Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Published: June 16, 2019 doi: 10.3791/59391
Automatic Translation
1,2, 3, 2,4,5,6
1Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 2Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 3Department of Urology, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, 4Boler-Parseghian Center for Rare and Neglected Diseases, University of Notre Dame, 5Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame, 6Tumor Microenvironment and Metastasis Program, Indiana University Melvin and Bren Simon Cancer Center

Summary

פרופיל פרוטאומומית של טירולך-nitrated חלבונים כבר טכניקה מאתגרת בשל השפע הנמוך של שינוי 3-ניטרוטירולי. כאן אנו מתארים גישה מקורית להעשרה וליצירת פרופילים של ניטרוגליצרין באמצעות אנגיוטנסין II כמודל. שיטה זו ניתנת להארכה עבור אחרים בתחום החוץ הגופית או במערכות vivo .

Abstract

ניטרציה חלבון היא אחת השינויים החשובים ביותר פוסט-translational (ptm) על שאריות טירוזין וזה יכול להיגרם על ידי פעולות כימיות של מינים חמצן תגובתי (ROS) ו מינים חנקן תגובתי (rns) בתאי איקריוטית. זיהוי מדויק של אתרי ניטרציה על חלבונים הוא חיוני להבנת התהליכים הפיזיולוגיים והפתולוגיים הקשורים לניטרציה חלבונים, כגון דלקת, הזדקנות וסרטן. מאז החלבונים הנידורגים הינם בעלי שפע נמוך בתאים, אפילו בתנאים המושרה, לא פותחו שיטות אוניברסליות ויעילות ליצירת פרופיל וזיהוי של אתרי חלבון נימזון. כאן אנו מתארים פרוטוקול להעשרה ניטרוניות באמצעות תגובת הפחתת כימית ותיוג ביוטין, ואחריו ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה. בשיטה שלנו, נגזרות של ניטרופפטיד יכול להיות מזוהה עם דיוק גבוה. השיטה שלנו מציגה שני יתרונות בהשוואה לשיטות שדווחו קודם לכן. ראשית, תיוג diמתיל משמש כדי לחסום את האמין העיקרי על ניטרופפטידים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ליצור תוצאות כמותיים. שנית, קשר דיגואני המכיל את הגידול של מדיקל-ביוטין משמש להעשרה, שיכול להיות מופחת עוד יותר ואלשני כדי לשפר את אות הזיהוי על ספקטרומטר מסה. פרוטוקול זה הוחל בהצלחה על מודל הפפטיד אנגיוטנסין II בעיתון הנוכחי.

Introduction

ניטרציה של שאריות טירולי בחלבונים לטופס 3-ניטרוטירולך מסדיר תהליכים ביולוגיים רבים. בשל התכונות הכימיות השונות בין טירולי ו 3-ניטרוטירולך, חלבון nitrated דורג יכול להיות מודאג הפעילות איתות1,2. לכן, חשוב לפתח שיטות שיכולות להעשיר ולזהות אתרי ניטרציה על חלבונים ביעילות. כמו 3-ניטרוטירולך הוא שינוי שפע נמוך על חלבונים לעומת צורות אחרות של PTM, כגון זרחון ו מרחרחון, זה מאתגר לזהות אתרי נימזון אנדוגני ישירות מקווי התא או דגימות רקמות. עם זאת, המתודולוגיה של שימוש בספקטרומטר מסה (MS) כדי לאפיין את דפוס הפיצול של הנירוטפפטיד פותחה (למשל, Zhan &שלושה), אשר מטילה את הבסיס עבור שיטות חדשות של ניטרונים.

