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Biochemistry

Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

doi: 10.3791/59391 Published: June 16, 2019

Summary

Die proteomische Profilierung von Tyrosin-Nitrat-Proteinen war aufgrund der geringen Häufigkeit der 3-Nitrotytyrosin-Modifikation eine anspruchsvolle Technik. Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz für die Nitropeptidanreicherung und Profilierung unter Verwendung von Angiotensin II als Modell. Diese Methode kann für andere In-vitro- oder In-vivo-Systeme erweitert werden.

Abstract

Proteinnitration ist eine der wichtigsten post-translationalen Modifikationen (PTM) an Tyrosinrückständen und kann durch chemische Aktionen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktiven Stickstoffarten (RNS) in eukaryotischen Zellen induziert werden. Die genaue Identifizierung von Nitrationsstellen auf Proteinen ist entscheidend für das Verständnis der physiologischen und pathologischen Prozesse im Zusammenhang mit Proteinnitration, wie Entzündungen, Alterung und Krebs. Da die nitratierten Proteine auch unter induzierten Bedingungen in Zellen von geringer Fülle sind, wurden keine universellen und effizienten Methoden zur Profilierung und Identifizierung von Proteinnitrationsstellen entwickelt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Nitropeptidanreicherung mit einer chemischen Reduktionsreaktion und Biotin-Etikettierung, gefolgt von hochauflösender Massenspektrometrie. In unserer Methode können Nitropeptidderivate mit hoher Genauigkeit identifiziert werden. Unsere Methode weist zwei Vorteile gegenüber den zuvor gemeldeten Methoden auf. Erstens wird die Dimethylkennzeichnung verwendet, um das primäre Amin auf Nitropeptiden zu blockieren, die verwendet werden können, um quantitative Ergebnisse zu generieren. Zweitens wird zur Anreicherung eine Disulfidbindung verwendet, die NHS-Biotin-Reagenz enthält, die weiter reduziert und alkyliert werden kann, um das Detektionssignal auf einem Massenspektrometer zu verbessern. Dieses Protokoll wurde im aktuellen Papier erfolgreich auf das Modellpeptid Angiotensin II angewendet.

Introduction

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Die Nitration von Tyrosinrückständen in Proteinen zu 3-Nitrotyrosin reguliert viele biologische Prozesse. Aufgrund der unterschiedlichen chemischen Eigenschaften zwischen Tyrosin und 3-Nitrotyrosin kann ein nitratiertes Protein die Signalwirkung1,2gestört haben. Daher ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, die Nitrationsstellen auf Proteinen effizient anreichern und identifizieren können. Da 3-Nitrotyrosin eine geringe Häufigkeitsmodifikation auf Proteine im Vergleich zu anderen Formen von PTM, wie Phosphorylierung und Acetylierung, ist es schwierig, endogene Nitrationsstellen direkt aus Zelllinien oder Gewebeproben zu identifizieren. Dennoch wurde die Methode der Verwendung von Massenspektrometrie (MS) entwickelt, um das Fragmentierungsmuster von Nitrotpeptid zu charakterisieren (z. B. Zhan & Desiderio3), die den Grundstein für neue Methoden der Nitroproteomik legt.

Derzeit ist ein Anreicherungsschritt gefolgt von MS die stärkste Strategie für Nitropeptid Profilierung4,5. Die Anreicherungsmethoden können in zwei Klassen eingeteilt werden. Eine Klasse basiert auf Antikörpern, die 3-Nitrotyrosin spezifisch erkennen können, während die andere Klasse auf der chemischen Ableitung basiert, die eine Nitrogruppe auf eine Amingruppereduziert 4,5. Für die Antikörper-basierte Methode wird nitrotyrosin-Affinitätssäule für die Anreicherung verwendet, aus der das eluierte Material weiter gelöst und mit hochauflösendem MS6,7analysiert wird. Für die chemische Ableitungsmethode sollten die Amingruppen am N-Terminus des Peptids oder Lysins im ersten Schritt entweder durch Acetylierung, isobarere te-Tags für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) oder Tandemmassen-Tags (TMT)-Reagenzien blockiert werden. Als nächstes wird ein Reduzierer verwendet, um Nitrotyrosin zu Aminotyrosin zu reduzieren, gefolgt von einer Änderung der neu gebildeten Amingruppe, die Biotinligation, Sulphydrylpeptid-Konvertierung oder andere Arten von Tagging-Systemen8,9, 10,11. Die meisten der bisher etablierten Protokolle basieren auf in vitro übernitrateten Proteinen statt auf endogen nitratierten Proteinen.

