Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

doi: 10.3791/59391 Published: June 16, 2019

Summary

وقد كان التنميط البروتيني للبروتينات التيروزين-نترات تقنية صعبة بسبب وفرة منخفضة من التعديل 3-nitrotyrosine. هنا نحن نوصف نهج جديد لإثراء nitropeptide والتنميط باستخدام أنجيوتنسين الثاني كنموذج. ويمكن توسيع هذه الطريقة لأنظمة أخرى في المختبر أو في الجسم الحي.

Abstract

المعايرة البروتينية هي واحدة من أهم التعديلات بعد الترجمة (PTM) على بقايا التيروزين ويمكن أن يسببها الإجراءات الكيميائية من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وأنواع النيتروجين التفاعلية (RNS) في الخلايا eukaryotic. تحديد دقيق لمواقع التغذية على البروتينات أمر بالغ الأهمية لفهم العمليات الفسيولوجية والمرضية المتعلقة بالنفية البروتين، مثل الالتهاب والشيخوخة والسرطان. وبما أن البروتينات النتراتية قليلة الوفرة في الخلايا حتى في ظل الظروف المستحثة، لم يتم تطوير أي أساليب عالمية وفعالة لتحديد خصائص مواقع التغذية البروتينية وتحديدها. هنا نحن وصف بروتوكول لإثراء nitropeptide باستخدام تفاعل خفض المواد الكيميائية ووضع العلامات البيوتين، تليها قياس الطيف الكتلي عالية الدقة. في طريقتنا، يمكن تحديد مشتقات نيتروبتيد بدقة عالية. أسلوبنا يعرض اثنين من المزايا مقارنة مع الأساليب التي تم الإبلاغ عنها سابقا. أولاً، يستخدم وضع العلامات ثنائي الميثيل لمنع الأمين الأساسي على nitropeptides، والتي يمكن استخدامها لتوليد نتائج كمية. وثانياً، تستخدم رابطة ثاني كبريتيد تحتوي على كاشف من NHS-البيوتين للتخصيب، ويمكن زيادة تخفيضه وألوكيلة لتعزيز إشارة الكشف على مطياف الكتلة. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على نموذج الببتيد أنجيوتنسين الثاني في الورقة الحالية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

النِيْتَرَة من بقايا التيروزين في البروتينات لتشكيل 3-nitrotyrosine ينظم العديد من العمليات البيولوجية. بسبب الخصائص الكيميائية المختلفة بين التيروزين و 3-nitrotyrosine، قد يكون البروتين النترات اضطراب نشاط إشارة1،2. لذلك، من المهم تطوير الأساليب التي يمكن أن تثري وتحدد مواقع التغذية على البروتينات بكفاءة. كما 3-nitrotyrosine هو تعديل وفرة منخفضة على البروتينات مقارنة مع أشكال أخرى من PTM، مثل الفوسفورية والاسيتيل، فإنه من الصعب تحديد مواقع النخلة الذاتية مباشرة من خطوط الخلايا أو عينات الأنسجة. ومع ذلك، تم تطوير منهجية استخدام قياس الطيف الكتلي (MS) لوصف نمط التجزؤ من nitrotpeptide (علىسبيل المثال، زان وDesiderio 3)، الذي يضع الأساس لأساليب جديدة من nitroproteomics.

حاليا، خطوة الإثراء تليها MS هي الاستراتيجية الأقوى لnitropeptide التنميط4،5. ويمكن تصنيف أساليب الإثراء إلى فئتين. ويستند فئة واحدة على الأجسام المضادة التي يمكن أن تعترف 3-nitrotyrosine على وجه التحديد، في حين أن الطبقة الأخرى تقوم على اشتقاق الكيميائية التي تقلل من مجموعة نيترو إلى مجموعة أمين4،5. للأسلوب القائم على الأجسام المضادة، يتم استخدام عمود تقارب النيتروتيروزين للتخصيب، والتي يتم من خلاله حل المادة المُشار عنها وتحليلها من خلال دقة عالية MS6،7. بالنسبة للأسلوب القائم على الاشتقاق الكيميائي، يجب حظر مجموعات الأمين في المحطة N من الببتيد أو يسين في الخطوة الأولى إما عن طريق أسيتيليشن، علامات متساوية الشبه لكمية نسبية ومطلقة (iTRAQ)، أو علامات كتلة جنبا إلى جنب (TMT) الكواشف. بعد ذلك، يتم استخدام المخفض للحد من النيتروتيروزين إلى أمينالتيوسين متبوعا بتعديل مجموعة الأمين شكلت حديثا، والتي تشمل ربط البيوتين، تحويل الببتيد الكبريتات، أو أنواع أخرى من أنظمة الوسم8،9، 10,11. وتستند معظم البروتوكولات التي أنشئت حتى الآن على البروتينات في المختبر الإفراط في النترات، بدلا من البروتينات النترات الذاتية.

