Summary
Proteomikk profilering av tyrosin-Nitro proteiner har vært en utfordrende teknikk på grunn av den lave overflod av 3-nitrotyrosine modifikasjon. Her beskriver vi en ny tilnærming for nitropeptide berikelse og profilering ved å bruke angiotensin II som modell. Denne metoden kan utvides for andre in vitro -eller in vivo -systemer.
Abstract
Protein nitreringsbestandighet er en av de viktigste post-translational modifikasjoner (PTM) på tyrosin rester og det kan bli indusert av kjemiske handlinger av reaktive oksygen arter (ROS) og reaktive nitrogen arter (RNS) i eukaryote celler. Presis identifisering av nitreringsbestandighet områder på proteiner er avgjørende for å forstå fysiologiske og patologiske prosesser knyttet til protein nitreringsbestandighet, slik som betennelser, aldring og kreft. Siden Nitro proteiner er av lav overflod i celler selv under indusert forhold, ingen universelle og effektive metoder har blitt utviklet for profilering og identifisering av protein nitreringsbestandighet nettsteder. Her beskriver vi en protokoll for nitropeptide berikelse ved hjelp av en kjemisk reduksjons reaksjon og biotin merking, etterfulgt av høy oppløsning masse massespektrometri. I vår metode kan nitropeptide derivater identifiseres med høy nøyaktighet. Vår metode har to fordeler sammenlignet med tidligere rapporterte metoder. Først, dimethyl merking brukes til å blokkere det primære Amin på nitropeptides, som kan brukes til å generere kvantitative resultater. For det andre brukes en disulfide obligasjon som inneholder NHS-biotin-reagens for berikelse, som kan bli ytterligere redusert og alkylated for å forbedre deteksjons signalet på en masse spektrometer. Denne protokollen har blitt brukt på modellen peptid angiotensin II i gjeldende papir.
Introduction
Nitreringsbestandighet av tyrosin rester i proteiner for å danne 3-nitrotyrosine regulerer mange biologiske prosesser. På grunn av de forskjellige kjemiske egenskapene mellom tyrosin og 3-nitrotyrosine, kan et Nitro protein ha perturbed signal aktivitet1,2. Derfor er det viktig å utvikle metoder som kan berike og identifisere nitreringsbestandighet områder på proteiner effektivt. Som 3-nitrotyrosine er en lav overflod modifikasjon på proteiner i forhold til andre former for PTM, som fosforylering og acetylering, er det utfordrende å identifisere endogene nitreringsbestandighet områder direkte fra cellelinjer eller vevsprøver. Likevel, metodikk for å bruke masse massespektrometri (MS) til å karakterisere fragmentering mønster av nitrotpeptide er utviklet (for eksempel Zhan & Desiderio3), som legger grunnlaget for nye metoder for nitroproteomics.
Aktuelle, en berikelse steg føle etter av MULTIPLE SCLEROSIS er de fleste kraftfull strategi for nitropeptide profilering4,5. Den berikelse metoder kan klassifiseres i to klasser. En klasse er basert på antistoffer som kan gjenkjenne 3-nitrotyrosine spesielt, mens den andre klassen er basert på den kjemiske avledning som reduserer en Nitro gruppe til et Amin gruppe4,5. For antistoff-basert metode, nitrotyrosine affinitet kolonnen brukes for berikelse, som eluert materialet er ytterligere løst og analyseres av høy oppløsning MS6,7. For kjemisk avledning-basert metode, Amin grupper ved N-Terminus av peptid eller lysin bør være blokkert i første trinn enten ved acetylering, isobar koder for relative og absolutte kvantifisering (iTRAQ), eller tandem Mass Tags (TMT) reagenser. Deretter brukes et redusering for å redusere nitrotyrosine til aminotyrosine etterfulgt av å endre den nyopprettede Amin gruppen, som inkluderer biotin ligation, sulphydryl peptid konvertering, eller andre typer tagging systemer8,9, 10,11. De fleste protokollene som er etablert så langt er basert på in vitro -Nitro proteiner, istedenfor endogenously Nitro proteiner.
