Summary
En mild touch-Force lasting maskinen er bygget fra menneskehår børster, robotarmer og en kontroller. Håret børster er drevet av robot armene installert på maskinen og flytte med jevne mellomrom for å bruke touch-kraft på planter. Styrken på maskin drevne hår detaljer kan sammenlignes med manuelt anvendte innslag.
Abstract
Planter reagerer på både intracellulære og ekstracellulære mekaniske stimuleringer (eller kraft signaler) og utvikle spesielle morfologiske endringer, en kalt thigmomorphogenesis. I de siste ti årene har flere signalering komponenter blitt identifisert og rapportert for å være involvert i mechanotransduction (f. eks, kalsium ion bindende proteiner og jasmonic acid biosyntesen enzymer). Men den relativt langsomme tempoet i forskningen i studiet av makt signalering eller thigmomorphogenesis er i stor grad tilskrives to grunner: kravet om arbeidskrevende menneskelige hånd-manipulert touch induksjon av thigmomorphogenesis og styrken styrke feil forbundet med folks hånd-touch. For å øke effektiviteten av ekstern kraft lasting på en plante organisme, en automatisk touch-kraft lasting maskinen ble bygget. Dette robot arm drevne hår børste berører gir en arbeidsbesparende og lett repeterbar touch-Force simulering, ubegrenset runder med touch repetisjon og justerbar touch styrke. Denne hår touch-Force lasting maskinen kan brukes til både stor skala screening av touch-Force signalering mutanter og phenomics studie av anlegget thigmomorphogenesis. I tillegg berører materialer som menneskehår, kan erstattes med andre naturlige materialer som dyr hår, silke tråder og bomull fibre. Den automatiserte bevegelige armer på maskinen kan være utstyrt med vann strø dyser og luft vifter for å etterligne den naturlige krefter regndråper og vind, henholdsvis. Ved å bruke denne automatiske hår touch-Force lasting maskin i kombinasjon med hånd-utført bomullsdott berøre, har vi undersøkt touch respons av to force signalering mutanter, MAp kyuzanso kYUZANSO 1 (MKK1) og MKK2 planter . Den phenomes av touch-Force lastet vill type planter og to mutanter ble evaluert statistisk. De har vist vesentlige forskjeller i touch respons.
Introduction
Plant thigmomorphogenesis er et begrep som ble skapt av Jaffe, MJ i 19731. Det er en plante tropism men forskjellig fra den velkjente phototropism eller gravitropism forårsaket av stimuli av sollys eller gravitasjon2,3. Den beskriver fenotypiske endringer forbundet med periodiske mekaniske stimuleringer, som ofte har blitt observert av botanikere i tidligere tider4,5. Regndråper, vind, anlegg, dyr og menneskelige berører, selv dyr biter, er alle regnet for å være forskjellige typer mechano-stimuli som utløser kraften signalering i planter4,5. Egenskapene til plante thigmomorphogenesis inkluderer forsinkelsen av bolting, en kortere stilk, mindre rosett/blad størrelse i stauder, og tykkere stammen i Woody planter6,7,8. Dette er i motsetning til thigmonastic eller thigmotropic respons ofte funnet i Mimosa anlegget eller andre mechano-sensitive vinranker, hvor disse raske touch svarene er lettere å bli observert1,9,10. Thigmomorphogenesis, derimot, er relativt vanskelig å bli observert på grunn av sin langsomme vekst respons. Thigmomorphogenesis observeres vanligvis følgende uker eller år med kontinuerlig kraft lasting stimulering. Denne unike natur plante touch respons gjør det vanskelig å utføre en frem genetisk skjerm ved hjelp av menneskelige hånd touch stimulering å isolere touch-Force signaliserer motstandsdyktig mutanter i en robust måte.