في هذه الدراسة، تم تطوير إجراء معدل للاشتقاق الكيميائي من النيتروتيروزين لإثراء nitropeptide وتحديد، والذي يظهر حساسية معززة أثناء الكشف عن التصلب المتعدد ومناسبة لغرض القياس الكمي. حددت دراستنا الأخيرة التي تستخدم هذه الطريقة في النظم البيولوجية أن النفية من البروتين التيروزين كيناز (LCK) محددة اللمفاوية (LCK) في Tyr394 من قبل RNS المنتجة من الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع (MDSCs) يلعب دورا هاما في كبت المناعة من الورم microenvironment12. ولذلك، يمكن تطبيق طريقة تحديد nitropeptide لدينا على العينات البيولوجية المعقدة كذلك. هنا، ونحن نوصف بروتوكوللدينا باستخدام نموذج الببتيد أنجيوتنسين الثاني، الذي هو معروف نمط التجزؤ وتستخدم على نطاق واسع في الدراسات nitroproteomic8،9،10،11، على سبيل المثال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. نِيأيشن أنجيوتنسين الثاني

  1. لتوليد الببتيد النترات، تمييع 10 ميكرولتر من الأنجيوتنسين الثاني (DRVYIHPF) محلول الأم (2 مللي م في الماء) في 390 ميكرولتر PBS الحل (10 m NaH2PO4، 150 m NaCl، درجة الألف 7.4) في التركيز النهائي من 50 ميكرومتر.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من البيروكسينيتريت (200 مللي أمبير في 4.7٪ النوى) إلى الحل أنجيوتنسين الثاني لجعل التركيز النهائي من البيروكسينيتريت 5 mM.
    ملاحظة: Peroxynitrite غير مستقر وسهلة لحل عندما يكون في شكل حمض، لذلك يتم الاحتفاظ الحل الأم من peroxynitrite في الحل الأساسي وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  3. ضبط قيمة رقم الولل للمحلول إلى 7-8 في 1 M HCl. لبدء رد فعل النيستريون، هز الأنبوب في 400 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
  4. استخدم عمود SPE للمرحلة العكسية المتاحة تجارياً (راجع جدولالمواد) لإزالة الملح.
    1. إعداد 2 حلول لdesalting، 5٪ الميثانول في الماء للغسيل و 80٪ الميثانول في الماء للالأوتيون.
    2. إضافة 500 μL من الميثانول، تليها 500 μL من الماء إلى الشرط المسبق للعمود، وضع 1 مل pipettor مع طرف على الجزء العلوي من العمود، اضغط على pipettor لتسريع تدفق.
    3. تحميل 410 μL من العينة في الخطوة 1.3 على العمود، تجاهل التدفق من خلال.
    4. بعد الغسيل مع 500 ميكرولتر من 5٪ الميثانول، واستخدام 300 μL من 80٪ من الميثانول إلى elute nitropeptide، الذي يتم بعد ذلك تجفيفها بالكامل عن طريق سرعة-vac في الإعداد الافتراضي في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: إزالة الملحمهم جدا ً لردود الفعل، حيث أن المذيب الأيسر في الخطوة السابقة قد يكون له تأثير سلبي على الخطوات التالية.

