Summary
Uma máquina de carregamento suave de força de toque é construída a partir de escovas de cabelo humano, braços robóticos e um controlador. As escovas do cabelo são conduzidas por braços robóticos instalados na máquina e movem-se periodicamente para aplicar a toque-força em plantas. A força dos toques de cabelo acionado por máquina é comparável à dos toques aplicados manualmente.
Abstract
As plantas que respondem às estimulações mecânicas intracelular e extracelular (ou sinais da força) e desenvolvem mudanças morfológicas especiais, um thigmomorphogenesis chamado. Em décadas passadas, vários componentes de sinalização foram identificados e relatados por estarem envolvidos na mecanotransdução (por exemplo, proteínas de ligação de íons de cálcio e enzimas de biossíntese de ácido jasmonico). Entretanto, o ritmo relativamente lento da pesquisa no estudo da sinalização da força ou do thigmomorphogenesis é atribuído pela maior parte a duas razões: a exigência para a indução mão-manipulada humana trabalhoso do toque do thigmomorphogenesis e os erros da força da força associado ao toque das pessoas. Para realçar a eficiência do carregamento externo da força em um organismo de planta, uma máquina de carregamento automática da toque-força foi construída. Este braço robótico-driven escova de cabelo toques fornecer um trabalho-economia e facilmente repetível toque-força de simulação, ilimitado rodadas de toque de repetição e ajustável força de toque. Esta máquina do carregamento da toque-força do cabelo pode ser usada para a seleção da grande escala de mutantes da sinalização da toque-força e o estudo phenomics da planta thigmomorphogenesis. Além, os materiais do toque tais como o cabelo humano, podem ser substituídos com outros materiais naturais como o cabelo animal, as linhas de seda e as fibras do algodão. Os braços moventes automatizados na máquina podem ser equipados com os bocais de aspersão da água e os sopradores de ar para imitar as forças naturais de gotas e de vento da chuva, respectivamente. Usando esta máquina de carregamento automática do toque-força do cabelo em combinação com o toque Hand-realizado do cotonete de algodão, nós investigamos a resposta do toque de dois mutantes de sinalização da força, MAP kinase kinase 1 (MKK1) e plantas MKK2 . Os diferentes das plantas tipo selvagem carregadas da toque-força e dois mutantes foram avaliados estatisticamente. Eles exibiram diferenças significativas na resposta ao toque.
Introduction
O thigmomorphogenesis da planta é um termo que seja cunhado por Jaffe, MJ em 19731. É um tropismo vegetal, mas diferente do conhecido fototropismo ou gravitropismo causado por estímulos de luz solar ou gravidade2,3. Descreve alterações fenotípicas associadas a estímulos mecânicos periódicos, que têm sido freqüentemente observados por botânicos em épocas anteriores4,5. Pingos de chuva, vento, planta, animal e toques humanos, mesmo mordidas de animais, são todos considerados diferentes tipos de estímulos Mecano que desencadeiam a sinalização de força em plantas4,5. As características do thigmomorphogenesis da planta incluem o atraso de aparafir, de uma haste mais curta, de um tamanho menor da roseta/folha em plantas herbáceas, e de uma haste mais grossa em plantas arborizados6,7,8. Isto é diferente da resposta movimentos ou thigmotropic encontrada frequentemente na planta do Mimosa ou em outras videiras mechano-sensíveis, onde estas respostas rápidas do toque são mais fáceis de ser observadas1,9,10. O thigmomorphogenesis, de um lado, é relativamente difícil de ser observado por causa de sua resposta lenta do crescimento. O thigmomorphogenesis é observado geralmente depois das semanas ou mesmo dos anos de estimulação contínua da força-carregamento. Esta natureza original da resposta do toque da planta faz difícil executar uma tela genética para diante usando a estimulação humana do toque da mão para isolar os mutantes resistentes da sinalização da toque-força em uma maneira robusta.