Å belyse kraften signal Transduction trasé og molekylære mekanismer underliggende thigmomorphogenesis6,11, molekylær og cellulære biologiske eksperimenter har blitt utført i de siste6, 12,13,14. Disse studiene har foreslått at anlegget Force signal reseptorer hovedsakelig består av mechanosensitive ion Channels (msc) og bundet MSC komplekser komponert av multimeric komplekser av membran-som spenner over proteiner11,14 , 15. den cytoplasmatiske ca2 + transient Spike generert i løpet av sekunder av den første berøring. Vind-, regn-, eller gravi-stimulering kan samhandle med nedstrøms kalsium sensorer for å overfører styrken signaler til kjernefysiske hendelser14,16,17,18. I tillegg til molekylær og cellulære studier, har den frem genetiske skjermen med manuell finger berøring av planter funnet at phytohormones og sekundære metabolitter er involvert i den påfølgende touch-induserbart (TCH) genuttrykk etter Touch-Force lasting13,19. For eksempel har AOS og opr320 mutanter blitt identifisert så langt fra de genetiske studiene. Imidlertid er det store problemet forbundet med anvendelse av frem genetikk i studiet av thigmomorphogenesis fortsatt intensiv arbeidskraft som kreves for kvantitere nivået på touch respons og berøre en stor befolkning av genetisk mutert enkelte anlegg. Det tidkrevende problemet vedvarer i den hånden rørende-baserte mutant skjermen14,20. For et eksempel, for å fullføre en runde med touch-Force stimulering, en person trenger å berøre 30-60 ganger (ett trykk per sekund) på en enkelt plante. For å få nok antall anlegg for statistisk fenotype analyse, er 20-50 individuelle anlegg av samme genotype normalt nødvendig for touch-Force lasting prosessen. Dette touch-Force lasting regime betyr at en person må full av gjentagelser utføre 600-3000 berører en genotype av valget. Denne typen touch normalt må gjentas 3 til 5 runder om dagen, som tilsvarer omtrent 1800-15000 finger eller bomullsdott berører per dag per genotype av planter. En godt trent person er normalt nødvendig for å opprettholde styrke og styrke på flere innslag i en ønskelig rekkevidde gjennom mange runder med repetisjon i en dag for å unngå den store variasjonen i kraft og styrke. Som det er velkjent at thigmomorphogenesis er en nasyŝaemoe og dose avhengig prosess6,21, touch Force/styrke blir kritisk til en suksess i utløsende touch respons av en plante.
For å fjerne den person-avhengige touch-Force lasting og for å opprettholde mekanisk anvendelse innenfor en akseptabel feilområde14, vi derfor laget en automatisk touch-Force lasting maskin for å erstatte hånd-manipulert berører. Maskinen har 4 bevegelige armer bygget, som hver er utstyrt med en menneskelig hår børste. Denne versjonen heter modell K1 for å spesifisere sin funksjon av menneskehår touch-Force lasting. Hvis 4 genotyper måles kvantitativt for deres thigmomorphogenesis eller berørings respons under én maskin, kan 40-48 personer per genotype måles. Hver runde med touch repetisjon (mindre enn 60 ganger per plante) varer i mindre enn 5 minutter med en bevegelig hastighets justerbar robot arm. Dermed kan planter på en modell K1 touch maskin bli mekanisk stimulert for flere runder om dagen enten med en konstant touch-Force lasting eller ulike nivåer av styrke som opprinnelig programmert.
Arabidopsis thaliana, en modell plante organisme, ble derfor valgt som mål plantearter for å teste den helautomatiske hår touch-Force lasting maskin søknad. Fordi det er flere store Seedbanks tilgjengelig for å hente de ulike germplasms av mutanter og størrelsen på blomstring, passer Arabidopsis godt til den plassen som er tilgjengelig i veksten hylle montert med Model K1 touch maskin.
Modellen K1 automatisk touch maskin består av tre hovedkomponenter: (1) H-formen metall rack komponert av to belte-drevet lineære aktuatorer, (2) Robotic metall armer utstyrt med hårbørster, og (3) en kontroller. For en tilpasset modell K1 touch maskin, hver X/Y akse modulen er sammensatt av en belte-drevet guide-rail, to Slide blokker (rød) og 1 57 stepper motor (pre-installert og demonterbar) (figur 1a,B). Den øvre horisontale aktuatoren gjør det mulig for robot metall armen å bevege seg mot venstre og høyre horisontalt, den nedre vertikale belte drevne lineære aktuatoren gjør at robot metall armen kan bevege seg opp og ned vertikalt (figur 1B, figur 2A ). Fire demonterbar robotarmer ble installert på den vertikale aktuatoren (figur 1C, figur 2B). Fire menneskehår børster var bundet til fire Robotic armer, henholdsvis (figur 1C, figur 2B). Alle mekaniske deler for å konstruere modellen K1 touch maskin i uthevet skrift nedenfor er merket i figur 1C (se også tabellen over materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Seed forberedelse
Merk: Arabidopsis frø av både vill type (Col-0) samt mkk1 og mkk2 tap-of-funksjon mutanter brukt ble kjøpt fra Arabidopsis biologiske Resource Center (ABRC, https://www.Arabidopsis.org, Columbus, oh).
- Beregn hvor mange plante individer av hver genotype vil bli brukt for en pålitelig statistisk analyse. Forbered et tilstrekkelig antall frø basert på spire rate på hver linje, vanligvis 4-5 ganger mer enn det som er nødvendig for et eksperiment. Sikre nok antall sunne og uniform-sized planter kan brukes til touch respons analysen. Ifølge denne protokollen, er 300-500 frø per genotype vanligvis brukes til å produsere 80-90 planter av samme størrelse.
- Dypp frøene i kaldt vann og oppbevar dem i 4 ° c (dekket med aluminiumsfolie for å holde i mørket) for frø absorpsjon. Sår frøene 5-7 dager etter absorpsjon.