In der vorliegenden Studie wurde ein modifiziertes Verfahren zur chemischen Ableitung von Nitrotyrosin zur Nitropeptidanreicherung und -identifikation entwickelt, das eine erhöhte Empfindlichkeit beim MS-Nachweis zeigt und für Quantifizierungszwecke geeignet ist. Unsere jüngste Studie, die diese Methode in biologischen Systemen verwendet, hat gezeigt, dass die Nitration der lymphozytenspezifischen Proteintyrosinkinase (LCK) bei Tyr394 von RNS, die aus myeloiden abgeleiteten Suppressorzellen (MDSCs) hergestellt wird, eine wichtige Rolle bei der Immunsuppression der Tumormikroumgebung12. Daher kann unsere Methode der Nitropeptid-Identifikation auch auf komplexe biologische Proben angewendet werden. Hier beschreiben wir unser Protokoll anhand des Modells Peptid Sgiotensin II, von dem das Fragmentierungsmuster bekannt ist und in nitroproteomischen Studien 8,9,10,11als Beispiel weit verbreitet ist.

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Protocol

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1. Nitration von Angiotensin II

  1. Zur Erzeugung von nitratiertem Peptid 10 l Angiotensin II (DRVYIHPF) Mutterlösung (2 mM in Wasser) in 390 L PBS-Lösung (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4) bei der Endkonzentration von 50 m zu verdünnen.
  2. Fügen Sie der Angiotensin-II-Lösung 10 l Peroxynitritrit (200 mM in 4,7 % NaOH) hinzu, um die Endkonzentration von Peroxynitrit 5 mM herzustellen.
    HINWEIS: Peroxynitrit ist instabil und leicht zu lösen, wenn es in saurer Form ist, so dass die Übergeordnete Lösung von Peroxynitrit in einer Grundlösung aufbewahrt und in -80 °C gelagert wird.
  3. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 7-8 mal 1 M HCl ein. Um die Nitrationsreaktion zu initiieren, schütteln Sie das Rohr bei 400 U/min für 5 min.
  4. Verwenden Sie eine handelsübliche Reverse-Phase-SPE-Spalte (siehe Materialtabelle) für die Entaltung.
    1. Bereiten Sie 2 Lösungen für die Entsalzung, 5% Methanol in Wasser für das Waschen und 80% Methanol in Wasser für die Elution vor.
    2. Fügen Sie 500 l Methanol hinzu, gefolgt von 500 l Wasser, um die Säule vorzukonditionieren, 1 ml Pipettiertor mit der Spitze auf die Oberseite der Säule legen, den Pipettentor drücken, um den Durchfluss zu beschleunigen.
    3. Laden Sie 410 l der Probe in Schritt 1.3 auf die Säule, verwerfen Sie den Durchfluss durch.
    4. Verwenden Sie nach dem Waschen mit 500 l 5 % Methanol 300 l 80 % Methanol, um das Nitropeptid zu entleeren, das dann in der Standardeinstellung bei Raumtemperatur vollständig durch Speed-vac getrocknet wird.
      HINWEIS: Die Entsalzung ist sehr wichtig für die Reaktionen, da das im vorherigen Schritt übrig gebliebene Lösungsmittel sich negativ auf die nächsten Schritte auswirken kann.

2. Alkylierung von primären Auminen durch Dimethylkennzeichnung

  1. Rekonstituieren Sie die pulverisierte Nitro-Angiotensin-II-Lösung in 100 l von 100 mM Triethylammonium-Bicarbonat (TEAB).
    HINWEIS: Der pH-Wert der Lösung sollte zwischen 7 und 9 liegen und sicherstellen, dass der Lösung kein primäres Amin hinzugefügt wird.
  2. 4 l 4% Formaldehyd in die Lösung geben, kurz mischen.
    VORSICHT: Formaldehyddämpfe sind giftig; die Experimente in einer Dunstabzugshaube durchführen.
  3. Fügen Sie der Lösung 4 l 0,6 M NaBH3CN hinzu, schütteln Sie das Rohr bei 400 U/min für 1 h bei Raumtemperatur.
  4. Die Etikettierreaktion durch Zugabe von 16 l 1% Ammoniaklösung zulöschen, bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren.
  5. Fügen Sie 8 l Ameisensäure hinzu, um die Lösung zu säuern und die Entsalzung mit der umgekehrten Phase der SPE-Säule durchzuführen, wie in Schritt 1.4 beschrieben.

