Summary
チロシン硝化タンパク質のプロテオミックプロファイリングは、3-ニトロチロシン修飾の低い存在性のために挑戦的な技術であった。ここでは、アンジオテンシンIIをモデルにしたニトロペプチド濃縮とプロファイリングに対する新しいアプローチについて述べた。この方法は、他のインビトロまたはインビボシステムに拡張することができます。
Abstract
タンパク質硝化は、チロシン残基に対する最も重要な翻訳後修飾(PTM)の1つであり、真核細胞における活性酸素種(ROS)および反応性窒素種(RNS)の化学作用によって誘導されうる。タンパク質上の硝化部位の正確な同定は、炎症、老化、癌などのタンパク質硝化に関連する生理学的および病理学的プロセスを理解するために重要です。硝化タンパク質は、誘導条件下でも細胞内の存在量が少ないため、タンパク質硝化部位のプロファイリングと同定のための普遍的かつ効率的な方法は開発されていません。ここでは、化学還元反応とビオチン標識を用いてニトロペプチド濃縮のためのプロトコルを説明し、続いて高分解能質量分析を行う。我々の方法では、ニトロペプチド誘導体を高精度で同定することができる。我々の方法は、以前に報告された方法と比較して2つの利点を示す。まず、ジメチル標識は、ニトロペプチド上の一次アミンをブロックするために使用され、定量的な結果を生成するために使用することができます。第二に、NHS-ビオチン試薬を含むジスルフィド結合が濃縮に使用され、質量分析計上の検出信号を増強するためにさらに低減およびアルキル化することができる。このプロトコルは、現在の論文においてモデルペプチドアンジオテンシンIIに正常に適用されている。
Introduction
3-ニトロチロシンを形成するタンパク質中のチロシン残化の硝化は、多くの生物学的プロセスを調節する。チロシンと3-ニトロチロシンの間の異なる化学的特性のために、硝化されたタンパク質はシグナル伝達活性1、2を乱暴にしてもよい。そのため、タンパク質上の硝化部位を効率的に濃縮・同定できる方法を開発することが重要です。3-ニトロチロシンは、リン酸化やアセチル化などの他の形態のPTMと比較してタンパク質に対する豊富な修飾が低いため、細胞株や組織サンプルから直接内因性の硝化部位を同定することは困難です。それにもかかわらず、ニトロペプチドの断片化パターンを特徴付けるために質量分析(MS)を用いた方法論(例えば、Zhan & Desiderio 3)が開発され、これはニトロプロテオミクスの新しい方法の基礎を築く。
現在、MSに続く濃縮ステップは、ニトロペプチドプロファイリング4、5のための最も強力な戦略です。エンリッチメント メソッドは、2 つのクラスに分類できます。1つのクラスは、3-ニトロチロシンを特異的に認識できる抗体に基づいており、他のクラスは、アミン基4、5にニトロ基を減少させる化学誘導法に基づいている。抗体ベースの方法では、ニトロチロシン親和性カラムが濃縮に使用され、そこから、解離された材料がさらに高分解能MS6、7によって分解および分析される。化学誘導ベースの方法では、ペプチドまたはリジンのN終位におけるアミン基は、アセチル化、相対および絶対定量のための同位体タグ(iTRAQ)、またはタンデム質量タグ(TMT)試薬のいずれかによって最初のステップでブロックされるべきである。次に、ミトロチロシンをアミノチロシンに還元し、続いて新たに形成されたアミン群を改変するためにリデューサを使用し、ビオチンライゲーション、スルフィドリルペプチド変換、または他のタイプのタグ付けシステム8、9、および 10、11.これまでに確立されたプロトコルのほとんどは、内因性硝化タンパク質の代わりに、インビトロの過剰硝化タンパク質に基づいています。
本研究では、ニトロチロシンの化学誘導法の改変手順を、MS検出時の感度向上を示し、定量化目的に適したニトロペプチド濃縮および同定のために開発される。この手法を生物系に用いた最近の研究では、骨髄系抑制細胞(MDSC)から産生されるRNSによるTyr394におけるリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)の硝化が重要な役割を果たしていることを明記した。腫瘍微小環境の免疫抑制12.したがって、我々のニトロペプチド同定の方法は、複雑な生物学的試料にも適用することができる。ここで、フラグメンテーションパターンが知られており、ニトロプロテオミクス研究8、9、10、11で広く使用されているモデルペプチドアンジオテンシンIIを例として我々のプロトコルを説明する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. アンジオテンシンIIの硝化
- 硝化ペプチドを生成するには、50 μMの最終濃度で390 μL PBS溶液(10mM NaH2PO 4、150 mM NaCl、pH 7.4)でアンジオテンシンII(DRVYIHPF)親溶液(水中2mM)を希釈します。
- アンジオテンシンII溶液に10 μLのペルオキシニットライト(4.7%NaOHで200mM)を加え、ペルオキシニットライト5mMの最終濃度を作ります。
注:ペルオキシニットライトは、それが酸性の形態であるときに不安定で解決しやすいので、ペルオキシニットライトの親溶液は、基本的な溶液に保持され、-80 °Cに保存されます。 - 溶液のpH値を1M HClで7-8に調整します。硝化反応を開始するには、チューブを400rpmで5分間振ります。
- 脱塩には、市販の逆相 SPE 列 (材料の表を参照) を使用します。
- 脱塩用の2つの溶液、洗浄用の水に5%のメタノール、溶出用の水に80%メタノールを調べます。
- 500 μLのメタノールを加え、続いて500μLの水をカラムを予め条件付けし、1mLピペッタを柱の上部に先端に置き、ピペッタを押して流れを加速させる。
- カラムのステップ1.3でサンプルの410 μLをロードし、流れを破棄します。
- 5%メタノールの500 μLで洗浄した後、80%メタノールの300 μLを使用してニトロペプチドを溶出させ、室温でのデフォルト設定で速度vacによって完全に乾燥させます。
注:前のステップで残された溶媒は次のステップに悪影響を及ぼす可能性があるため、脱塩は反応にとって非常に重要です。
2. ジメチル標識による一次アミンのアルキル化
- 重炭酸トリエチランモニウム(TEAB)溶液の100μLで粉末ニトロアンジオテンシンIIを再構成する。
注:溶液のpH値は7~9で、溶液中に一次アミンが添加されていないことを確認してください。 - 溶液に4%ホルムアルデヒドの4 μLを加え、簡単に混ぜます。
注意: ホルムアルデヒド蒸気は有毒です。ヒュームフードで実験を行う。 - 溶液に0.6 M NaBH3CNの4 μLを加え、室温で1時間400rpmでチューブを振る。
- 1%アンモニア溶液の16μLを添加して標識反応をクエンチし、室温で5分間インキュベートする。
- 溶液を酸性化するために8 μLのギ酸を加え、ステップ1.4で説明するように逆相SPEカラムを使用して脱塩を行います。
3. アミノチロシンに対するニトロチロシンの減少
- PBSの500 μL(10mM NaH2PO 4、150 mM NaCl、pH7.4)でジメチル標識ニトロアンジオテンシンIIを再構成する。
- 溶液に1Mジチオネートナトリウムの10 μLを加え、室温で1時間インキュベートします。還元反応の後、溶液の黄色が明らかになる。
注:174.1 mgのジチオネートナトリウムの重量を量り、最終的な容積が1 mLであることを作るために水にそれを溶解します。この溶液は、1週間以内に-20°Cで保存することができます。 - ステップ 1.4 で説明するように、脱塩には逆相 SPE 列を使用します。
4. バイオチンラ化、濃縮、検出
- PBSの500 μL(10mM NaH2PO 4、150 mM NaCl、pH 7.4)でアミノアンジオテンシンIIを標識したジメチルを再構成する。
- 40 nM NHS-S-S-ビオチンの5μLを加え、DMSOに溶解し、溶液に、室温で2時間インキュベーションした後、反応をクエンチするために5%ヒドロキシルアミンの1 μLを使用する。
- 一方、PBSの500μL(10mM NaH2PO 4、150 mM NaCl、pH7.4)を加えて平衡化し、室温で5分間580×gで遠心分離し、上清を廃棄する。平衡化を3回行う。
- 反応系に100μLの連鎖アジャビジンアガロースビーズを加え、室温でロータリーシェーカーで1時間インキュベートする。PBSで4回洗浄(10 mM NaH2PO 4、150 mM NaCl、pH 7.4)。各洗浄工程について、ビーズに500 μLのPBSを加え、よく混ぜ、室温で5分間580xgで遠心分離機を使用し、上清を廃棄します。
- 10mMジチオスレイトール(DTT)の400 μLを使用して、アガロースビーズを50°Cで45分間インキュベートし、室温で5分間580xgでスピンダウンし、ビーズを捨て、0.5Mのidoacetatamid(IAM)の20 μLを超暗闇の20mに加えます。
注:DTTは、ビオチンとペプチドのリンク間の二硫化結合を破るために使用され、後者はビーズから放出され、さらにIAMによってアルキル化される。 - ステップ 1.4 に示す脱塩には、逆相 SPE 列を使用します。
- 0.1%ギ酸(FA)の20μLで乾燥ペプチドを溶解した後、各部の産物をスタンデム質量分析(LC-MS/MS)分析で液体クロマトグラフィーに加える。
- 60分の勾配溶出によって修飾されたAng IIペプチドを分離する(0-8分、2%B;8-10分、 5% B; 10-35 分, 18% B; 35-50 分, 28% B; 50-52 分, 80% B; 52-58 分, 80% B; 58-59 分, 2% B; 59-60 分, 2% B) 流量で 0.30 μl/mPLC システム高分解能質量分析計と直接インターフェースされます。
注:分析カラムは、C-18樹脂を詰めた75μmのID、150 mmの長さです。移動相Aは0.1%ギ酸、移動相Bは100%アセトニトリルと0.1%のギ酸で構成された。 - データ依存性集録モードで質量分析計を操作し、単一のフルスキャン質量スペクトル(300-1800 m/z、60 000解像度)を設定し、20のデータ依存MS/MSスキャンを28%正規化された衝突エネルギーでスキャンします。