2. Plant vekst
- Velg riktig jord for plantevekst (se tabell over materialer). Unngå store klumper og bland dem homogenously.
- Forbered 24 plast kopper: holde kapasiteten er 207 mL og øvre felg diameter er 7,4 cm. bor tre runde hull i bunnen av en kopp for vanning formål.
- Fyll disse plast koppene med blandet jord. La jorda hoper seg opp til 1-2 cm høyere enn koppen rim og flat overflaten av stablet jord sakte.
- Overfør 24 kopper i et plast brett (21 tommer x 10,8 tommer x 2,5 tommer) og plasser skuffen under konstant lys tilstand (se nedenfor).
- Tilsett 2,5 L av vann i hver skuff to timer før frø såing. La jorda å absorbere vann fra hullene som ligger på bunnen av kopper og vente på overflaten av jorda for å slippe til koppen rim nivå.
- Sår 3-4 frø i ett enkelt sted, og 4 jevnt fordelt flekker i en kopp.
- Plasser et gjennomsiktig plast deksel over hver skuff, og la frøene spire i en uke. Deretter fjerner dekselet og la frøplanter å vokse for en uke.
- Fjern ekstra planter ved tynning og holde 4 plante individer av samme størrelse i hver kopp 9-10 dager etter frø såing.
- Vanne planter med 1,5 liter vann annenhver dag etter frøene spire.
3. vekst tilstand
- Still inn temperaturen på vekst kammeret ved 23,5 ± 1,5 ° c, og luftfuktigheten mellom 35 og 45%.
- Sett lys intensitet mellom 180 og 240 μE ∙ m-2∙ s-1 (målt ved Il 1700 forskning Radiometer mølle, International Light)14. Den fotosyntetiske aktive strålingen er fra 90 til 120 μE ∙ m-2∙ s-1.
- Sett lys tilstand til å være 24 h konstant.
4. byggingen av touch-Force lasting maskin
Merk: denne robot hår touch-Force lasting maskin (modell K1) er utformet for å tjene formål både touch-kraft signaliserer mutant screening og plante thigmomorphogenesis generasjon (figur 1, figur 2).
- Pre-installasjon moduler (demonterbar, figur 1C)
- Installer to lysbilde blokker (I) og en 57 Stepper Motor (II) på X/Y-aksen guide-rail-modul (III/V).
- Installer to lysbilde blokker (I) på den ekstra Girder for X/Y-aksen (IV/vi).
- Montering av andre mekaniske deler (figur 1C)
- Feste X-aksen guide-rail modul (III) og X-aksen hjelpe Girder (IV) sammen ved å montere to knutepunkt plater (VII) i hver ende av førings-rail.
- Fest guide-rail-modulen for Y-aksen (V) på rygg med to skyve blokker (X-akse) i en krysset posisjon ved å sette sammen to forbindelses plater (VIII) i mellom.
- Fest hjelpe Girder for Y -aksen (vi) på rygglene til de to andre lysbilde blokkene (X-aksen) i en krysset posisjon ved å sette sammen to koblings plater (VIII) imellom.
- Monter holderen til robot armene (IX) på forsiden av to skyve blokker (Y-akse) i en krysset posisjon med en forbindelses plate (figur 2a).
- Monter 4 hårbørster (X) på robot armene (IX) med klemmer (figur 2B).
5. touch-Force lasting maskin innstilling
Merk: alle kontroll parametre for å sette modellen K1 touch maskin i uthevet skrift nedenfor vises i Control Panel (figur 2F).
- Installer berørings hårbørster på robot armene. Bruk en 330 mm lang stål linjal som holder for å fikse ett lag av menneskehår (3600-4600 hår/pensel) jevnt. Lengden på håret er 126 mm (figur 1C).
- Fix de stål herskere på robot armene med to metall klemmer.
- Angi høyden på maskin armene langs den vertikale dimensjonen (Y-aksen) først. Trykk jogge F + for å heve og jogge R- for å senke robotarmer og børster. La tuppen av håret børster 0,5 cm lavere enn koppen rim. Trykk på null-settet. Pre-Run maskinen 1-2 sykluser for å sikre at alle planter individer blir rørt. Juster og Kalibrer børster og hårtuppene til samme høyde hver dag under hele den rørende perioden.
- Bruk en elektronisk målestokk for å måle berørings kraften (vertikal lasting) og opprettholde berørings Styrkenivået ved 1-2 mN14.
- Angi startposisjonen for maskin armene langs den horisontale dimensjonen (X-aksen) manuelt. La hår børstene henge på kanten av hver skuff, og sørg for at ingen anlegg berøres før det rørende eksperimentet starter. Trykk på jogge F +/jogge R- for å flytte maskin armen horisontalt litt etter litt for å sette startposisjonen.
- Angi hårbørsten reiseavstand i den horisontale dimensjonen (X-aksen) til 365 mm ved å trykke på reise knappen. Trykk på Inc. F +/Inc. R- for å flytte maskin armene for å få full reiseavstand og sørge for at alle de behandlede plantene blir berørt under hele det rørende eksperimentet.
- Angi bevegelseshastighet langs X-aksen på maskin armene på 5 000 mm/min ved å trykke på Auto Speed -knappen. Behold den samme Bevegelseshastigheten under hele det rørende eksperimentet.
- Still inn berørings tiden ved 20 forsøk ved å trykke på knappen for mindre syklus . Oppbevar samme antall berører per runde under hele berøring eksperimentet.
Merk: en mindre syklus er lik to reise avstander, noe som betyr at maskin armer vil flytte fra startposisjonen til endeposisjonen og deretter tilbake til startposisjonen. En mindre syklus genererer to innslag. Hårbørster berøre planter 40 ganger innen 20 forsøk (2 berører x 20 forsøk = 40 berører). 40-touch er definert som én runde med touch-Force-lasting. - Sett repetisjonsintervall på touch-runde på 480 min per dag ved å trykke på store periode knappen. Behold den samme frekvensen av berørings runder under et helt rørende eksperiment.
Merk: Dette gjør at hårbørster for å berøre planter for 3 runder om dagen, og intervalltiden mellom hver runde er 480 min (8 h). Det viste blå tallet står for intervalltiden for hver berørings runde. Maskinen vil starte en ny runde med berøring automatisk når nedtellingen nedenfor (rødt tall) blir til 0000. - Sett de store syklus på 12 forsøk, noe som betyr at maskinen vil berøre planter for 12 runder i løpet av en periode på 4 dager automatisk. Denne innstillingen av 12 forsøk brukes til å unngå menneskelige feil i hoppe en dag med rørende.
- Trykk på Start -knappen for å starte det forhåndsinnstilte programmet. Modell K1 touch maskinen vil automatisk utføre touch Force lasting i henhold til innstillingene.
6. fysiologiske datainnsamling og analyse
-
Dager til bolting: ta opp den bolting dagen for hver plante enkeltvis i et rørende eksperiment. Bolting er et symbol på at en plante endrer sin vekst scenen fra vegetative fasen til reproduksjons fasen. I Arabidopsis, den bolting dagen er definert som antall dager som brukes av en plante for å få sin første Blomsterstanden stammen nå 1 cm i lengde.
Merk: under veksten tilstand beskrevet ovenfor, bolting av vill type planter normalt initierer fra 19 til 23 dager etter frø såing og slutter på 28-32 dager. -
Rosett radius: mål avstanden fra rosett senteret til tuppen av det lengste bladet.
- Ta bilder av hele skuffen fra toppen. Ta bilder av kontrollgruppen og den touch-behandlede gruppen separat.
- Last ned den aktuelle programvaren. Bruk gratis nedlastet programvare ImageJ (https://ImageJ.nih.gov/IJ/Download.html) for eksempel.
- Åpne en bildefil, bruk zoom-funksjonen til å zoome bildet til en passende størrelse.
- Velg det rette verktøyet for å tegne en rett linje mellom rosett senteret og spissen av et lengste blad for å måle rosett radiusen.
- Velg en plante og trykk på venstre knapp for å tegne en rett linje fra rosett senteret til den lengste blad spissen.
- Velg analyser-mål- funksjonen eller trykk CTRL + M for å analysere linjeavstanden.
- Velg en kopp og gjenta de to foregående trinnene for å analysere diameteren på hver plast kopp på samme tid. Bruk disse dataene til å utføre beregningen for å eliminere skjevhet som følge av bilde Taking.
Merk: ligningen er:
Ra/da = Rm/dm
(Ra, den faktiske rosett radius av en plante; Da, den faktiske diameter av plast kopp; Rm, den målte rosett radius av samme plante bestemmes av en programvare; Dm, den målte diameter av plast koppen som brukes for dyrking av samme plante)
-
Rosett område: mål den horisontale 2-dimensjonale areal på rosett blader.
- Fjern Blomsterstanden uten å påvirke resten av rosett organer.
- Ta bilder fra toppen av hver plante sammen med en skala linjal plassert i nærheten.