כיום, צעד העשרה ולאחריו MS היא האסטרטגיה החזקה ביותר ליצירת פרופיל באמצעות ניטרופפטיד4,5. ניתן לסווג את שיטות ההעשרה לשתי כיתות. מחלקה אחת מבוססת על נוגדנים שיכולים לזהות 3-ניטרוטירולי במיוחד, בעוד המחלקה האחרת מבוססת על הנגזרת הכימית שמפחית קבוצת ניטרו לקבוצת אמין4,5. עבור השיטה המבוססת על נוגדן, העמודה זיקה של ניטרוטירולך משמשת להעשרה, שממנה החומר החומק נפתר ונותח ברזולוציה גבוהה MS6,7. עבור השיטה המבוססת על נגזרת כימית, הקבוצות של האמין במסוף N-הטרמינוס של הפפטיד או ליזין צריכות להיות חסומות בשלב הראשון על-ידי מרחרחון, תגי איזואוריים לקוונטים יחסיים ומוחלטים (iTRAQ), או משני תגי המסה (מציון). בשלב הבא, כמפחית משמש כדי להקטין את הניטרוטירולטירואל ואחריו שינוי קבוצת האמין החדשה שהוקמה, הכוללת המרה של ביוטין ליזיט, המרת פפטיד sulphydryl, או סוגים אחרים של מערכות תיוג8,9, 10,11. רוב הפרוטוקולים שהוקמו עד כה מבוססים על חלבונים מחוץ למבחנה, במקום חלבונים שאינם מדורגים באופן שורש.

במחקר הנוכחי, הליך שונה של הנגזרת הכימית של ניטרוטירולך מפותח עבור העשרה ניטרוגליצרין וזיהוי, אשר מראה רגישות מוגברת במהלך זיהוי MS והוא מתאים למטרת כימות. המחקר האחרון שלנו העסקת שיטה זו במערכות ביולוגיות זיהה כי ניטרציה של חלבון מסוים לימפוציטים טירולך קינאז (lck) ב Tyr394 על ידי rns המיוצרים מתאי מדכא מיאלואידית נגזר (MDSCs) ממלא תפקיד חשוב ב דיכוי חיסוני של מיקרואקולוגיה של הגידול12. לכן, השיטה שלנו לזיהוי ניטרופפטיד יכולה להיות מוחלת גם על דגימות ביולוגיות מורכבות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו על ידי שימוש במודל מודל אנגיוטנסין II, אשר דפוס הפיצול ידועה בשימוש נרחב ב ניטרואומומית לימודי8,9,10,11, כדוגמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ניטרציה של אנגיוטנסין II

  1. כדי ליצור פפטיד מדורגים, לדלל 10 μL של אנגיוטנסין II (DRVYIHPF) הפתרון ההורה (2 מ"מ במים) ב 390 μL PBS פתרון (10 מ"מ בלבד2פו4, 150 מ"מ הנאל, pH 7.4) בריכוז הסופי של 50 μm.
  2. הוסף 10 μL של הפראוקסיניטריט (200 מ"מ ב4.7% NaOH) לפתרון השני של אנגיוטנסין II כדי לבצע את הריכוז הסופי של הפראוקסיניטריט 5 מ"מ.
    הערה: פראוקסיניטריט הוא לא יציב וקל לפתור כאשר הוא בצורת חומצה, כך פתרון ההורה של הפראוקסיניטריט נשמר בפתרון בסיסי ומאוחסן ב-80 ° c.
  3. להתאים את ערך ה-pH של הפתרון כדי 7-8 על ידי הHCl 1 M. כדי ליזום את תגובת הניטרציה, טלטל את הצינור ב 400 סל ד למשך 5 דקות.
  4. השתמש בעמודת SPE מסחרית זמינה בשלב הפוך (ראה טבלת חומרים) עבור התפלה.
    1. הכן 2 פתרונות עבור התפלה, 5% מתנול במים לכביסה 80% מתנול במים עבור הימנעות.
    2. הוסף 500 μL של מתנול, ואחריו 500 μL של מים למצב מראש את העמודה, לשים 1 הצינורות mL עם הקצה על החלק העליון של הטור, לחצו על הצינורות כדי להאיץ את הזרימה.
    3. טעינת 410 μL של המדגם בשלב 1.3 בעמודה, למחוק את הזרימה.
    4. לאחר כביסה עם 500 μL של 5% מתנול, השתמש 300 μL של 80% מתנול כדי elute הניטרוגליצרין, אשר לאחר מכן מיובש באופן מלא על ידי מהירות vac בהגדרת ברירת המחדל בטמפרטורת החדר.
      הערה: התפלה חשוב מאוד עבור התגובות, מאז הממס השמאלי בשלב הקודם עשוי להיות השפעה שלילית על השלבים הבאים.