Para elucidar as vias de transdução de sinal de força e os mecanismos moleculares subjacentes ao thigmomorphogenesis6,11, molecular e celular experimentos biológicos têm sido realizados nos últimos6, 12,13,14. Estes estudos têm proposto que os receptores de sinal de força vegetal consistem principalmente em canais de íons mecanosensíveis (MSC) e os complexos de MSC tethered compostos por complexos multiméricos de proteínas de abrangência de membrana11,12 , 15. o pico de CA2 + transiente citoplasmático gerado dentro de segundos do toque inicial. Vento-, chuva-, ou gravi-estimulação pode interagir com os sensores de cálcio a jusante para transduce os sinais de força para eventos nucleares14,16,17,18. Além do que estudos moleculars e celulares, a tela genética para diante com toque manual do dedo das plantas encontrou que os fitormônios e os Metabolites secundários são involvidos na expressão de gene toque-inducible (tch) conseqüente que segue o carga da força de toque13,19. Para exemplos, aos e OPR320 mutantes foram identificados assim distante dos estudos genéticos. Entretanto, o problema principal associado com a aplicação da genética para diante no estudo do thigmomorphogenesis é ainda o trabalho intensivo exigido para quantificar o nível de resposta do toque e tocar em uma grande população de mutado genetically plantas individuais. O problema demorado igualmente persiste na tela tocante-baseada do mutante da mão14,20. Para um exemplo, para completar uma rodada de estimulação de força de toque, uma pessoa precisa tocar 30-60 vezes (um toque por segundo) em uma planta individual. A fim ter bastante número de plantas para a análise estatística do phenotype, 20-50 plantas individuais do mesmo genótipo são exigidas normalmente para o processo do carregamento da toque-força. Este regime de carregamento da força de toque significa que uma pessoa precisa de executar repetitivamente 600-3000 toques em um genótipo da escolha. Este tipo de toque normalmente precisa ser repetido 3 a 5 rodadas por dia, que equivale a cerca de 1800-15000 dedo ou cotonete toques por dia por genótipo de plantas. Uma pessoa bem treinada é normalmente necessária para manter a força e força de múltiplos toques dentro de uma faixa desejável ao longo de muitas rodadas de repetição em um dia para evitar a grande variação na força e força. Como é sabido que o thigmomorphogenesis é um processo saturável e dose-dependente6,21, força/força do toque torna-se crítico a um sucesso em provocar a resposta do toque de uma planta.
Para remover o carregamento de força de toque dependente da pessoa e para manter a aplicação mecânica dentro de um intervalo de erro aceitável14, nós projetamos conseqüentemente uma máquina de carregamento automática da toque-força para substituir os toques Hand-manipulados. A máquina tem 4 braços moventes construídos, cada qual é equipado com a uma escova de cabelo humana. Esta versão é nomeada modelo K1 para especificar sua característica do carregamento do toque-força do cabelo humano. Se 4 genótipos são medidos quantitativamente por sua thigmomorphogenesis ou resposta do toque uma máquina, 40-48 indivíduos por o genótipo podem ser medidos. Cada rodada de repetição de toque (menos de 60 vezes de toque por planta) dura menos de 5 minutos usando um braço robótico ajustável de velocidade móvel. Assim, as plantas em uma máquina do toque do modelo K1 podem mecanicamente ser estimuladas para círculos múltiplos um o dia ou com um carregamento constante da toque-força ou níveis diferentes de forças como programado inicialmente.
Arabidopsis Arabidopsis thaliana, um organismo modelo da planta, foi escolhida conseqüentemente como a espécie da planta do alvo para testar a aplicação inteiramente automática da máquina do carregamento da toque-força do cabelo. Porque há diversos grandes bancos de sementes disponíveis para recuperar os vários germplasms dos mutantes e o tamanho da florescência, Arabidopsis cabe bem ao espaço disponível na prateleira do crescimento montada com a máquina do toque do modelo K1.
A máquina automática do toque do modelo K1 consiste em três componentes principais: (1) a cremalheira do metal da H-forma compor por dois atuadores lineares correia-conduzidos, (2) braços robóticos do metal equipados com as escovas de cabelo, e (3) um controlador. Para uma máquina de toque modelo K1 personalizada, cada módulo de eixo X/Y é composto por um trilho-guia acionado por correia, dois blocos de slides (vermelho) e motor deslizante 1 57 (pré-instalado e desmontável) (Figura 1a,B). O atuador horizontal superior permite que o braço de metal robótico se mova para a esquerda e para a direita horizontalmente, o atuador linear com acionamento vertical inferior permite que o braço de metal robótico mova para cima e para baixo verticalmente (Figura 1B, Figura 2a ). Quatro braços robóticos desmontáveis foram instalados no atuador vertical (Figura 1C, Figura 2B). Quatro escovas de cabelo humano foram ligadas a quatro braços robóticos, respectivamente (Figura 1C, Figura 2B). Todas as peças mecânicas para construir a máquina de toque modelo K1 na fonte em negrito abaixo são marcadas na Figura 1C (ver também a tabela de materiais).
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Protocol
1. preparação de sementes
Nota: as sementes de Arabidopsis de ambos os tipos selvagens (Col-0) assim como os mutantes mkk1 e mkk2 da perda--função usadas foram compradas do centro de recursos biológicos de arabidopsis (ABRC, https://www.Arabidopsis.org, Columbus, Oh).
- Calcule Quantos indivíduos vegetais de cada genótipo serão utilizados para uma análise estatística fiável. Prepare um número suficiente de sementes com base na taxa de germinação de cada linha, geralmente 4-5 vezes mais do que o que é necessário para um experimento. Assegure o número suficiente de plantas saudáveis e uniforme-feitas medida pode ser usada para o ensaio da resposta do toque. De acordo com este protocolo, 300-500 sementes por genótipo são geralmente utilizados para produzir 80-90 plantas de tamanho semelhante.
- Mergulhe as sementes em água fria e guarde-as em 4 ° c (cobertas com folha de alumínio para manter no escuro) para embebição de sementes. Semeie as sementes 5-7 dias após a embebição.
