Summary
由于三硝基酪氨酸修饰的丰度较低,酪氨酸硝酸蛋白的蛋白组谱分析一直是一项具有挑战性的技术。在这里,我们描述了一种利用血管紧张蛋白II作为模型来增强和分析硝基肽扩脂的新方法。此方法可以扩展到其他体外或体内系统。
Abstract
蛋白质硝化是酪氨酸残留物最重要的转化后修饰(PTM)之一,可由真核细胞中活性氧种(ROS)和活性氮(RNS)的化学作用诱导。精确识别蛋白质上的硝化位点对于了解与蛋白质硝化(如炎症、老化和癌症)相关的生理和病理过程至关重要。由于硝酸盐蛋白即使在诱导条件下细胞中的丰度较低,因此没有开发用于分析和识别蛋白质硝化位点的普遍有效方法。在这里,我们描述了使用化学还原反应和生物锡标记,然后是高分辨率质谱法的硝基肽富集方案。在我们的方法中,硝基肽衍生物可以高精度地识别。与之前报告的方法相比,我们的方法具有两个优点。首先,二甲基标记用于阻断硝基肽上的主要胺,可用于生成定量结果。其次,使用含有NHS生物锡试剂的二硫化物键进行浓缩,进一步减少和烷基化,以增强质谱仪上的检测信号。该协议已成功应用于本论文中的肽血管紧张剂II模型。
Introduction
蛋白质中酪氨酸残留物的硝化形成3-硝基酪氨酸调节许多生物过程。由于酪氨酸和3-硝基酪氨酸之间的化学性质不同,硝酸盐蛋白可能具有扰动信号活性1,2。因此,开发能够有效地丰富和识别蛋白质上的硝化位点的方法非常重要。与其他形式的PTM(如磷酸化和乙酰化)相比,3-硝基酪氨酸对蛋白质的丰度修饰是一种低丰度修饰,因此直接从细胞系或组织样本中识别内源性硝化位点是具有挑战性的。然而,使用质谱法(MS)来描述硝基肽的破碎模式的方法已经开发出来(例如,Zhan & Desiderio 3),为硝基蛋白质组学的新方法奠定了基础。
目前,MS之后的扩充步骤是硝基肽分析4,5的最强大策略。浓缩方法可以分为两类。一类基于抗体,可以具体识别3-硝基酪氨酸,而另一类是基于化学衍生,减少硝基组胺组4,5。对于基于抗体的方法,硝基酪氨酸亲基柱用于浓缩,从中,洗脱物质通过高分辨率MS6,7进一步解毒和分析。对于基于化学衍生的方法,肽或赖氨酸的N-终点处的胺组应通过乙酰化、相对和绝对定量(iTRAQ)的异物标记或串联质量标记(TMT)试剂在第一步中阻断。接下来,一个减少剂用于减少亚硝基酪氨酸到氨基酪氨酸,然后修改新形成的胺组,其中包括生物素结扎,磺二醇肽转化,或其他类型的标记系统8,9, 10,11.迄今建立的大多数协议都基于体外过度硝酸盐蛋白,而不是内生硝酸盐蛋白。
本研究针对硝基肽的富集和鉴定,开发了硝基酪氨酸化学衍生的改良程序,表明在MS检测过程中灵敏度增强,适合定量。我们最近在生物系统中采用这种方法的研究表明,由骨髓衍生抑制细胞(MDSc)产生的RNS在Tyr394的Tyr394中,淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)的硝化在肿瘤微环境的免疫抑制12。因此,我们的硝基肽鉴定方法也可以应用于复杂的生物样品。在这里,我们使用肽血管紧张症II模型来描述我们的协议,其中分裂模式在硝基蛋白酶研究8、9、10、11中为已知和广泛使用。
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Protocol
1. 血管紧张辛II的硝化
- 要产生硝酸盐肽,在390 μL PBS溶液(10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4) 中稀释10 μL的血管紧张素II(DRVYIHPF)的母溶液(水中2 mM),最终浓度为50μM。
- 在血管紧张素II溶液中加入10μL的过氧硝酸盐(4.7%NaOH中的200 mM),使过氧硝酸盐的最终浓度达到5 mM。