2. אלקיללציה של האמרינות הראשיות על ידי תיוג דימתיל

  1. מהווים מחדש את אבקת ניטרו-אנגיוטנסין II ב 100 μL של 100 mM triethylammonium ביקרבונט (TEAB) פתרון.
    הערה: ערך ה-pH של הפתרון צריך להיות בין 7 ל -9, ולוודא שלא מוסיפים מאמין ראשי בפתרון.
  2. הוסף 4 μL של 4% פורמלדהיד לפתרון, לערבב בקצרה.
    התראה: אדים פורמלדהיד רעילים; בצע את הניסויים בתוך מכסה המנוע.
  3. הוסף 4 μL של 0.6 M NaBH3CN לפתרון, לנער את הצינור ב 400 סל ד עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
  4. כיבוי תגובת תיוג על ידי הוספת 16 μL של 1% אמוניה פתרון, דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
  5. הוסף 8 μl של חומצה פורמית כדי לacidify את הפתרון ולבצע התפלה באמצעות הפוך בשלב היפוך SPE כמתואר בשלב 1.4.

3. צמצום הניטרוגליצרין לעמינח

  1. מרכיבים מחדש את הדימתיל המסומן ניטרו-אנגיוטנסין II ב 500 μL של PBS (10 מ"מ בלבד2PO4, 150 מ"מ הנאל, pH 7.4).
  2. הוסף 10 μL של 1 M נתרן dithionate לפתרון ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 h. לאחר התגובה הפחתת, הצבע הצהוב של הפתרון הופך ברור.
    הערה: שוקל 174.1 מ"ג נתרן dithionate ולפזר אותו במים כדי להפוך את הנפח הסופי הוא 1 mL. ניתן לאחסן פתרון זה ב-20 ° c לא יותר משבוע.
  3. השתמש בעמודת ה-SPE של השלב ההפוך עבור התפלה כמתואר בשלב 1.4.

4. ביוטילציה, העשרה וגילוי

  1. מרכיבים מחדש את הדימתיל מתויג האמינו אנגיוטנסין II ב 500 μL של PBS (10 מ"מ בלבד2PO4, 150 מ"מ הנאל, pH 7.4).
  2. הוסף 5 μL של 40 nM-S-s-biotin, הומס ב DMSO, לפתרון, אחרי 2 h דגירה בטמפרטורת החדר, השתמש 1 μL של 5% הידרוקסילטין כדי להרוות את התגובה.
  3. בינתיים, מחרוזת streptavidin agarose חרוזים על ידי הוספת 500 μL של PBS (10 מ"מ מילימטר2PO4, 150 מ"מ הנאל, pH 7.4), תפרידו ב 580 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ומחיקת supernatant. בצע את הequiציה 3 פעמים.
  4. הוסף 100 μL streptavidin agarose חרוזים אל מערכת התגובה, הדגירה 1 h על שייקר רוטרי בטמפרטורת החדר. שטוף 4 פעמים עם PBS (10 מ"מ בלבד2PO4, 150 מ"מ הנאל, pH 7.4). עבור כל צעד כביסה, להוסיף 500 μL של PBS אל החרוזים, לערבב היטב, אז צנטריפוגה ב 580 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהיפטר supernatant.
  5. השתמש ב-400 μL של 10 מ"מ dithio, (DTT) כדי לסקול את החרוזים ב-50 ° c עבור 45 דקות, ספין למטה ב-580 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את החרוזים, להוסיף 20 μl של 0.5 M האירחאמיד (יאם) על supernatant עבור 20 דקות בחשיכה
    הערה: dtt משמש כדי לשבור את הקשר הדיגופרתי בין הקישור של ביוטין ו פפטיד, האחרון משוחרר מחרוזים ועוד האלח על ידי יאם.
  6. השתמש בעמודת SPE של שלב הפוך עבור התפלה המוצגת בשלב 1.4.
  7. לאחר פתרון פפטידים יבשים ב 20 μl של 0.1% החומצה פורמית (הפא), הנושא את המוצר של כל קטע לתוך כרומטוגרפיה נוזלית עם טנדם המסה (LC-ms/MS) ניתוח.
    1. להפריד את הפפטידים אנג II שונה על ידי הימנעות 60 דקות הדרגתי (0-8 דקות, 2% ב; 8-10 דקות, 5% b; 10-35 דקות, 18% b; 35-50 דקות, 28% b; 50-52 min, 80% b; 52-58 min, 80% b; 58-59 min, 2% b; 59-60 דקות, 2% b) בקצב זרימה 0.300 μl/min עם מערכת ננו-מערכות ה מתמודד ישירות עם ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה.
      הערה: הטור האנליטי הוא 75 יקרומטר ID, 150 מ"מ אורך, גדוש עם שרף C-18. השלב הנייד A מורכב 0.1% פורמית חומצה, ו השלב הנייד B כללה 100% acetonitrile ו 0.1% פורמית חומצה.
    2. הפעל את ספקטרומטר המסה במצב רכישה תלוי-נתונים, קבע ספקטרום מלא של סריקה מלאה (300-1800 m/z, 60 000 רזולוציה) ואחריו 20 מערכת ההפעלה של MS/MS תלויי נתונים ב -28% אנרגיית התנגשות מנורמלת.
    3. פתח נתונים ספקטרום מסה ולזהות את הפסגות של המוצר בכל שלב כדי לאשר את התגובה הכימית בוצעה בהצלחה.