2. crescimento vegetal
- Selecione o solo apropriado para o crescimento da planta (veja a tabela de materiais). Evite grandes aglomerantes e misture-os homogeneamente.
- Prepare 24 copos plásticos: a capacidade da terra arrendada é 207 mL e o diâmetro superior da borda é 7,4 cm. perfure três furos redondos na parte inferior de um copo para a finalidade da irrigação.
- Encha estes copos plásticos com o solo misturado. Deixe o solo empilhe até 1-2 cm mais altamente do que a borda do copo e aplainar a superfície do solo empilhou macia.
- Transfira 24 copos em uma bandeja plástica (21 polegadas x 10,8 polegadas x 2,5 polegadas) e coloc a bandeja a condição clara constante (veja abaixo).
- Adicione 2,5 L de água em cada bandeja duas horas antes da semeadura da semente. Deixe o solo absorver a água dos furos situados nas partes inferiores dos copos e esperar para que a superfície do solo deixe cair ao nível da borda do copo.
- Semeie 3-4 sementes em um único ponto, e 4 pontos uniformemente distribuídos dentro de um copo.
- Coloc uma tampa plástica transparente acima de cada bandeja, e deixe sementes germinar por uma semana. Em seguida, retire a tampa e permita que as mudas cresçam por mais uma semana.
- Remova plantas extra diluindo e mantenha 4 indivíduos da planta do tamanho similar em cada copo 9-10 dias após a sementeira da semente.
- Irrigar plantas com 1,5 L de água todos os dias após a germinação das sementes.
3. condição de crescimento
- Definir a temperatura da câmara de crescimento em 23,5 ± 1,5 ° c, e umidade entre 35 e 45%.
- Ajuste a intensidade luminosa entre 180 e 240 μE ∙ m-2∙ s-1 (medido pelo RADIÓMETRO da pesquisa de Il 1700, luz internacional)14. A radiação fotossintética ativa é de 90 a 120 μE ∙ m-2∙ s-1.
- Defina a condição de luz para ser 24 h constante.
4. a construção da máquina de carregamento da toque-força
Nota: esta máquina de carregamento de força de toque de cabelo robótico (modelo K1) foi concebida para servir para fins de detecção de mutantes de sinalização de força táctil e geração de thigmomorfogênese de plantas (Figura 1, Figura 2).
- Módulos de pré-instalação (desmontável, Figura 1C)
- Instale dois blocos de slides (I) e um motor deslizante 57 (II) no módulo de guia-trilho de eixo X/Y (III/V).
- Instale dois blocos de slides (I) na viga auxiliar do eixo X/Y (IV/VI).
- Instalação de outras peças mecânicas (Figura 1C)
- Fixe o módulo do guia-trilho do eixo X (III) e a viga auxiliar do eixo x (IV) junto montando duas placas de junção (VII) em cada extremidade do guia-trilho.
- Fixar o eixo Y guia-Rail módulo (V) para o dorsal de dois blocos de slides (eixo X) em uma posição de cruzamento através da montagem de duas placas de junção (VIII) no meio.
- Fixar a viga auxiliar do eixo Y (vi) no dorsal dos outros dois blocos de slides (eixo X) em uma posição de cruzamento, montando duas placas de junção (VIII) no meio.
- Monte o suporte dos braços do robô (IX) na frente de dois blocos de slides (eixo Y) em uma posição de cruzamento com uma placa de junção (Figura 2a).
- Montar 4 escovas de cabelo (X) nos braços do robô (IX) com grampos (Figura 2B).
5. ajuste da máquina de carregamento da toque-força
Nota: todos os parâmetros de controle para definir o modelo K1 Touch Machine na fonte em negrito abaixo são mostrados no painel de controle (Figura 2F).
- Instale escovas de cabelo toque sobre os braços robóticos. Use uma régua de aço 330 mm-Long como um suporte para fixar uma camada de cabelo humano (3600-4600 cabelos/escova) uniformente. O comprimento do cabelo é de 126 mm (Figura 1C).
- Fixar as réguas de aço sobre os braços robóticos com duas braçadeiras de metal.
- Defina a altura dos braços da máquina ao longo da dimensão vertical (eixo Y) primeiro. Pressione jog F + para elevar e jog R- para abaixar os braços robóticos e escovas. Deixe a ponta de escovas de cabelo 0,5 cm mais baixo do que a borda do copo. Pressione o conjunto de zero. Pre-Run a máquina 1-2 ciclos para certificar-se de todos os indivíduos da planta estão sendo tocados. Ajustar e calibrar as escovas e pontas do cabelo para a mesma altura todos os dias durante todo o período de toque.
- Use uma balança eletrônica para medir a força de toque (carregamento vertical) e manter o nível de força de toque em 1-2 mN14.
- Defina a posição inicial dos braços da máquina ao longo da dimensão horizontal (eixo X) manualmente. Permita que as escovas de cabelo pendurem na borda de cada bandeja e certifique-se de que nenhuma planta está sendo tocada antes que o experimento tocante comece. Pressione jog F +/jog R- para mover o braço da máquina horizontalmente pouco a pouco para definir a posição inicial.