I denne studien, en modifisert prosedyre av kjemisk avledning av nitrotyrosine er utviklet for nitropeptide berikelse og identifisering, som viser forbedret følsomhet under MS deteksjon og er egnet for kvantifisering formål. Vår nylige studien ansette denne metoden i biologiske systemer identifisert som nitreringsbestandighet av lymfocytter-spesifikke protein tyrosin kinase (LCK) på Tyr394 av RNS produsert fra myelogen-avledet Suppressor celler (MDSCs) spiller en viktig rolle i immunsuppresjon av tumor mikromiljøet12. Derfor vår metode for nitropeptide identifisering kan brukes til komplekse biologiske prøver også. Her beskriver vi vår protokoll ved hjelp av modellen peptid angiotensin II, hvorav fragmentering mønsteret er kjent og mye brukt i nitroproteomic studier8,9,10,11, som et eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nitreringsbestandighet av angiotensin II
- For å generere Nitro peptid, fortynne 10 μL av angiotensin II (DRVYIHPF) forelder løsning (2 mM i vann) i 390 μL PBS løsning (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4) ved den endelige konsentrasjonen av 50 μM.
- Tilsett 10 μL av peroxynitrite (200 mM i 4,7% NaOH) til angiotensin II-løsningen for å gjøre den endelige konsentrasjonen av peroxynitrite 5 mM.
Merk: Peroxynitrite er ustabil og lett å løse når den er i syre form, så foreldre løsning av Peroxynitrite oppbevares i grunnleggende løsning og oppbevares i-80 ° c. - Juster pH-verdien for løsningen til 7-8 med 1 M HCl. For å starte nitreringsbestandighet reaksjonen, riste røret ved 400 RPM i 5 min.
- Bruk en kommersielt tilgjengelig omvendt fase SPE-kolonne (se tabell over materialer) for avsaltingsspisser overlegne sammenlignet.
- Forbered 2 løsninger for avsaltingsspisser overlegne sammenlignet, 5% metanol i vann til vasking og 80% metanol i vann til eluering.
- Tilsett 500 μL av metanol, etterfulgt av 500 μL vann til pre-condition kolonnen, sette 1 mL pipettehjelper med spissen på toppen av kolonnen, trykk på pipettehjelper for å akselerere flyten.
- Last 410 μL av prøven i trinn 1,3 på kolonnen, kast flyten gjennom.
- Etter vask med 500 μL av 5% metanol, bruk 300 μL av 80% metanol for å eluere nitropeptide, som deretter tørkes helt av Speed-VAC i standardinnstillingen ved romtemperatur.
Merk: Avsaltingsspisser overlegne sammenlignet er svært viktig for reaksjonene, siden løsningsmidlet igjen i forrige trinn kan ha en negativ effekt på de neste trinnene.
2. Alkylation av primær aminer ved dimethyl merking
- Rekonstituer av pulverisert Nitro-angiotensin II i 100 μL av 100 mM triethylammonium bikarbonat (TEAB) løsning.
Merk: pH-verdien av løsningen skal være mellom 7 og 9, og sørg for at ingen primære Amin er lagt i løsningen. - Tilsett 4 μL av 4% formaldehyd til løsningen, bland kort.
FORSIKTIG: formaldehyd damp er giftig; utføre eksperimentene i en avtrekksvifte. - Tilsett 4 μL av 0,6 M NaBH3cn til løsningen, rist slangen ved 400 RPM for 1 time ved romtemperatur.
- Slukke merkingen reaksjonen ved å legge 16 μL av 1% ammoniakk løsning, ruge ved romtemperatur i 5 min.
- Tilsett 8 μL av maursyre syre for å acidify løsningen og utføre avsaltingsspisser overlegne sammenlignet ved hjelp av omvendt fase SPE-kolonnen som beskrevet i trinn 1,4.