2- ألكيلة الأمينات الأولية بواسطة وسم ثنائي الميثيل

  1. إعادة تشكيل مسحوق نيترو-أنجيوتنسين الثاني في 100 ميكرولتر من 100 مللي m ثلاثي إيثيل الأمونيوم بيكربونات (TEAB) الحل.
    ملاحظة: يجب أن تكون قيمة الرقم الpH الحل بين 7 و 9 وتأكد من عدم إضافة أمين الأساسي في الحل.
  2. أضف 4 ميكرولتر من الفورمالديهايد 4% إلى الحل، اخلطه لفترة وجيزة.
    تحذير: أبخرة الفورمالديهايد سامة; إجراء التجارب في غطاء محرك الدخان.
  3. أضف 4 ميكرولتر من 0.6 M NaBH3CN إلى الحل، هز الأنبوب في 400 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تُقَدَم ردّة فعل الوسم بإضافة 16 ميكرولتر من محلول الأمونيا 1%، وتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  5. إضافة 8 μL من حمض الفورميك لحمض الحل وتنفيذ desalting باستخدام عكس المرحلة SPE العمود كما هو موضح في الخطوة 1.4.

3. الحد من النيتروتيروزين إلى أمينيروسين

  1. إعادة تشكيل ثنائي ميثيل المسمى نيترو-أنجيوتنسين الثاني في 500 ميكرولتر من PBS (10 m NaH2PO4, 150 m M NaCl, pH 7.4).
  2. إضافة 10 ميكرولتر من 1 م ثنائي الصوديوم إلى محلول واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. بعد رد فعل التخفيض، يصبح اللون الأصفر للحل واضحًا.
    ملاحظة: وزن 174.1 ملغ ثنائي ثيونات الصوديوم وحله في الماء لجعل الحجم النهائي هو 1 مل. يمكن تخزين هذا الحل في -20 درجة مئوية لا يزيد عن أسبوع.
  3. استخدام العمود SPE المرحلة العكسية لdesalting كما هو موضح في الخطوة 1.4.

4. التخصيب الحيوي، والتخصيب، والكشف

  1. إعادة تشكيل ثنائي ميثيل المسمى الأمينية أنجيوتنسين الثاني في 500 ميكرولتر من PBS (10 m NaH2PO4, 150 m M NaCl, pH 7.4).
  2. إضافة 5 μL من 40 NM NHS-S-S-البيوتين، وتذوب في DMSO، إلى الحل، بعد 2 ح الحضانة في درجة حرارة الغرفة، واستخدام 1 μL من هيدروكسيلامين 5٪ لإرواء رد الفعل.
  3. في هذه الأثناء، توازن ستربفيدين خرز أغاروز بإضافة 500 ميكرولتر من PBS (10 mM NAH2PO150 mM NaCl، درجة الـ 7.4 درجة الألف)، ودرجة حرارة 580 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ونبذ supernatant. أداء التوازن 3 مرات.
  4. إضافة 100 μL ستربتينين خرز أجاروز إلى نظام رد الفعل، احتضان 1 ح على الهزاز الدوارة في درجة حرارة الغرفة. غسل 4 مرات مع PBS (10 m NaH2PO150 m كلوريد الصوديوم، وpH 7.4). لكل خطوة الغسيل، إضافة 500 ميكرولتر من PBS إلى الخرز، وتخلط جيدا، ثم الطرد المركزي في 580 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل supernatant.
  5. استخدام 400 μL من 10 m dithiothreitol (DTT) لحضانة مع خرز الأغاروز في 50 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، وتدور في 580 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل الخرز، إضافة 20 μL من 0.5 M idoacetamide (IAM) إلى سوبرناتان لمدة 20 دقيقة في الظلام.
    ملاحظة: DTT يستخدم لكسر السندات ثاني كبريتيد بين صلة البيوتين والببتيد، وهذا الأخير هو الافراج عن الخرز ومزيد من الألكيلة من قبل IAM.
  6. استخدام العمود SPE المرحلة العكسية لdesalting هو موضح في الخطوة 1.4.
  7. بعد حل الببتيدات الجافة في 20 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ (FA)، وإخضاع المنتج من كل قسم إلى الكروماتوغرافيا السائلة مع الطيف الكتلي جنبا إلى جنب (LC-MS / MS) تحليل.
    1. فصل الببتيدات أنج الثاني المعدلة بواسطة 60 دقيقة التدرج (0-8 دقيقة، 2 في المائة باء؛ 8-10 دقائق، 5 في المائة باء؛ 10-35 دقيقة، 18 في المائة باء؛ 35-50 دقيقة، 28 في المائة باء؛ 50-52 دقيقة، 80 في المائة باء؛ 52-58 دقيقة، 80 في المائة باء؛ 58-59 دقيقة، 2 في المائة باء؛ 59-60 دقيقة، 2 في المائة ب) بمعدل تدفق 0.300 ميكروغرام/دقيقة مع نظام نانو-HPLC الذي هو واجهة مباشرة مع مطياف كتلة عالية الدقة.
      ملاحظة: العمود التحليلي هو في 75 μm ID، 150 مم طول، معبأة مع الراتنج C-18. المرحلة المتنقلة أ تألفت من 0.1٪ حمض الفورميك، والمرحلة المتنقلة B تتكون من 100٪ الأسيتونيتريل و 0.1٪ حمض الفورميك.
    2. تشغيل مطياف الكتلة في وضع الاستحواذ المعتمد على البيانات، تعيين طيف كتلة مسح كامل واحد (300-1800 م /ض، 60 000 القرار) تليها 20 بيانات تعتمد على MS / MS بمسح في 28% تطبيع طاقة الاصطدام.
    3. بيانات الأطياف الكتلية المفتوحة وتحديد قمم المنتج في كل خطوة للتأكد من أن التفاعل الكيميائي قد تم تنفيذه بنجاح.