5. קוונפיקציה של ניטרוגליצרין

  1. הכן 3 סטים של פתרונות ניטרו-Angiotensin II משלב 1.4, כל ערכה המכילה 2 ריכוזים של ניטרו-אנגיוטנסין II: להגדיר1, 20 nmol ב צינור A ו 20 nmol ב צינור B, כל אחד 100 μl TEAB פתרון; הגדר2, 10 nmol ב צינור C ו 20 nmol בצינור D, כל אחד ב100 μl TEAB פתרון; Set3, 40 nmol ב צינור E ו 10 nmol ב צינור F, כל אחד 100 μl TEAB פתרון.
    הערה: שני הריכוזים של ניטרו-Angiotensin II בכל ערכה משמשים עבור תיוג diמתיל, כדי להגיב עם פורמלדהיד (אור) ו-פורמלדהיד-D2 (כבד), בהתאמה.
  2. עבור כל ערכה, להוסיף 4 μL של 4% פורמלדהיד ו-פורמלדהיד-D2 למדגם להיות מתויג כמו אור וכבד, בהתאמה. בצע את השלבים 2.3 כדי 2.5 כדי לסיים תיוג diמתיל.
  3. ערבב את הדגימות האור והתוויות הכבדות.
  4. בצע את השלבים מ 3.1 עד 4.6 עבור הפחתת, biotinylation, העשרה, ואיתור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תרשים הזרימה ליצירת פרופיל ניטרוגליצרין בכתב יד זה מוצג באיור 1. איור 2, 3, 4 ו- 5 מציגים את הספקטרום ההמוני של אנגיוטנסין ii, ניטרו-אנגיוטנסין Ii, דימתיל-אנגיוטסין ii ו דימתיל, המסומנים בשני אנגיוטנסין, בהתאמה. המשקל המולקולרי של התרכובת יכול להיות משתקף על ידי ערכי m/z של הפסגה מונו-איזוטופ בכל דמות, המציינת את השינוי הכימי של אנגיוטנסין II הושג בהצלחה עבור כל שלב. איור 6 מציג את המוצר הסופי בשלב 4.7 שזוהו ומאופיינים ב-LC-MS/Ms. איור 7 מראה את התוצאות הכמותי של הניטרופפטיד על ידי תיוג diמתיל. הכמויות היחסיות של האור והכבד נקבעו בהשוואה לעוצמת השיא של מונו-איזוטופ בכל קבוצה, המאפשרת לנו לכמת את הניטרוגליצרין המועשרת מקבוצות שונות.