3. Reduktion von Nitrotyrosin zu Aminotyrosin

  1. Rekonstituieren Sie das Dimethyl-beschriftete Nitro-Angiotensin II in 500 l PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4).
  2. 10 l 1 M Natriumdithionat in die Lösung geben und bei Raumtemperatur 1 h brüten. Nach der Reduktionsreaktion wird die gelbe Farbe der Lösung deutlich.
    HINWEIS: Wiegen Sie 174,1 mg Natriumdithionat und lösen Sie es in Wasser auf, um das Endvolumen von 1 ml zu machen. Diese Lösung kann bei -20 °C nicht länger als eine Woche gelagert werden.
  3. Verwenden Sie die in Schritt 1.4 beschriebene Sp-Spalte der Rückwärtsphase für die Entaltung.

4. Biotinylation, Anreicherung und Detektion

  1. Rekonstituieren Sie das dimethylmarkierte Amino Angiotensin II in 500 l PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4).
  2. Fügen Sie der Lösung 5 l 40 nM NHS-S-S-Biotin, gelöst in DMSO, in die Lösung ein, verwenden Sie nach 2 h Inkubation bei Raumtemperatur 1 l 5% Hydroxylamin, um die Reaktion zu löschen.
  3. In der Zwischenzeit, Gleichgewicht Streptavidin Agarose Perlen durch Zugabe von 500 L PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4), Zentrifugieren bei 580 x g für 5 min bei Raumtemperatur und Wegwerfen des Überstandes. Führen Sie das Gleichgewicht 3 mal aus.
  4. 100 L Streptavidin-Agarose-Perlen in das Reaktionssystem geben, 1 h auf einem Drehschüttler bei Raumtemperatur inkubieren. 4 mal mit PBS waschen (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.4). Für jeden Waschschritt 500 l PBS zu den Perlen geben, gut mischen, dann bei 580 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
  5. Verwenden Sie 400 l von 10 mM Dithiothreitol (DTT), um mit Agarosaperlen bei 50 °C für 45 min zu brüten, bei 580 x g für 5 min bei Raumtemperatur nach unten zu drehen und die Perlen zu entsorgen, 20 l 0,5 M Idoacetamide (IAM) in 20 min in der Dunkelheit zum Überstand hinzuzufügen.
    HINWEIS: DTT wird verwendet, um die Disulfidbindung zwischen der Verbindung von Biotin und Peptid zu brechen, letzteres wird aus Perlen freigesetzt und durch IAM weiter alkyliert.
  6. Verwenden Sie die SPE-Spalte der Rückwärtsphase für die in Schritt 1.4 dargestellte Entaltung.
  7. Nach dem Auflösen der trockenen Peptide in 20 l 0,1% Ameisensäure (FA) wird das Produkt jedes Abschnitts der Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) unterzogen.
    1. Trennen Sie die modifizierten Ang II Peptide durch eine 60 min Gradientenelution (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) bei einer Durchflussrate 0,300 l/min mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das 59-60 min, 2% B) mit einem Durchfluss 0,300 l/min mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC- direkt mit dem hochauflösenden Massenspektrometer in Verbindung steht.
      HINWEIS: Die analytische Säule ist in 75'm-ID, 150 mm Länge, verpackt mit C-18-Harz. Die mobile Phase A bestand aus 0,1 % Ameisensäure, und die mobile Phase B bestand aus 100 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure.
    2. Betreiben Sie das Massenspektrometer im datenabhängigen Erfassungsmodus, stellen Sie ein einziges Vollscan-Massenspektrum (300-1800 m/z, 60 000 Auflösung) ein, gefolgt von 20 datenabhängigen MS/MS-Scans mit 28 % normalisierter Kollisionsenergie.
    3. Offene Massenspektrendaten und identifizieren die Spitzen des Produkts in jedem Schritt, um zu bestätigen, dass die chemische Reaktion erfolgreich durchgeführt wurde.

5. Quantifizierung von Nitropeptid

  1. Bereiten Sie 3 Sätze von Nitro-Angiotensin II-Lösungen aus Schritt 1.4 vor, die jeweils 2 Konzentrationen von Nitro-Angiotensin II enthalten: Set #1, 20 nmol in Tube A und 20 nmol in Tube B, jeweils in 100-l-TEAB-Lösung; Set #2, 10 nmol in Tube C und 20 nmol in Tube D, jeweils in 100 l TEAB-Lösung; Set #3, 40 nmol in Rohr E und 10 nmol in Rohr F, jeweils in 100 l TEAB-Lösung.
    Anmerkung: Die beiden Konzentrationen von Nitro-Angiotensin II in jedem Satz werden zur Dimethylkennzeichnung verwendet, um mit Formaldehyd (leicht) bzw. Formaldehyd-D2 (schwer) zu reagieren.
  2. Fügen Sie der Probe, die als leicht und schwer zu kennzeichnen ist, für jeden Satz 4 l Formaldehyd und Formaldehyd-D2 hinzu. Befolgen Sie die Schritte 2.3 bis 2.5, um die Dimethylkennzeichnung abzuschließen.
  3. Mischen Sie die leichten und schwer beschrifteten Proben.
  4. Befolgen Sie die Schritte von 3.1 bis 4.6 für die Reduktion, Biotinylierung, Anreicherung und Detektion.

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Representative Results

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Das Flussdiagramm für Nitropeptidprofilierung in diesem Manuskript ist in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2, 3, 4 und 5 zeigen die Massenspektren von Angiotensin II, Nitro-Angiotensin II, Dimethyl beschriftetes Nitro-Angiotensin II und Dimethyl markiertes Amino Angiotensin II. Das Molekulargewicht der Verbindung kann durch die m/z-Werte des Monoisotopenspitzen in jeder Abbildung reflektiert werden, was darauf hindeutet, dass die chemische Modifikation an Angiotensin II für jeden Schritt erfolgreich erreicht wurde. Abbildung 6 zeigt das Endprodukt in Schritt 4.7, das durch LC-MS/MS nachgewiesen und charakterisiert wird. Abbildung 7 zeigt die quantitativen Ergebnisse von Nitropeptid durch Dimethylkennzeichnung. Die relativen Mengen an Licht und Schwere wurden durch den Vergleich der Intensität des Monoisotopenspitzen in jeder Gruppe bestimmt, was es uns ermöglicht, die angereicherten Nitropeptide aus verschiedenen Gruppen zu quantifizieren.

Figure 1
Abbildung 1 . Der Arbeitsablauf der chemischen Ableitungsmethode zur Anreicherung und Detektion von Nitro- Angiotensin II. Erstens wird Angiotensin II mit Peroxynitrit nitratiert, nach Entsalzung wird die Dimethylkennzeichnung verwendet, um das primäre Amin auf dem Peptid zu blockieren. Dann wird Natriumdithionat verwendet, um Nitrotyrosin zu Aminotyrosin zu reduzieren, das weiter mit NHS-S-S-Biotin reagiert wird. Nach der Anreicherung durch Streptavidinperlen wird das Peptid durch DTT, gefolgt von Alkylierung, geschnitten und von LC-MS/MS erkannt. Diese Zahl wurde von12geändert, Abbildung 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 . Das Massenspektrum von Angiotensin II. Diese Abbildung zeigte, dass der Monoisotopenspitzen bei m/z 523,78 mit dem mitdem geladenen Peptid (oben) und dem MS/MS-Fragmentierungsmuster von Angiotensin II (unten) übereinstimmte. Diese Zahl wurde von12geändert, Abbildung S2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 . Das Massenspektrum von Nitro-Angiotensin II. Diese Abbildung zeigte, dass der Monoisotopenspitzen bei m/z 546.28 mit dem mitdem geladenen Peptid (oben) und dem MS/MS-Fragmentierungsmuster von Nitro-Angiotensin II (unten) übereinstimmte. Diese Zahl wurde von12geändert, Abbildung S2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 . Das Massenspektrum von Dimethyl beschriftet Nitro-Angiotensin II. Diese Abbildung zeigte, dass der Monoisotopenspitzen bei m/z 560.29 mit dem mitdem geladenen Peptid (oben) und dem MS/MS-Fragmentierungsmuster von Dimethyl beschriftetem Nitro-Angiotensin II (unten) übereinstimmte. Diese Zahl wurde von12geändert, Abbildung S2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5 . Das Massenspektrum des dimethylmarkierten Amino Angiotensin II. Diese Abbildung zeigte, dass der Monoisotopenspitzen bei m/z 545.31 mit dem mit dem Gleichen geladenen Peptid (oben) und dem MS/MS-Fragmentierungsmuster des dimethylmarkierten Amino Angiotensin II (unten) übereinstimmte. Diese Zahl wurde von12geändert, Abbildung S2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6 . Das Massenspektrum des Endprodukts. Diese Abbildung zeigte, dass der Monoisotopenspitzen von m/z 617.82 dem mit dem Doppel aufgeladenen Peptid (oben) und dem MS/MS-Fragmentierungsmuster des Endprodukts (Mitte) und dem Zoom-in-Spektrum von 400 bis 1000 m/z entsprachen, das detailliertere Fragmentierungsmuster (unten) aufweist. . Diese Zahl wurde von12geändert, Abbildung S2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7 . Die Massenspektren der Quantifizierungsergebnisse der Nitropeptide durch Dimethylkennzeichnung. Die leichten bis schweren Verhältnisse sind 1:1 (oben), 1:2 (Mitte) bzw. 4:1 (unten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