- Bruk en gratis plugin av ImageJ, rosett tracker og følg protokollen publisert tidligere22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den automatiske hår touch-Force lasting maskin
For observasjon av morfologiske endringer på planter, både reproduserbar vekstforhold og behandlingsmetoder er nøkkelen til å oppnå repeterbar resultater. Denne høy-gjennomstrømning og automatisk touch-Force signalering mutant screening oppnås ved den nybygde hår touch-Force lasting maskin, modell K1 (figur 1, figur 2). Disse hårbørster kan berøre maksimalt 4 skuffer av planter samtidig. Det var 24 kopper plassert i en skuff, og 12 kopper planter i en gruppe som brukes som både kontroll og behandlede planter (figur 2C, D). I hver kopp ble fire planter dyrket og totalt 48 eller mindre plante individer ble rørt av den samme hårbørsten, noe som garanterer nok planter til senere statistisk analyse. Maksimalt 4 genotyper av planter kan være touch-behandlet samtidig på en modell K1 touch maskin. En av de viktigste punktene er innstillingen av touch Machine arm/hår høyde fordi thigmomorphogenesis er dose avhengig6,21. Ulike hår posisjoner med hensyn til anlegget rosett blad posisjon generere forskjellige touch styrker, som kan generere helt forskjellige thigmomorphogenesis resultater. I våre eksperimenter, bør anlegget-kontakt spissen av hår plasseres 0,5 cm lavere enn koppen rim (figur 2E), som genererer krefter som ligner på den tidligere publiserte touch Force14. En programmerbar kontroller installert i en touch panel brukes til å styre hele touch-Force lasting maskin (figur 2F, se tabell over materialer).
Sammenligningen av to forskjellige touch metoder
For å sammenligne denne automatiske maskin drevne hår metoden med den konvensjonelle manuelt bomullsdott berøre metoden, ble to uavhengige eksperimenter utført på Col-0 (Figur 3). I bomullsdott touch gruppe, rørende startet fra 12-dagers-gamle planter. Hver runde hadde 40 innslag (1 berøring/s). Totalt ble 3 runder utført hver dag (Figur 3A). Det viste 1,7 dager med forsinkelse i bolting etter en kontinuerlig bomullsdott berørings behandling (22,1 ± 0,2 dager kontra 23,8 ± 0,2 dager). På samme måte, for automatisk maskin drevet hår berøring, ble touch-Force loading initiert fra 14-dagers-gamle planter og 40 ganger med berøring (innen 3 min) søkt i en runde. I alt ble 3 runder med innslag utført en dag med nøyaktig 8 timers intervall (Figur 3B). Forsinket bolting ble observert for Col-0 planter. Den gjennomsnittlige bolting tiden var 23,0 ± 0,3 dager, mens den bolting tiden av Model K1 på maskin behandlede planter var 24,7 ± 0,2 dager. Forskjellene mellom kontroll-og berørings behandlede anlegg ble dermed analysert med den univariate Cox-modellen for proporsjonal risiko. Det tilbys estimert Hazard Ratio (HR) av 0,31 (bomullsdott touch) og 0,52 (maskin-drevet hår touch), henholdsvis (Figur 3C), noe som betyr at bolting risiko/sannsynligheten for planter i rørt gruppen er 31% og 52% sammenlignet med planter i kontrollgruppen, henholdsvis. Dette indikerer at muligheten for bolting av rørt Wild type planter er rundt halvparten i forhold til at av de uberørte kontrollanlegg uavhengig av om det er manuell berøring med en bomullspinne eller den automatiserte hår berøring.
Den potensielle resultater på ulike touch mutanter
Nylige foreløpige data foreslo at MKK1 og MKK2 kunne spille en viktig rolle i berørings responsen til Arabidopsis14. Vi valgte disse to mutanter og gjennomført touch eksperimenter på disse antatte touch respons mutanter ved hjelp av automatisk hår touch-Force lasting maskin (Figur 4, tabell 1). Den ville type kontroll planter viste 1,8 dager bolting forsinkelse (24,1 ± 0,3 dager g. 25,9 ± 0,2 dager, Figur 4A) akkurat som den forrige rapporten14 mens denne bolting forsinkelsen ikke ble observert på T-DNA insertional mutanter, mkk1 (24,6 ± 0,2 dager kontra 24,4 ± 0,3 dager, Figur 4B og tabell 1) og mkk2 (23,9 ± 0,1 dager vs. 24,2 ± 0,2 dager, Figur 4C og tabell 1). Ved å analysere disse dataene med univariate Cox proporsjonal-farer modellen, bare vill type Col-0 utstilt en betydelig forskjell mellom kontroll og rørt planter med anslagsvis HR på 0,41 (Figur 4D). Disse touch-Force lasting eksperimenter utført av den automatiske hår touch-kraft lasting maskin demonstrert at mkk1 og mkk2 mutanter er touch respons mutanter.