注:过氧硝酸盐在酸形式下不稳定且易于分解,因此过氧硝酸盐的父溶液保存在基本溶液中,并储存在-80°C中。 - 将溶液的pH值调整为7-8乘1M HCl。要启动硝化反应,在 400 rpm 转速下摇动管 5 分钟。
- 使用市售的反向相位 SPE 列(参见材料表)进行脱盐。
- 准备2种脱盐溶液,5%的甲醇用于洗涤,80%甲醇在水中进行洗脱。
- 加入500μL甲醇,再加500μL的水来预置柱子,将1mL移管器与尖端放在柱子顶部,按移管器加速流量。
- 在柱上加载步骤 1.3 中样品的 410 μL,丢弃流过。
- 使用 500 μL 的 5% 甲醇洗涤后,使用 300 μL 的 80% 甲醇来洗去硝化肽,然后在室温下在默认设置下通过速度真空完全干燥。
注: 脱盐对反应非常重要,因为上一步留下的溶剂可能对下一步产生负面影响。
2. 通过二甲基标记对原胺进行Alky化
- 在100 mM三乙酰胺碳酸氢盐(TEAB)溶液中重组粉末状硝基血管紧张素II。
注: 溶液的pH值应介于7和9之间,并确保溶液中未添加原胺。 - 在溶液中加入4μL4%甲醛,短暂混合。
注意:甲醛蒸气是有毒的;在烟罩里做实验。 - 在溶液中加入 4 μL 的 0.6 M NaBH3CN,在室温下以 400 rpm 的转速摇动管 1 小时。
- 加入16μL的1%氨溶液,在室温下孵育5分钟,淬火标签反应。
- 加入8μL的甲酸使溶液酸化,并使用反向相位SPE柱进行脱盐,如步骤1.4所述。
3. 减少亚硝基酪氨酸对氨基酪氨酸
- 在PBS的500μL(10mM NaH2PO 4,150 mM NaCl,pH 7.4)中重组二甲基标记硝基血管紧张素II。
- 在溶液中加入10μL的1M二硫磷酸钠,并在室温下孵育1小时。还原反应后,溶液的黄色变得清晰。
注:重量为174.1毫克二硫磷酸钠并将其溶解在水中,使最终体积为1 mL。此解决方案可储存在-20°C不超过一周。 - 使用反向相位 SPE 列进行脱盐,如步骤 1.4 中所述。
4. 生物异化、浓缩和检测
- 在PBS的500μL(10mM NaH2PO 4,150 mMNaCl,pH 7.4)中重组二甲基标记的氨基血管紧张素II。
- 将5μL的40 nM NHS-S-S-生物锡(溶解在DMSO中)加入溶液中,在室温下孵育2小时后,使用1μL的5%羟基胺来淬火反应。
- 同时,通过加入500 μL的PBS(10mM NaH2PO 4,150 mM NaCl,pH 7.4),在580 x g室温下离心5分钟,并丢弃上清液,平衡链球蛋白胶合一。执行平衡 3 次。
- 将100μL链球菌增生珠添加到反应系统中,在室温下在旋转摇床上孵育1小时。用 PBS 洗涤 4 次(10 mM NaH2PO4,150 mM NaCl,pH 7.4)。对于每个洗涤步骤,向珠子中加入 500 μL 的 PBS,混合均匀,然后在室温下以 580 x g离心 5 分钟,然后丢弃上清液。
- 使用400 μL的10mM二硫酰胺(DTT)在50°C下孵育阿甘草珠45分钟,在室温下以580 x g旋转5分钟,并丢弃珠子,在黑暗中向上微体中加入20 μL的0.5M二乙酰胺(IAM)。
注:DTT用于打破生物蛋白和肽之间的二硫化物键,后者从珠子中释放,并通过IAM进一步烷基化。 - 使用反向相位 SPE 列进行步骤 1.4 中显示的脱盐。
- 在20μL0.1%的甲酸(FA)中解出干肽后,通过串联质谱(LC-MS/MS)分析,对每个部分的产物进行液相色谱分析。
- 用60分钟梯度洗脱(0-8分钟, 2% B;8-10分钟,5%B;10-35分钟,18%B;35-50分钟,28%B;50-52分钟,80%B;52-58分钟,80%B;58-59分钟,2%B;59-60分钟,2%B),流量为0.300μl/min,其中纳米-HPLC系统与高分辨率质谱仪直接接口。