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Das Protokoll beschreibt hier die Nitropeptid-Anreicherung und Profilierung. Anhand von Angiotensin II als Modellpeptid haben wir das in Abbildung 1dargestellte Verfahren veranschaulicht. Nach Erhalt des Nitro-Angiotensin II sollte das primäre Amin auf dem Peptid blockiert werden, um die weitere Aminkonjugation zu vermeiden, die einer der kritischsten Schritte innerhalb des Protokolls ist. Im aktuellen Protokoll wird die Dimethylkennzeichnung verwendet, um die primären Aumine aus zwei Gründen zu blockieren: Erstens ermöglicht es die Erfassung quantitativer Ergebnisse; zweitens sind die Kosten für diese Reaktion niedriger als die NHS-basierte Reaktion und die Blockierungseffizienz ist hoch13. Bei der Quantifizierung liegen die gemessenen leichten zu schweren Verhältnisse sehr nahe an den erwarteten Verhältnissen (Abbildung 7), die Fehler werden weniger als 10 % berechnet.

Ein weiterer kritischer Schritt des Protokolls ist die Reduktion des 3-Nitrotyrosinaufs auf Dimethyl markiertem Peptid zu Aminotyrosin durch Natriumdithionat, das schnell und effizient reagiert. Die neu generierte Amingruppe ist ferner mit einem 4-5-fachen Überschuss an NHS-S-S-Biotin gekennzeichnet. Weniger oder mehr NHS-S-S-Biotin würde zu einer unvollständigen Etikettierungsreaktion bzw. unvollständigen Anreicherung führen. DTT kann die Disulfidbindung vollständig brechen und das angereicherte Peptid aus Streptavidinperlen freisetzen, die von IAM alkyliert und von LC-MS/MS analysiert werden.

Dieses Protokoll eignet sich zur Identifizierung und Quantifizierung von Nitropeptiden sowohl in biochemischen System- als auch in biologischen Materialien wie Zellen oder Geweben. Da Biotinanreicherung und IAM-Alkylierung die Empfindlichkeit deutlich verbessern können, werden die gering reichlich vorhandenen Nitropeptide durch MS nachweisbar. Zum Beispiel haben wir dieses Protokoll verwendet, um endogene Nitropeptide isolierter infiltrierender T-Zellen aus den murinen Prostata- und Lungenkarzinommodellen12zu profilieren. Wir identifizierten Nitro-Tyr294 des Proteins LCK und führten funktionelle Studien durch, um zu zeigen, dass diese Modifikation eine entscheidende Rolle im Prozess der Immunsuppression durch MDB12spielen kann.

Die Anwendung unserer Technik wird durch zwei Faktoren begrenzt: Erstens, die geringe Fülle von Nitropeptiden in Zellen und Geweben diktiert, dass nur wenige Nitropeptide identifiziert werden können; zweitens die inhärente geringe Erkennungsempfindlichkeit von MS im Vergleich zu den hochempfindlichen Methoden wie der genomischen und transkriptomischen Sequenzierung einzelner Zellen. Wir stellen uns vor, dass die Anwendung dieses Protokolls auf andere pathologische Bedingungen dazu beitragen wird, mehr ProteinnitrationptMs mit bisher unbekannten Funktionen im Krankheitsverlauf zu definieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack ist Principal Investigator; X.L. ist ein Subrecipient-Ermittler). Diese Publikation wurde mit teilweiser Unterstützung durch die Grant Numbers KL2 TR002530 und UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) vom National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award ermöglicht. X. L. ist Einträger des Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. wird von der Walther Cancer Foundation Unterstützt. X. W. wird vom National Natural Science Foundation of China General Program (Grant No. 817773047) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acclaim pepmap 100 C18 column Thermo-Fisher 164534
1 M TEAB solution Sigma-Aldrich T7408
50% hydroxylamine Thermo-Fisher 90115
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2 Toronto Research Chemicals F691353
formic acid Sigma-Aldrich 695076 ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
isoacetamide Sigma-Aldrich I1149
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
NHS-S-S-bition Thermo-Fisher 21441
Oasis HLB column (10 mg) Waters 186000383
peroxynitrite Merck-Millipore 516620
sodium cyanoborohydrite Sigma-Aldrich 42077 PhamaGrade
sodium dithionate Sigma-Aldrich 157953 Technical Grade
Streptavidin Sepharose GE Healcare GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC Thermo

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References

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Feng, S., Wen, X., Lu, X. Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II. J. Vis. Exp. (148), e59391, doi:10.3791/59391 (2019).More

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