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Biology

एक मॉडल संयंत्र Arabidopsis thaliana के Thigmomorphogenesis के अध्ययन के लिए एक श्रम की बचत और दोहराने योग्य टच बल संकेतन उत्परिवर्ती स्क्रीन प्रोटोकॉल

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59392
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Division of Life Science, Energy Institute, Institute for the Environment, The Hong Kong University of Science and Technology, 2Shenzhen Research Institute, The Hong Kong University of Science and Technology

Summary

एक कोमल स्पर्श बल लोडिंग मशीन मानव बाल ब्रश, रोबोट हथियार और एक नियंत्रक से बनाया गया है. बाल ब्रश रोबोट मशीन पर स्थापित हथियारों से संचालित कर रहे हैं और पौधों पर स्पर्श बल लागू करने के लिए समय-समय पर कदम। मशीन चालित बालों को छू की ताकत मैन्युअल रूप से लागू छू की तुलना में है.

Abstract

दोनों intracellular और extracellular यांत्रिक उत्तेजनाओं (या बल संकेतों) का जवाब पौधों और विशेष रूपात्मक परिवर्तन का विकास, एक कहा जाता thigmomorphogenesis. पिछले दशकों में, कई संकेतन घटकों की पहचान की गई है और mechanotransuction में शामिल होने के लिए रिपोर्ट (उदाहरण के लिए, कैल्शियम आयन बाध्यकारी प्रोटीन और जैस्मोनिक एसिड biosynthesis एंजाइमों). हालांकि, बल संकेतन या thigmomorphogenesis के अध्ययन में अनुसंधान की अपेक्षाकृत धीमी गति मोटे तौर पर दो कारणों के लिए जिम्मेदार ठहराया है: कठिन मानव हाथ के लिए आवश्यकता thigmomorphogenesis और बल शक्ति त्रुटियों के स्पर्श प्रेरण लोगों के हाथ स्पर्श के साथ जुड़े. एक संयंत्र जीव पर बाहरी बल लोडिंग की दक्षता बढ़ाने के लिए, एक स्वत: स्पर्श बल लोडिंग मशीन का निर्माण किया गया था। इस रोबोट हाथ संचालित बाल ब्रश छू एक श्रम की बचत और आसानी से repeatable स्पर्श बल सिमुलेशन, स्पर्श पुनरावृत्ति और समायोज्य स्पर्श शक्ति के असीमित दौर प्रदान करते हैं. इस बाल स्पर्श बल लोड िंग मशीन दोनों स्पर्श बल संकेत म्यूटेंट के बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग और संयंत्र thigmomorphogenesis के phenomics अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, मानव बाल जैसे स्पर्श सामग्री, पशु बाल, रेशम धागे और कपास फाइबर जैसे अन्य प्राकृतिक सामग्री के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है. मशीन पर स्वचालित चलती हथियार क्रमशः बारिश की बूंदों और हवा की प्राकृतिक ताकतों की नकल करने के लिए पानी के छिड़काव नलिका और हवा blowers के साथ सुसज्जित किया जा सकता है। हाथ से प्रदर्शन कपास झाड़ू छू के साथ संयोजन में इस स्वत: बाल स्पर्श बल लोडिंग मशीन का उपयोग करके, हम दो बल संकेत म्यूटेंट के स्पर्श प्रतिक्रिया की जांच की है, एमएपी केINASE केINASE 1 (MKK1) और MKK2 पौधों . स्पर्श बल भरी हुई जंगली प्रकार के पौधों के phenomes और दो म्यूटेंट सांख्यिकीय मूल्यांकन किया गया. वे संपर्क प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण मतभेद का प्रदर्शन किया है.

Introduction

संयंत्र thigmomorphogenesis एक शब्द है कि Jaffe, MJ द्वारा 19731में गढ़ा गया था. यह एक पादप अनुवर्तनता है लेकिन सूर्य के प्रकाश या गुरुत्वाकर्षण2,3के उद्दीपकों के कारण प्रसिद्ध प्रकाश-अनुवर्तीता या गुरुत्वाकर्षण से भिन्न है। यह आवधिक यांत्रिक उत्तेजनाओं से जुड़े फीनोटाइपिक परिवर्तनों का वर्णन करता है, जिन्हें वनस्पतिविज्ञानियों द्वारा पहले के समय4,5में बार-बार देखा जाता है. वर्षाबूंदों, हवा, संयंत्र, पशु और मानव छू, यहां तक कि पशु के काटने, सभी mechano-stimuli के विभिन्न प्रकार है कि पौधों में बल संकेत ट्रिगर माना जाता है4,5. पादप थाइग्मोमॉर्फोजनन के लक्षणों में बोल्टिंग की देरी, एक छोटा तना, शाकीय पौधों में छोटे रोज़ेट/लीफ आकार और वुडी पौधों में मोटा तना6,7,8शामिल है । यह मिमोसा संयंत्र या अन्य मेको-संवेदी दाखलताओं में पाए जाने वाले थिग्मोनेस्टिक या थिग्मोट्रोपिक प्रतिक्रिया के विपरीत है, जहां इन त्वरित स्पर्श प्रतिक्रियाओं को1,9,10देखा जा सकता है । दूसरी ओर, थिग्मोमॉर्फोजनन, इसकी धीमी वृद्धि प्रतिक्रिया के कारण अपेक्षाकृत कठिन है। Thigmomorphogenesis आमतौर पर सप्ताह या निरंतर बल लोड उत्तेजना के वर्षों के बाद मनाया जाता है. संयंत्र स्पर्श प्रतिक्रिया की यह अनूठी प्रकृति यह मुश्किल एक मजबूत तरीके से स्पर्श बल संकेत प्रतिरोधी उत्परिवर्ती को अलग करने के लिए मानव हाथ स्पर्श उत्तेजना का उपयोग कर एक आगे आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए बनाता है।