5. الكمية من نيتروببتيد

  1. إعداد 3 مجموعات من حلول نيترو-أنجيوتنسين الثاني من الخطوة 1.4، كل مجموعة تحتوي على 2 تركيزات من نيترو-أنجيوتنسين الثاني: تعيين #1، 20 نمول في أنبوب A و 20 نمول في أنبوب B، كل في 100 محلول الكهب ميكرون; تعيين #2، 10 نمول في أنبوب C و 20 نمول في أنبوب D، كل في 100 محلول ميكروب ميكرون؛ تعيين #3، 40 نمول في أنبوب E و 10 نمول في أنبوب F، كل في 100 محلول ميكروب ميكرون.
    ملاحظة: يتم استخدام تركيزين من نيترو-أنجيوتنسين الثاني في كل مجموعة لوضع العلامات ثنائي ميثيل، للرد مع الفورمالديهايد (الضوء) والفورمالديهايد-D2 (الثقيلة)، على التوالي.
  2. لكل مجموعة، إضافة 4 μL من 4٪ الفورمالديهايد والفورمالديهايد-D2 إلى العينة التي وصفت بأنها خفيفة وثقيلة، على التوالي. اتبع الخطوات من 2.3 إلى 2.5 لإنهاء وضع العلامات ثنائي الميثيل.
  3. اخلطي العينات الخفيفة والثقيلة.
  4. اتبع الخطوات من 3.1 إلى 4.6 للحد من التخصيب الحيوي والتخصيب والكشف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يظهر المخطط الانسيابي لتنميط النيتروببتيد في هذه المخطوطة في الشكل 1. الشكل 2و 3و 4 و 5 تظهر الأطياف الكتلية للأنجيوتنسين الثاني، نيترو-أنجيوتنسين الثاني، ثنائي ميثيل المسمى نيترو-أنجيوتنسين الثاني و ثنائي ميثيل المسمى الأمينية أنجيوتنسين الثاني، على التوالي. ويمكن أن ينعكس الوزن الجزيئي للمركب من خلال قيم م / ض ذروة أحادية النظائر في كل رقم، مما يدل على التعديل الكيميائي على أنجيوتنسين الثاني تم تحقيقه بنجاح لكل خطوة. ويبين الشكل 6 المنتج النهائي في الخطوة 4-7 المكتشفة والمتميزة بـ LC-MS/MS. ويبين الشكل 7 النتائج الكمية للنيتروببتيد بواسطة وضع العلامات على ثنائي الميثيل. تم تحديد الكميات النسبية من الضوء والثقيلة من خلال مقارنة كثافة ذروة النظائر الأحادية في كل مجموعة، مما يسمح لنا بتحديد كمية نيتروببتيدات المخصب من مجموعات مختلفة.

Figure 1
الشكل 1 . سير العمل من طريقة اشتقاق الكيميائية لإثراء والكشف عن نيترو- أنجيوتنسين الثاني. أولاً، الأنجيوتنسين الثاني هو نترات من قبل البيروكسينيتريت، بعد إزالة الملحة، ويستخدم وضع العلامات ثنائي ميثيل لمنع الأمين الأساسي على الببتيد. ثم يستخدم ثنائي ثيونات الصوديوم للحد من النيتروتيروزين إلى أمينوتيرولين, وهو رد فعل كذلك مع NHS-S-S-البيوتين. بعد إثراء الخرز الستربطي، يتم قطع الببتيد بواسطة DTT تليها الألكلة والكشف عن طريق LC-MS / MS. وقد تم تعديل هذا الرقم من12, الشكل 2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 . الطيف الشامل من أنجيوتنسين الثاني. وأظهر هذا الرقم أن ذروة النظائر الأحادية عند م/z 523.78 تطابق الببتيد المشحون (حتى) ونمط تشظية MS/MS من أنجيوتنسين الثاني (أسفل). وقد تم تعديل هذا الرقم من12, الشكل S2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 . الطيف الشامل من نيترو-أنجيوتنسين الثاني. وأظهر هذا الرقم أن ذروة النظائر الأحادية عند م/z 546.28 تطابق الببتيد المشحون (حتى) ونمط تشظية MS/MS من نيترو-أنجيوتنسين الثاني (أسفل). وقد تم تعديل هذا الرقم من12, الشكل S2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 . الطيف الشامل من ثنائي ميثيل المسمى نيترو أنجيوتنسين الثاني. وأظهر هذا الرقم أن ذروة النظائر الأحادية عند م/z 560.29 تطابق الببتيد المشحون (حتى) ونمط تشظية MS/MS من ثنائي ميثيل المسمى نيترو-أنجيوتنسين الثاني (أسفل). وقد تم تعديل هذا الرقم من12, الشكل S2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 . الطيف الشامل من ثنائي ميثيل المسمى الأمينية أنجيوتنسين الثاني. وأظهر هذا الرقم أن ذروة النظائر الأحادية في m/z 545.31 مطابقة الببتيد المشحون (حتى) ونمط تجزئة MS/MS من ثنائي ميثيل المسمى الأمينية أنجيوتنسين الثاني (أسفل). وقد تم تعديل هذا الرقم من12, الشكل S2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 . الطيف الشامل للمنتج النهائي. وأظهر هذا الرقم أن ذروة النظائر الأحادية عند 617.82 متر/z تطابق الببتيد المشحون (حتى) ونمط تجزئة MS/MS للمنتج النهائي (الوسط) وطيف التكبير من 400 إلى 1000 م/ض أظهرت نمط تجزئة أكثر تفصيلاً (أسفل) . وقد تم تعديل هذا الرقم من12, الشكل S2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7 . الأطياف كتلة نتائج التكميم من nitropeptides بواسطة وضع العلامات ثنائي الميثيل. نسب الضوء إلى الثقيلة هي 1:1 (حتى)، 1:2 (الوسط) و 4:1 (أسفل)، على التوالي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يصف البروتوكول هنا ال [نيتروببتيد] إغناء وتوصيف. باستخدام أنجيوتنسين الثاني كما الببتيد نموذج, أوضحنا الإجراء المبين في الشكل 1. بعد الحصول على نيترو-أنجيوتنسين الثاني، ينبغي أن يتم حظر الأمين الأساسي على الببتيد لتجنب مزيد من اقتران الأمين، والتي هي واحدة من الخطوات الأكثر أهمية داخل البروتوكول. وفي البروتوكول الحالي، تستخدم وسم ثنائي الميثيل لمنع الأمينات الأولية لسببين: أولا، أنه يتيح الحصول على نتائج كمية؛ وأولا، يمكن أن يكون هناك نقص في المقاييس. ثانيا، تكلفة رد الفعل هذا أقل من رد فعل يستند إلى NHS وكفاءة حجب عالية13. بالنسبة للتقدير الكمي، تكون النسب الخفيفة المقاسة إلىالثقيلة قريبة جداً من النسب المتوقعة (الشكل 7)، ويتم حساب الأخطاء بأقل من 10%.

خطوة حاسمة أخرى من البروتوكول هو الحد من 3-nitrotyrosine على ثنائي ميثيل المسمى الببتيد إلى أمينوتيرولسين عن طريق ثنائي ثيونات الصوديوم, الذي يتفاعل بسرعة وكفاءة. كما أن مجموعة الأمين التي تم توليدها حديثاً تحمل علامات إضافية على 4-5 طيات زائدة من NHS-S-S-biotin. ومن شأن أقل أو أكثر من NHS-S-S-biotin أن يؤدي إلى رد فعل غير كامل لوضع العلامات أو إلى إثراء غير كامل، على التوالي. DTT يمكن كسر تماما السندات ثاني كبريتيد والإفراج عن الببتيد المخصب من الخرز الستربتين، والتي هي ألكيلات من قبل IAM وتحليلها من قبل LC-MS / MS.

هذا البروتوكول هو مناسبة لتحديد وقياس nitropeptides في كل من النظام البيوكيميائي والمواد البيولوجية مثل الخلايا أو الأنسجة. منذ التخصيب البيوتين والألكلة IAM يمكن أن تعزز بشكل كبير حساسية, ونيتروببتيدات وفيرة منخفضة تصبح قابلة للكشف عن طريق التصلب المتعدد. على سبيل المثال، استخدمنا هذا البروتوكول لملف nitropeptides الذاتية من الخلايا T التسلل معزولة من البروستاتا المورين ونماذج سرطان الرئة12. حددنا نيترو-Tyr294 من LCK البروتين وأجريت دراسات وظيفية لإظهار أن هذا التعديل قد تلعب دورا حاسما في عملية كبت المناعة بواسطة MDSCs12.

تطبيق تقنيتنا محدود من قبل عاملين: أولاً، وفرة منخفضة من nitropeptides في الخلايا والأنسجة تملي أنه يمكن تحديد عدد قليل من nitropeptides; ثانياً، حساسية الكشف المنخفضة المتأصلة في التصلب المتعدد مقارنة بالمنهجيات شديدة الحساسية مثل الجينات أحادية الخلية والتسلسل المستنسخ. ونحن نتصور أن تطبيق هذا البروتوكول على الحالات المرضية الأخرى سوف تساعد على تحديد المزيد من البروتين النيتريشن PTMs مع وظائف غير معترف بها سابقا في تطور المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل من قبل جمعية السرطان الأمريكية منحة البحوث المؤسسية IRG-14-195-01 (M. شارون المكدس هو المحقق الرئيسي; X.L. هو محقق المتلقي الفرعي). وقد أمكن هذا المنشور بدعم جزئي من عدد المنح KL2 TR002530 وUL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) من المعاهد الوطنية للصحة، المركز الوطني للنهوض بالعلوم الترجمة، وجائزة العلوم السريرية والترجمة. X. L. هو الحائز على جائزة إنديانا CTSI KL2 المحقق الشباب. S. F. ويدعم هاثر مؤسسة السرطان النهوض المنح الأساسية للسرطان. يدعم البرنامج العام للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 817773047) س. دبليو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acclaim pepmap 100 C18 column Thermo-Fisher 164534
1 M TEAB solution Sigma-Aldrich T7408
50% hydroxylamine Thermo-Fisher 90115
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2 Toronto Research Chemicals F691353
formic acid Sigma-Aldrich 695076 ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
isoacetamide Sigma-Aldrich I1149
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
NHS-S-S-bition Thermo-Fisher 21441
Oasis HLB column (10 mg) Waters 186000383
peroxynitrite Merck-Millipore 516620
sodium cyanoborohydrite Sigma-Aldrich 42077 PhamaGrade
sodium dithionate Sigma-Aldrich 157953 Technical Grade
Streptavidin Sepharose GE Healcare GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC Thermo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
  2. Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
  3. Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
  4. Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
  5. Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
  6. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
  8. Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
  9. Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
  10. Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. Chapter 14, Unit 14.13 (2012).
  11. Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
  12. Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
  13. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).
توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, S., Wen, X., Lu, X. Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II. J. Vis. Exp. (148), e59391, doi:10.3791/59391 (2019).More

Feng, S., Wen, X., Lu, X. Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II. J. Vis. Exp. (148), e59391, doi:10.3791/59391 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter