поэтому исследователи должны проверить заспорение эффективности тщательно с КПД 90% в качестве целевого объекта. В результатах представительных в неактивные споры, соответственно ~ 50% и 40% всех споры имеют один или два Герд-GFP и очагов GerKB-mCherry (Таблица 1). Процент споры с двумя центрами намного выше, чем сообщенные Гриффитс ранее7. Существует несколько причин, которые могли бы объяснить различные результат в текущей работе. Во-первых 3D визуализации процесса могло бы облегчить обнаружение более очагов. Различные очаги в том же spore расположены в различных местах в вертикальном направлении, как показано на рисунке 1. Во-вторых ПЗС-камеры (Таблица материалов) и лазерной единства для Микроскоп SIM значительной для визуализации результатов. В-третьих, подобный подход Гриффитса7 средняя десятки последовательных изображений для лучшего анализа изображений, псевдо-Widefield образ germinosome был также среднее изображение из сырой SIM (5 этапов и 3 ориентации изображения). Наконец заспорение среднего и заспорение условий, важным переменным фактором в определении свойства споро, отличаются в нашей работе от используемого ранее. Соавт. Гриффитс7 используется богатый 2 x Шеффера-глюкоза (2 x SG) средний для заспорение, хотя определенные минимальные MOPS буферизации среднего работал здесь. Несколько документов показали, что заспорение среднего и условия имеют существенное влияние на состав белка, сопротивление, и прорастание B. subtilis споры22,,2324 , 25. действительно, было показано, что уровни GR субблоков 3 - 8 раз ниже в споры, полученные на бедных средних по сравнению с результатами, полученными на богатых носителе. Герд уровни были также в бедных средних споры вокруг поддирочно ниже, и эти споры заняло больше времени, чтобы начать прорастания спор26. Однако это не ясно ли заспорение условия также влияют на количество наблюдаемых germinosome очагов.

Рамирес-Перальта et al.' s результаты26 указали, что ставки питательных прорастания спор на уровне населения значительно зависят от уровня всхожести белков и Герд. Если комплексной флуоресцентные интенсивности за споры из флуоресцентных Репортеры прямо пропорциональна уровни Герд и GerKB синтез белков, уровни обоих синтез белков различаются в KGB80 спор, который согласуется с предыдущей работы 7. Этот уровень гетерогенности белка могут быть связаны с spore всхожесть неоднородность наблюдается на уровне одного спора, и число очагов germinosome может быть другим фактором, способствующим неоднородность прорастания спор. Дальнейшие эксперименты будет сосредоточена на анализ возможных последствий этого числа очагов germinosome и очагов всхожесть белка композиция (не все germinosomes могут быть равными в состав белка всхожесть) может иметь на всхожесть неоднородность. Данные привели к ряду текущих исследований вопросов, включая: i) Какова роль Герд в кластеризации гр в IM; и ii) как являются два других гр, Гера и GerB, организовал в spore IM?

Протокола, представлены для dim и яркий спор образцов позволяет визуализировать дискретных вложенные структуры в том же spore SIM микроскопии. Яркие пятна FM4-64, которые наблюдались в спор может быть вызвано большой складной IM27. Кроме того мы предполагаем, что эти районы являются районами IM, где краситель более легко может получить доступ к из-за повышенной текучести местных IM. Такие регионы увеличение текучести (Мендельсона) могут быть организованы цитоскелета актина гомолог MreB, известный за его концентрации жидкости короткие ацильные цепи липиды28,29. Заметно применяя ту же процедуру для одичал тип B. subtilis споры также приводит к аналогичной схеме ярких пятен FM4-64 (наши Неопубликованные наблюдения). В B. subtilis растительных клеток, рухнул мембранный потенциал приводит к кластеризации29MreB и Мендельсона. Внутренняя мембрана спящие споры вероятно имеет относительно низкий мембраны потенциальных20,21 и содержит поддающиеся обнаружению уровни MreB30 , которые могли бы привести к кластеризации Мендельсона в больших доменах высокой текучести29 . Ли такие домены может совпадать с наличием germinosomes в настоящее время проводится расследование.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Отсутствие конфликта интересов объявил.

Acknowledgments

Авторы благодарят Christiaan Zeelenberg за его помощь во время визуализации SIM. JW признает Совет Китая стипендии PhD стипендии и спасибо Ирен Stellingwerf за ее помощь на начальном этапе обработки изображений.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air dried glass slides Menzel Gläser 630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 L Sigma-Aldrich Z567868
Erlenmeyer flasks 250 mL Sigma-Aldrich Z723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres Invitrogen, 0.1 μm F8803
FM4-64 Thermo Fisher Scientific F34653
Histodenz nonionic density gradient medium Sigma-Aldrich D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera Andor Technology https://imagej.net/Welcome
LB Agar Sigma-Aldrich L2897
Microfuge tubes 1.5 mL Thermo Fisher Scientific 3451PK
Microscope imaging software Nikon, Japan NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water Millipore Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL Thermo Fisher Scientific 75003800
Precision Coverslips Paul Marienfeld 117650
Round Bottom tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM
Screw cap tubes 50 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
  2. Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
  3. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
  4. Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
  5. Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
  6. Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
  7. Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
  8. Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
  9. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
  10. Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
  11. Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
  12. Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
  13. Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
  14. Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
  15. Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
  16. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
  17. Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
  18. Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
  19. Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
  20. Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
  21. Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
  22. Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
  23. Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
  24. Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
  25. Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
  26. Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
  27. Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
  28. Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
  29. Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
  30. Swarge, B. N., et al. "One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).

Tags

Биоинженерии выпуск 146 грам-положительных бактерий Bacillales микроскопия микробиологии организмов бактерии аналитические диагностические и терапевтические методы и оборудование методы расследования биологических наук наук о жизни (Общие) Bacillus Споры прорастание белки Germinosomes Spore внутренняя мембрана супер резолюции микроскопии микроскопии флуоресцирования
Визуализация Germinosomes и внутренняя мембрана в спор <em>Bacillus subtilis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M.… More

Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M. M., Setlow, P., Brul, S. Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (146), e59388, doi:10.3791/59388 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter