Summary
Proteomisk profilering av tyrosin-Nitrerade proteiner har varit en utmanande teknik på grund av det låga överflöd av 3-nitrotyrosin modifiering. Här beskriver vi en ny metod för nitropeptid berikning och profilering genom att använda angiotensin II som modell. Denna metod kan för längas för andra in vitro -eller in vivo -system.
Abstract
Protein nitrering är en av de viktigaste post-translational modifieringar (PTM) på tyrosinrester och det kan induceras av kemiska åtgärder av reaktiva syreradikaler (ROS) och reaktiva kväve arter (RNS) i eukaryotiska celler. Exakt identifiering av nitrations platser på proteiner är avgörande för förståelsen av fysiologiska och patologiska processer relaterade till protein nitrering, såsom inflammation, åldrande och cancer. Eftersom de Nitrerade proteinerna är av låg förekomst i celler även under inducerade förhållanden, har inga universella och effektiva metoder utvecklats för profilering och identifiering av proteinnitreringsanläggningar. Här beskriver vi ett protokoll för nitropeptid berikning med hjälp av en kemisk Reduktions reaktion och biotin märkning, följt av hög upplöst masspektrometri. I vår metod kan nitropeptidderivat identifieras med hög noggrannhet. Vår metod uppvisar två fördelar jämfört med tidigare rapporterade metoder. Först, dimetyl märkning används för att blockera den primära Amin på nitropeptider, som kan användas för att generera kvantitativa resultat. För det andra används en disulfidbindning som innehåller NHS-biotin-reagens för berikningen, som kan minskas ytterligare och alkyleras för att förbättra detekterings signalen på en masspektrometer. Detta protokoll har tillämpats framgångs rikt på modellen peptid angiotensin II i det aktuella papperet.
Introduction
Nitrering av tyrosin rester i proteiner för att bilda 3-nitrotyrosin reglerar många biologiska processer. På grund av de olika kemiska egenskaperna mellan tyrosin och 3-nitrotyrosin, kan ett nitrerat protein ha orolig signalering aktivitet1,2. Därför är det viktigt att utveckla metoder som kan berika och identifiera nitrations platser på proteiner effektivt. Eftersom 3-nitrotyrosin är ett lågt överflöd modifiering på proteiner jämfört med andra former av PTM, såsom fosforylering och Acetylering, är det svårt att identifiera endogena nitrering platser direkt från cellinjer eller vävnadsprover. Icke desto mindre har metoden att använda masspektrometri (MS) för att karakterisera fragmenteringsmönstret av nitrotpeptid utvecklats (till exempel Zhan & Desiderio3), som lägger grunden för nya metoder för nitroproteomik.
För närvarande är ett anriknings steg följt av MS den mest kraftfulla strategin för nitropeptid profilering4,5. Anriknings metoderna kan indelas i två klasser. En klass är baserad på anti kroppar som kan känna igen 3-nitrotyrosin specifikt, medan den andra klassen är baserad på kemisk härledning som minskar en Nitro grupp till en Amin grupp4,5. För den antikroppsbaserade metoden används kolonn för nitrotyrosin-tillhörighet för berikningen, från vilken det eluerade materialet ytterligare löses och analyseras med hög upplöst MS6,7. För kemisk derivation-baserad metod, bör amingrupperna vid N-Terminus av peptiden eller lysin blockeras i det första steget antingen genom Acetylering, isobariska Taggar för relativ och absolut kvantitation (iTRAQ), eller tandem massa Taggar (TMT) reagenser. Nästa, en Reducer används för att minska nitrotyrosin till aminotyrosin följt genom att ändra den nybildade amine gruppen, som omfattar biotin ligation, sulfydrylgrupper peptid omvandling, eller andra typer av märknings system8,9, 10,11. De flesta av de protokoll som hittills upprättats bygger på in vitro -Nitrerade proteiner, i stället för endogent Nitrerade proteiner.
I den här studien är ett modifierat förfarande för kemisk härledning av nitrotyrosin utvecklat för nitropeptid-berikning och-identifiering, vilket visar förbättrad känslighet vid MS-detektion och är lämpligt för kvantifieringsändamål. Vår nyligen genomförda studie med denna metod i biologiska system identifierade att nitrering av lymfocytspecifikt protein tyrosinkinas (LCK) vid Tyr394 av RNS framställt av myeloida-härledda suppressor celler (MDSCs) spelar en viktig roll i immunsuppression av tumörmikromiljön12. Därför kan vår metod för nitropeptid identifiering tillämpas på komplexa biologiska prover samt. Här beskriver vi vårt protokoll genom att använda modell peptiden angiotensin II, där fragmenteringssmönstret är känt och allmänt använt i nitroproteomiska studier8,9,10,11, som exempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nitrering av angiotensin II
- För att generera nitrerad peptid, späd 10 μL av den överordnade lösningen av angiotensin II (DRVYIHPF) (2 mM i vatten) i 390 μL PBS-lösning (10 mM NaH2Po4, 150 mm nacl, pH 7,4) vid den slutliga koncentrationen på 50 μM.
- Tillsätt 10 μL peroxynitrit (200 mM i 4,7% NaOH) till angiotensin II-lösningen för att göra den slutliga koncentrationen av peroxynitrit 5 mM.
Obs: Peroxynitrit är instabilt och lätt att lösa när det är i syra form, så förälder lösning av peroxynitrit hålls i grundläggande lösning och lagras i-80 ° c. - Justera lösningens pH-värde till 7-8 med 1 M HCl. För att initiera nitrations reaktionen, skaka röret vid 400 rpm i 5 min.
- Använd en kommersiellt tillgänglig omvänd fas SPE-kolumn (se material tabell) för avsaltning.
- Förbered 2 lösningar för avsaltning, 5% metanol i vatten för tvättning och 80% metanol i vatten för elueringen.
- Tillsätt 500 μL metanol, följt av 500 μL vatten för att förkonditionera kolonnen, Lägg 1 mL pipett med spetsen på toppen av kolonnen, tryck på pipetten för att påskynda flödet.
- Lasta 410 μL av provet i steg 1,3 på kolonnen, kassera flödet genom.
- Efter tvättning med 500 μL 5% metanol, Använd 300 μL 80% metanol för att eluera nitropeptiden, som sedan torkas helt av Speed-VAC i standardinställningen vid rums temperatur.
Anmärkning: avsaltning är mycket viktigt för reaktionerna, eftersom vätskan kvar i föregående steg kan ha en negativ effekt på nästa steg.
2. alkylering av primära aminer genom dimetylmärkning
- Bered den pulveriserade Nitro-angiotensin II i 100 μL av 100 mM triethylammoniumbikarbonat (TEAB) lösning.
Anmärkning: pH-värdet för lösningen ska vara mellan 7 och 9, och se till att ingen primär Amin tillsätts i lösningen. - Tillsätt 4 μL 4% formaldehyd i lösningen, blanda en kort stund.
Varning: formaldehyd ångor är giftiga; utföra experimenten i en draghuv. - Tillsätt 4 μL 0,6 M NaBH3CN till lösningen, skaka röret vid 400 RPM för 1 h vid rums temperatur.
- Släcka märknings reaktionen genom att tillsätta 16 μL 1% ammoniaklösning, Inkubera i rums temperatur i 5 minuter.
- Tillsätt 8 μL myrsyra för att acifiera lösningen och utföra avsaltning med omvänd fas SPE-kolonn enligt beskrivningen i steg 1,4.
3. reduktion av nitrotyrosin till aminotyrosin
- Bered dimetylmärkt Nitro-angiotensin II i 500 μL PBS (10 mM NaH2Po4, 150 mm nacl, pH 7,4).
- Tillsätt 10 μL 1 M natriumditionat till lösningen och inkubera i rums temperatur under 1 timme. Efter Reduktions reaktionen blir lösningens gula färg klar.
Märk: väg upp 174,1 mg natriumditionat och lös upp det i vatten så att den slutliga volymen blir 1 mL. Denna lösning kan förvaras vid-20 ° c inte längre än en vecka. - Använd omvänd fas SPE-kolumn för avsaltning enligt beskrivningen i steg 1,4.
4. biotinylering, berikning och detektion
- Bered den dimetylmärkta aminosyran angiotensin II i 500 μL PBS (10 mM NaH2Po4, 150 mm nacl, pH 7,4).
- Tillsätt 5 μL 40 nM NHS-S-S-biotin, upplöst i DMSO, till lösningen, efter 2 h inkubation vid rums temperatur, Använd 1 μL 5% hydroxylamin för att släcka reaktionen.
- Under tiden, jämvikt streptividin AGA ros pärlor genom att tillsätta 500 μl PBS (10 mm NaH2Po4, 150 mm NaCl, pH 7,4), centrifugering vid 580 x g för 5 min i rums temperatur och kasta supernatanten. Utför jämvikt 3 gånger.
- Tillsätt 100 μl streptividin AGA ros pärlor till reaktions systemet, Inkubera 1 h på en roterande skakapparat vid rums temperatur. Tvätta 4 gånger med PBS (10 mM NaH2Po4, 150 mm nacl, pH 7,4). För varje tvätt steg, tillsätt 500 μL PBS till pärlorna, blanda väl, Centrifugera sedan vid 580 x g i 5 min vid rums temperatur och Kassera supernatanten.
- Använd 400 μl 10 mm ditiothreitol (DTT) för att Inkubera med AGA ros pärlor vid 50 ° c i 45 min, snurra på 580 x g i 5 min i rums temperatur och kassera pärlorna, tillsätt 20 μl 0,5 M idoacetamid (IAM) till supernatanten i 20 min i mörker.
Anmärkning: DTT används för att bryta disulfidbindningen mellan sambandet mellan biotin och peptid, den senare frigörs från pärlor och ytterligare alkylerade av IAM. - Använd omvänd fas SPE-kolumn för avsaltning som visas i steg 1,4.
- Efter lösning av torra peptider i 20 μL av 0,1% myrsyra (FA), föremål produkten av varje avsnitt till vätskekromatografi med tandem masspektrometri (LC-MS/MS) analys.
- Separera de modifierade ang II-peptiderna med en 60 min lutning eluering (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) med en flödes hastighet på 0,300 μl/min med nano-HPLC-system som är direkt sammanflätas med hög upplöst masspektrometer.
Anmärkning: analys kolonnen är i 75 μm ID, 150 mm längd, packad med C-18 harts. Mobil fas A bestod av 0,1% myrsyra, och mobil fas B bestod av 100% acetonitril och 0,1% myrsyra. - Manövrera masspektrometer i data beroende förvärvs läge, Ställ in en enda full-Scan Mass spektrum (300-1800 m/z, 60 000 upplösning) följt av 20 data-beroende MS/MS-skanningar vid 28% normaliserad kollision energi.
- Öppna massa spektra data och identifiera toppar av produkten i varje steg för att bekräfta den kemiska reaktionen har utförts framgångs rikt.
- Separera de modifierade ang II-peptiderna med en 60 min lutning eluering (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) med en flödes hastighet på 0,300 μl/min med nano-HPLC-system som är direkt sammanflätas med hög upplöst masspektrometer.
5. kvantifiering av nitropeptid
- Förbered 3 uppsättningar av Nitro-angiotensin II-lösningar från steg 1,4, varje set innehåll ande 2 koncentrationer av Nitro-angiotensin II: set #1, 20 nmol i tub A och 20 nmol i rör B, var och en i 100 μl TEAB-lösning; Ställ #2, 10 nmol i tub C och 20 nmol i tub D, var och en i 100 μl TEAB lösning; Ställ in #3, 40 nmol i tub E och 10 nmol i tub F, var och en i 100 μl TEAB lösning.
Anmärkning: de två koncentrationerna av Nitro-angiotensin II i varje set används för dimetylmärkning, för att reagera med formaldehyd (ljus) och formaldehyd-D2 (tung) respektive. - För varje set, tillsätt 4 μL 4% formaldehyd och formaldehyd-D2 till provet som ska märkas som lätt och tungt, respektive. Följ stegen 2,3 till 2,5 för att avsluta dimetylmärkning.
- Blanda de lätta och tunga märkta proverna.
- Följ stegen från 3,1 till 4,6 för reduktion, biotinylation, berikning och detektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flödesschemat för nitropeptid profilering i detta manuskript visas i figur 1. Figur 2, 3, 4 och 5 visar Mass spektra av angiotensin II, Nitro-angiotensin II, dimetylmärkt Nitro-ANGIOTENSIN II och dimetylmärkt amino angiotensin II, respektive. Den molekyl ära vikten av föreningen kan återspeglas av m/z-värden för mono-isotop topp i varje siffra, vilket tyder på kemisk modifiering av angiotensin II uppnåddes framgångs rikt för varje steg. Figur 6 visar den slutliga produkten i steg 4,7 upptäcks och KÄNNETECKNAS av LC-MS/MS. figur 7 visar de kvantitativa resultaten av nitropeptid med dimetylmärkning. De relativa mängderna av ljus och tunga bestämdes genom jämförelsen av intensiteten hos mono-isotop-toppen i varje grupp, vilket gör det möjligt för oss att kvantifiera de berikade nitropeptiderna från olika grupper.
Figur 1 . Arbets flödet av kemisk härledning metod för berikande och upptäcka Nitro-angiotensin II. För det första, angiotensin II är Nitro av peroxynitrite, efter avsaltning, dimetyl märkning används för att blockera den primära Amin på peptiden. Därefter används Natriumditionat för att reducera nitrotyrosin till aminotyrosin, som ytterligare reagerar med NHS-S-S-biotin. Efter berikas av streptividin pärlor, peptid skärs av DTT följt av alkylering och detekteras av LC-MS/MS. Siffran har ändrats från12, figur 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Det Mass spektrum av angiotensin II. Denna siffra visade att mono-isotop topp vid m/z 523,78 matchade den tudelade laddade peptiden (upp) och MS/MS fragmentering mönstret av angiotensin II (botten). Siffran har ändrats från12, figur S2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Mass spektrum av Nitro-angiotensin II. Denna siffra visade att mono-isotop topp vid m/z 546,28 matchade den tudelade laddade peptiden (upp) och MS/MS fragmentering mönstret av Nitro-angiotensin II (botten). Siffran har ändrats från12, figur S2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Det Mass spektrum av dimetyl märkt Nitro-angiotensin II. Denna siffra visade att mono-isotop topp vid m/z 560,29 matchade den tudelade laddade peptiden (upp) och MS/MS fragmentering mönstret av dimetyl märkt Nitro-angiotensin II (botten). Siffran har ändrats från12, figur S2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Det massa spektrum av dimetyl märkt amino angiotensin II. Denna siffra visade att mono-isotop topp vid m/z 545,31 matchade den tudelade laddade peptid (upp) och MS/MS fragmentering mönstret av dimetyl märkt amino angiotensin II (botten). Siffran har ändrats från12, figur S2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Den slutliga produktens Mass spektrum. Denna siffra visade att mono-isotop topp på m/z 617,82 matchade den tudelade laddade peptid (upp) och MS/MS fragmentering mönster av den slutliga produkten (mitten) och zooma in spektrum från 400 till 1000 m/z uppvisade mer detaljerad fragmentering mönster (botten) . Siffran har ändrats från12, figur S2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 . Massan spektra av kvantifieringsresultaten av nitropeptider genom dimetylmärkning. Den ljusa till tunga nyckeltal är 1:1 (upp), 1:2 (mitten) och 4:1 (botten), respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskriver här nitropeptid berikning och profilering. Med angiotensin II som modell peptid illustrerade vi proceduren som visas i figur 1. Efter att ha erhållit Nitro-angiotensin II bör den primära aminan på peptiden blockeras för att undvika ytterligare aminkonjugering, vilket är ett av de mest kritiska stegen i protokollet. I det nuvarande protokollet används dimetylmärkning för att blockera primära aminer av två anledningar: för det första möjliggör förvärvet av kvantitativa resultat. för det andra är kostnaden för denna reaktion lägre än NHS-baserad reaktion och blockeringseffektiviteten är hög13. För kvantifiering är det uppmätta ljuset till tunga förhållanden mycket nära de förväntade kvoterna (figur 7), felen beräknas mindre än 10%.
Ett annat kritiskt steg i protokollet är minskningen av 3-nitrotyrosin på dimetylmärkt peptid till aminotyrosin genom natriumditionat, som reagerar snabbt och effektivt. Den nyligen genererade amine-gruppen är ytterligare märkt med 4-5 veck överskott av NHS-S-S-biotin. Mindre eller fler NHS-S-S-biotin skulle leda till ofullständig märknings reaktion eller ofullständig berikning, respektive. DTT kan helt bryta disulfidbindningen och frigöra den berikade peptiden från streptividin-pärlor, som är alkylerade av IAM och analyseras av LC-MS/MS.
Detta protokoll lämpar sig för identifiering och kvantifiering av nitropeptider i både biokemiska system och biologiska material som celler eller vävnader. Eftersom biotin berikning och IAM alkylering kan avsevärt öka känsligheten, de ringa rikliga nitropeptider blir detekterbara av MS. Till exempel, vi använde detta protokoll för att profilera endogena nitropeptider av isolerade infiltrerande T-celler från murina prostata-och lung cancer modellerna12. Vi identifierade Nitro-Tyr294 av proteinet LCK och utförde funktionella studier för att visa att denna modifiering kan spela en avgörande roll i processen för immunsuppression av MDSCs12.
Tillämpningen av vår teknik begränsas av två faktorer: för det första, den låga förekomsten av nitropeptider i celler och vävnader dikterar att få nitropeptider kan identifieras; för det andra, den inneboende låga detektions känsligheten hos MS jämfört med de mycket känsliga metoder såsom encellig genomisk och transkriptomisk sekvensering. Vi ser fram emot att tillämpningen av detta protokoll till andra sjukdoms tillstånd kommer att bidra till att definiera mer protein nitrering PTMs med tidigare okända funktioner i sjukdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av American Cancer Society institutionell Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon stack är ansvarig utredare; X.L. är en subrecipient utredare). Denna publikation möjliggjordes med partiellt stöd från Grant Numbers KL2 TR002530 och UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) från nationella institut för hälsa, nationellt centrum för främjande av translationell vetenskap, klinisk och translationell vetenskap Award. X. L. är mottagare av Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. stöds av Walther cancer Foundation främja grundläggande cancer bidrag. X. W. stöds av National Natural Science Foundation i Kina General program (Grant nr. 817773047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
- Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
- Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
- Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
- Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
- Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
- Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
- Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 14, Unit 14.13 (2012).
- Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
- Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).