3. reduksjon av nitrotyrosine til aminotyrosine
- Rekonstituer dimethyl merket Nitro-angiotensin II i 500 μL av PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4).
- Tilsett 10 μL av 1 M natrium dithionate til oppløsningen og ruge ved romtemperatur i 1 time. Etter reduksjon reaksjonen, den gule fargen på løsningen blir klar.
Merk: veie 174,1 mg natrium dithionate og oppløse den i vann for å gjøre det endelige volumet er 1 mL. Denne løsningen kan oppbevares ved-20 ° c ikke lenger enn en uke. - Bruk den omvendte fase SPE-kolonnen for avsaltingsspisser overlegne sammenlignet som beskrevet i trinn 1,4.
4. Biotinylation, berikelse og deteksjon
- Rekonstituer dimethyl merket amino angiotensin II i 500 μL av PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4).
- Tilsett 5 μL av 40 nM NHS-S-S-biotin, oppløst i DMSO, til løsningen, etter 2 h inkubasjons ved romtemperatur, bruk 1 μL av 5% hydroksylamin for å slukke reaksjonen.
- I mellomtiden, likevekt streptavidin agarose perler ved å legge 500 μL av PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4), sentrifugering ved 580 x g i 5 min ved romtemperatur og kaste supernatanten. Utfør likevekts 3 ganger.
- Tilsett 100 μL streptavidin agarose perler i reaksjonssystemet, ruge 1 t på en roterende shaker ved romtemperatur. Vask 4 ganger med PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4). For hvert vasketrinn, tilsett 500 μL av PBS til perlene, bland godt, deretter sentrifuger ved 580 x g i 5 min ved romtemperatur og kast supernatanten.
- Bruk 400 μL av 10 mM dithiotreitol (DTT) for å ruge med agarose perler ved 50 ° c i 45 min, spinn ned ved 580 x g i 5 min ved romtemperatur og kast perlene, tilsett 20 μL av 0,5 M IDOACETAMIDE (iam) til supernatanten i 20 min i mørket.
Merk: DTT brukes til å bryte disulfide bånd mellom koblingen av biotin og peptid, sistnevnte er frigitt fra perler og videre alkylated av IAM. - Bruk den omvendte fase SPE-kolonnen for avsaltingsspisser overlegne sammenlignet som vises i trinn 1,4.
- Etter å løse de tørre peptider i 20 μL av 0,1% maursyre syre (FA), underlagt produktet av hver seksjon til flytende kromatografi med tandem masse massespektrometri (LC-MS/MS) analyse.
- Skill modifisert Ang II peptider med en 60 min gradient eluering (0-8 min, 2% B; 8-10 min., 5% B; 10-35 min., 18% B; 35-50 min., 28% B; 50-52 min., 80% B; 52-58 min., 80% B; 58-59 min., 2% B; 59-60 min., 2% B) ved en strømningshastighet 0,300 μL/min med Nano-HPLC system som er direkte tilkobles med høyoppløselig masse spektrometer.
Merk: den analytiske kolonnen er i 75-ID, 150 mm lengde, fullpakket med C-18 harpiks. Mobil fase A besto av 0,1% maursyre syre, og mobil fase B besto av 100% acetonitril og 0,1% maursyre syre. - Betjene massen spektrometer i data-avhengige oppkjøpet modus, satt et enkelt full Scan masse spektrum (300-1800 m/z, 60 000 oppløsning) etterfulgt av 20 data-avhengige MS/MS skanner på 28% normalisert kollisjon energi.
- Åpne masse Spectra data og identifisere toppene av produktet i hvert trinn for å bekrefte den kjemiske reaksjonen er vellykket utført.
- Skill modifisert Ang II peptider med en 60 min gradient eluering (0-8 min, 2% B; 8-10 min., 5% B; 10-35 min., 18% B; 35-50 min., 28% B; 50-52 min., 80% B; 52-58 min., 80% B; 58-59 min., 2% B; 59-60 min., 2% B) ved en strømningshastighet 0,300 μL/min med Nano-HPLC system som er direkte tilkobles med høyoppløselig masse spektrometer.