बल संकेत transduction रास्ते और thigmomorphogenesis6,11अंतर्निहित आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए पिछले6में किया गया है, 12,13,14. इन अध्ययनों का प्रस्ताव किया है कि संयंत्र बल संकेत रिसेप्टर्स मुख्य रूप से mechanosensitive आयन चैनलों से मिलकर बनता है (एमएससी) और tethered एमएससी परिसरों झिल्ली spanning प्रोटीन के multimeric परिसरों द्वारा रचित11,14 , 15. कोशिकाद्रव्यी Ca2 + क्षणिक स्पाइक प्रारंभिक स्पर्श के सेकंड के भीतर उत्पन्न. पवन, वर्षा, या ग्रेवी-उत्तेजना डाउनस्ट्रीम कैल्शियम सेंसरके साथ बातचीत कर सकते हैं ताकि बल संकेतों को परमाणु घटनाओं14,16,17,18में स्थानांतरित किया जा सके . आणविक और सेलुलर अध्ययन के अलावा, पौधों की मैनुअल उंगली छू के साथ आगे आनुवंशिक स्क्रीन पाया गया है कि phytohormones और माध्यमिक चयापचयों के परिणामस्वरूप स्पर्श प्रेरक (TCH) जीन अभिव्यक्ति में शामिल हैं निम्नलिखित स्पर्श बल लोड हो रहा है13,19. उदाहरण के लिए, aos और opr320 उत्परिवर्ती इस प्रकार आनुवंशिक अध्ययन से अब तक की पहचान की गई है. हालांकि, thigmomorphogenesis के अध्ययन में आगे आनुवंशिकी के आवेदन के साथ जुड़े प्रमुख समस्या अभी भी गहन स्पर्श प्रतिक्रिया के स्तर की मात्रा निर्धारित करने और आनुवंशिक रूप से उत्परिवर्तित की एक बड़ी आबादी को छूने के लिए आवश्यक श्रम है व्यक्तिगत पौधों. समय लेने वाली समस्या भी हाथ छू आधारित उत्परिवर्ती स्क्रीन14,20में बनी हुई है. एक उदाहरण के लिए, स्पर्श बल उत्तेजना के एक दौर को पूरा करने के लिए, एक व्यक्ति को एक व्यक्ति के संयंत्र पर 30-60 बार (प्रति सेकंड एक स्पर्श) को छूने की जरूरत है. सांख्यिकीय फीनोटाइप विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या में पौधों के लिए, एक ही जीनोटाइप के 20-50 अलग-अलग पौधों को सामान्य रूप से स्पर्श बल लदान प्रक्रिया के लिए आवश्यक है। इस स्पर्श बल लोडिंग शासन का मतलब है कि एक व्यक्ति को बार-बार पसंद के एक जीनोटाइप पर 600-3,000 छू प्रदर्शन करने की जरूरत है। स्पर्श के इस प्रकार के सामान्य रूप से 3 से 5 राउंड एक दिन है, जो लगभग 1,800-15,000 उंगली या कपास झाड़ू पौधों के प्रति जीनोटाइप प्रति दिन छू के बराबर होती है दोहराया जाना चाहिए. एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित व्यक्ति सामान्य रूप से बल और शक्ति में बड़ी भिन्नता से बचने के लिए एक दिन में पुनरावृत्ति के कई दौर भर में एक वांछनीय सीमा के भीतर कई छू के बल को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। के रूप में यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि thigmomorphogenesis एक saturable और खुराक पर निर्भर प्रक्रियाहै 6,21, स्पर्श बल /

व्यक्ति पर निर्भर स्पर्श बल लोड हो रहा है को दूर करने के लिए और एक स्वीकार्य त्रुटि सीमा14के भीतर यांत्रिक आवेदन को बनाए रखने के लिए, इसलिए हम हाथ से हेरफेर छू बदलने के लिए एक स्वत: स्पर्श बल लोडिंग मशीन बनाया गया है। मशीन 4 चलती हथियार बनाया है, जिनमें से प्रत्येक एक मानव बाल ब्रश के साथ सुसज्जित है. इस संस्करण मानव बाल स्पर्श बल लोड हो रहा है की अपनी सुविधा निर्दिष्ट करने के लिए मॉडल K1 नाम दिया गया है. यदि 4 जीनोटाइपों को एक मशीन के अंतर्गत उनके thigmomorphogenesis या स्पर्श प्रतिक्रिया के लिए मात्रात्मक रूप से मापा जाता है, तो प्रति जीनोटाइप 40-48 व्यक्तियों को मापा जा सकता है। स्पर्श पुनरावृत्ति के प्रत्येक दौर (प्रति संयंत्र स्पर्श के कम से कम 60 बार) एक चलती गति समायोज्य रोबोट हाथ का उपयोग कर कम से कम 5 मिनट तक रहता है. इस प्रकार, एक मॉडल K1 स्पर्श मशीन पर पौधों यंत्रवत् कई दौर के लिए एक दिन में या तो एक निरंतर स्पर्श बल लोड हो रहा है या ताकत के विभिन्न स्तरों के साथ के रूप में शुरू में क्रमादेशित प्रेरित किया जा सकता है.

Arabidopsis thaliana,एक मॉडल संयंत्र जीव, इसलिए पूरी तरह से स्वचालित बाल स्पर्श बल लोडिंग मशीन आवेदन के परीक्षण के लिए लक्ष्य संयंत्र प्रजातियों के रूप में चुना गया था. क्योंकि वहाँ कई बड़े seedbanks म्यूटेंट के विभिन्न gerplasms और फूल के आकार को पुन: प्राप्त करने के लिए उपलब्ध हैं, Arabidopsis मॉडल K1 स्पर्श मशीन के साथ घुड़सवार विकास शेल्फ में उपलब्ध अंतरिक्ष के लिए अच्छी तरह से फिट बैठता है.

मॉडल K1 स्वत: स्पर्श मशीन तीन प्रमुख घटकों के होते हैं: (1) एच आकार धातु दो बेल्ट चालित रैखिक actuators द्वारा रचित रैक, (2) रोबोट धातु बाल ब्रश से लैस हथियार, और (3) एक नियंत्रक. एक अनुकूलित मॉडल K1 स्पर्श मशीन के लिए, प्रत्येक X/Y अक्ष मॉड्यूल एक बेल्ट चालित गाइड-रेल, दो स्लाइड ब्लॉक (लाल) और एक 57 stepper मोटर (पूर्व स्थापित और dismountable) से बना है (चित्र 1ए,बी). ऊपरी क्षैतिज actuator रोबोट धातु हाथ छोड़ दिया और सही क्षैतिज स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है, कम ऊर्ध्वाधर बेल्ट चालित रैखिक actuator रोबोट धातु हाथ ऊपर और नीचे खड़ी स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है (चित्र 1बी, चित्रा 2ए ). चार डिसमाउंटेबल रोबोटिक आर्म्स ऊर्ध्वाधर प्रवर्तक पर लगाए गए थे (चित्र 1ब्, चित्र 2ठ) . चार मानव बाल ब्रश क्रमशः चार रोबोटिक आर्म्स से बंधे हुए थे (चित्र 1ब्, चित्र 2ठ) । नीचे बोल्ड ्ड फ़ॉन्ट में मॉडल K1 स्पर्श मशीन का निर्माण करने के लिए सभी यांत्रिक भागों चित्र 1C में चिह्नित हैं (सामग्री की तालिकाभी देखें)।

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Protocol

1. बीज तैयार करना

नोट: दोनों जंगली प्रकार के Arabidopsis बीज (कोल-0) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से mkk1 और mkk2 नुकसान के समारोह उत्परिवर्ती इस्तेमाल किया Arabidopsis जैविक संसाधन केंद्र (ABRC, https://www.arabidopsis.org, कोलंबस, OH) से खरीदा गया था.

  1. गणना कितने संयंत्र प्रत्येक जीनोटाइप के व्यक्तियों एक विश्वसनीय सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. प्रत्येक पंक्ति के अंकुरण दर के आधार पर पर्याप्त संख्या में बीज तैयार कीजिए, जो प्रयोग के लिए आवश्यक तुलना में 4-5 गुना अधिक होती है। सुनिश्चित करें कि पर्याप्त संख्या में स्वस्थ और वर्दी के आकार के पौधों को स्पर्श प्रतिक्रिया परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के अनुसार, प्रति जीनोटाइप 300-500 बीज आमतौर पर समान आकार के 80-90 पौधों का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है।
  2. ठंडे पानी में बीज विसर्जित कर के लिए और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर (अंधेरे में रखने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर) बीज आत्मसात के लिए। आत्मसात करने के 5-7 दिन बाद बीज बोएं।

2. संयंत्र की वृद्धि

  1. पादप वृद्धि के लिए उपयुक्त मृदा का चयन कीजिए (सामग्री सारणीदेखिए ) बड़े झुरमुटों से बचें और उन्हें समरूप रूप से मिलाएं।
  2. 24 प्लास्टिक कप तैयार करें: होल्डिंग क्षमता 207 एमएल है और ऊपरी रिम व्यास सिंचाई के उद्देश्य के लिए एक कप के नीचे ड्रिल तीन गोल छेद 7.4 सेमी है।
  3. मिश्रित मिट्टी के साथ इन प्लास्टिक के कप भरें. कप रिम की तुलना में 1-2 सेमी अधिक मिट्टी को जमा करने दें और ढेर की मिट्टी की सतह को धीरे से समतल करें।
  4. एक प्लास्टिक ट्रे (21 इंच x 10.8 इंच x 2.5 इंच) में 24 कप स्थानांतरण और लगातार प्रकाश हालत के तहत ट्रे जगह (नीचे देखें).
  5. बीज बोने से दो घंटे पहले प्रत्येक ट्रे में 2.5 L पानी डालें। कप के तल पर स्थित छेद से पानी को अवशोषित करने के लिए मिट्टी को अवशोषित करने दें और कप रिम स्तर तक जाने के लिए मिट्टी की सतह की प्रतीक्षा करें।
  6. एक ही स्थान में 3-4 बीज बोना, और 4 समान रूप से एक कप के भीतर धब्बे वितरित.
  7. प्रत्येक ट्रे के ऊपर एक पारदर्शी प्लास्टिक कवर रखें, और बीज एक सप्ताह के लिए अंकुरित होने दें। फिर कवर को हटा दें और अंकुरों को एक सप्ताह के लिए बढ़ने दें।
  8. thinning द्वारा अतिरिक्त पौधों को निकालें और बीज बुवाई के बाद 9-10 दिनों के प्रत्येक कप में इसी तरह के आकार के 4 पौधे व्यक्तियों रखें।
  9. बीज अंकुरित होने के बाद हर दूसरे दिन 1.5 एल पानी के साथ पौधों को सिंचाई करें।

3. विकास की स्थिति

  1. वृद्धि कक्ष का तापमान 23.5 - 1.5 डिग्री सेल्सियस और आर्द्रता 35 से 45% के बीच निर्धारित करें।
  2. प्रकाश तीव्रता 180 से 240 डिग्रीउ-2-2 (आईएल 1700 अनुसंधान रेडियोमीटर, इंटरनेशनल लाइट द्वारा मापी गई)14के बीच निर्धारित की गई है। प्रकाश संश् लेषी सक्रिय विकिरण 90 से 120 डिग्रीउदृ-2े-1है।
  3. प्रकाश स्थिति को 24 ज स्थिरांक के रूप में सेट करें।

4. स्पर्श बल लोडिंग मशीन का निर्माण

नोट: यह रोबोट बाल स्पर्श बल लोडिंग मशीन (मॉडल K1) दोनों स्पर्श बल उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग और संयंत्र thigmomorphogenesis पीढ़ी के प्रयोजनों की सेवा करने के लिए डिज़ाइन किया गया है (चित्र 1, चित्र 2).

  1. पूर्व स्थापना मॉड्यूल (डिस्माउंटेबल, चित्रा 1C)
    1. दो स्लाइड ब्लॉक स्थापित करें (I) और एक 57 stepper मोटर (II) X/Y अक्ष गाइड-रेल मॉड्यूल (III/V)पर।
    2. X/Y अक्ष सहायक गर्डर (IV/VI)पर दो स्लाइड ब्लॉक स्थापित करें।
  2. अन्य यांत्रिक भागों की स्थापना (चित्र 1ग)
    1. गाइड-रेल के प्रत्येक छोर पर दो जंक्शन प्लेट (VII) को एक साथ संयोजन करके एक्स अक्ष गाइड-रेल मॉड्यूल (III) और एक्स अक्ष सहायक गर्डर (IV) को एक साथ ठीक करें।
    2. वाई अक्ष गाइड-रेल मॉड्यूल (V) को दो स्लाइड ब्लॉक (एक्स अक्ष) के पृष्ठीय पर एक क्रासिंग स्थिति में दो जंक्शन प्लेट (VIII) को बीच में एकत्र करके ठीक करें।
    3. वाई अक्ष सहायक गर्डर (VI) को बीच में दो संधि प्लेटों (VIII) को संयोजन करके क्रासिंग स्थिति में अन्य दो स्लाइड ब्लॉक्स (एक्स अक्ष) के पृष्ठीय पर ठीक करें।
    4. रोबोट आर्म्स (IX) के धारक को संधि प्लेट के साथ क्रासिंग स्थिति में दो स्लाइड ब्लॉक (Y अक्ष) के सामने इकट्ठा करना (चित्र 2क)।
    5. रोबोट हथियारों पर 4 बाल ब्रश (X) इकट्ठा (IX) clamps के साथ (चित्र 2बी) .

5. टच फोर्स लोडिंग मशीन सेटिंग

नोट: नीचे बोल्ड फ़ॉन्ट में मॉडल K1 स्पर्श मशीन सेट करने के लिए मानकों को नियंत्रित करने के सभी नियंत्रण कक्ष में दिखाए जाते हैं (चित्र 2एफ).

  1. रोबोट हथियारों पर स्पर्श बाल ब्रश स्थापित करें। मानव बालों की एक परत को ठीक करने के लिए एक धारक के रूप में एक 330 मिमी लंबी स्टील शासक का प्रयोग करें (3,600-4,600 बाल / बालों की लंबाई 126 मिमी है (चित्र 1ग)
  2. दो धातु clamps के साथ रोबोट हथियारों पर उन इस्पात शासकों को ठीक करें.
  3. पहले अनुलंब आयाम (Y अक्ष) के साथ मशीन आर्म की ऊँचाई सेट करें. प्रेस जोग एफ + बढ़ाने के लिए और जोग आर- रोबोट हथियार और ब्रश कम करने के लिए। बाल ब्रश की नोक कप रिम की तुलना में 0.5 सेमी कम करते हैं। शून्य सेटदबाएँ. सभी संयंत्र व्यक्तियों को छुआ जा रहा है सुनिश्चित करने के लिए मशीन 1-2 चक्र पूर्व चलाते हैं. समायोजित करें और पूरे छू अवधि के दौरान हर दिन एक ही ऊंचाई के लिए ब्रश और बाल सुझावों जांचना।
  4. स्पर्श बल (विपरीत लोडिंग) को मापने और 1-2 mN14पर स्पर्श बल स्तर को बनाए रखने के लिए एक इलेक्ट्रॉनिक पैमाने का उपयोग करें।
  5. क्षैतिज आयाम (एक्स अक्ष) मैन्युअल साथ मशीन हथियारों की प्रारंभिक स्थिति निर्धारित करें। बाल ब्रश प्रत्येक ट्रे के किनारे पर लटका और सुनिश्चित करें कि कोई संयंत्र छू प्रयोग शुरू होने से पहले छुआ जा रहा है बनाने के लिए अनुमति दें। प्रेस जोग F +/ जोगआर- शुरू स्थिति सेट करने के लिए थोड़ा से थोड़ा द्वारा मशीन हाथ ले जाने के लिए।
  6. यात्रा बटन दबाकर 365 मिमी करने के लिए क्षैतिज आयाम (एक्स अक्ष) में यात्रा दूरी बाल ब्रश सेट करें। प्रेस इंक एफ +/ इंकआर- एक पूर्ण यात्रा दूरी प्राप्त करने के लिए मशीन हथियारों को स्थानांतरित करने के लिए और सुनिश्चित करें कि इलाज पौधों के सभी पूरे छू प्रयोग के दौरान छुआ जा रहा है.
  7. ऑटो स्पीड बटन दबाकर 5,000 मिमी/मिनट पर मशीन हथियारों के एक्स अक्ष के साथ आंदोलन की गति निर्धारित करें। पूरे छू प्रयोग के दौरान एक ही आंदोलन की गति रखें.
  8. माइनर साइकिल बटन दबाकर 20 परीक्षणों पर स्पर्श समय निर्धारित करें। पूरे स्पर्श प्रयोग के दौरान प्रति राउंड एक ही संख्या को स्पर्श करें.
    नोट: एक माइनर चक्र दो यात्रा दूरी के बराबर होती है, जिसका अर्थ है कि मशीन हथियार प्रारंभिक स्थिति से अंत स्थिति में चले जाएंगे और फिर वापस प्रारंभिक स्थिति में जाएंगे। एक लघु चक्र दो छू उत्पन्न करता है. बाल ब्रश स्पर्श पौधों 40 बार के भीतर 20 परीक्षण (2 छू x 20 परीक्षण - 40 छू). 40 स्पर्श स्पर्श बल लोड हो रहा है के एक दौर होने के लिए परिभाषित किया गया है.
  9. मेजर अवधि बटन दबाकर प्रति दिन 480 मिनट पर स्पर्श दौर की पुनरावृत्ति अंतराल सेट करें। संपूर्ण स्पर्श प्रयोग के दौरान स्पर्श राउंड की समान आवृत्ति रखें.
    नोट: यह बाल ब्रश 3 राउंड एक दिन के लिए पौधों को छूने के लिए अनुमति देता है, और प्रत्येक दौर के बीच अंतराल समय 480 मिनट (8 ज) है। प्रदर्शित नीले नंबर प्रत्येक स्पर्श दौर के अंतराल समय के लिए खड़ा है. मशीन (लाल संख्या) नीचे उलटी गिनती 0000 करने के लिए बदल जाता है जब स्वचालित रूप से स्पर्श का एक नया दौर शुरू कर देंगे।
  10. 12 परीक्षणों में मेजर साइकिल सेट करें, जिसका अर्थ है कि मशीन स्वचालित रूप से 4 दिनों की अवधि के भीतर 12 राउंड के लिए पौधों को छू जाएगी। 12 परीक्षणों की इस सेटिंग को छूने के एक दिन लंघन में मानव त्रुटि से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  11. पूर्व-निर्धारित प्रोग्राम आरंभ करने के लिए प्रारंभ बटन दबाएँ. मॉडल K1 स्पर्श मशीन स्वचालित रूप से सेटिंग्स के अनुसार स्पर्श बल लोड हो रहा है प्रदर्शन करेंगे.

6. शारीरिक डेटा संग्रह और विश्लेषण

  1. बोल्टिंग के लिएदिन: एक छू प्रयोग के भीतर व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक संयंत्र के बोल्टिंग दिन रिकॉर्ड. बोल्टिंग एक प्रतीक है कि एक संयंत्र वनस्पति चरण से प्रजनन चरण के लिए अपने विकास चरण में परिवर्तन है। Arabidopsis में, बोल्टिंग दिन एक संयंत्र द्वारा इस्तेमाल किया दिनों की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया है अपनी पहली पुष्पक्रम स्टेम लंबाई में 1 सेमी तक पहुँचने के लिए.
    नोट: ऊपर वर्णित विकास की स्थिति के तहत, जंगली प्रकार के पौधों की बोल्टिंग आम तौर पर बीज की बुआई के 19 से 23 दिनों के बाद शुरू होती है और 28-32 दिनों में समाप्त होती है।
  2. Rosette त्रिज्या:सबसे लंबे समय तक पत्ती की नोक करने के लिए rosette केंद्र से दूरी को मापने.
    1. ऊपर से पूरी ट्रे की तस्वीरें ले लो. नियंत्रण समूह और स्पर्श-उपचारित समूह की फ़ोटो अलग-अलग लें.
    2. उपयुक्त सॉफ़्टवेयर डाउनलोड करें। उदाहरण के लिए मुफ्त डाउनलोड सॉफ्टवेयर ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html) का प्रयोग करें.
    3. एक फोटो फ़ाइल खोलें, एक उपयुक्त आकार में तस्वीर ज़ूम करने के लिए ज़ूम समारोह का उपयोग करें।
    4. गुलाब के रंग के त्रिज्या को मापने के लिए सबसे लंबे समय तक पत्ती के गुलाब के केंद्र और टिप के बीच एक सीधी रेखा बनाने के लिए सीधे उपकरण चुनें।
    5. एक संयंत्र का चयन करें और सबसे लंबे समय तक पत्ती टिप करने के लिए rosette केंद्र से एक सीधी रेखा आकर्षित करने के लिए छोड़ दिया बटन दबाएँ।
    6. विश्लेषण-माप फ़ंक्शन चुनें या पंक्ति दूरी का विश्लेषण करने के लिए Ctrl + M दबाएँ.
    7. एक कप का चयन करें और एक ही समय में प्रत्येक प्लास्टिक कप के व्यास का विश्लेषण करने के लिए पिछले दो चरणों को दोहराएँ। फ़ोटो लेने से उत्पन्न पूर्वाग्रह को समाप्त करने के लिए परिकलन करने के लिए इन डेटा का उपयोग करें.
      नोट: समीकरण है:
      Ra/Da ] Rm/
      (आरए, एक संयंत्र के वास्तविक Rosette त्रिज्या; डीए, प्लास्टिक कप का वास्तविक व्यास; Rm, एक सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित एक ही संयंत्र के मापा Rosette त्रिज्या; Dm, प्लास्टिक कप का मापा हुआ व्यास जो एक ही पौधे को उगाने के लिए प्रयोग किया जाता है)
  3. रोजेटक्षेत्र: रोज़ेट पत्तियों के क्षैतिज 2-आयामी सतह क्षेत्र को मापें।
    1. गुलाब के बाकी अंगों को प्रभावित किए बिना पुष्पक्रम को हटा दें।
    2. पास में रखा एक पैमाने शासक के साथ एक साथ प्रत्येक संयंत्र के ऊपर से तस्वीरें ले लो।
    3. ImageJ, Rosette ट्रैकर के एक मुक्त प्लगइन का प्रयोग करें और पहले22प्रकाशित प्रोटोकॉल का पालन करें.

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Representative Results

स्वचालित बाल स्पर्श बल लोडिंग मशीन
पौधों पर रूपात्मक परिवर्तनों के प्रेक्षण के लिए, पुन: उत्पादनीय वृद्धि की स्थिति और उपचार के तरीके दोनों दोहराए जाने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस उच्च throughput और स्वत: स्पर्श बल संकेत उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग नव निर्मित बाल स्पर्श बल लोडिंग मशीन, मॉडल K1 (चित्र1, चित्र 2) द्वारा हासिल की है. ये बाल ब्रश एक साथ पौधों की 4 ट्रे की एक अधिकतम स्पर्श कर सकते हैं. ट्रे में 24 कप रखे गए थे, और एक समूह में 12 कप पौधे थे जिनका उपयोग नियंत्रण और उपचारित पौधों दोनों के रूप में किया जाता है (चित्र 2सी,डी)। प्रत्येक कप में, चार पौधों बड़े हो रहे थे और 48 या कम संयंत्र व्यक्तियों की कुल एक ही बाल ब्रश, जो बाद में सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त पौधों की गारंटी देता द्वारा छुआ गया. पौधों की एक अधिकतम 4 जीनोटाइप एक मॉडल K1 स्पर्श मशीन पर एक साथ स्पर्श किया जा सकता है। मुख्य बिंदुओं में से एक स्पर्श मशीन हाथ / बाल ऊंचाई की स्थापना है क्योंकि thigmomorphogenesis खुराक पर निर्भरहै 6,21. संयंत्र rosette पत्ती की स्थिति के संबंध में विभिन्न बाल पदों अलग स्पर्श बलों उत्पन्न करते हैं, जो पूरी तरह से अलग thigmomorphogenesis परिणाम उत्पन्न कर सकते हैं. हमारे प्रयोगों में, बालों के पौधे से संपर्क टिप को कप रिम से 0.5 सेमी कम रखा जाना चाहिए (चित्र 2ई),जो पहले प्रकाशित स्पर्श बल14के समान बलों को उत्पन्न करता है। एक स्पर्श पैनल में स्थापित एक प्रोग्राम ेबल नियंत्रक पूरे स्पर्श बल लोडिंग मशीन को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्र 2एफ, सामग्री की तालिकादेखें) .

दो अलग स्पर्श विधियों की तुलना
पारंपरिक मैन्युअल रूप से कपास झाड़ू छू विधि के साथ इस स्वत: मशीन चालितबाल विधि की तुलना करने के लिए, दो स्वतंत्र प्रयोगों कोल-0 पर प्रदर्शन किया गया (चित्र 3)। कपास झाड़ू स्पर्श समूह में, छू 12 दिन पुराने पौधों से शुरू कर दिया. प्रत्येक दौर में 40 छू (1 स्पर्श / कुल मिलाकर, प्रत्येक दिन 3 राउंड किए गए (चित्र 3ए)। यह एक सतत कपास झाड़ू स्पर्श उपचार के बाद बोल्टिंग में देरी के 1.7 दिनों से पता चला (22.1 - 0.2 दिन बनाम 23.8 - 0.2 दिन). इसी तरह, स्वचालित मशीन चालित हेयर टच के लिए, 14 दिन पुराने पौधों से शुरू की गई टच-फोर्स लोडिंग और 40 बार स्पर्श (3 मिनट के भीतर) एक दौर के लिए आवेदन किया गया था। कुल मिलाकर, स्पर्श के 3 राउंड एक दिन में पूरे 8 घंटे के अंतराल के साथ निष्पादित किए गए (चित्र3ठ)। कोल-0 पौधों के लिए विलंबित बोल्टिंग देखी गई. औसत बोल्टिंग समय 23.0 - 0.3 दिन था, जबकि मॉडल K1 स्पर्श मशीन का इलाज पौधों का बोल्टिंग समय 24.7 - 0.2 दिन था। नियंत्रण और स्पर्श उपचार संयंत्रों के बीच मतभेद फलस्वरूप univariate कॉक्स आनुपातिक-खतरों मॉडल के साथ विश्लेषण किया गया. इसने 0.31 (कॉटन स्वैब टच) और 0.52 (मशीन चालित हेयरटच) के अनुमानित जोखिम अनुपात (एचआर) की पेशकश की , जिसका अर्थ है कि छुआ समूह में पौधों का बोल्टिंग जोखिम/ नियंत्रण समूह में पौधों, क्रमशः. यह इंगित करता है कि छुआ जंगली प्रकार के पौधों के बोल्टिंग की संभावना के आसपास है के रूप में अछूता नियंत्रण पौधों की तुलना में है कि क्या यह एक कपास झाड़ू या स्वचालित बाल स्पर्श के साथ मैनुअल स्पर्श है की तुलना में.

अलग स्पर्श म्यूटेंट पर संभावित परिणाम
हाल के प्रारंभिक आंकड़ों से पता चलता है कि एमकेके1 और एमकेके2 अरबोडोप्सिस14के स्पर्श प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं . हमने इन दो म्यूटेंटों का चयन किया और स्वचालित बाल स्पर्श-बल लदान मशीन का उपयोग करके इन putative स्पर्श प्रतिक्रिया म्यूटेंट पर स्पर्श प्रयोगों का आयोजन किया (चित्र 4,तालिका 1)। जंगली प्रकार के नियंत्रण संयंत्रों में 1.8 दिन बोल्टिंग देरी (24.1 ] 0.3 दिन बनाम 25.9 - 0.2 दिन, चित्र 4ए) ठीक उसी तरह से दिखाया गया है, जैसा कि पिछली रिपोर्ट14 की तरह है, जबकि इस बोल्टिंग विलंब को टी-डीएनए आविष्णन उत्परिवर्ती, mkk1 (24.6 ] 0.2 पर नहीं देखा गया था दिन बनाम 24.4 - 0.3 दिन, चित्र 4बी और तालिका 1) और mkk2 (23.9 ] 0.1 दिन बनाम 24.2 - 0.2 दिन, चित्र ांवः१) एकवैरिटेट कॉक्स आनुपातिक-खतरों मॉडल के साथ इन आंकड़ों का विश्लेषण करके, केवल जंगली प्रकार कर्नल-0 नियंत्रण के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर का प्रदर्शन किया और 0.41 के एक अनुमानित मानव संसाधन के साथ पौधों को छुआ (चित्र 4डी)। इन स्पर्श बल लोड हो रहा प्रयोगों स्वत: बाल स्पर्श बल लोड हो रहा है मशीन द्वारा आयोजित प्रदर्शन किया है कि mkk1 और mkk2 म्यूटेंट स्पर्श प्रतिक्रिया उत्परिवर्ती हैं.

अन्य आकृतिक सूचकांकों का माप
thigmomorphogenesis के साथ जुड़े morphological परिवर्तन बोल्टिंग के देरी तक ही सीमित नहीं हैं. छोटे तने और छोटे रोज़ेट के पत्तों के आकार दोनों ही थगमोमॉर्फोजेनेस6,7,9,14के घटक हैं . इसलिए हमने यहाँ स्पर्श अनुक्रिया के रूपात्मक सूचकांकों, रोज़ेट त्रिज्या/लीफ लंबाई तथा रोज़ेट (प्रक्षेपित) क्षेत्रफल (चित्र5)पर दो अतिरिक्त प्रकार के मापन की सूचना दी। पहले से मनाया phenotype परिवर्तन करने के लिए इसी तरह, जंगली प्रकार कर्नल-0 संयंत्र काफी छोटे गुलाब त्रिज्या और लगातार और दोहराव स्वत: मशीन चालित बाल स्पर्श के 3 दिनों के बाद कम पत्ती लंबाई से पता चला (1.77 - 0.05 सेमी बनाम 1.50 - 0.04 cm, चित्रा 5A). अनुमानित रोज़ेट क्षेत्र को 20.32 से 0.53 सेमी2 से 16.19 डिग्री 0.48 सेमी2 13 दिनों के स्पर्श के बाद बदल दिया गया था (चित्र 5ठ)। दोनों mkk1 और mkk2 समान कम rosette त्रिज्या और क्षेत्र था. एक साथ लिया, इन आंकड़ों का प्रदर्शन किया है कि MKK1 और MKK2 प्रोटीन Arabidopsis के बोल्टिंग देरी के लिए महत्वपूर्ण हैं और rosette आकार और rosette क्षेत्र को आकार देने में आवश्यक नहीं है.

सांख्यिकीय विश्लेषण
चित्र 2 और चित्र 3 में दिखाए गए बॉक्स और व्हिस्की प्लॉट्स और चित्र 5में दिखाए गए कॉलम चार्ट के अनुसार, सांख्यिकीय महत्व का विश्लेषण दो पूंछ वाले छात्र के टी-परीक्षण द्वारा किया गया था, जिसका महत्व * * * और एन.एस. [lt; 0.001 और p gt; 0.05, क्रमशः. चित्र 2 और चित्र 3में दिखाए गए काप्लान-मेयर भूखंडों के लिए बोल्टिंग घटना23,24पर स्पर्श उपचार के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक एकवैवारी कॉक्स खतरा विश्लेषण का उपयोग किया गया था . खतरा अनुपात (मानव संसाधन), 95% विश्वास अंतराल (95% सीआई) और च मूल्य नीचे दी गई तालिकाओं में पेश किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, मानव संसाधन - 0ण्5 का अर्थ है कि एक विशिष्ट दिन पर, स्पर्शित समूह में पौधों का बोल्टिंग जोखिम/संभाव्यता नियंत्रण समूह के उन पौधों की तुलना में 0.5 या 50% थी।

Figure 1
चित्र 1 . निर्माण और स्वत: बाल स्पर्श बल लोडिंग मशीन के मापदंडों. (ए) रैखिक प्रेक्टिसर की डिफ़ॉल्ट योजनाबद्ध। ऊपरी बाएँ पैनल पार्श्व दृश्य है और निचले बाएँ पैनल पृष्ठीय दृश्य है. एक्स अक्ष मॉड्यूल और वाई अक्ष मॉड्यूल की कुल लंबाई 843 मिमी और 1,038 मिमी, क्रमशः कर रहे हैं. प्रत्येक डिफ़ॉल्ट X/Y मॉड्यूल एक गाइड-रेल, एक स्लाइड ब्लॉक और एक 57 stepper मोटर (पूर्व स्थापित और dismountable) से बना है। एक अनुकूलित मॉडल K1 स्पर्श मशीन के लिए, प्रत्येक X/Y मॉड्यूल दो स्लाइड ब्लॉक (लाल) से बना है। एक्स मॉड्यूल के जंक्शन प्लेट 56 मिमी से 100 मिमी करने के लिए बेहतर कनेक्शन और समर्थन की पेशकश करने के लिए बढ़ा दिया है. ऊपरी दाएँ पैनल गाइड रेल के पार अनुभाग है और कम सही पैनल 57 stepper मोटर है. (बी) निर्मित डबल एक्स अक्ष और डबल वाई अक्ष रैखिक actuators के Schematics. यह स्पर्श बल लोडिंग मशीन का प्रमुख हिस्सा है। निम्न बाएँ फलक का निर्माण रैखिक actuators के पृष्ठीय दृश्य है. ऊपरी बाएँ फलक एक्स अक्ष मॉड्यूल (843 मिमी) के पार्श्व दृश्य है. मध्य पैनल Y अक्ष मॉड्यूल (1,038 मिमी) के पार्श्व दृश्य है. ऊपरी दाएँ पैनल वाई मॉड्यूल और वाई सहायक गर्डर पर 4 स्लाइड ब्लॉकों के पृष्ठीय दृश्य है। निचले दाएँ फलक X मॉड्यूल पर जंक्शन प्लेट का पृष्ठीय दृश्य है। (ग) मशीन भाग असेंबली का प्रवाहचार्ट। विभिन्न भागों को चिह्नित किया गया है और आंकड़ा में नाम है। प्रोटोकॉल में विस्तृत संयोजन प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया था। दिखाया गया इकाई यह आंकड़ा मिमी है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . स्वचालित बाल स्पर्श बल लोडिंग मशीन के समग्र डिजाइन. (ए) समाप्त मॉडल K1 स्पर्श मशीन. फोटो सामने की ओर से लिया गया था. ऊपरी रैखिक प्रवर्तक क्षैतिज रूप से आगे बढ़रहे रोबोट हाथ को नियंत्रित करता है और निचले रैखिक प्रवर्तक रोबोट हाथ को ऊर्ध्वाधर रूप से हिलाता हुआ नियंत्रित करता है। (ख) पार्श्व दृश्य जिसमें अगम्य रोबोटिक हथियार दिखाई देते हैं। रोबोटिक आर्म्स पर हेयर ब्रश लगा दिए गए थे। (सी और डी) तस्वीरें दिखा कैसे मानव बाल ब्रश पौधों को छूने, जो सामने की ओर से लिया गया था और पार्श्व की ओर, क्रमशः. (ई) पार्श्व दृश्य दिखा कैसे कप रिम के खिलाफ बाल ब्रश की ऊंचाई निर्धारित करने के लिए. दोनों मशीन हथियार और बाल ब्रश दिखाई दे रहे हैं. (एफ) मॉडल K1 स्पर्श मशीन के आपरेशन इंटरफ़ेस. एक स्पर्श पैनल (MT6070i) से लिंक एक प्रोग्राम नियंत्रक (AFPX-C30T) पूरी मशीन को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है। विस्तृत सेटिंग्स और ऑपरेटिंग कार्यविधियाँ प्रोटोकॉल में वर्णित हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . thigmomorphogenesis पर दो स्पर्श विधियों के प्रभाव की तुलना. (ए-बी) मैनुअल कपास झाड़ू स्पर्श (ए) की तुलना और मानव बाल स्पर्श क्रमशः स्वचालित स्पर्श बल लोडिंग मशीन (बी) द्वारा संचालित। बॉक्स और व्हिस्की भूखंडों बाएँ पैनल है, जो नियंत्रण समूह और छुआ समूह के बीच औसत बोल्टिंग दिन की तुलना दिखाने में दिखाए जाते हैं. मतलब - एसई दिखाया जाता है. सांख्यिकीय विश्लेषण एक छात्र के टी परीक्षण द्वारा किया गया था. p और lt पर महत्व; 0.001 * * * के रूप में दिखाया गया है। Kaplan-Meier भूखंडों के बीच में दिखाया गया है, जो विकास के समय (बुवाई के बाद के दिनों) पर बोल्टिंग पौधों का प्रतिशत हैं. सही पैनल अछूता नियंत्रण के प्रतिनिधि व्यक्तियों से पता चलता है और पौधों को छुआ है कि बोल्टिंग समय और पुष्पक्रम स्टेम ऊंचाई में अंतर दिखा. (ग) संक्षेप सारणी: नियंत्रण और स्पर्शित स्तंभों में संख्यात्मक संख्यासांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रयुक्त पादप संख्या है। खतरा अनुपात (मानव संसाधन), 95% विश्वास अंतराल (95% सीआई) और एकुणता कॉक्स खतरा विश्लेषण के अनुभाग के तहत पी मूल्य की पेशकश कर रहे हैं. छुआ समूह में पौधों की बोल्टिंग जोखिम और संभावना क्रमशः अछूता समूह की तुलना में 31% और 52% थी। एकचर कॉक्स खतरा विश्लेषण एसपीएसएस द्वारा अनुमान लगाया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . mkk1 और mkk2 म्यूटेंट के thigmomorphogenesis के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जंगली प्रकार संयंत्र (कोल-0) स्वत: बाल स्पर्श से प्रेरित. (ए -सी) कोल-0 (ए ), एमकेके1 (बी) और एमकेके2 (सी) की भावी स्पर्श प्रतिक्रिया स्वत: स्पर्श बल लोडिंग मशीन द्वारा संचालित मानव बालों को छूके की पुनरावृत्ति के माध्यम से उत्पन्न होती है. बॉक्स और मूंछ भूखंडों बाएँ पैनल में दिखाए जाते हैं, जो नियंत्रण समूह और छुआ समूह के बीच औसत बोल्टिंग दिन की तुलना कर रहे हैं. मतलब - एसई दिखाया जाता है. सांख्यिकीय विश्लेषण एक छात्र के टी परीक्षण द्वारा किया गया था. ** और n.s. क्रमशः p और lt; 0.001 और p gt; 0.05का प्रतिनिधित्व करते हैं। Kaplan-Meier भूखंडों के बीच में दिखाया गया है, जो विकास की अवधि में बोल्टिंग पौधों का प्रतिशत हैं (बुआई के बाद दिन). सही पैनल अछूता नियंत्रण के प्रतिनिधि व्यक्तियों और छुआ पौधों है कि बोल्टिंग अंतर दिखाने से पता चलता है. एमकेके1 (बी) और एमकेके2 (ब्) के आंकड़े क्रमशः दो और तीन जैविक प्रतिकृतियों से संकलित किए गए थे। प्रत्येक प्रतिकृति में प्रयुक्त विस्तृत पौधों की संख्या तालिका 1में दिखाई गई थी। (घ) संक्षेप तालिकाः नियंत्रण और स्पर्श स्तंभों के अंतर्गत ये संख्याएँ क्रमशः इन दोनों समूहों में उपयोग/विश्लेषणित की गई थीं। मानव संसाधन, 95% सीआई और एकवैचर कॉक्स खतरा विश्लेषण के अनुभाग के तहत पी मूल्य की पेशकश की गई थी. स्पर्शित समूह में जंगली प्रकार के पौधों का बोल्टिंग जोखिम/संभाव्यता नियंत्रण समूह की तुलना में 41% है। एकचर कॉक्स खतरा विश्लेषण एसपीएसएस द्वारा अनुमान लगाया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 . thigmomorphogenesis को परिभाषित करने के लिए गुलाब त्रिज्या और क्षेत्र माप. (ए-बी) बीज की बुआई के बाद क्रमश: 17 दिन और दिन 27 दिन में गुलाब का त्रिज्या तथा गुलाब का क्षेत्र मापा जाता था। ऊपरी बाएँ फलक में दिखाए गए बार क्रमशः नियंत्रण समूह और स्पर्शित समूह के बीच या तो rosete त्रिज्या या rosette क्षेत्र की तुलना कर रहे हैं. मतलब - एसई दिखाया जाता है. सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-परीक्षण द्वारा किया गया था; च;lt; 0.001| ऊपरी दाएँ पैनल में दिखाए गए चित्र प्रतिनिधि व्यक्तिगत पौधे हैं। नीचे दी गई संक्षेप तालिकाएँ नियंत्रण समूह और स्पर्शित समूह में विश्लेषित पौधों की संख्या दर्शाती हैं। दिन में दोनों रोज़ेट त्रिज्या (सेमी) और रोजेट क्षेत्र (सेमी2) दिन में 27 भी दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Table 1
तालिका 1. विभिन्न जैविक प्रतिकृति के बोल्टिंग डेटा। संक्षेप ित् स में मक्क1 की दो जैविक प्रतिकृतियां तथा मक्क2की तीन जैविक प्रतिकृतियां होती हैं।

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Discussion

Thigmomorphogenesis यांत्रिक क्षोभ की दिशा में एक जटिल संयंत्र वृद्धि प्रतिक्रिया है, जो सेलुलर संकेतन और phytohormones की कार्रवाई का एक नेटवर्क शामिल है. यह पौधों के अनुकूली विकास का परिणाम है जो अवांछनीय पर्यावरणीय परिस्थितियों25,26में जीवित रहते हैं . यांत्रिक स्पर्श, विशेष रूप से मानव उंगली स्पर्श और हाथ से आयोजित कपास झाड़ू स्पर्श, पहले thigmomorphogenetic अध्ययन14,20में इस रूपात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए चुना गया है. संयंत्र स्पर्श प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए स्पर्श बल लोड करने के इस सरलीकृत संस्करण को नियंत्रित करने और लागू करने के लिए आसान है। इसके अतिरिक्त, इस प्रकार की स्पर्श-बल लदान विधि किसी प्रकार से प्राकृतिकवातावरणमें उत्पादित पवन और वर्षा-प्रेरित बल संकेतों की नकल कर सकती है। स्पर्श बल कैल्शियम spikes को गति प्रदान करने में सक्षम है, प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन14 और डाउनस्ट्रीम जीन अभिव्यक्ति मध्य स्पर्श प्रतिक्रिया19प्रेरित . इसी तरह, स्वचालित चलती बाहों पर घुड़सवार मानव बाल ब्रश भी मानव हाथ से हेरफेर छू नकल करके संयंत्र स्पर्श प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकते हैं. बल अनुप्रयोग के प्रकार में विविधता लाने के लिए, पानी छिड़काव नलिका और / अनूठी विशेषता morphogenetic और शारीरिक अध्ययन में स्वत: यांत्रिक बल लोड हो रहा है मशीन और अधिक बहुमुखी बनाता है. इस स्वत: यांत्रिक बल लोडिंग मशीन का सबसे बड़ा लाभ शायद अपने श्रम मुक्त, repeatable और समय की बचत सुविधा है, जो यह संभव mutagenized व्यक्तियों की एक बड़ी संख्या से एक विशिष्ट उत्परिवर्ती phenotype चयन प्रदर्शन करने के लिए बनाता है. मानव हाथ से हेरफेर छू के घंटे के विपरीत, मॉडल K1 स्पर्श मशीन विभिन्न म्यूटेंट एक साथ स्पर्श और 3 से 5 मिनट के भीतर स्पर्श का एक दौर पूरा कर सकते हैं. स्पर्श के एक दौर के लिए समय सीमा काफी हद तक उपचार की शुरुआत में कार्यक्रम की स्थापना पर निर्भर करता है. यदि प्रत्येक व्यक्ति संयंत्र एक दौर में 40 बार छुआ जाएगा, मॉडल K1 मशीन केवल 9-15 मिनट की आवश्यकता के लिए एक दिन के भीतर स्पर्श उपचार के तीन दौर खत्म होगा. छू के प्रत्येक दौर के बीच अंतराल समय ठीक नियंत्रित किया जा सकता है; यह मनुष्य के लिए इस तरह के एक परिशुद्धता को प्राप्त करने के लिए कम होने की संभावना है.

स्पर्श उपचार के बारे में एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि पौधों की वृद्धि की किस चरण पर स्पर्श बल लागू करने की आवश्यकता है। हमारे व्यवहार में, छू दोनों जंगली प्रकार और दो म्यूटेंट के लिए बीज बुवाई के बाद 14 दिनों के बाद शुरू कर दिया के रूप में इन तीन जीनोटाइप की वृद्धि दर समान हैं. जंगली प्रकार से विकास के समय में एक महत्वपूर्ण अंतर है कि उन म्यूटेंट के लिए, एक छू शुरू करने के लिए एक अलग प्रारंभिक दिन चुन सकते हैं। कई तुलना के लिए दोनों जंगली प्रकार के संयंत्र और म्यूटेंट के बोल्टिंग डेटा पर एक तरह से ANOVA परीक्षण प्रदर्शन14मदद कर सकते हैं। इस सांख्यिकीय विश्लेषण genotypes द्वारा उत्पन्न बोल्टिंग समय के अंतर के बारे में उचित निष्कर्ष की पेशकश कर सकते हैं. इस स्थिति में, एक बहुचर कॉक्स आनुपातिक खतरा विश्लेषण दो चर पैरामीटर पर विचार करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

मॉडल K1 स्पर्श मशीन पर घुड़सवार मानव बाल के स्पर्श बल स्तर सेट करने के लिए, हम दोनों ऊंचाई समायोजित (वर्टिकल बल) और गति (क्षैतिज बल) बाल ब्रश की (चित्र 2ई). सही सेटिंग्स एक इलेक्ट्रॉनिक पैमाने पर रखा एक Arabidopsis संयंत्र पर बल स्तर परीक्षण के कई दौर से एकत्र प्रारंभिक डेटा के आधार पर निर्धारित किया गया. जैसा कि हमने पाया है, दोनों बाल ऊंचाई और पूरे स्पर्श प्रतिक्रिया प्रयोग भर में अपरिवर्तित गति रखने के एक ही और निरंतर thigmomorphogenetic phenotype एक Arabidopsis लाइन के लिए प्रतिकृति के बीच का उत्पादन होगा. बहुत भारी एक स्पर्श बल युवा अंकुर ों को मार सकता है क्योंकि तेजी से चलती बाल ब्रश एक पत्ती की सतह पर घाव करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसके विपरीत, बहुत हल्का एक स्पर्श बल को छूने की पुनरावृत्ति के 2 सप्ताह के भीतर बोल्टिंग की देरी को ट्रिगर करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है। हमारे पिछले प्रयोग में, हमने 14, 19 प्रति स्पर्श 1-2 mN होने के लिए उपयुक्त स्पर्श-बल लोडिंग निर्धारितकीहै। कप रिम की तुलना में 0.5 सेमी कम के बाल लंबाई एक कोमल क्षैतिज चलती गति 5000 मिमी/ मॉडल K1 मशीन की यह निश्चित सेटिंग मानव त्रुटि से उत्पन्न बल शक्ति की भिन्नता कम कर देता है.

कुल मिलाकर, स्वचालित स्पर्श बल लोडिंग मशीन द्वारा प्रदर्शन किया बाल छू पौधों पर केवल एक औसत स्पर्श बल लोड हो रहा है प्रदान करते हैं. सटीक स्पर्श बल लागू, विशेष रूप से क्षैतिज बल भरी हुई है, या तो एक बाल या एक ब्रश पर बालों के एक समूह के लिए गणना करने के लिए मुश्किल है. इसके अलावा, पौधे के आकार और स्टेम ऊंचाई के विचरण क्षैतिज बल के आवेदन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. शारीरिक शक्ति या तनाव के इस तरह मापने एक और अधिक सटीक दबाव एक बाल या बालों के एक समूह से जुड़े सेंसर की जरूरत है. यह माना जाता है कि अधिक सटीक दबाव सेंसर और गणितीय मॉडलिंग भविष्य में स्वत: स्पर्श बल लोडिंग मशीन में सुधार करने के लिए लागू किया जाएगा. इस तरह के प्रकाश तीव्रता, मिट्टी की नमी और ग्रीनहाउस के तापमान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पोषक तत्वों की आपूर्ति के रूप में विकास की स्थिति, सभी स्पर्श प्रतिक्रिया phenotype विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. किसी भी तनाव की स्थिति, जैसे सूखा, 90 से कम केसाथ कमजोर प्रकाश की स्थिति-2 -1, और एक उच्च या कम तापमान जो Arabidopsis की सामान्य वृद्धि को प्रभावित कर सकता है, दोनों जंगली प्रकार की स्पर्श प्रतिक्रिया के माप के साथ हस्तक्षेप करेगा और उत्परिवर्ती.

संक्षेप में, यह स्वचालित स्पर्श-बल लोडिंग मशीन मानव उंगली स्पर्श और कपास झाड़ू स्पर्श की तुलना में अधिक श्रम-बचत और वर्दीधारी औसत स्पर्श बल लोड िंग की पेशकश कर सकती है। यह उम्मीद है कि मॉडल K1 स्पर्श मशीन विभिन्न उच्च throughput स्पर्श बल में लागू किया जाएगा उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग और कृषि फसलों या शायद पशु मॉडल के बीच स्पर्श बल लोड हो रहा है के कुछ संशोधनों के बीच स्पर्श प्रतिक्रिया विश्लेषण संकेत मशीन.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह अध्ययन निम्नलिखित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: 31370315, 31570187, 31870231 (चीन के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, एओई/ लेखक चित्र 1में दिखाए गए कई schematics की अपनी पेशकश के लिए जू फेंग प्रेसिजन और स्वचालन प्रौद्योगिकी लिमिटेड (Shenzhen, चीन) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

लेखक भी स्पर्श बल लोडिंग मशीन के विकास के लिए उनके योगदान के लिए एस के Cheung और डब्ल्यू सी ली शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 hair brushes customized
4 robot arms with one holder customized 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm
57 stepper motor 57HS22-A
All purpose potting soil Plantmate, Hong Kong
Arabidopsis plant seeds Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH For arabidopsis seed purchase
BIO-MIX potting substratum Jiffy Products International BV, the Netherlands 1000682050 Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and  BIO-MIX is 1:2
IL 1700 research radiometer International Light, Newburyport, MA The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured.
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html Free downloaded software
Ju Feng Precision and Automation Technology Limited Shenzhen, China For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase
Junction plate of the slide block To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks
Junction plate of the X axis module customized To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder
Slide block
WDT4045 X axis guide-rail module 843 mm, customized Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor
WDT4045 Y axis guide-rail module 1038 mm, customized Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor
X axis auxiliary girder 843 mm, customized Pre-installed with two slide blocks
Y axis auxiliary girder 1038 mm, customized Pre-installed with two slide blocks

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जीव विज्ञान अंक 150 बाल स्पर्श बल लोडिंग मशीन स्पर्श बल संकेतन thigmomorphogenesis MKK1/
एक मॉडल संयंत्र <em>Arabidopsis thaliana</em> के Thigmomorphogenesis के अध्ययन के लिए एक श्रम की बचत और दोहराने योग्य टच बल संकेतन उत्परिवर्ती स्क्रीन प्रोटोकॉल
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Wang, K., Law, K., Leung, M., Wong,… More

Wang, K., Law, K., Leung, M., Wong, W., Li, N. A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (150), e59392, doi:10.3791/59392 (2019).

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