Summary
一个温和的触摸力装载机是由人的头发刷,机械臂和控制器。发刷由安装在机器上的机械臂驱动,并定期移动,对植物施加触摸力。机器驱动的头发触摸强度可与手动应用的触摸强度相媲美。
Abstract
植物对细胞内和细胞外机械刺激(或力信号)作出反应,并产生特殊的形态变化,称为血性发生。在过去的几十年中,已经发现并报告了一些信号成分,这些成分参与了干扰(例如,钙离子结合蛋白和jasmonic酸生物合成酶)。然而,在力信号或异位磷发生研究中研究相对缓慢,主要归因于两个原因:需要人工操纵的触摸感应的异质性发生和力强度误差与人们的手触摸相关。为了提高植物有机体上外力装载的效率,建立了自动触摸力装载机。这款机械臂驱动式毛刷触感可提供省力且易于重复的触摸力模拟、无限轮的触摸重复和可调节的触摸强度。这种头发触摸力装载机可用于触摸力信号突变体的大规模筛选和植物造影的鸡学研究。此外,触摸材料,如人的头发,可以替代其他天然材料,如动物的头发,丝线和棉纤维。机器上的自动移动臂可配备喷水喷嘴和空气鼓风机,分别模拟雨滴和风的自然力。通过结合手工棉签触摸,结合这种自动发触摸力装载机,我们研究了两种力信号突变体MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) 和 MKK2 工厂的触摸响应.对触摸力加载的野生型植物和两种突变体的现象进行了统计评价。他们在触摸响应方面表现出显著差异。
Introduction
植物异质性是1973年由Jaffe,MJ所创建的术语。它是一种植物对流,但不同于众所周知的光动或重力引起的阳光或重力刺激2,3。它描述了与周期性机械刺激相关的表型变化,在早期4,5中,植物学家经常观察到这些改变。雨滴、风、植物、动物和人类接触,甚至动物叮咬,都被认为是不同类型的梅查诺刺激,触发植物4,5的力信号。植物异质性的特征包括螺栓的延迟、较短的茎、草本植物中较小的玫瑰花/叶大小,以及木本植物6、7、8的较厚茎。这与在米莫萨植物或其他对美茶敏感的藤蔓中经常发现的异体或地皮反应不同,在这些快速接触反应中更容易观察到1、9、10。另一方面,由于生长反应缓慢,因此相对难以观察到三角性发生。在连续的力载刺激后,通常观察三重磷发生。植物触摸反应的这种独特特性使得使用人手触摸刺激来分离抗触摸信号突变体的正向遗传屏幕变得困难。
为了阐明强力信号转导途径和分子机制,在过去6年进行了分子和细胞生物学实验。12,13,14.这些研究提出,植物力信号受体主要由机械敏感电通道(MSC)和系绳MSC复合物组成,由膜跨度蛋白11、14的多体复合体组成。,15.细胞质Ca2+瞬态尖峰在初始接触后几秒钟内生成。风、雨或重力刺激可能与下游钙传感器相互作用,将力信号转用于核事件14、16、17、18。除了分子和细胞研究外,用手动手指触摸植物的正向遗传屏幕发现,植物激素和继发代谢物与随后的接触诱导(TCH)基因表达有关。触摸力加载13,19 。例如,到目前为止,从基因研究中已经发现了aos和opr320突变体。然而,在血性发生研究中应用前向遗传学的主要问题仍然是定量触摸反应水平和接触大量基因突变所需的大量劳动。个别植物。耗时的问题也仍然存在于手触摸为基础的突变屏幕14,20。例如,要完成一轮触摸力刺激,一个人需要触摸单个植物30-60次(每秒一次)。为了有足够的植物进行统计表型分析,触摸力加载过程通常需要20-50个相同基因型的单个植物。这种触摸力加载机制意味着一个人需要重复执行600-3,000次触摸选择一个基因型。这种类型的触摸通常需要每天重复3至5轮,这相当于大约1,800-15,000指或棉拭子触摸每天每个基因型的植物。训练有素的人通常需要在一天的多轮重复中,在理想的范围内保持多重接触的强度和力量,以避免力量和力量的很大变化。众所周知,血性发生是一个可饱和和剂量依赖的过程6,21,触摸力/强度成为成功触发植物触摸反应的关键。
为了消除与人相关的触摸力载荷,并将机械应用保持在可接受的误差范围14内,我们设计了一个自动触摸力装载机,以取代手工操作的触摸。机器有4个移动臂,每个都配有一个人发刷。此版本名为模型 K1,以指定其人发触摸力加载功能。如果在一台机器下定量测量4个基因型的血性发生或触摸反应,可以测量每个基因型40-48个个体。每轮触摸重复(每株触摸不到 60 次)使用移动速度可调机械臂持续不到 5 分钟。因此,K1 型触摸机上的工厂可以机械地刺激一天多轮,或者具有恒定的触摸力负载或最初编程的不同强度级别。
阿拉伯植物有机体模型,因此被选为测试全自动头发触摸力装载机应用的目标植物物种。由于有几个大型种子库可用于检索突变体的各种种质和开花的大小,阿拉伯兰多普西斯非常适合安装在使用型号 K1 触摸机的生长架上可用的空间。
K1 型自动触摸机由三个主要部件组成:(1) 由两个皮带驱动的线性执行器组成的 H 形金属机架,(2) 配备发刷的机械金属臂,以及 (3) 控制器。对于定制的 K1 型触摸机,每个 X/Y 轴模块由一个皮带驱动导轨、两个滑动块(红色)和一个 57 步进电机(预安装和拆卸)组成(图 1A,B)。上部水平执行器允许机械臂左右水平移动,下部垂直皮带驱动的线性执行器允许机械臂垂直上下移动(图 1B,图 2A).垂直执行器上安装了四个可拆卸的机械臂(图1C,图2B)。四个人类发刷被绑定到四个机械臂上,分别(图1C,图2B)。图1C中标有下面用粗体字构建K1型触摸机的所有机械部件(另见材料表)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 种子制备
注:野生型(Col-0)以及mkk1和mkk2所用功能丧失突变体的种子从阿拉伯生物多样性生物资源中心(ABRC、https://www.arabidopsis.org、哥伦布、OH)购买。
- 计算将用每个基因型的植物个体数量进行可靠的统计分析。根据每行的发芽率准备足够数量的种子,通常比实验所需的种子多4-5倍。确保有足够的健康且均匀大小的植物可用于触摸响应测定。根据该协议,每个基因型300-500种子通常用于生产80-90株大小相似的植物。
- 将种子浸入冷水中,并储存在4°C(用铝箔覆盖,以保持在黑暗中)的种子浸渍。播种后5-7天浸渍。
2. 植物生长
- 选择适合植物生长的土壤(参见材料表)。避免大块,并均匀地混合它们。
- 准备24个塑料杯:保持能力为207 mL,上轮缘直径为7.4厘米。在杯子底部钻三个圆孔,用于灌溉。
- 用混合的土壤填充这些塑料杯。让土壤堆积到比杯边高1-2厘米的地方,轻轻地平平堆积的土壤表面。
- 将 24 个杯子转移到塑料托盘(21 英寸 x 10.8 英寸 x 2.5 英寸)中,并将托盘置于恒定的光照条件下(见下文)。
- 在播种前两小时,将2.5升水加入每个托盘。让土壤从位于杯子底部的孔中吸收水分,并等待土壤表面下降到杯边缘水平。
- 将 3-4 个种子播种到单个位置,在杯内将 4 个均匀分布的点放入其中。
- 在每个托盘上方放置一个透明的塑料盖,让种子发芽一周。然后取下盖子,让幼苗再长一个星期。
- 通过变薄去除多余的植物,并在种子播种后9-10天保持4个大小相似的植物个体。
- 种子发芽后,每隔一天用1.5升水灌溉植物。
3. 生长条件
- 将生长室的温度设定为 23.5 ± 1.5 °C,湿度在 35 到 45% 之间。
- 将光强度设置为 180 和 240 μE_m-2μs-1(IL 1700 研究辐射计测量,国际光)14。光合有源辐射为90至120μE_m-2μs-1。
- 将光照条件设置为 24 小时常量。
4. 触摸力装载机的建造
注:这种机器人头发触摸力加载机(型号K1)旨在用于触摸力信号突变筛选和植物异体生成(图1,图2)。
- 预安装模块(可拆卸,图1C)
- 将两个滑块(I)和一个57 步进电机 (II)安装到 X/Y 轴导轨模块(III/V)上。
- 将两个滑块 (I)安装到 X/Y 轴辅助梁(IV/VI)上。
- 安装其他机械部件(图1C)
- 通过在导轨两端装配两个接合板(VII),将 X 轴导轨模块(III)和 X 轴辅助梁(IV)固定在一起。
- 通过在两个接合板 (VIII) 之间装配两个接合板(VIII),将 Y 轴导轨模块(V)固定在两个滑动块(X 轴)的背板上。
- 通过在交叉位置装配两个接合板(VIII),将 Y 轴辅助梁(VI)固定在交叉位置的其他两个滑块(X 轴)的背上。
- 将机械臂(IX)的支架组装到两个滑块(Y 轴)的前部,在交叉位置使用接合板(图 2A)。
- 用夹子将 4 个发刷(X)组装到机械手臂(IX)上(图 2B)。
5. 触摸力装载机设置
注: 控制面板(图 2 F ) 显示了以粗体字体设置型号 K1 触摸机的所有控制参数(图 2F)。
- 在机械臂上安装触摸发刷。使用 330 毫米长的钢制尺作为支架,均匀地固定一层人的头发(3,600-4,600 根头发/刷)。头发的长度是126毫米 (图1C)。
- 用两个金属夹将钢制标尺固定在机械臂上。
- 首先沿垂直尺寸(Y 轴)设置机床臂的高度。按Jog F+升起,然后旋转 R-降低机械臂和刷子。让发刷的尖端比杯边低0.5厘米。按零设置。预运行机器 1-2 个循环,以确保接触所有工厂人员。在整个触摸期间,每天调整和校准画笔和发尖到相同的高度。
- 使用电子刻度测量触摸力(垂直加载),并将触摸力水平保持在 1-2 mN14。
- 手动沿水平尺寸 (X 轴) 设置机床臂的起始位置。允许发刷挂在每个托盘的边缘,并确保在触摸实验开始之前没有接触任何植物。按Jog F+/Jog R-水平移动机器臂,以设置起始位置。
- 按下"行程"按钮,将水平尺寸(X 轴)中的毛刷行驶距离设置为 365 mm。压榨公司 F+/Inc. R-移动机器臂以获得完整的行驶距离,并确保在整个触摸实验中接触所有经过处理的植物。
- 按下自动速度按钮,将机器臂的 X 轴上的移动速度设置为 5,000 mm/min。在整个触摸实验中保持相同的移动速度。
- 按下"次要循环"按钮,将触摸时间设置为 20 次试验。在整个触摸实验中,保持每轮相同数量的触摸。
注: 一个小循环等于两个行驶距离,这意味着机器臂将从起始位置移动到结束位置,然后返回起始位置。一个小循环产生两个触摸。毛刷在20次试验中接触植物40次(2次触摸x20次试验=40次)。40 触控定义为一轮触摸力加载。 - 按下"主要周期"按钮,将触摸循环的重复间隔设置为每天 480 分钟。在整个触摸实验中保持相同的触摸轮频。
注:这允许发刷每天接触植物3轮,每轮间隔时间为480分钟(8小时)。显示的蓝色数字代表每个触摸回合的间隔时间。当下面的倒计时(红色数字)变为 0000 时,机器将自动开始新一轮的触摸。 - 将主循环设置为 12 次试验,这意味着机器将在 4 天内自动接触工厂 12 轮。此设置为 12 次试验,用于避免跳过一天的触摸时出现人为错误。
- 按开始按钮启动预设程序。型号 K1 触摸机将根据设置自动执行触摸力加载。
6. 生理数据收集和分析
-
螺栓的天数:在一个感人的实验中分别记录每个工厂的螺栓日期。螺栓是植物从植物阶段到繁殖阶段的生长阶段的象征。在阿拉伯兰多普西斯,螺栓日期被定义为植物使用其第一个花序茎长度达到1厘米的天数。
注:在上述生长条件下,野生型植物的螺栓通常从种子播种后19至23天开始,在28-32天结束。 -
罗塞特半径:测量从玫瑰花角到最长叶尖的距离。
- 从顶部拍摄整个托盘的照片。分别拍摄对照组和触摸处理组的照片。
- 下载相应的软件。例如,使用免费下载的软件ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html)。
- 打开照片文件,使用缩放功能将照片缩放到适当的大小。
- 选择"直线"工具,在玫瑰花环中心和长叶尖之间绘制一条直线,以测量玫瑰花环半径。
- 选择一个植物,然后按左键从玫瑰花环到最长的叶尖绘制一条直线。
- 选择分析测量函数或按Ctrl + M分析线距离。
- 选择一个杯子,重复前两个步骤,同时分析每个塑料杯的直径。使用这些数据执行计算以消除拍照造成的偏差。
注:公式为:
Ra/Da = Rm/Dm
(Ra, 植物的实际罗塞特半径;Da, 塑料杯的实际直径;Rm,由软件测定的同一植物的测量罗斯特半径;Dm,用于种植同一植物的塑料杯的测量直径)
-
罗塞特面积:测量玫瑰花叶的水平二维表面积。
- 去除花序,而不影响其余的玫瑰花管器官。
- 从每个植物的顶部拍摄照片,并放在附近放置一个比例尺。
- 使用一个免费的插件的图像J,罗塞特跟踪器,并遵循之前发布的协议22。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
自动发触摸力装载机
为了观察植物的形态变化,可重复的生长条件和治疗方法都是获得可重复结果的关键。这种高通量和自动触摸力信号突变筛选是由新建成的头发触摸力加载机,型号K1(图1,图2)实现的。这些发刷可以同时触摸最多 4 个托盘的植物。在托盘中放置了24个杯子,在一组中放置了12个植物,作为控制和处理过的植物(图2C,D)。在每个杯子中,种植了四株植物,共有48个或更少的植物个体被同一发刷触摸,这保证了足够的植物供以后的统计分析。在一台 K1 型触摸机上,最多可同时触摸处理 4 种植物基因型。其中一个关键点是触摸机臂/头发高度的设置,因为异体磷发生是剂量依赖6,21。不同的头发位置相对于植物玫瑰花叶位置产生不同的触摸力,这可能产生完全不同的异质生成结果。在我们的实验中,头发的植物接触尖端应放置在比杯缘低0.5厘米(图2E),产生类似于先前公布的触摸力14的力。安装在触摸屏上的可编程控制器用于控制整个触摸力装载机(图2F,参见材料表)。
两种不同触摸方法的比较
为了将这种自动机器驱动发法与传统手动棉签接触法进行比较,在Col-0上进行了两个独立的实验(图3)。在棉签触摸组,触摸从12天的植物开始。每轮有40次接触(1次触摸/s)。每天总共进行3轮(图3A)。在连续棉签触摸处理后(22.1 ~ 0.2 天,23.8 = 0.2 天)后,螺栓延迟 1.7 天。同样,对于自动机器驱动的毛触摸,从14天老工厂开始的触摸力加载和40次触摸(3分钟内)被应用一轮。总共进行3轮接触,间隔正好8小时(图3B)。观察到Col-0工厂的延迟螺栓。平均螺栓处理时间是23.0~0.3天,而K1型触摸机处理装置的螺栓处理时间是24.7~0.2天。因此,用单变量Cox比例危害模型分析了控制与触摸处理植物之间的差异。它提供了估计的危险比 (HR) 0.31 (棉拭触摸) 和 0.52 (机器驱动的头发触摸), 分别 (图 3C), 这意味着螺栓风险/概率的植物在接触组是 31% 和 52% 相比分别位于对照组中的植物。这表明,与未接触的对照植物相比,接触野生型植物的螺栓连接的可能性约为未接触控制植物的一半,无论是用棉签手动触摸还是自动触摸头发。
不同触摸突变体的预期结果
最近的初步数据表明,MKK1和MKK2可能在阿拉伯14的触摸反应中发挥重要作用。我们选择了这两个突变体,并使用这些假定的触摸反应突变体使用自动头发触摸力加载机进行了触摸实验(图4,表1)。野生型控制植物显示1.8天的螺栓延迟(24.1 ± 0.3天对25.9 × 0.2天,图4A),正如上一份报告14,而这种螺栓延迟没有观察到在T-DNA插入突变体,mkk1(24.6 × 0.2 天数与 24.4 = 0.3 天,图 4B和表 1) 和mkk2 (23.9 = 0.1 天,24.2 = 0.2 天,图 4C和表 1)。通过使用单变量 Cox 比例危害模型分析这些数据,只有野生类型Col-0在控制与接触植物之间表现出显著差异,估计 HR 为 0.41(图 4D)。自动头发触摸力加载机进行的触摸力加载实验表明,mkk1和mkk2突变体是触摸反应突变体。
其他形态指标的测量
与血性发生相关的形态变化并不限于螺栓的延迟。较短的茎和较小的玫瑰花叶大小也是三角磷发生6,7,9,14的组成部分。因此,我们在这里报告了关于触摸响应的形态指数、玫瑰花半径/叶长和玫瑰花(投影)面积的另外两种测量类型(图5)。与先前观察到的表型变化类似,野生型Col-0植物在3天恒定和重复的自动机驱动发触摸(1.77 ± 0.05 cm 对 1.50 ± 0.04) 后,其玫瑰花半径和叶长明显减小厘米,图 5A)。经过13天的触摸,预计的玫瑰花饰面积从20.32 ±0.53厘米2变为16.19~0.48厘米2(图5B)。mkk1和mkk2都有类似的减少玫瑰花的半径和面积。综合起来,这些数据表明MKK1和MKK2蛋白对阿拉伯的螺栓延迟很重要,在塑造玫瑰花尺和玫瑰花环区域时不需要。
统计分析
对于图 2和图3所示的框图和胡须图以及图 5所示的柱形图,通过双尾学生的 t 检验分析统计显著性,显著性由 p =和 n.s 表示< 0.001 和p > 0.05,分别。对于图2和图3所示的卡普兰-迈尔图,使用了单变量Cox危险分析来分析触摸处理对螺栓处理事件23、24的影响。下表提供了危险比率 (HR)、95% 置信区间(95% CI)和p值。例如,HR = 0.5 表示在特定日中,与对照组中的植物相比,接触组中的植物的螺栓风险/概率为 0.5 或 50%。
图 1.自动发触摸力装载机的构造和参数。(A) 线性执行器的默认示意图。左上角面板是横向视图,左下角面板是背视图。X 轴模块和 Y 轴模块的总长度分别为 843 mm 和 1,038 mm。每个默认 X/Y 模块由一个导轨、一个滑块和一个 57 步进电机(预安装和拆卸)组成。对于定制的 K1 型触摸机,每个 X/Y 模块由两个滑动块(红色)组成。X 模块的接合板从 56 mm 放大到 100 mm,以提供更好的连接和支持。右上面板是导轨的横截面,右下角面板是 57 步进电机。(B) 构造的双 X 轴和双 Y 轴线性执行器的原理图。这是触摸力装载机的主要部分。左下角面板是构造的线性执行器的背视图。左上角面板是 X 轴模块 (843 mm) 的横向视图。中间面板是 Y 轴模块的横向视图(1,038 mm)。右上方面板是 Y 模块和 Y 辅助梁上 4 个滑块的背视图。右下面板是 X 模块上结板的背视图。(C) 机器零件装配的流程图.图中标记和命名了不同的零件。协议中描述了详细的装配过程。显示的单位是这个图是毫米。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图 2.自动发触摸力装载机的整体设计。(A) 成品型号 K1 触摸机.这张照片是从正面拍摄的。上部线性执行器控制机械臂水平移动,下部线性执行器控制机械臂垂直移动。(B) 显示可拆卸机械臂的横向视图。发刷被夹在机械臂上。(C 和 D)照片显示人类的头发刷如何触摸植物,这是分别从正面和侧面拍摄的。(E) 显示如何设置毛刷高度与杯缘的横向视图。机器臂和发刷都可见。(F) 型号 K1 触摸机的操作界面。与触摸屏 (MT6070i) 相连的可编程控制器 (AFPX-C30T) 用于控制整机。协议中介绍了详细的设置和操作过程。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.比较两种触摸方法对血性发生的影响。(A-B) 手动棉签触摸 (A) 和人的头发触摸的比较分别由自动触摸力装载机 (B) 驱动.框图和胡须图显示在左侧面板中,显示对照组和接触组之间平均螺栓日的比较。显示均值 = SE。统计分析由学生的 t 测试执行。p < 0.001的显著性显示为 *。卡普兰-迈尔地块显示在中间,即在生长时间(播种后几天)螺栓固定植物的百分比。右侧面板显示未动控制和接触植物的代表性个体,显示螺栓时间和花序茎高度的差异。(C) 汇总表:控制列和触摸列中的数值是用于统计分析的工厂编号。在单变量 Cox 危险分析部分下提供了危险比率 (HR)、95% 置信区间 (95% CI) 和p值。与未接触组相比,接触组植物的螺栓风险和概率分别为31%和52%。SPSS对单变量Cox危害分析进行了分析。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.mkk1和mkk2突变体的异体发生,以及自动头发接触引起的野生型植物(Col-0)。(A-C) Col-0 (A)、 mkk1 (B) 和mkk2 (C) 的预期触摸响应,由自动触摸力装载机驱动,由人类头发接触的重复产生。框图和胡须图显示在左侧面板中,这是对照组和接触组之间平均螺栓日的比较。显示均值 = SE。统计分析由学生的 t 测试执行。*和 n.s. 分别表示p < 0.001和p > 0.05。卡普兰-迈尔地块显示在中间,即在生长期(播种后的几天)螺栓固定植物的百分比。右侧面板显示未动控件的代表性个体和显示螺栓差异的触摸植物。mkk1 (B) 和mkk2 (C) 的数据分别从两个和三个生物复制中汇编。表1显示了每个复制中使用的详细植物编号。(D) 汇总表:控制的数字和触摸列分别是这两组使用/分析的工厂编号。给出了单变量Cox危害分析部分下的HR、95%CI和p值。与对照组相比,接触组野生型植物的螺栓风险/概率为41%。SPSS对单变量Cox危害分析进行了分析。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5.用于定义血性发生值的玫瑰花角和面积测量。(A-B) 种子播种后,分别在第17天和第27天测量野生型的玫瑰花环半径和玫瑰花环面积。左上角面板中显示的条形是对照组和接触组之间分别玫瑰半径或玫瑰花角区域的比较。显示均值 = SE。统计分析由学生的t-测试执行;p < 0.001.右上角面板中显示的照片是具有代表性的单个植物。下表显示了对照组和接触组中分析的植物编号。第 17 天的玫瑰花环半径 (cm) 和第 27天的玫瑰花环区域 (cm 2) 也显示出来。请点击此处查看此图的较大版本。
表 1.不同生物复制的螺栓数据。汇总表包含两个mkk1的生物复制和三个mkk2的生物复制。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
三毛磷发生是一种复杂的植物生长反应对机械扰动,这涉及到细胞信号和植物激素的作用网络。它是植物在不良环境条件下生存的适应性进化的结果25、26。机械触摸,特别是人的手指触摸和手持棉签触摸,已被选定来研究这种形态变化在以前的三元遗传学研究14,20。这种简化的触摸力加载版本可触发工厂触摸响应,更易于控制和应用。此外,这种触摸力加载方法可以在某种程度上模仿自然环境中产生的风雨滴刺激力信号19。触摸力能够触发钙尖峰,诱导蛋白质磷酸化14和下游基因表达中介触摸反应19。同样,安装在自动移动臂上的人类发刷也可以通过模仿人类手工操作的触摸来产生植物触摸响应。为了分散用力应用的类型,喷水喷嘴和/或风风机也可以安装在机器的机械臂上,用于生理实验(图2)。这一独特特点使自动机械力装载机在形态遗传学和生理研究中更加通用。这种自动机械力装载机的最大优点可能是其无劳动、可重复和省时的特点,这使得可以从大量诱变个体中执行特定的突变表型选择。与数小时的人工触摸相比,K1 型触摸机可以同时触摸各种突变体,并在 3 到 5 分钟内完成一轮触摸。一轮接触的时间框架很大程度上取决于治疗开始时的程序设置。如果每个工厂在一轮中接触 40 次,则 K1 型机器只需 9-15 分钟即可在一天内完成三轮触摸处理。可以精确控制每轮接触之间的间隔时间;人类实现这种精度的可能性较小。
触摸处理的另一个重要问题是需要应用触摸力的植物生长阶段。在我们的实践中,接触开始后14天播种的野生类型和两个突变体,因为这三个基因型的生长速度相似。对于那些在发育时间上与野生类型有显著差异的突变体,可以选择不同的开始接触的开始。对野生植物和突变体的螺栓数据进行单向方差分析测试,进行多重比较,有助于进行14项。这种统计分析可以给出基因型产生的螺栓时间差异的正确结论。在这种情况下,应使用多变量 Cox 比例危险分析来考虑两个可变参数。
为了设置安装在模型 K1 触摸机上的人类毛发的触摸力级别,我们调整了毛刷的高度(垂直力)和速度(水平力)(图 2E)。根据从在电子秤上对一个阿拉伯拟南芥工厂进行多轮力级测试收集的初步数据,确定了正确的设置。正如我们已经发现,在整个触摸反应实验中保持头发高度和速度不变,在阿布拉多普西斯线的复制中会产生类似和恒定的硫磷遗传表型。太重的触摸力可能会杀死幼苗,因为快速移动的发刷可能导致叶子表面受伤。相反,太轻的触摸力可能不足以触发在重复触摸的 2 周内螺栓的延迟。在以前的实验中,我们已经确定适当的触摸力载荷是1-2 mN每触摸14,19。头发长度比杯缘低 0.5 厘米,用于在基于 K1 的型号机器的头发触摸上产生类似的垂直触摸力,具有 5000 mm/min 的温和水平移动速度(图 2E)。这种K1型机器的这种固定设置减少了人为误差造成的力强度变化。
总体而言,自动触摸力装载机执行的毛发操作仅提供工厂的平均触摸力加载。应用的精确触摸力,尤其是加载的水平力,对于单发或刷子上的一组毛发都难以计算。此外,植物形状和茎高的方差也会干扰水平力的应用。测量这种体力或应力需要一个更精确的压力传感器连接到头发或一组头发。相信今后将采用更精确的压力传感器和数学建模来改进自动触摸力装载机。生长条件,如光强度、土壤湿度、温室温度、养分供应等,在触摸反应表型发育中起着至关重要的作用。任何应力条件,如干旱、小于 90 μEμm-2μs-1的弱光条件,以及可能影响阿拉伯拟南芥正常生长的较高或较低温度,都会干扰两种野生类型触摸响应的测量和突变体。
简而言之,这种自动触摸力装载机比人指触摸和棉签触摸更省力、更均匀的平均触摸力装载。预计K1型触摸机将应用于各种高通量触摸力信号突变筛选和农作物接触反应分析,或可能采用动物模型,对触摸力载荷进行一些修改机。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到以下拨款的支持:31370315、31570187、31870231(中国国家科学基金会)、16100318、661613、16101114、16103615、16103817、AoE/M-403/16(香港RGC)。作者感谢巨峰精密自动化技术有限公司(中国深圳)提供图1所示的几张原理图。
作者们还要感谢张国宝和李华华为触摸力装载机的发展所做出的贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. The Flowering Process. , Macmillan. New York. (1963).
- Darwin, C. The Power of Movement in Plants. , Appleton. New York. (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , Germany. (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