5. kvantifisering av nitropeptide
- Forbered 3 sett med nitro-angiotensin II løsninger fra trinn 1,4, hvert sett inneholder 2 konsentrasjoner av Nitro-angiotensin II: Sett #1, 20 nmol i rør A og 20 nmol i rør B, hver i 100 μL TEAB løsning; Sett #2, 10 nmol i rør C og 20 nmol i rør D, hver i 100 μL TEAB-løsning; Sett #3, 40 nmol i rør E og 10 nmol i rør F, hver i 100 μL TEAB-løsning.
Merk: de to konsentrasjonene av Nitro-angiotensin II i hvert sett brukes for dimethyl merking, å reagere med formaldehyd (lys) og formaldehyd-D2 (tunge), henholdsvis. - For hvert sett, tilsett 4 μL av 4% formaldehyd og formaldehyd-D2 til prøven for å være merket som lett og tung, henholdsvis. Følg trinnene 2,3 til 2,5 for å fullføre dimethyl merking.
- Bland lys og tunge merket prøver.
- Følg trinnene fra 3,1 til 4,6 for reduksjon, biotinylation, berikelse og gjenkjenning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flytskjemaet for nitropeptide profilering i dette manuskriptet er vist i figur 1. Figur 2, 3, 4 og 5 viser massen SPECTRA av angiotensin II, Nitro-ANGIOTENSIN II, dimethyl merket Nitro-angiotensin II og dimethyl merket amino angiotensin II, henholdsvis. Molekylvekten av det sammensatte kan reflekteres av m/z verdier av mono-isotop Peak i hver figur, indikerer kjemisk modifikasjon på angiotensin II ble vellykket oppnådd for hvert trinn. Figur 6 viser det endelige produktet i trinn 4,7 oppdaget og PREGET av LC-MS/MS. figur 7 viser de kvantitative resultatene av nitropeptide ved dimethyl merking. Den relative mengder av lys og tunge ble bestemt av sammenligningen av intensiteten av mono-isotop Peak i hver gruppe, som tillater oss å kvantifisere beriket nitropeptides fra ulike grupper.
Figur 1 . Arbeidsflyten av den kjemiske avledning metode for berikende og oppdage Nitro-angiotensin II. Først, angiotensin II er Nitro av peroxynitrite, etter avsaltingsspisser overlegne sammenlignet, dimethyl merking brukes til å blokkere det primære Amin på peptid. Deretter natrium dithionate brukes til å redusere nitrotyrosine til aminotyrosine, som er ytterligere reagerte med NHS-S-S-biotin. Etter beriket med streptavidin perler, er peptid kuttet av DTT etterfulgt av alkylation og oppdages av LC-MS/MS. Dette tallet er endret fra12, figur 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Massen spekteret av angiotensin II. Dette tallet viste at mono-isotop peak på m/z 523,78 matchet duple ladet peptid (opp) og MS/MS fragmentering mønster av angiotensin II (nederst). Dette tallet er endret fra12, figur S2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Massen spekteret av Nitro-angiotensin II. Dette tallet viste at mono-isotop peak på m/z 546,28 matchet duple ladet peptid (opp) og MS/MS fragmentering mønster av Nitro-angiotensin II (nederst). Dette tallet er endret fra12, figur S2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Massen spekteret av dimethyl merket Nitro-angiotensin II. Dette tallet viste at mono-isotop peak på m/z 560,29 matchet duple ladet peptid (opp) og MS/MS fragmentering mønster av dimethyl merket Nitro-ANGIOTENSIN II (nederst). Dette tallet er endret fra12, figur S2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Massen spekteret av dimethyl merket amino angiotensin II. Dette tallet viste at mono-isotop peak på m/z 545,31 matchet duple ladet peptid (opp) og MS/MS fragmentering mønster av dimethyl merket amino angiotensin II (nederst). Dette tallet er endret fra12, figur S2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Massen spekteret av det endelige produktet. Dette tallet viste at mono-isotop peak på m/z 617,82 matchet duple ladet peptid (opp) og MS/MS fragmentering mønster av det endelige produktet (midten) og zoom-i spekteret fra 400 til 1000 m/z utstilt mer detaljert fragmentering mønster (nederst) . Dette tallet er endret fra12, figur S2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 . Massen Spectra av kvantifisering resultatene av nitropeptides ved dimethyl merking. Lyset til tunge prosenter er 1:1 (opp), 1:2 (midten) og 4:1 (nederst), henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen her beskriver nitropeptide berikelse og profilering. Bruke angiotensin II som modell peptid, illustrerte vi prosedyren vist i figur 1. Etter å ha innhentet Nitro-angiotensin II, den primære Amin på peptid bør blokkeres for å unngå ytterligere Amin Bøyning, som er en av de mest kritiske skritt i protokollen. I den gjeldende protokollen, dimethyl merking brukes til å blokkere den primære aminer av to grunner: for det første, gjør det oppkjøpet av kvantitative resultater; for det andre er kostnaden for denne reaksjonen lavere enn NHS-basert reaksjon og blokkerings effektiviteten er høy13. For kvantifisering, den målte lys til tunge prosenter er svært nær den forventede prosenter (figur 7), er feilene beregnet mindre enn 10%.
Et annet kritisk trinn i protokollen er reduksjonen av 3-nitrotyrosine på dimethyl merket peptid for å aminotyrosine av natrium dithionate, som reagerer raskt og effektivt. Den nylig genererte Amin gruppen er videre merket med 4-5 folder overkant av NHS-S-S-biotin. Mindre eller mer NHS-S-S-biotin ville føre til ufullstendig merking reaksjon eller ufullstendig berikelse, henholdsvis. DTT kan fullt bryte disulfide Bond og slipp beriket peptid fra streptavidin perler, som er alkylated av IAM og analysert av LC-MS/MS.
Denne protokollen er egnet for å identifisere og kvantifisere nitropeptides i både biokjemiske system og biologiske materialer som celler eller vev. Siden biotin berikelse og IAM alkylation kan betydelig forbedre følsomheten, den ydmyke rikelig nitropeptides bli synlig ved MS. For eksempel har vi brukt denne protokollen til profilen endogene nitropeptides av isolerte infiltrere T-celler fra murine prostata og lungekreft modeller12. Vi identifiserte Nitro-Tyr294 av proteinet LCK og utførte funksjonelle studier for å vise at denne endringen kan spille en avgjørende rolle i prosessen med immunsuppresjon av MDSCs12.
Anvendelsen av vår teknikk er begrenset av to faktorer: for det første, den lave overflod av nitropeptides i celler og vev tilsier at få nitropeptides kan identifiseres; andre, det iboende lav oppdagelsen følsomheten av MULTIPLE SCLEROSIS sammenlignet med det høylig følsom metoder som enkeltcellen genomisk og transcriptomic sekvensering. Vi ser for oss at anvendelsen av denne protokollen til andre patologiske tilstander vil bidra til å definere mer protein nitreringsbestandighet PTMs med tidligere ukjente funksjoner i sykdomsprogresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av American Cancer Society institusjonelle Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon stack er rektor etterforsker; X.L. er en subrecipient etterforsker). Denne publikasjonen ble gjort mulig med delvis støtte fra Grant Numbers KL2 TR002530 og UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) fra National Institutes of Health, nasjonalt senter for fremmarsj translational Sciences, Clinical og translational Sciences Award. X. L. er en mottaker av Indiana CTSI KL2 Young etterforsker Award. S. F. er støttet av Walther Cancer Foundation fremmarsj Basic Cancer tilskudd. X. W. støttes av National Natural Science Foundation i Kinas General program (Grant no. 817773047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
- Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
- Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
- Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
- Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
- Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
- Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
- Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 14, Unit 14.13 (2012).
- Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
- Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).