- Defina a distância de viagem da escova de cabelo na dimensão horizontal (eixo X) para 365 mm pressionando o botão de viagem . Pressione Inc. F +/Inc. R- para mover os braços da máquina para obter uma distância de viagem completa e garantir que todas as plantas tratadas estão sendo tocadas durante todo o experimento tocante.
- Ajuste a velocidade de movimento ao longo do eixo X dos braços da máquina em 5.000 mm/min pressionando o botão de velocidade automática . Mantenha a mesma velocidade de movimento durante toda a experiência tocante.
- Defina o tempo de toque em 20 ensaios pressionando o botão ciclo menor . Mantenha o mesmo número de toques por rodada durante todo o experimento tocante.
Nota: um ciclo menor é igual a duas distâncias de viagem , o que significa que os braços da máquina se movem da posição inicial para a posição final e depois voltam para a posição inicial. Um ciclo menor gera dois toques. Escovas de cabelo tocar plantas 40 vezes dentro de 20 ensaios (2 toques x 20 ensaios = 40 toques). O 40-Touch é definido para ser uma rodada de carga de força de toque. - Defina o intervalo de repetição do touch-round em 480 min por dia pressionando o botão de período principal . Mantenha a mesma frequência de rodadas de toque durante toda uma experiência tocante.
Nota: isso permite que as escovas de cabelo para tocar plantas para 3 rodadas por dia, eo tempo de intervalo entre cada rodada é 480 min (8 h). O número azul exibido representa o tempo de intervalo de cada rodada de toque. A máquina iniciará uma nova rodada de toque automaticamente quando a contagem regressiva abaixo (número vermelho) se transforma em 0000. - Defina o ciclo principal em 12 ensaios, o que significa que a máquina irá tocar plantas para 12 rodadas dentro de um período de 4 dias automaticamente. Esta configuração de 12 ensaios é usado para evitar erro humano em pular um dia de tocar.
- Pressione o botão Iniciar para iniciar o programa pré-definido. A máquina do toque do modelo K1 executará automaticamente o carregamento da força do toque de acordo com ajustes.
6. análise e coleta de dados fisiológicos
-
Dias para aparafir: Registre o dia de aparafação de cada planta individualmente dentro de um experimento tocante. O bolting é um símbolo que uma planta muda seu estágio do crescimento da fase vegetativa à fase reprodutiva. Em Arabidopsis, o dia de aparafusamento é definido como o número de dias utilizados por uma planta para ter sua primeira haste de inflorescência atingir 1 cm de comprimento.
Nota: a condição de crescimento descrita acima, a aparafação de plantas tipo selvagem normalmente inicia de 19 a 23 dias após a semeadura da semente e termina em 28-32 dias. -
Raio da roseta: Meça a distância do centro da roseta à ponta da folha a mais longa.
- Tire fotos de toda a bandeja a partir do topo. Tire fotos do grupo de controle e do grupo tratado por toque separadamente.
- Baixe o software apropriado. Use o software baixado gratuitamente ImageJ (https://ImageJ.nih.gov/IJ/download.html) por exemplo.
- Abra um arquivo de foto, use a função de zoom para ampliar a foto em um tamanho apropriado.
- Escolha a ferramenta reta para desenhar uma linha reta entre o centro da roseta e a ponta de uma folha mais longa para medir o raio da roseta.
- Selecione uma planta e pressione o botão esquerdo para desenhar uma linha reta do centro da roseta até a ponta mais longa da folha.
- Escolha a função Analyze-Measure ou pressione Ctrl + M para analisar a distância da linha.
- Selecione um copo e repita os dois passos anteriores para analisar o diâmetro de cada copo de plástico ao mesmo tempo. Use esses dados para executar o cálculo para eliminar o viés resultante da tomada de fotos.
Nota: a equação é:
Ra/da = rm/dm
(Ra, o raio real de Rosette de uma planta; Da, o diâmetro real do copo plástico; Rm, o raio Rosette medido da mesma planta determinada por um software; Dm, o diâmetro medido do copo plástico que é usado para crescer a mesma planta)
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Rosette área: medir a área de superfície horizontal 2-dimensional de folhas de Roseta.
- Retire a inflorescência sem afetar o resto dos órgãos de Roseta.
- Tire fotos do topo de cada planta junto com uma régua de escala colocada nas proximidades.
- Use um plugin gratuito de ImageJ, Rosette Tracker e siga o protocolo publicado anteriormente22.
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Representative Results
A máquina de carregamento automática do toque-força do cabelo
Para a observação de alterações morfológicas nas plantas, tanto as condições de crescimento reprodutíveis quanto os métodos de tratamento são fundamentais para a obtenção de resultados repetíveis. Esta triagem de sinalização mutante de alta produtividade e força de toque automática é alcançada pela máquina de carregamento de força de toque de cabelo recém-construída, modelo K1 (Figura 1, Figura 2). Estas escovas de cabelo pode tocar um máximo de 4 bandejas de plantas simultaneamente. Havia 24 copos colocados em uma bandeja, e 12 xícaras de plantas em um grupo usado como controle e as plantas tratadas (Figura 2C, D). Em cada xícara, quatro plantas foram cultivadas e um total de 48 ou menos indivíduos da planta foram tocados pela mesma escova de cabelo, o que garante plantas suficientes para posterior análise estatística. Um máximo de 4 genótipos de plantas pode ser tratado ao toque simultaneamente em uma máquina de toque modelo K1. Um dos pontos-chave é o ajuste da altura do braço/cabelo da máquina do toque porque o thigmomorphogenesis é dose-dependente6,21. As posições diferentes do cabelo com respeito à posição da folha da Roseta da planta geram forças diferentes do toque, que podem gerar resultados totalmente diferentes do thigmomorphogenesis. Em nossas experiências, a ponta de contato da planta dos cabelos deve ser coloc 0,5 cm mais baixo do que a borda do copo (Figura 2E), que gera as forças que são similares à força previamente publicada14do toque. Um controlador programável instalado em um painel de toque é usado para controlar toda a máquina de carregamento da força de toque (Figura 2F, Veja a tabela de materiais).
A comparação de dois métodos de toque diferentes
Para comparar este método automático de cabelo acionado por máquina com o método de toque de cotonete convencional manualmente, foram realizados dois experimentos independentes na Col-0 (Figura 3). No grupo do toque do cotonete de algodão, tocar começou das plantas 12 Day-Old. Cada rodada tinha 40 toques (1 toque/s). No total, foram realizadas 3 rodadas por dia (Figura 3A). Mostrou 1,7 dias de atraso na aparafação após um tratamento contínuo do toque do cotonete de algodão (22,1 ± 0,2 dias contra 23,8 ± 0,2 dias). Da mesma forma, para o toque automático de cabelo acionado por máquina, o carregamento de força de toque iniciado a partir de plantas de 14 dias de idade e 40 vezes de toque (dentro de 3 min) foram aplicados para uma rodada. No total, foram realizadas 3 rodadas de toques por dia com exatamente 8 horas de intervalo (Figura 3B). A parafação atrasada foi observada para plantas Col-0 . O tempo médio de aparafenamento foi de 23,0 ± 0,3 dias, enquanto o tempo de aparafenamento das plantas tratadas com máquina de toque modelo K1 foi de 24,7 ± 0,2 dias. As diferenças entre o controle e as plantas tratadas com toque foram, conseqüentemente, analisadas com o modelo univariado de riscos proporcionais de Cox. Ele ofereceu a estimativa de risco Ratio (HR) de 0,31 (cotonete de toque) e 0,52 (toque de cabelo acionado por máquina), respectivamente (Figura 3C), o que significa que os riscos de aparafatamento/probabilidade de plantas no grupo tocado é de 31% e 52% em comparação com plantas no grupo controle, respectivamente. Isto indica que a possibilidade de aparafir das plantas selvagens tocadas do tipo é em torno da metade em comparação àquela das plantas de controle intocadas não obstante se é toque manual com um cotonete do algodão ou o toque automatizado do cabelo.
Os resultados prospectivos em diferentes mutantes de toque
Os dados preliminares recentes sugeriram que MKK1 e MKK2 puderam jogar um papel importante na resposta do toque de Arabidopsis14. Selecionamos esses dois mutantes e realizamos experimentos de toque nesses mutantes de resposta de toque putativos usando a máquina de carregamento automática de força de toque de cabelo (Figura 4, tabela 1). As plantas de controle do tipo Wild mostraram 1,8 dias de atraso de aparafus (24,1 ± 0,3 dias vs. 25,9 ± 0,2 dias, Figura 4a) assim como o relatório anterior14 , enquanto este atraso de aparafação não foi observado em mutantes insercionais de T-DNA, mkk1 (24,6 ± 0,2 dias vs. 24,4 ± 0,3 dias, Figura 4B e tabela 1) e mkk2 (23,9 ± 0,1 dias vs. 24,2 ± 0,2 dias, Figura 4C e tabela 1). Analisando esses dados com o modelo univariado de riscos proporcionais de Cox, apenas o tipo selvagem Col-0 exibiu diferença significativa entre o controle e as plantas tocadas com uma FC estimada de 0,41 (Figura 4D). Estas experiências de carregamento da força de toque conduzidas pela máquina de carregamento automática do toque-força do cabelo demonstraram que os mutantes mkk1 e mkk2 são mutantes da resposta do toque.
A mensuração de outros índices morfológicos
As mudanças morfológicas associadas com o thigmomorphogenesis não são limitadas ao atrasando de aparaftratar. A haste mais curta e o tamanho menor da folha do Rosette são igualmente os componentes de thigmomorphogenesis6,7,9,14. Assim, foram relatados dois tipos adicionais de medidas em índices morfológicos de resposta ao toque, raio de Roseta/comprimento da folha e área de roseta (projetada) (Figura 5). Similar à mudança previamente observada do phenotype, o tipo selvagem Col-0 planta mostrou o raio significativamente menor do Rosette e o comprimento mais curto da folha após 3 dias do toque de cabelo máquina-conduzido automático constante e repetitivo (1,77 ± 0, 5 cm contra 1,50 ± 0, 4 cm, Figura 5A). A área de Roseta projetada foi alterada de 20,32 ± 0,53 cm2 para 16,19 ± 0,48 cm2 após 13 dias de toque (Figura 5B). Ambos mkk1 e mkk2 tiveram o raio e a área reduzidos similares da roseta. Tomados em conjunto, estes dados demonstraram que as proteínas MKK1 e MKK2 são importantes para o atraso de aparafreamento de Arabidopsis e não são necessárias para moldar o tamanho da roseta e a área da roseta.
Análise estatística
Quanto às parcelas de caixa e de Whisker mostradas na Figura 2 e na Figura 3 e os gráficos de coluna mostrados na Figura 5, a significância estatística foi analisada pelo teste t de Student bicaudal, com significância representada por * * * e n.s. em p < 0, 1 e p > 0, 5, respectivamente. Para as parcelas de Kaplan-Meier mostradas na Figura 2 e na Figura 3, utilizou-se uma análise de risco univariada de Cox para analisar o efeito do tratamento do toque no evento de parafusamento,23. O índice de risco (HR), 95% intervalo de confiança (95% CI) e valor de p são oferecidos nas tabelas abaixo. Por exemplo, hr = 0,5 significa que em um dia específico, o risco/probabilidade de aparafusamento de plantas no grupo tocado era 0,5 ou 50% comparado com aquelas plantas no grupo de controle.
Figura 1 . A construção e os parâmetros da máquina de carregamento automática do toque-força do cabelo. (A) esquemas padrão do atuador linear. O painel superior esquerdo é a vista lateral e o painel inferior esquerdo é a vista dorsal. Os comprimentos totais do módulo do eixo X e do módulo do eixo Y são 843 mm e 1.038 mm, respectivamente. Cada padrão X/Y módulo é composto de um guia-ferroviário, um bloco de slides e 1 57 motor deslizante (pré-instalado e desmontável). Para uma máquina de toque modelo K1 personalizada, cada módulo X/Y é composto por dois blocos de slides (vermelho). A placa de junção do módulo X é ampliada de 56 mm para 100 mm para oferecer melhor conexão e suporte. O painel superior direito é a seção transversal do guia-trilho e o painel direito mais baixo é o motor deslizante 57. (B) esquemas do eixo duplo X construído e dos atuadores lineares de eixo Y duplo. Esta é a parte principal da máquina de carregamento da força de toque. O painel inferior esquerdo é a vista dorsal dos atuadores lineares construídos. O painel superior esquerdo é a vista lateral do módulo do eixo X (843 mm). O painel central é a vista lateral do módulo do eixo Y (1.038 mm). O painel superior direito é a vista dorsal de 4 blocos da corrediça no módulo de Y e na viga auxiliar de Y. O painel inferior direito é a vista dorsal da placa de junção no módulo X. (C) o fluxograma do conjunto da peça da máquina. As peças diferentes são marcadas e nomeadas na figura. Os processos de montagem detalhados foram descritos no protocolo. A unidade mostrada é esta figura é mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . O projeto total da máquina de carregamento automática do toque-força do cabelo. (A) o modelo acabado K1 toque máquina. A foto foi tirada da parte da frente. O atuador linear superior controla o braço do robô que move-se horizontalmente e o atuador linear mais baixo controla o braço robótico que move-se verticalmente. (B) a vista lateral que mostra os braços robóticos desmontáveis. Escovas de cabelo foram presas sobre os braços robóticos. (C e D) Fotos mostrando como os cabelos humanos escovas tocar as plantas, que foram tomadas a partir do lado da frente e do lado lateral, respectivamente. (E) a vista lateral que mostra como ajustar a altura da escova de cabelo de encontro à borda do copo. Ambos os braços da máquina e escovas de cabelo são visíveis. (F) a interface de operação da máquina de toque modelo K1. Um controlador programável (AFPX-C30T) ligado a um painel táctil (MT6070i) é utilizado para controlar toda a máquina. As configurações detalhadas e os procedimentos operacionais são descritos no protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Comparando os efeitos de dois métodos do toque no thigmomorphogenesis. (A-b) a comparação do toque manual do cotonete de algodão (a) e do toque humano do cabelo conduzido pela máquina de carregamento automática da toque-força (b), respectivamente. As parcelas da caixa e do Whisker são mostradas no painel esquerdo, que mostram a comparação do dia de aparafação médio entre o grupo de controle e o grupo tocado. Médias ± SE são mostradas. A análise estatística foi realizada pelo teste t de Student. Significância em p < 0, 1 é mostrada como * * *. As parcelas de Kaplan-Meier são mostradas no meio, que são a porcentagem de plantas de aparafreamento sobre o tempo de crescimento (dias após a semeadura). O painel direito mostra indivíduos representativos do controle intocado e das plantas tocadas que mostram a diferença no tempo de aparafenamento e na altura do caule da desflorescência. (C) a tabela resumida: os números numéricos no controle e nas colunas tocadas são o número da planta usado para a análise estatística. A razão de risco (HR), o intervalo de confiança de 95% (95% CI) e o valor de p a seção da análise de risco univariada de Cox são oferecidos. O risco e a probabilidade de aparafusamento das plantas no grupo tocado eram 31% e 52% em comparação com o grupo intocado, respectivamente. A análise de risco univariada de Cox foi estimada pelo programa SPSS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . O thigmomorphogenesis de mutantes de mkk1 e de mkk2 assim como a planta selvagem do tipo (Col-0) induzida pelo toque automático do cabelo. (A-C) a resposta de toque prospectivo de Col-0 (a) , mkk1 (B), e mkk2 (C) gerada através da repetição de toques de cabelo humano impulsionado pela máquina de carregamento automático de força de toque. As parcelas da caixa e do Whisker são mostradas no painel esquerdo, que são a comparação do dia de aparafação médio entre o grupo de controle e o grupo tocado. Médias ± SE são mostradas. A análise estatística foi realizada pelo teste t de Student. Os * * * e n.s. representam p < 0, 1 e p > 0, 5, respectivamente. As parcelas de Kaplan-Meier são mostradas no meio, que são a porcentagem de plantas de aparafreamento durante o período de crescimento (dias após a semeadura). O painel direito mostra indivíduos representativos do controle intocado e das plantas tocadas que mostram a diferença de aparafenamento. Os dados de mkk1 (B) e mkk2 (C) foram compilados a partir de duas e três repetições biológicas, respectivamente. Os números de plantas detalhados utilizados em cada repetição foram mostrados na tabela 1. (D) a tabela resumida: os números controle e colunas de toque foram o número da planta utilizado/analisado nesses dois grupos, respectivamente. Foram oferecidas a FC, 95% IC e valor de p na seção de análise de risco univariada de Cox. O risco/probabilidade de aparafusamento de plantas selvagens do tipo no grupo tocado é 41% em comparação com o grupo de controle. A análise de risco univariada de Cox foi estimada pelo programa SPSS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . O raio da roseta e a medida da área para definir o thigmomorphogenesis. (A-B) o raio da roseta e a área da roseta do tipo selvagem foram medidos no dia 17 e dia 27 após a semeadura da semente, respectivamente. As barras mostradas no painel superior esquerdo são as comparações entre o raio da roseta ou a área da roseta entre o grupo controle e o grupo tocado, respectivamente. Médias ± SE são mostradas. A análise estatística foi realizada pelo teste t de Student; p < 0, 1. As fotos mostradas no painel superior direito são plantas individuais representativas. As tabelas resumidas abaixo mostram o número do centro analisado no grupo controle e o grupo tocado. O raio da roseta (cm) no dia 17 e a área do Rosette (cm2) no dia 27 são mostrados igualmente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Os dados de aparafação de diferentes repetições biológicas. A tabela resumida contém duas repetições biológicas de mkk1 e três repetições biológicas de mkk2.
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Discussion
Thigmomorphogenesis é uma resposta complexa do crescimento de planta para perturbações mecânicas, que envolve uma rede da sinalização e da ação celulares de phytohormones. É uma consequência da evolução adaptativa das plantas para sobreviver as condições ambientais indesejáveis25,26. O toque mecânico, especialmente o toque humano do dedo e o toque Hand-Held do cotonete de algodão, foram selecionados para estudar estas mudanças morfológicas em estudos previamente thigmomorphogenetic14,15. Esta versão simplificada do carregamento da força de toque para acionar a resposta do toque da planta é mais fácil de controlar e aplicar. Além, este tipo de método do carregamento da toque-força pode em alguma maneira imitar os sinais de força gota-estimulados vento-e da chuva produzidos no ambiente natural19. A força de toque é capaz de desencadear picos de cálcio, induzir a fosforilação proteica14 e a expressão gênica a jusante mediando a resposta do toque19. Similarmente, as escovas de cabelo humanas montadas em braços moventes automatizados podem igualmente gerar a resposta do toque da planta imitando os toques mão-manipulados humanos. Para diversificar os tipos de aplicação da força, os bocais de aspersão de água e/ou sopradores de vento também podem ser instalados nos braços robóticos da máquina e utilizados para um experimento fisiológico (Figura 2). A característica original faz a máquina de carregamento automática da mecânico-força mais versátil nos estudos morfogénicos e fisiológicos. A vantagem a mais grande desta máquina automática do carregamento da mecânico-força é provavelmente seu trabalho-livre, repetível e tempo-economia característica, que faz possível executar uma seleção específica do phenotype do mutante de um grande número indivíduos mutagenized. Em contraste com horas de toques mão-manipulados humanos, a máquina de toque modelo K1 pode tocar vários mutantes simultaneamente e completar uma rodada de toque dentro de 3 a 5 min. O período de tempo para uma rodada de toque depende em grande parte da configuração do programa no início do tratamento. Se cada planta individual seria tocado 40 vezes em uma rodada, o modelo K1 máquina só precisaria 9-15 min para terminar três rodadas de tratamento de toque dentro de um dia. O intervalo de tempo entre cada rodada de toques pode ser precisamente controlada; é menos provável que os seres humanos alcancem tal precisão.