Målingen av andre morfologiske indekser
Morfologiske endringer forbundet med thigmomorphogenesis er ikke begrenset til forsinkelsen av bolting. Både kortere Stem og mindre rosett blad størrelse er også komponentene i thigmomorphogenesis6,7,9,14. Derfor har vi rapportert her to ekstra typer målinger på morfologiske indekser av touch respons, rosett radius/blad lengde og rosett (anslått) område (figur 5). I likhet med den tidligere observerte fenotype endring, viste den ville typen Col-0 plante betydelig mindre rosett radius og kortere blad lengde etter 3 dager med konstant og repeterende automatisk maskin drevet hår touch (1,77 ± 0,05 cm vs. 1,50 ± 0,04 cm, figur 5A). Det projiserte rosett området ble endret fra 20,32 ± 0,53 cm2 til 16,19 ± 0,48 cm2 etter 13 dagers Berøring (figur 5B). Både mkk1 og mkk2 hadde tilsvarende redusert rosett radius og areal. Til sammen viste disse dataene at MKK1 og MKK2 proteiner er viktige for den bolting forsinkelsen av Arabidopsis og ikke nødvendig for å forme rosett størrelsen og rosett området.
Statistisk analyse
Som til boksen og whisker tomter vist i figur 2 og Figur 3 og de stolpediagrammer som vises i figur 5, den statistiske betydningen ble analysert av tosidige studentens t-test, med betydning representert ved * * * og n.s. på p < 0,001 og henholdsvis p > 0,05. For Kaplan-Meier-plott vist i figur 2 og Figur 3ble en univariate Cox Hazard-analyse brukt til å analysere effekten av berørings behandling på bolting hendelse23,24. Fare raten (HR), 95% av sikkerhets intervallene (95% CI) og p -verdien tilbys i tabellene nedenfor. For eksempel, HR = 0,5 betyr at på en bestemt dag, bolting risiko/sannsynlighet for planter i rørt gruppen var 0,5 eller 50% sammenlignet med disse plantene i kontrollgruppen.
Figur 1 . Konstruksjonen og parametrene av den automatiske hår touch-Force lasting maskin. (A) standard skjematisk av den lineære aktuatoren. Øvre venstre panel er lateral visning og nedre venstre panel er rygg visningen. Den totale lengder av X-aksen modul og Y-aksen modulen er 843 mm og 1 038 mm, henholdsvis. Hver standard X/Y-modul består av en guide-rail, en lysbilde blokk og 1 57 stepper motor (pre-installert og demonterbar). For en tilpasset modell K1 touch maskin består hver X/Y-modul av to skyve blokker (rød). Krysset plate av X-modulen er forstørret fra 56 mm til 100 mm for å tilby bedre tilkobling og støtte. Den øvre høyre panel er tverrsnitt av guide-rail og nedre høyre panel er 57 stepper motor. (B) skjematisk av den konstruerte doble X-aksen og dobbel Y-akse lineære aktuatorer. Dette er den største delen av touch-Force lasting maskin. Nedre venstre panel er rygg visningen av konstruerte lineære aktuatorer. Øvre venstre panel er lateral visning av X-aksen modulen (843 mm). Den midterste panelet er lateral visning av Y-aksen modulen (1 038 mm). Den øvre høyre panel er rygg visning av 4 skyve blokker på Y-modulen og Y ekstra Girder. Nedre høyre panel er rygg visningen på kryss platen på X-modulen. (C) flytdiagram av maskindel montering. Ulike deler er merket og navngitt i figuren. Detaljerte monteringsprosesser ble beskrevet i protokollen. Enheten som vises er dette tallet er mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Den generelle utformingen av den automatiske hår touch-Force lasting maskin. (A) den ferdige modellen K1 touch Machine. Bildet ble tatt fra forsiden. Den øvre lineære aktuatoren kontrollerer at robotarmen beveger seg horisontalt, og den nedre, lineære aktuatoren kontrollerer at robotarmen beveger seg vertikalt. (B) sideveis visning som viser demonterbar robotarmer. Hårbørster ble klemt fast på robot armene. (C og D) Bilder som viser hvordan menneskelige hårbørster berøre planter, som ble tatt fra forsiden og den laterale siden, henholdsvis. (E) den laterale visningen viser hvordan du setter høyden på håret pensel mot koppen rim. Både maskin armer og hårbørster er synlige. (F) betjenings grensesnittet til modell K1 touch maskin. En programmerbar kontroller (AFPX-C30T) koblet til en touch panel (MT6070i) brukes til å styre hele maskinen. Detaljerte innstillinger og driftsprosedyrer er beskrevet i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Sammenligne virkningene av to touch metoder på thigmomorphogenesis. (A-B) sammenligningen av manuell bomullsdott touch (a) og menneskelig hår touch drevet av den automatiske touch-Force lasting maskin (B), henholdsvis. Box og whisker plott vises i venstre panel, som viser sammenligning av gjennomsnittlig bolting dag mellom kontrollgruppen og rørt gruppen. Betyr ± SE vises. Statistisk analyse ble utført av en student t-test. Betydning ved p < 0,001 vises som * * *. Kaplan-Meier plott er vist i midten, som er prosentandelen av bolting planter over vekst tid (dager etter såing). Høyre panel viser representative individer av urørt kontroll og rørt planter som viser forskjellen i bolting tid og Blomsterstanden Stem høyde. (C) den summerte tabellen: de numeriske tallene i kontroll og rørt kolonner er plante nummeret som brukes for statistisk analyse. Hazard Ratio (HR), 95% sikkerhetsintervall (95% CI) og p verdi under seksjonen av univariate Cox fare analyse tilbys. Den bolting risikoen og sannsynligheten av planter i rørt gruppen var 31% og 52% i forhold til den uberørte gruppen, henholdsvis. Den univariate Cox Hazard analysen ble anslått av SPSS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Den thigmomorphogenesis av mkk1 og mkk2 mutanter samt Wild type anlegget (Col-0) indusert av den automatiske hår berøring. (A-C) den potensielle touch respons av Col-0 (a), mkk1 (B), og mkk2 (C) generert gjennom gjentakelse av menneskelig hår berører drevet av den automatiske touch-Force lasting maskin. Box og whisker plott vises i venstre panel, som er sammenligningen av gjennomsnittlig bolting dag mellom kontrollgruppen og rørt gruppen. Betyr ± SE vises. Statistisk analyse ble utført av en student t-test. * * * Og n.s. representerer henholdsvis p < 0,001 og p > 0,05. Kaplan-Meier plott er vist i midten, som er prosentandelen av bolting planter over vekstperioden (dager etter såing). Høyre panel viser representative individer av urørt kontroll og rørt planter som viser bolting forskjellen. Data fra mkk1 (B) og mkk2 (C) ble samlet fra henholdsvis to og tre biologiske replikeres. Detaljerte plante numre som ble brukt i hver replikere, ble vist i tabell 1. (D) den summerte tabellen: tallene under kontroll og touch kolonner var plante nummer brukt/analysert i disse to gruppene, henholdsvis. HR, 95% CI og p verdi under den delen av univariate Cox Hazard analyse ble tilbudt. Den bolting risiko/sannsynlighet for vill type planter i rørt gruppen er 41% sammenlignet med kontrollgruppen. Den univariate Cox Hazard analysen ble anslått av SPSS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Rosett radius og areal måling for å definere thigmomorphogenesis. (A-B) rosett radius og rosett området av vill typen ble målt på dag 17 og dag 27 etter frø såing, henholdsvis. Barer vist i øvre venstre panel er sammenligninger av enten rosett radius eller rosett området mellom kontrollgruppen og rørt gruppen, henholdsvis. Betyr ± SE vises. Statistisk analyse ble utført av student t-test; p < 0,001. Bilder som vises i øvre høyre panel er representative individuelle planter. De summerte tabellene nedenfor viser plante nummeret analysert i kontrollgruppen og rørt gruppen. Både rosett radius (cm) på dag 17 og rosett område (cm2) ved dag 27 vises også. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Den bolting data av ulike biologiske replikerer. Den summerte tabellen inneholder to biologiske replikerer av mkk1 og tre biologiske replikerer av mkk2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Thigmomorphogenesis er en kompleks plantevekst respons mot mekaniske forstyrrelser, som innebærer et nettverk av mobilnettet signalering og handling av phytohormones. Det er en konsekvens av adaptive utviklingen av planter for å overleve under de uønskede miljømessige forholdene25,26. Mekanisk berøring, spesielt menneskelig finger touch og håndholdt bomullsdott touch, har blitt valgt til å studere denne morfologiske endringer i tidligere thigmomorphogenetic studier14,20. Denne forenklede versjonen av touch-Force lasting å utløse anlegget touch respons er lettere å kontrollere og søke. I tillegg har denne typen touch-Force lasting metoden kan på noen måte etterligne vind-og regn drop-stimulert kraft signaler produsert i det naturlige miljøet19. Touch kraften er i stand til å utløse kalsium pigger, indusere protein fosforylering14 og nedstrøms genuttrykket formidling touch respons19. Tilsvarende, menneskelig hårbørster montert på automatiserte bevegelige armer kan også generere anlegget touch respons ved å etterligne den menneskelige hånd-manipulert berører. For å diversifisere typer kraft anvendelse, kan vann dryss dyser og/eller vind vifter også monteres på robot armene på maskinen og brukes til et fysiologisk eksperiment (figur 2). Den unike funksjonen gjør den automatiske mekaniske kraft laste maskinen mer allsidig i Morfogenetiske og fysiologiske studier. Den største fordelen med denne automatiske mekaniske-Force lasting maskinen er trolig sin arbeids-fri, repeterbar og tidsbesparende funksjon, som gjør det mulig å utføre en bestemt mutant fenotype utvalg fra et stort antall mutagenized individer. I motsetning til timer med menneskelig hånd-manipulert berører, modell K1 touch maskin kan berøre ulike mutanter samtidig og fullføre en runde med touch innen 3 til 5 min. Tidsrammen for en runde med berøring avhenger i stor grad av programinnstillingen i begynnelsen av behandlingen. Hvis hver enkelt plante ville bli rørt 40 ganger i en runde, vil modell K1 maskinen bare trenger 9-15 min til slutt tre runder med touch behandling i løpet av en dag. Intervalltiden mellom hver runde av berører kan være nøyaktig styrt; Det er mindre sannsynlig for mennesker å oppnå en slik presisjon.
Et annet viktig spørsmål om touch behandling er hvilket stadium av plantevekst touch kraft må påføres. I vår praksis, rørende startet 14 dager etter frø såing for både den ville typen og to mutanter som veksten av disse tre genotyper er like. For de mutanter som har en betydelig forskjell i utviklingen tid fra den ville typen, kan man velge en annen første dag for å starte rørende. Utføre enveis ANOVA test på bolting data av både vill type plante og mutanter for flere sammenligninger kan hjelpe14. Denne statistiske analysen kan tilby riktig konklusjon om forskjellene i bolting tid generert av genotyper. I dette tilfellet bør en multivariabel Cox proporsjonal fare analyse brukes til å vurdere to variable parametre.
For å sette touch-Force nivå av den menneskelige hårene montert på modell K1 touch maskin, justerte vi både høyde (vertikal kraft) og hastigheten (horisontal kraft) av hårbørster (figur 2E). De riktige innstillingene ble bestemt basert på foreløpige data samlet inn fra mange runder med styrke nivå tester på en Arabidopsis anlegg plassert på en elektronisk skala. Som vi har funnet, holde både hår høyde og hastigheten uendret gjennom hele touch respons eksperimentet vil produsere en lignende og konstant thigmomorphogenetic fenotype blant replikerer for en Arabidopsis linje. For tung en touch-kraft kan drepe den unge frøplanter som raskt bevegelige hårbørster kan føre til såret på overflaten av et blad. I kontrast, for lys en touch-styrke kan ikke være nok til å utløse forsinkelsen av bolting innen 2 uker etter repetisjon av rørende. I vårt forrige eksperiment, har vi bestemt den aktuelle touch-Force lasting å være 1-2 mN per touch14,19. Håret lengde på 0,5 cm lavere enn koppen felgen brukes til å generere en lignende vertikal touch kraft på modell K1 maskin-basert hår touch med en mild horisontal bevegelse hastighet 5000 mm/min (figur 2E). Denne faste innstillingen av modell K1 maskinen reduserer variasjonen av kraft styrke resulterte fra den menneskelige feil.
Overall, håret berører utført av den automatiske touch-Force lasting maskin gir bare en gjennomsnittlig touch-Force lasting på planter. Den presise touch-Force anvendt, spesielt den horisontale kraften lastet, er vanskelig å beregne enten for et enkelt hår eller en gruppe av hår på en pensel. I tillegg kan variansen av plante form og Stem høyde forstyrre anvendelsen av horisontal kraft. Måling av denne typen fysisk styrke eller stress trenger en mer presis trykksensor knyttet til et hår eller en gruppe hår. Det antas at mer presis trykksensor og matematisk modellering vil bli brukt for å forbedre den automatiske touch-Force lasting maskin i fremtiden. Vekst forholdene, slik som lys intensitet, fuktighet av jord og temperatur i drivhuset, samt næringsstoffer forsyne, alle spille en avgjørende rolle i touch respons fenotype utvikling. Eventuelle stress forhold, slik som tørke, svakt lys tilstand med mindre enn 90 μE ∙ m-2∙ s-1, og en høyere eller en lavere temperatur som kan påvirke den normale veksten av Arabidopsis vil forstyrre måling av berøring respons av både vill type og mutanter.
Kort sagt, denne automatiske touch-Force lasting maskinen kan tilby mer arbeidsbesparende og uniformerte gjennomsnittlig touch-Force lasting enn menneskelig finger touch og bomullsdott touch. Det er forventet at modell K1 touch maskin vil bli brukt i ulike høy-gjennomstrømming touch-Force signalnettverk mutant screening og touch respons analyse blant landbruket avlinger eller sannsynligvis dyremodeller med noen modifikasjoner av touch-Force lasting Maskin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av følgende tilskudd: 31370315, 31570187, 31870231 (National Science Foundation of China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC of Hong Kong). Forfattere vil gjerne takke Ju Feng Precision og automatisering Technology Limited (Shenzhen, Kina) for deres tilbud av flere skjematisk vist i figur 1.
Forfattere vil også gjerne takke S. K. Cheung og W. C. Lee for deres bidrag til utvikling av touch-Force lasting maskin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. The Flowering Process. , Macmillan. New York. (1963).
- Darwin, C. The Power of Movement in Plants. , Appleton. New York. (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , Germany. (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
