Summary
Протеомное профилирование тирозиновых белков было сложной техникой из-за низкого обилия 3-нитротирозиновой модификации. Здесь мы описываем новый подход к обогащению нитропептида и профилированию с помощью Angiotensin II в качестве модели. Этот метод может быть расширен для других систем in vitro или in vivo.
Abstract
Нитрирование белка является одним из наиболее важных посттрансляционных модификаций (ПТМ) на тирозиновых остатках и может быть вызвано химическими действиями реактивных видов кислорода (ROS) и реактивных видов азота (RNS) в эукариотических клетках. Точное выявление участков нитации на белках имеет решающее значение для понимания физиологических и патологических процессов, связанных с нитрационной этилации белка, таких как воспаление, старение и рак. Поскольку нитовые белки имеют низкое изобилие в клетках даже в индуцированных условиях, не были разработаны универсальные и эффективные методы для профилирования и идентификации участков нитрационации белка. Здесь мы описываем протокол для обогащения нитропептида с помощью реакции химического сокращения и биотина маркировки, а затем высокого разрешения масс-спектрометрии. В нашем методе производные нитропептида можно отождествлять с высокой точностью. Наш метод обладает двумя преимуществами по сравнению с ранее заявленными методами. Во-первых, диметиловая маркировка используется для блокирования первичного амина на нитропептидах, которые могут быть использованы для получения количественных результатов. Во-вторых, для обогащения используется дисульфидная связь, содержащая реагент NHS-biotin, которая может быть дополнительно уменьшена и аклинила для усиления сигнала обнаружения на масс-спектрометре. Этот протокол был успешно применен к модели пептида Angiotensin II в текущем документе.
Introduction
Нитирование остатков тирозина в белках для формирования 3-нитротирозин регулирует многие биологические процессы. Из-за различных химических свойств между тирозином и 3-нитротирозин, нитарный белок может иметь возмущенный сигнальной активности1,2. Поэтому важно разработать методы, которые могут обогащать и идентифицировать места нитроации на белках эффективно. Как 3-нитротирозин является низким изменением изобилия на белки по сравнению с другими формами ПТМ, таких как фосфорилирование и ацетилирование, это сложно определить эндогенных нитрационных участков непосредственно из клеточных линий или образцов тканей. Тем не менее, была разработана методология использования масс-спектрометрии (МС) для характеристики фрагментации нитропептида (например, «Чжан энд Десидерио 3»), которая закладывает основу для новых методов нитропротеомики.
В настоящее время, шаг по обогащению следуют MS является наиболее мощной стратегией для нитропептида профилирования4,5. Методы обогащения можно разделить на два класса. Один класс основан на антителах, которые могут распознавать 3-нитротирозин в частности, в то время как другой класс основан на химической производной, что снижает нитро группы амин группы4,5. Для антител на основе метода, нитротирозин сродство колонка используется для обогащения, из которого eluted материал далее решается и анализируется с высоким разрешением MS6,7. Для химического метода, основанного на производной, группы амина в N-терминах пептида или лизин должен быть заблокирован в первом шаге либо ацетилированием, изобариатом теги для относительной и абсолютной количественной оценки (iTRA)), или тандемных масс-тегов (TMT) реагентов. Далее, редуктор используется для уменьшения нитротирозин аминотирозин с последующим изменением вновь сформированной группы амина, которая включает в себя перевязку биотина, сульфидрявшее пептид преобразования, или другие типы систем пометки8,9, 10,11. Большинство установленных до сих пор протоколов основаны на сверхнитированных белках in vitro, а не на эндогенно нитированных белках.
В настоящем исследовании разработана модифицированная процедура химического произввода нитротирозина для обогащения и идентификации нитропептида, которая показывает повышенную чувствительность при обнаружении рассеянного склероза и подходит для целей количественной оценки. Наше недавнее исследование, используюемое этот метод в биологических системах, показало, что нитрация лимфоцитов специфического белка тирозина киназы (LCK) на Tyr394 RNS, произведенная из миелоидных супрессоров (MDSCs), играет важную роль в иммуносупрессии опухолевой микросреды12. Поэтому наш метод идентификации нитропептида может быть применен и к сложным биологическим образцам. Здесь мы описываем наш протокол с помощью модели пептида Angiotensin II, из которых фрагментация картина известна и широко используется в нитропротеомических исследований8,9,10,11, в качестве примера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Нитация Ангиотензина II
- Для генерации нитированного пептида разбавьте 10 зл ангиотензина II (DRVYIHPF) в растворе 390 МЛ PBS (10 мм НаГ2PO4, 150 мМ NaCl, pH 7.4) при окончательной концентрации 50 мкм.