- 質量スペクトルデータを開き、各工程で製品のピークを特定し、化学反応が正常に行われたことを確認します。
- 60分の勾配溶出によって修飾されたAng IIペプチドを分離する(0-8分、2%B;8-10分、 5% B; 10-35 分, 18% B; 35-50 分, 28% B; 50-52 分, 80% B; 52-58 分, 80% B; 58-59 分, 2% B; 59-60 分, 2% B) 流量で 0.30 μl/mPLC システム高分解能質量分析計と直接インターフェースされます。
5. ニトロペプチドの定量
- ステップ1.4からニトロアンジオテンシンII溶液の3セットを準備し、各セットは、ニトロアンジオテンシンIIの2濃度を含む:#1、チューブAで20 nmol、チューブBで20 nmol、それぞれ100 μl TEAB溶液中に。#2、チューブCに10nmol、チューブDに20 nmolを設定し、それぞれ100 μl TEAB溶液中に入れます。#3、チューブEに40nmol、チューブFに10nmol、それぞれ100μl TEAB溶液にセットします。
注:各セット中のニトロアンジオテンシンIIの2つの濃度は、ジメチル標識に使用され、ホルムアルデヒド(光)およびホルムアルデヒド-D2(重)とそれぞれ反応する。 - 各セットについて、4%ホルムアルデヒドとホルムアルデヒド-D2の4 μLをサンプルに加え、それぞれ軽くて重いと標識します。ジメチルラベリングを完了するには、手順 2.3 ~ 2.5 に従います。
- 軽く、重いラベルのサンプルを混ぜます。
- 削減、バイオチニル化、濃縮、検出については、3.1 から 4.6 までの手順に従います。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
この原稿におけるニトロペプチドプロファイリングのフローチャートを図1に示す。図2、3、4および5は、アンジオテンシンII、ニトロ−アンジオテンシンII、ジメチル標識ニトロアンジオテンシンIIおよびジメチル標識アミノアンジオテンシンIIの質量スペクトルを示す。 化合物の分子量は、各図におけるモノアイソトープピークのm/z値によって反映することができ、アンジオテンシンII上の化学修飾が各工程で正常に達成されたことを示す。図6は、LC-MS/MS.図7によって検出および特徴付けられたステップ4.7における最終製品を示し、ジメチル標識によるニトロペプチドの定量的結果を示す。光と重の相対的な量は、各群のモノアイソトープピークの強度の比較によって決定され、異なるグループからの濃縮ニトロペプチドを定量化することができます。
図 1.ニトロ-アンジオテンシンIIを濃縮および検出するための化学誘導法のワークフロー。まず、アンジオテンシンIIはペルオキシニットライトによって硝化され、脱塩後、ジメチル標識がペプチド上の一次アミンを遮断するために使用される。その後、ジチオネートナトリウムは、ニトロチロシンをアミオチロシンに還元するために使用され、これはさらにNHS-S-S-ビオチンと反応する。ストレプトアビジンビーズで濃縮した後、ペプチドをDTTによって切断し、続いてアルキル化を行い、LC-MS/MSによって検出する。この図は12から変更されています,図 2.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.アンジオテンシンIIの質量スペクトル。この図は、m/z 523.78におけるモノアイソトープピークが、アンジオテンシンII(下)の二重帯電ペプチド(上)とMS/MS断片化パターンと一致することを示した。この図は12、図 S2から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.ニトロアンジオテンシンIIの質量スペクトル。この図は、m/z 546.28におけるモノアイソトープピークが、ニトロ・アンジオテンシンII(下)の二重帯電ペプチド(アップ)とMS/MS断片化パターンと一致することを示した。この図は12、図 S2から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.ジメチル標識ニトロアンジオテンシンIIの質量スペクトル。この図は、m/z 560.29におけるモノアイソトープピークが、二トロ・アンジオテンシンII(下)を標識したジメチルの二重荷電ペプチド(アップ)とMS/MS断片化パターンと一致することを示した。この図は12、図 S2から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.ジメチル標識アミノアンジオテンシンIIの質量スペクトル。この図は、m/z 545.31におけるモノアイソトープピークが、アミノアンジオテンシンII(下)を標識したジメチルの二重荷電ペプチド(アップ)とMS/MS断片化パターンと一致することを示した。この図は12、図 S2から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.最終製品の質量スペクトル。