Figure 1
איור 1 . זרימת העבודה של שיטת הנגזרת הכימית להעשרת וזיהוי ניטרו-אנגיוטנסין II. ראשית, אנגיוטנסין II הוא מדורג על ידי הפראוקסינטריט, לאחר התפלה, תיוג דימתיל משמש כדי לחסום את האמין העיקרי על פפטיד. לאחר מכן נתרן dithionate משמש כדי להקטין את הניטרוטירולה לעמינח, שעוד הגיב עם האחים-ים-ביוטין. לאחר מועשר על ידי חרוזי streptavidin, פפטיד הוא נחתך על ידי DTT ואחריו האללציה זוהה על ידי LC-MS/MS. איור זה שונה מ-12, איור 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 . הספקטרום ההמוני של אנגיוטנסין II. איור זה הראה כי הפסגה מונו-איזוטופ ב-m/z 523.78 התאימו את הפפטיד טעונה (למעלה) ואת דפוס MS/MS הפיצול של Angiotensin II (למטה). דמות זו שונתה מ12, איור S2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 . הספקטרום ההמוני של ניטרו-אנגיוטנסין II. נתון זה הראה כי הפסגה מונו-איזוטופ ב-m/z 546.28 התאימו את הפפטיד טעונה (למעלה) ואת תבנית הפיצול MS/MS של ניטרו-Angiotensin II (למטה). דמות זו שונתה מ12, איור S2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 . הספקטרום ההמוני של דימתיל, המסומן באמצעות ניטרו-אנגיוטנסין II. נתון זה הראה כי הפסגה מונו-איזוטופ ב-m/z 560.29 התאימו את הפפטיד טעונה (למעלה) ואת דפוס ms/ms הפיצול של diמתיל התווית ניטרו-Angiotensin II (למטה). דמות זו שונתה מ12, איור S2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 . הספקטרום ההמוני של דימתיל, המסומן בידי האמינו אנגיוטנסין II. נתון זה הראה כי הפסגה מונו-איזוטופ ב-m/z 545.31 התאימו את הפפטיד טעונה (למעלה) ואת דפוס MS/MS הפיצול של diמתיל התווית של השני אנגיוטנסין II (למטה). דמות זו שונתה מ12, איור S2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6 . . הספקטרום ההמוני של המוצר הסופי נתון זה הראה כי הפסגה מונו-איזוטופ ב-m/z 617.82 התאימו את הפפטיד טעונה (למעלה) ואת תבנית הפיצול MS/MS של המוצר הסופי (אמצע) ואת הספקטרום זום מ 400 ל 1000 m/z הציגו דפוס פיצול מפורט יותר (למטה) . דמות זו שונתה מ12, איור S2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7 . ספקטרום המסה של תוצאות הקוונפיקציה של הניטרוגליצרין על ידי תיוג דימתיל. האור ליחס כבד הם 1:1 (למעלה), 1:2 (באמצע) ו 4:1 (למטה), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול מתאר את ההעשרה. והפרופיל של הניטרוגליצרין השימוש באנגיוטנסין II כפפטיד מודל, אנו מומחש את ההליך המוצג באיור 1. לאחר קבלת ניטרו-Angiotensin II, האמין העיקרי על פפטיד צריך להיות חסום כדי למנוע את הקוניוגאמין נוסף, שהוא אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול. בפרוטוקול הנוכחי, תיוג דימתיל משמש לחסימת האמרינות העיקריות משתי סיבות: הראשונה, היא מאפשרת רכישת תוצאות כמותיים; שנית, העלות עבור תגובה זו נמוכה יותר מאשר התגובה מבוססת, היעילות החוסמת הוא גבוה13. עבור כימות הכמת, האור הנמדד ליחס הכבד קרוב מאוד ליחס הצפוי (איור 7), השגיאות מחושבות פחות מ-10%.