- Добавьте 10 зЛ пероксинитрита (200 мм в 4,7% NaOH) в раствор Ангиотензин II, чтобы сделать окончательную концентрацию пероксинитита 5 мМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пероксинитрит нестабилен и легко решить, когда он находится в кислотной форме, поэтому родительский раствор пероксинитрита хранится в базовом растворе и хранится в -80 градусов по Цельсию. - Отрегулируйте значение pH раствора до 7-8 на 1 М HCl. Чтобы инициировать реакцию нитрации, встряхните трубку при 400 об/мин в течение 5 минут.
- Для опреснения опреснения используйте коммерчески доступный столбец обратной фазы SPE (см. таблицуматериалов).
- Подготовьте 2 раствора для опреснения, 5% метанола в воде для мытья и 80% метанола в воде для elution.
- Добавьте 500 л метанола, а затем 500 л воды, чтобы предварительно состояние колонки, положить 1 мл пипетки с кончиком на верхней части колонки, нажмите пипетки для ускорения потока.
- Загрузите 410 л образца в шаге 1.3 на столбец, отбросьте поток через.
- После мытья с 500 л 5% метанола, используйте 300 л 80% метанола, чтобы утолить нитропетид, который затем полностью высушивается путем скоростного вакуума в настройке по умолчанию при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дезалостирование очень важно для реакций, так как растворитель, оставленный на предыдущем этапе, может оказать негативное влияние на следующие шаги.
2. Алкилирование первичных аминов с помощью диметиловой маркировки
- Восстановите порошкообразный нитро-ангиотензин II в 100 л из 100 мм триэтиламмония бикарбоната (TEAB).
ПРИМЕЧАНИЕ: значение pH раствора должно быть между 7 и 9, и убедитесь, что нет первичного амин добавляется в раствор. - Добавьте в раствор 4 qL 4% формальдегида, кратко перемешайте.
ВНИМАНИЕ: Паров формальдегида являются токсичными; выполнять эксперименты в дымовой капюшон. - Добавьте в раствор 4 qL 0,6 M NaBH3CN, встряхните трубку при 400 об/мин при температуре в комнате.
- Утолить реакцию маркировки, добавив 16 л 1% раствора аммиака, инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавьте 8 qL фомической кислоты, чтобы подкисить раствор и выполнить опреснение с помощью обратной фазы SPE столбец, как описано в шаге 1.4.
3. Снижение нитротирозина до аминотирозина
- Восстановите диметил с маркировкой нитро-ангиотензин II в 500 л PBS (10 мМ2PO4,150 мм NaCl, рН 7.4).
- Добавьте в раствор 10 зл 1 М дитионата натрия и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч. После реакции сокращения желтый цвет раствора становится ясным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Взвесьте 174,1 мг натрия dithionate и растворить его в воде, чтобы сделать окончательный объем 1 мл. Это решение может храниться при -20 градусов не более чем на неделю. - Используйте столбец обратной фазы SPE для опреснения, как описано в шаге 1.4.
4. Биотинилагация, обогащение и обнаружение
- Восстановите диметил с маркировкой амино Ангиотензин II в 500 л PBS (10 мМ2PO4,150 мм NaCl, рН 7.4).
- Добавьте 5 зЛ из 40 нМ NHS-S-S-biotin, растворенный в DMSO, к раствору, после 2 ч инкубации при комнатной температуре, используйте 1 кЛ 5% гидроксиламин для утоления реакции.
- В то же время, эквилибристого стрептавидина агарозных бусинок, добавляя 500 мл PBS (10 мм2PO4, 150 мМ NaCl, рН 7.4), центрифугирование на 580 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и отбрасывая супернатан. Выполните равновесие 3 раза.
- Добавьте в систему реакции 100 зЛ стрептавидин агарозные бусы, инкубацию 1 ч на роторный шейкер при комнатной температуре. Вымойте 4 раза с PBS (10 мм2PO4, 150 мм NaCl, рН 7,4). Для каждого шага мытья, добавить 500 л PBS в бисер, хорошо перемешать, затем центрифугу на 580 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и отказаться от супернатанта.
- Используйте 400 мМ дитиотрийтол (DTT) для инкубации с агарозными бусинами при температуре 50 градусов по Цельсию в течение 45 минут, вращайтесь при 580 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и отбрасывайте бусы, добавляйте 20 л idoacetamide (IAM) к супернатану в течение 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: DTT используется для разрыва дисульфидной связи между связью биотина и пептида, последний освобождается от бисера и далее алкилируется IAM. - Используйте столбец обратной фазы SPE для опреснения, показанного в шаге 1.4.
- После разрешения сухих пептидов в 20 ЗЛ 0,1% formic acid (FA), подвергните продукт каждого раздела жидкой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) анализа.
- Разделите модифицированные пептиды Ang II на 60 мин градиентного выращения (0-8 мин, 2% В; 8-10 мин, 5% B; 10-35 мин, 18% B; 35-50 мин, 28% B; 50-52 мин, 80% B; 52-58 мин, 80% B; 58-59 мин, 2% B; 59-60 мин, 2% B) при скорости потока 0,30 л/мин с нано-ПЛК системой, которая непосредственно взаимосвязаны с масс-спектрометром высокого разрешения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аналитическая колонка находится в 75 мкм ID, 150 мм длиной, упакованы с C-18 мизины. Мобильная фаза А состояла из 0,1% для мической кислоты, а мобильная фаза B состояла из 100% ацетонитрила и 0,1% для мической кислоты. - Управляйте масс-спектрометром в режиме передачи данных, установите единый спектр полного сканирования массы (300-1800 м/з, разрешение 60 000), а затем 20 зависимых от данных MS/MS-сканирования при 28% нормализованной энергии столкновения.
- Откройте данные масс-спектров и определить пики продукта на каждом этапе, чтобы подтвердить химическую реакцию, успешно выполненной.
- Разделите модифицированные пептиды Ang II на 60 мин градиентного выращения (0-8 мин, 2% В; 8-10 мин, 5% B; 10-35 мин, 18% B; 35-50 мин, 28% B; 50-52 мин, 80% B; 52-58 мин, 80% B; 58-59 мин, 2% B; 59-60 мин, 2% B) при скорости потока 0,30 л/мин с нано-ПЛК системой, которая непосредственно взаимосвязаны с масс-спектрометром высокого разрешения.
5. Количественная оценка нитропетида
- Подготовьте 3 комплекта растворов нитро-ангиотензина II со ступени 1,4, каждый из которых содержит 2 концентрации нитро-ангиотензина II: установить #1, 20 нмоль в трубке А и 20 нмоль в трубке В, каждый в 100 йл растворе TEAB; Установите #2, 10 нмоль в трубке C и 20 нмоль в трубке D, каждый в 100 л растворе TEAB; Установите #3, 40 нмоль в трубке E и 10 нмоль в трубке F, каждый в 100 л РАСТВОР TEAB.
Примечание: Две концентрации нитро-ангиотензина II в каждом наборе используются для маркировки диметил, чтобы реагировать с формальдегидом (легкий) и формальдегидом-D2 (тяжелый), соответственно. - Для каждого набора добавьте 4 злиадизм 4% формальдегида и формальдегида-D2 в образец, который будет помечен как легкий и тяжелый, соответственно. Выполните шаги 2.3 до 2.5, чтобы закончить диметиловую маркировку.
- Смешайте легкие и тяжелые маркированные образцы.
- Выполните шаги от 3,1 до 4,6 для сокращения, биотиниляции, обогащения и обнаружения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Диаграмма потока для нитропептида профилирования в этой рукописи показана на рисунке 1. Нарисунке 2, 3, 4 и 5 показаны масс-спектры Ангиотензина II, нитро-ангиотензина II, диметила с маркировкой нитро-ангиотензин II и диметил помечены амино Ангиотензин II, соответственно. Молекулярный вес соединения может быть отражен значениями м/з моноизотопного пика в каждой фигуре, что свидетельствует об успешной химической модификации на Ангиотензине II. На рисунке 6 показан конечный продукт в шаге 4.7 обнаружен и характеризуется LC-MS/MS. Рисунок 7 показывает количественные результаты нитропетида с помощью диметиловой маркировки. Относительное количество легких и тяжелых определялось сравнением интенсивности моноизотопного пика в каждой группе, что позволяет нам количественно обогащать обогащенные нитропептиды из разных групп.