注:分析柱为75 μm ID,150毫米长,装有C-18树脂。移动阶段A包括0.1%的甲酸,移动阶段B包括100%乙酰乙酸和0.1%的甲酸。 - 在数据依赖采集模式下操作质谱仪,设置单个全扫描质量频谱(300-1800 m/z,60 000 分辨率),然后以 28% 的标准化碰撞能量进行 20 次数据相关 MS/MS 扫描。
- 打开质谱数据,识别产品在每一步骤中的峰值,以确认化学反应已成功执行。
- 用60分钟梯度洗脱(0-8分钟, 2% B;8-10分钟,5%B;10-35分钟,18%B;35-50分钟,28%B;50-52分钟,80%B;52-58分钟,80%B;58-59分钟,2%B;59-60分钟,2%B),流量为0.300μl/min,其中纳米-HPLC系统与高分辨率质谱仪直接接口。
5. 硝肽定量
- 从步骤1.4制备3组硝基血管紧张蛋白II溶液,每组含有2浓度的硝基血管紧张剂II:#1组,管A中20nmol,B管20nmol,每组100μl TEAB溶液;设置#2,10 nmol在管C和20 nmol在管D,每个在100μlTEAB溶液;设置#3,40 nmol 在管 E 和 10 nmol 在管 F,每个在 100 μl TEAB 溶液中。
注:每组中硝基血管紧张辛II的两种浓度分别用于二甲基标签,分别与甲醛(轻)和甲醛-D2(重)发生反应。 - 每组甲醛和甲醛-D2分别加入4μL4%甲醛和甲醛-D2,分别标记为轻重。按照步骤 2.3 到 2.5 完成二甲基标记。
- 混合轻和重标记的样品。
- 按照 3.1 到 4.6 的步骤进行还原、生物异化、浓缩和检测。
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Representative Results
本手稿中硝基肽分析的流程图如图1所示。图2、3、4和5分别显示了血管紧张素II、硝基血管紧张素II、二甲基标记硝基血管紧张素II和二甲基标记氨基血管紧张素II的质量光谱。 该化合物的分子量可以通过每个图中单同位素峰的m/z值来反映,表明每一步都成功地实现了对血管紧张辛II的化学修饰。图6显示了步骤4.7中检测到并具有LC-MS/MS特征的最终产物。图7显示了二甲基标记的硝基肽定量结果。轻重的相对量是通过比较每组单同位素峰的强度来确定的,这使我们能够量化不同组富集的硝肽。
图 1.用于丰富和检测硝基血管紧张物II的化学衍生方法的工作流程。首先,血管紧张素II由过氧硝酸盐硝酸盐,脱盐后,二甲基标记用于阻断肽上的主要胺。然后,二硫磷酸钠用于减少亚硝基酪氨酸对氨基酪氨酸,这是进一步反应与NHS-S-S-生物锡。在通过链球蛋白珠浓缩后,通过DTT切割肽,然后进行烷基化,由LC-MS/MS检测。此图已由12,图2修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.血管紧张辛II的质量谱。该图显示,m/z 523.78的单同位素峰值与双核带带肽(上)和血管紧张氨酸II(下图)MS/MS/MS碎片模式匹配。这个数字已由图S2修改为12。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.硝基血管紧张辛II的质量谱。该图显示,m/z 546.28的单同位素峰值与二氧化苯计肽(上)和硝基血管紧张(下图)的MS/MS/MS碎片模式相匹配。这个数字已由图S2修改为12。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.二甲基标记硝基血管紧张辛II的质量谱。该图显示,m/z 560.29的单同位素峰值与二甲基标记硝基血管紧张(下图)的二甲基标记的二甲苯(下)的二甲苯带电肽(上)和MS/MS碎片模式匹配。这个数字已由图S2修改为12。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5.二甲基标记氨基血管紧张辛II的质量谱。该图显示,m/z 545.31 的单同位素峰值与二甲基标记的氨基血管紧张氨酸 II(下图)的二甲苯带电肽(上)和MS/MS/MS碎片模式匹配。这个数字已由图S2修改为12。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6.最终产品的质量谱。该图显示,m/z 617.82 的单同位素峰值与二元带带肽(上)匹配,最终产品(中)的 MS/MS 碎片模式和 400 到 1000 m/z 的放大频谱显示更详细的碎片模式(下图).这个数字已由图S2修改为12。请点击此处查看此图的较大版本。
图 7.二甲基标记硝基肽定量结果的质量光谱。轻重比分别为1:1(上升)、1:2(中)和4:1(下)。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
此处的协议描述了硝肽富集和分析。使用血管紧张蛋白II作为模型肽,我们说明了如图1所示的过程。获得硝基血管紧张蛋白II后,肽上的主要胺应被阻断,以避免进一步的胺结合,这是协议中最关键的步骤之一。在目前的协议中,二甲基标记用于阻断原胺有两个原因:第一,它允许获得定量结果;第二,它允许获得定量结果;其次,这种反应的成本低于NHS为基础的反应,阻塞效率高13。对于定量,测得的轻重比非常接近预期比率(图7),误差计算小于10%。
该协议的另一个关键步骤是通过二甲苯甲酸钠将二甲苯标记肽上的3-硝基酪氨酸还原为氨基酪氨酸,后者反应快速而有效。新生成的胺组进一步标有超过NHS-S-S-生物锡4-5倍的标记。少于或更多的NHS-S-S-生物锡将分别导致不完全的标签反应或不完全富集。DTT可以完全打破二硫化物键,从链球菌珠中释放富集肽,这些肽由IAM烷基化,LC-MS/MS分析。
该协议适用于识别和量化生化系统和生物材料(如细胞或组织)中的硝基肽。由于生物锡富集和IAM烷基化可以显著提高灵敏度,低丰度硝肽变得可被MS检测到。例如,我们使用该协议来分析从鼠前列腺和肺癌模型12中分离的渗入T细胞的内源性硝肽。我们鉴定了蛋白质LCK的硝基Tyr294,并进行了功能研究,表明这种修饰在MDSCs12的免疫抑制过程可能起着关键作用。
我们技术的应用受到两个因素的限制:第一,细胞和组织中硝基肽的丰度低,导致硝基肽的识别量很少;其次,与单细胞基因组和转录组测序等高灵敏度方法相比,MS固有的检测灵敏度较低。我们预计,该协议应用于其他病理条件将有助于定义更多的蛋白质硝化PTM与以前未识别的功能在疾病进展。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国癌症协会机构研究赠款IRG-14-195-01的支持(M.SharonStack是首席研究员;X.L. 是子接收者调查员)。该出版物是在国家卫生研究院、国家促进转化科学中心、临床和转化科学奖授予编号 KL2 TR002530 和 UL1 TR002529(A. Shekhar, PI) 的部分支持下制作的。X. L. 是印第安纳州 CTSI KL2 青年调查员奖的获得者。S.F.由沃尔瑟癌症基金会支持,该基金会推进基本癌症基金。X.W.由中国国家自然科学基金总体计划(授权号817773047)支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
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