Uma outra edição importante a respeito do tratamento do toque é que estágio do crescimento de planta a força do toque precisa de ser aplicada em cima. Em nossa prática, o toque começou 14 dias após a semeadura de sementes tanto para o tipo selvagem quanto para dois mutantes, já que as taxas de crescimento desses três genótipos são semelhantes. Para aqueles mutantes que têm uma diferença significativa no tempo de desenvolvimento do tipo selvagem, pode-se escolher um dia inicial diferente para iniciar o toque. Realizar o teste One-Way ANOVA nos dados de aparafus de ambos os tipos de plantas selvagens e mutantes para comparações múltiplas pode ajudar14. Esta análise estatística pode oferecer a conclusão adequada sobre as diferenças de tempo de aparafuso gerados por genótipos. Neste caso, uma análise de risco proporcional de Cox multivariada deve ser usada para considerar dois parâmetros variáveis.
Para definir o nível de força de toque dos pêlos humanos montados na máquina de toque modelo K1, ajustamos tanto a altura (força vertical) quanto a velocidade (força horizontal) das escovas de cabelo (Figura 2e). As configurações certas foram determinadas com base nos dados preliminares coletados de várias rodadas de testes de nível de força em uma planta de Arabidopsis colocada em escala eletrônica. Como encontramos, manter a altura do cabelo e a velocidade inalterada ao longo de todo o experimento de resposta ao toque produzirá um fenótipo thigmomorfogenético semelhante e constante entre as repetições para uma linha de Arabidopsis. Demasiado pesado um toque-força pode matar os seedlings novos porque as escovas moventes rápidas do cabelo podem conduzir a ferir na superfície de uma folha. Em contraste, muito leve um toque-força pode não ser suficiente para desencadear o atraso de aparafdar dentro de 2 semanas de repetição de tocar. Em nosso experimento anterior, determinamos o carregamento adequado da força de toque para ser 1-2 MN por toque14,15. O comprimento do cabelo de 0,5 cm mais baixo do que a borda do copo é usado para gerar uma força vertical similar do toque no toque máquina-baseado do cabelo do modelo K1 com uma velocidade movente horizontal suave 5000 milímetros/minuto (Figura 2E). Este ajuste fixo da máquina modelo K1 reduz a variação da força da força resultou do erro humano.
Total, os toques do cabelo executados pela máquina de carregamento automática da toque-força fornecem somente um carregamento médio da toque-força em plantas. A força de toque precisa aplicada, especialmente a força horizontal carregada, é difícil de calcular tanto para um único cabelo ou um grupo de pêlos em uma escova. Além disso, a variância da forma da planta e da altura da haste pode interferir na aplicação da força horizontal. Medir este tipo de força física ou stress precisa de um sensor de pressão mais preciso ligado a um cabelo ou um grupo de pêlos. Acredita-se que o sensor de pressão mais preciso e a modelagem matemática serão aplicados para melhorar a máquina de carregamento automática do toque-força no futuro. As condições de crescimento, tais como a intensidade da luz, a umidade do solo e a temperatura da estufa assim como os nutrientes que fornecem, todos jogam um papel crucial no desenvolvimento do phenotype da resposta do toque. Quaisquer condições de stress, tais como seca, fraca condição de luz com menos de 90 μE ∙ m-2∙ s-1, e uma temperatura mais alta ou mais baixa que pode afetar o crescimento normal de Arabidopsis irá interferir com a medição da resposta ao toque de ambos selvagem tipo e mutantes.
Em suma, esta máquina de carregamento de força de toque automático pode oferecer mais mão de obra-economia e uniformizado de toque de força de carga do que o toque humano dedo e cotonete de algodão toque. Espera-se que o modelo K1 toque máquina será aplicada em vários alta-taxa de toque-força de sinalização de rastreamento mutante e análise de resposta de toque entre as culturas agrícolas ou provavelmente modelos de animais com algumas modificações do toque-força de carga Máquina.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelas seguintes subvenções: 31370315, 31570187, 31870231 (Fundação Nacional de ciência da China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC de Hong Kong). Os autores gostariam de agradecer a Ju Feng Precision e Automation Technology Limited (Shenzhen, China) por sua oferta de vários esquemas mostrados na Figura 1.
Os autores também gostariam de agradecer a S. K. Cheung e W. C. Lee por sua contribuição para o desenvolvimento da máquina de carregamento de força de toque.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
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