この図は、m/z 617.82のモノアイソトープピークが、最終製品のデュプル帯電ペプチド(上)と最終製品のMS/MS断片化パターン(中央)とズームインスペクトル400~1000m/zと一致し、より詳細な断片化パターン(底部)を示した。.この図は12、図 S2から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.ジメチル標識によるニトロペプチドの定量結果の質量スペクトル。ライトとヘビーの比率はそれぞれ1:1(上)、1:2(中央)、4:1(下)です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでのプロトコルは、ニトロペプチド濃縮およびプロファイリングについて説明する。モデルペプチドとしてアンジオテンシンIIを用いて、図1に示す手順を示した。ニトロアンジオテンシンIIを得た後、ペプチド上の一次アミンは、プロトコル内で最も重要なステップの1つであるさらなるアミン結合を避けるためにブロックされるべきである。現在のプロトコルでは、ジメチル標識は2つの理由で一次アミンをブロックするために使用されます:最初に、定量的な結果の獲得を可能にします。第二に、この反応のコストはNHSベースの反応よりも低く、ブロッキング効率は高い13である。定量化の場合、測定された光と重い比率は予想される比率に非常に近い(図7)、誤差は10%未満に計算される。
プロトコルのもう一つの重要なステップは、ジメチル標識ペプチド上の3-ニトロチロシンの還元を、ディチオネートナトリウムによるアミオチロシンに還元し、迅速かつ効率的に反応する。新たに生成されたアミン群は、さらにNHS-S-S-ビオチンの4〜5倍を超えて標識される。NHS-S-S-ビオチンが少なかれ、不完全な標識反応または不完全な濃縮につながる。DTTはジスルフィド結合を完全に破り、IAMによってアルキル化され、LC-MS/MSによって分析されるストレプトアビジンビーズから濃縮ペプチドを放出することができる。
このプロトコルは、生化学系および細胞または組織などの生物学的材料の両方でニトロペプチドを同定および定量するのに適している。ビオチン濃縮およびIAMアルキル化は感度を有意に高めることができるので、低豊富なニトロペプチドはMSによって検出可能になる。例えば、このプロトコルを用いて、マウス前立腺および肺癌モデル12から単離された浸潤T細胞の内因性ニトロペプチドをプロファイリングした。我々は、タンパク質LCKのニトロ-Tyr294を同定し、この修飾がMDSC12による免疫抑制の過程で重要な役割を果たしうることを示すために機能的研究を行った。
我々の技術の応用は2つの要因によって制限される:まず、細胞および組織におけるニトロペプチドの低い存在量は、少数のニトロペプチドを同定できることを指示する。第二に、MSの本来の低検出感度は、単一細胞ゲノムおよびトランスクリプトームシーケンシングなどの高感度の方法論と比較した。我々は、このプロトコルを他の病理学的状態に適用することは、疾患の進行において以前に認識されていなかった機能を持つより多くのタンパク質硝化PTMを定義するのに役立つことを想定している。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、米国癌学会機関研究助成金IRG-14-195-01(M.シャロンスタックは主任研究者です。X.L.は、サブ受信者調査員です。この出版物は、国立衛生研究所、国立翻訳科学、臨床および翻訳科学賞のグラント番号KL2 TR002530とUL1 TR002529(A.シェカール、PI)からの部分的な支援によって可能になりました。X. L. はインディアナ CTSI KL2 若手研究者賞を受賞しています。S.F.は、基本がん助成金を推進するワルサー癌財団によって支援されています。X.W.は、中国国立自然科学財団(助成第817773047号)の支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
- Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
- Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
- Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
- Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
- Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
- Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
- Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 14, Unit 14.13 (2012).
- Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
- Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).