Рисунок 1 . Рабочий процесс метода химического произвостации для обогащения и обнаружения нитро-ангиотензина II. Во-первых, Ангиотензин II придирается пероксинитритом, после опреснения, диметилмаркировка используется для блокирования первичного амина на пептид. Затем дитионат натрия используется для уменьшения нитротирозина до аминотирозина, который далее реагирует с NHS-S-S-биотин. После обогащения стрептавидин бисером, пептид режется DTT следуют алкилирования и обнаружены LC-MS/MS. Эта цифра была изменена с12, Рисунок 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 . Массовый спектр Ангиотензин II. Эта цифра показала, что моноизотопный пик на м/з 523,78 соответствует заряженным пептидом (вверх) и модели фрагментации MS/MS Ангиотензина II (внизу). Эта цифра была изменена с12, Рисунок S2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 . Массовый спектр нитро-ангиотензина II. Эта цифра показала, что моноизотопный пик на м/з 546,28 соответствует заряженным пептидом (вверх) и модели фрагментации MS/MS нитро-ангиотензина II (внизу). Эта цифра была изменена с12, Рисунок S2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 . Массовый спектр диметила помечен нитро-ангиотензин ОМС II. Эта цифра показала, что моноизотопный пик на м/з 560.29 соответствует заряженным пептидом (вверх) и модели фрагментации MS/MS диметила с пометкой нитро-ангиотензин II (внизу). Эта цифра была изменена с12, Рисунок S2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 . Массовый спектр диметила помечен амино Ангиотензин II. Эта цифра показала, что моноизотопный пик на м/з 545,31 соответствует заряженным пептидом (вверх) и модели фрагментации MS/MS диметила с маркировкой амино Ангиотензин II (внизу). Эта цифра была изменена с12, Рисунок S2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 . Массовый спектр конечного продукта. Эта цифра показала, что моноизотопный пик на м/з 617,82 соответствовал заряженным пептидом (вверх) и модели фрагментации MS/MS конечного продукта (средний) и спектру масштабирования от 400 до 1000 м/з, выставленным более детальным шаблоном фрагментации (внизу) . Эта цифра была изменена с12, Рисунок S2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7 . Масс-спектры квантификации результатов нитропептидов с помощью диметиловой маркировки. Соотношение света и тяжелых: 1:1 (вверх), 1:2 (средний) и 4:1 (внизу), соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В протоколе описано обогащение нитропептида и профилирование. Используя Angiotensin II в качестве модели пептида, мы проиллюстрировали процедуру, показанную на рисунке 1. После получения нитро-ангиотензина II, первичный амин на пептид должен быть заблокирован, чтобы избежать дальнейшего спряжения амина, который является одним из наиболее важных шагов в рамках протокола. В текущем протоколе диметиловая маркировка используется для блокирования первичных аминов по двум причинам: во-первых, она позволяет получить количественные результаты; во-вторых, стоимость этой реакции ниже, чем NHS основе реакции и блокирование эффективность высока13. Для количественной оценки измеренные соотношения света и тяжелых очень близки к ожидаемым соотношениям(рисунок7), ошибки рассчитаны менее чем на 10%.
Еще одним важным шагом протокола является уменьшение 3-нитротирозин на диметил помечены пептид аминотирозин на тритрина дитионат, который реагирует быстро и эффективно. Вновь сгенерированные группы амина дополнительно помечены с 4-5 раз превышение NHS-S-S-биотин. Меньше или больше NHS-S-S-биотина приведет к неполной реакции маркировки или неполное обогащение, соответственно. DTT может полностью разорвать дисульфидную связь и выпустить обогащенный пептид из стрептавидиновых бусин, которые алкилируются IAM и анализируются LC-MS/MS.
Этот протокол подходит для выявления и количественной оценки нитропептидов как в биохимической системе, так и в биологических материалах, таких как клетки или ткани. Так как обогащение биотином и алкилирование IAM может значительно повысить чувствительность, скромные обильные нитропептиды становятся обнаруживаемыми MS. Например, мы использовали этот протокол для профиля эндогенных нитропептидов изолированных инфильтрации Т-клеток из мочеполовой и легкой карциномы моделей12. Мы определили нитро-Tyr294 белка LCK и провели функциональные исследования, чтобы показать, что эта модификация может играть важную роль в процессе иммуносупрессии MDSCs12.
Применение нашей техники ограничено двумя факторами: во-первых, низкое изобилие нитропептидов в клетках и тканях диктует, что несколько нитропептидов могут быть идентифицированы; во-вторых, присущая низкая чувствительность обнаружения MS по сравнению с высокочувствительными методологиями, такими как геномное геномическое и транскриптомическое секвенирование. Мы предусматриваем, что применение этого протокола к другим патологическим состояниям поможет определить больше птрации белка с ранее непризнанными функциями в прогрессировании заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Американского онкологического общества институциональных исследований Грант IRG-14-195-01 (М. Шэрон Стек является главным исследователем; X.L. является следователем-субполучателем). Эта публикация стала возможной при частичной поддержке Грант номеров KL2 TR002530 и UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) от Национальных институтов здравоохранения, Национальный центр по продвижению трансляционных наук, клинических и трансляционных наук премии. X. L. является получателем Индиана CTSI KL2 Молодой следователь премии. S. F. поддерживается Фондом Уолтера Рака Продвижение основных грантов рака. X. W. поддерживается Национальным фондом естественных наук Общей программы Китая (Грант No 817773047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
- Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
- Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
- Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
- Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
- Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
- Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
- Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 14, Unit 14.13 (2012).
- Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
- Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).