צעד קריטי נוסף של הפרוטוקול הוא הפחתה של 3-ניטרוטירולה על הפפטיד התווית של דימתיל, על ידי נתרן dithionate, אשר מגיב במהירות וביעילות. קבוצת האמין שנוצר לאחרונה הוא מתויג נוספת עם 4-5 קפלי עודף של האחים-S-s-biotin. פחות או יותר מנות-ים-ביוטין יובילו לתגובת תיוג לא מלאה או להעשרה לא מלאה, בהתאמה. Dtt יכול לשבור באופן מלא את הקשר קשר דיסולפידי ולשחרר את הפפטיד מועשר מ streptavidin חרוזים, אשר הם האלדינן על ידי יאם וניתח על ידי LC-ms/MS.

פרוטוקול זה מתאים לזיהוי ולכימות ניטרוגליצרין הן במערכת הביוכימית והן בחומרים ביולוגיים כגון תאים או רקמות. מאז העשרה ביוטין ו-יאם האלקיללציה יכול לשפר באופן משמעותי את הרגישות, את הפפטידים בשפע ניטרוגליצרין להיות לזיהוי על ידי MS. למשל, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי פרופילים אנדודוגני ניטרופפטידים של מבודד תאים T מתוך הערמונית מורקין מודלים קרצינומה של הריאות12. זיהינו-Tyr294 ניטרו של חלבון LCK וביצעו מחקרים פונקציונליים כדי להראות כי שינוי זה עשוי לשחק תפקיד קריטי בתהליך של דיכוי חיסוני על ידי MDSCs12.

היישום של הטכניקה שלנו מוגבל על ידי שני גורמים: הראשון, השפע הנמוך של ניטרוגליצרין בתאים ורקמות מכתיב כי מעטים ניטרונים ניתן לזהות; שנית, את הרגישות הטבועה בזיהוי נמוך של MS לעומת מתודולוגיות רגישות מאוד כגון גנומית תא יחיד ורצף טרנססקריפט. אנו מאשרים כי היישום של פרוטוקול זה לתנאים פתולוגיים אחרים יסייע להגדיר החלבון הניקצבה יותר לפטין עם פונקציות לא מזוהות בעבר התקדמות המחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי האגודה האמריקנית לחקר הסרטן מוסדיים IRG-14-195-01 (מ. שרון מחסנית הוא חוקר ראשי; X.L. הוא חוקר נמענים משנה). פרסום זה התאפשר עם תמיכה חלקית מתוך גרנט מספרים KL2 TR002530 ו UL1 TR002529 (א. שחאר, PI) מן המכונים הלאומיים לבריאות, המרכז הלאומי לקידום מדעי העבר, פרס קליני וטרנסלטיל מדעים. X L. הוא המקבל של אינדיאנה KL2 החוקר הצעיר פרס. ס. פ. נתמך על ידי וולטר סרטן הקרן קידום מענקים בסיסיים בסרטן. X. W. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין התוכנית הכללית (גרנט No. 817773047).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acclaim pepmap 100 C18 column Thermo-Fisher 164534
1 M TEAB solution Sigma-Aldrich T7408
50% hydroxylamine Thermo-Fisher 90115
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2 Toronto Research Chemicals F691353
formic acid Sigma-Aldrich 695076 ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
isoacetamide Sigma-Aldrich I1149
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
NHS-S-S-bition Thermo-Fisher 21441
Oasis HLB column (10 mg) Waters 186000383
peroxynitrite Merck-Millipore 516620
sodium cyanoborohydrite Sigma-Aldrich 42077 PhamaGrade
sodium dithionate Sigma-Aldrich 157953 Technical Grade
Streptavidin Sepharose GE Healcare GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC Thermo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
  2. Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
  3. Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
  4. Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
  5. Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
  6. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
  8. Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
  9. Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
  10. Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 14, Unit 14.13 (2012).
  11. Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
  12. Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
  13. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).

Tags

ביוכימיה סוגיה 148 ניטרופפטיד אנגיוטנסין II ניטרוטירוצין תיוג דימתיל נתרן dithionate ביוטין תיוג העשרה
ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, S., Wen, X., Lu, X.… More

Feng, S., Wen, X., Lu, X. Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II. J. Vis. Exp. (148), e59391, doi:10.3791/59391 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter