Summary
Una delicata macchina di caricamento touch-force è costruita da spazzole per capelli umani, bracci robotici e un controller. Le spazzole per capelli sono azionate da bracci robotici installati sulla macchina e si muovono periodicamente per applicare la forza tocco sulle piante. La forza dei tocchi di capelli guidati da macchine è paragonabile a quella dei tocchi applicati manualmente.
Abstract
Piante che rispondono a stimolazioni meccaniche intracellulari ed extracellulari (o segnali di forza) e sviluppano speciali cambiamenti morfologici, una chiamata thigmomorfogenesi. Negli ultimi decenni, diversi componenti di segnalazione sono stati identificati e segnalati per essere coinvolti nella meccanotra (ad esempio, proteine che legano gli ioni di calcio ed enzimi di biosintesi dell'acido jasmonico). Tuttavia, il ritmo relativamente lento della ricerca nello studio della segnalazione della forza o della tigmomorfogenesi è in gran parte attribuito a due motivi: il requisito per l'induzione del tocco manipolato a mano umano della thigmomorfogenesi e gli errori di forza della forza associato al tocco delle persone. Per migliorare l'efficienza del carico di forza esterna su un organismo vegetale, è stata costruita una macchina di carico automatico touch-force. Questo pennello robotico a braccio-driven fornisce una simulazione touch-force salvabile e facilmente ripetibile, cicli illimitati di ripetizione tramite tocco e forza di tocco regolabile. Questa macchina per il caricamento a pressione dei capelli può essere utilizzata sia per lo screening su larga scala dei mutanti di segnalazione a forza di tatto sia per lo studio della fenomica della tigmomorfogenesi delle piante. Inoltre, materiali tattili come i capelli umani, possono essere sostituiti con altri materiali naturali come i peli di animali, fili di seta e fibre di cotone. I bracci mobili automatizzati sulla macchina possono essere dotati di ugelli di spolverata d'acqua e soffiatori d'aria per imitare le forze naturali delle gocce di pioggia e del vento, rispettivamente. Utilizzando questa macchina di carico automatica per il tocco di capelli in combinazione con il tappi di cotone eseguito a mano, abbiamo studiato la risposta al tocco di due mutanti di segnalazione di forza, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) e MKK2 impianti . I fenomi delle piante di tipo selvaggio caricate a motore e due mutanti sono stati valutati statisticamente. Hanno mostrato differenze significative nella risposta al tocco.
Introduction
La thigmomorfogenesi vegetale è un termine che è stato coniato da Jaffe, MJ nel 19731. È un tropismo vegetale ma diverso dal noto fototropismo o gravitropismo causato da stimoli di luce solare o gravità2,3. Descrive alterazioni fenotipiche associate a stimolazioni meccaniche periodiche, che sono state frequentemente osservate dai botanici in tempi precedenti4,5. Gocce di pioggia, vento, piante, tocchi animali e umani, anche morsi di animali, sono tutti considerati diversi tipi di mechano-stimoli che innescano la segnalazione della forza nelle piante4,5. Le caratteristiche della thigmomorphogenesis comprendono il ritardo di bullonatura, uno stelo più corto, la dimensione più piccola di rosette/foglia nelle piante erbacee e uno stelo più spesso nelle piante legnose6,7,8. Questo è diverso dalla risposta tigmonastica o tigmotropica che si trova spesso nella pianta di Mimosa o in altre viti sensibili al meccano, dove queste risposte rapide al tatto sono più facili da osservare1,9,10. La thigmomorfogenesi, d'altra parte, è relativamente difficile da osservare a causa della sua lenta risposta alla crescita. La thigmomorfogenesi è di solito osservata dopo settimane o addirittura anni di stimolazione continua del caricamento della forza. Questa natura unica della risposta al tocco delle piante rende difficile eseguire uno schermo genetico in avanti utilizzando la stimolazione del tocco della mano umana per isolare i mutanti resistenti alla segnalazione della forza touche in modo robusto.
Per chiarire le vie di trasduzione del segnale di forza e i meccanismi molecolari alla base della tigmomorfogenesi6,11, esperimenti biologici molecolari e cellulari sono stati eseguiti negli ultimi6, 12,13,14. Questi studi hanno proposto che i recettori del segnale di forza vegetale consistono principalmente di canali ionici meccanosensitive (MSC) e complessi MSC legati composti da complessi multimerici di proteine che si estendono a membrana11,14 , 15.Il picco transitorio citoplasma Ca2 o generato in pochi secondi dal tocco iniziale. Vento, pioggia-, o gravi-stimolazione può interagire con i sensori di calcio a valle per trasdurre i segnali di forza agli eventi nucleari14,16,17,18. Oltre agli studi molecolari e cellulari, lo schermo genetico in avanti con tocco manuale delle piante ha scoperto che i fitoormoni e i metaboliti secondari sono coinvolti nella conseguente espressione genica tramite terrore (TCH) carico touch-force13,19. Ad esempio, aos e opr320 mutanti sono stati identificati finora dagli studi genetici. Tuttavia, il problema principale associato all'applicazione della genetica avanzata nello studio della thigmomorfogenesi è ancora il lavoro intensivo necessario per quantificare il livello di risposta al tatto e toccare una grande popolazione di geneticamente mutati singole piante. Il problema che richiede molto tempo persiste anche nello schermo mutante a contatto a mano14,20. Per un esempio, per completare un round di stimolazione della forza di tocco, una persona deve toccare 30-60 volte (un tocco al secondo) su una singola pianta. Per avere un numero sufficiente di piante per l'analisi statistica del fenotipo, per il processo di caricamento della forza touch sono normalmente necessari 20-50 singoli impianti dello stesso genotipo. Questo regime di caricamento touch-force significa che una persona ha bisogno di eseguire ripetutamente 600-3.000 tocchi su un genotipo di scelta. Questo tipo di tocco normalmente deve essere ripetuto da 3 a 5 colpi al giorno, che equivale a circa 1.800-15.000 dita o tocchi di cotone tocchi di cotone al giorno per genotipo di piante. Una persona ben addestrata è normalmente necessaria per mantenere la forza e la forza di tocchi multipli all'interno di una gamma desiderabile attraverso molti cicli di ripetizione in un giorno per evitare la grande variazione di forza e forza. Come è ben noto che la tigmomorfogenesi è un processo saturabile e dose-dipendente6,21, forza tocco / forza diventa fondamentale per un successo nell'attivazione della risposta al tocco di una pianta.
Per rimuovere il caricamento a passo toccato dipendente dalla persona e mantenere l'applicazione meccanica entro un intervallo di errore accettabile14,abbiamo quindi progettato una macchina di caricamento automatico a forza di tatto per sostituire i tocchi manipolati a mano. La macchina ha 4 bracci in movimento costruiti, ognuno dei quali è dotato di una spazzola per capelli umana. Questa versione è denominata Modello K1 per specificare la sua caratteristica del caricamento tatto-forza dei capelli umani. Se 4 genotipi sono misurati quantitativamente per la loro tigmomorfogenesi o risposta al tatto sotto una macchina, 40-48 individui per genotipo possono essere misurati. Ogni ripetizione del tocco (meno di 60 volte di tocco per pianta) dura meno di 5 minuti utilizzando un braccio robotico regolabile a velocità in movimento. Così, gli impianti su una macchina touch model K1 possono essere stimolati meccanicamente per più round al giorno, con un carico costante di touch-force o diversi livelli di forza inizialmente programmati.
L'Arabidopsis thaliana, un organismo vegetale modello, è stata quindi scelta come specie vegetale bersaglio per testare l'applicazione della macchina di carico a motore touch-force dei capelli completamente automatica. Poiché ci sono diverse grandi sementi disponibili per il recupero dei vari germplasmi di mutanti e delle dimensioni della fioritura, l'Arabidopsis si adatta bene allo spazio disponibile nella mensola di crescita montata con la macchina touch Model K1.
La macchina a sfioramento automatico Model K1 è composta da tre componenti principali: (1) il rack metallico a forma di H composto da due attuatori lineari a nastro, (2) bracci metallici robotici dotati di spazzole per capelli e (3) un controller. Per una macchina touch model K1 personalizzata, ogni modulo dell'asse X/Y è composto da una guida-rail guidata da cintura, due blocchi di scorrimento (rosso) e un motore da 57 stepper (preinstallato e smontabile) (Figura 1A,B). L'attuatore orizzontale superiore permette al braccio metallico robotico di muoversi a sinistra ea destra orizzontalmente, l'attuatore lineare con cintura verticale inferiore consente al braccio metallico robotico di muoversi su e giù verticalmente (Figura 1B, Figura 2A ). Nell'attuatore verticale sono stati installati quattro bracci robotici smontabili (Figura 1C, Figura 2B). Quattro spazzole per capelli umane erano legate a quattro bracci robotici, rispettivamente (Figura 1C, Figura 2B). Tutte le parti meccaniche per costruire la macchina touch Model K1 in grassetto riportato di seguito sono contrassegnate nella Figura 1C (vedere anche la tabella dei materiali).
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Protocol
1. Preparazione dei semi
NOTA: i semi di Arabidopsis di entrambi i tipi selvatici (Col-0) così come i mutanti mkk1 e mkk2 loss-of-function utilizzati sono stati acquistati presso l'Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC, https://www.arabidopsis.org, Columbus, OH).
- Calcolare quanti individui vegetali di ciascun genotipo saranno utilizzati per un'analisi statistica affidabile. Preparare un numero sufficiente di semi in base al tasso di germinazione di ogni linea, di solito 4-5 volte di più di quanto necessario per un esperimento. Assicurarsi che un numero sufficiente di piante sane e di dimensioni uniformi possa essere utilizzato per il saggio di risposta al tocco. Secondo questo protocollo, 300-500 semi per genotipo sono di solito utilizzati per produrre 80-90 piante di dimensioni simili.
- Immergere i semi in acqua fredda e conservarli in 4 gradi centigradi (coperti con un foglio di alluminio per tenerli scuri) per l'imbibition dei semi. Semina i semi 5-7 giorni dopo l'imbibition.
2. Crescita delle piante
- Selezionare il terreno appropriato per la crescita delle piante (vedere la Tabella dei Materiali). Evitare grandi ciuffi e mescolare in modo omogeneo.
- Preparare 24 bicchieri di plastica: la capacità di tenuta è di 207 mL e il diametro superiore del bordo è di 7,4 cm. Forare tre fori rotondi nella parte inferiore di una tazza per scopi di irrigazione.
- Riempire queste tazze di plastica con il terreno misto. Lasciare che il terreno si accumuli fino a 1-2 cm più in alto del bordo della tazza e appiattisci la superficie del terreno accatastato dolcemente.
- Trasferire 24 tazze in un vassoio di plastica (21 pollici x 10,8 pollici x 2,5 pollici) e posizionare il vassoio in condizioni di luce costante (vedi sotto).
- Aggiungere 2,5 L di acqua in ogni vassoio due ore prima della semina del seme. Lasciare che il terreno assorba l'acqua dai fori situati sul fondo delle tazze e attendere che la superficie del terreno cada al livello del cerchio della tazza.
- Semina 3-4 semi in un unico punto, e 4 punti distribuiti uniformemente all'interno di una tazza.
- Posizionare una copertura di plastica trasparente sopra ogni vassoio e lasciare che i semi germinano per una settimana. Quindi rimuovere il coperchio e lasciare che le piantine a crescere per un'altra settimana.
- Rimuovere le piante extra assottigliando e mantenere 4 individui vegetali di dimensioni simili in ogni tazza 9-10 giorni dopo la semina di semi.
- Irrigare le piante con 1,5 L di acqua ogni due giorni dopo la germinamento dei semi.
3. Condizione di crescita
- Impostare la temperatura della camera di crescita a 23,5 x 1,5 gradi centigradi, e l'umidità tra il 35 e il 45%.
- Impostare l'intensità della luce tra 180 e 240 m-2ì s-1 (misurata dal radiometro di ricerca IL 1700, Luce internazionale)14. La radiazione attiva fotosintetica è da 90 a 120 - M-2s-1.
- Impostare la condizione della luce su una costante di 24 ore.
4. La costruzione della macchina di carico touch-force
NOTA: Questa macchina robotica per il caricamento a motore dei capelli (modello K1) è progettata per servire per scopi sia di screening mutante di segnalazione touch-force che di generazione di piante thigmomorphogenesis (Figura 1, Figura 2).
- Moduli di preinstallazione (smontabile, Figura 1C)
- Installare due blocchi scorrevoli (I) e un motore da 57 stepper (II) sul modulo guida dell'asse X/Y (III/V).
- Installare due blocchi scorrevoli (I) sulla trave ausiliaria dell'asse X/Y (IV/VI).
- Installazione di altre parti meccaniche (Figura 1C)
- Fissare insieme il modulo guide-rail dell'asse X (III) e la trave ausiliaria (IV) dell'asse X assemblando due piastre di giunzione (VII) ad ogni estremità della guide-rail.
- Fissare il modulo guide-rail dell'asse Y (V) sulla dorsale di due blocchi di scorrimento (asse X) in posizione di incrocio assemblando due piastre di giunzione (VIII) in mezzo.
- Fissare la trave ausiliaria dell'asse Y (VI) sulla dorsale degli altri due blocchi di scorrimento (asse X) in posizione di incrocio assemblando due piastre di giunzione (VIII) in mezzo.
- Assemblare il supporto di bracci robot (IX) sulla parte anteriore di due blocchi di scorrimento (asse Y) in una posizione di incrocio con una piastra di giunzione (Figura 2A).
- Assemblare 4 spazzole per capelli (X) su bracci robot (IX) con morsetti (Figura 2B).
5. Impostazione della macchina di caricamento Touch-Force
NOTA: tutti i parametri di controllo per impostare la macchina touch Model K1 in grassetto riportato di seguito sono visualizzati nel pannello di controllo (Figura 2F).
- Installare spazzole per capelli touch sui bracci robotici. Utilizzare un righello d'acciaio lungo 330 mm come supporto per fissare uno strato di capelli umani (3.600-4.600 capelli /spazzola) in modo uniforme. La lunghezza dei capelli è 126 mm (Figura 1C).
- Fissare quei righelli d'acciaio sui bracci robotici con due morsetti metallici.
- Impostare prima l'altezza dei bracci macchina lungo la quota verticale (asse Y). Premere Jog F, per sollevare e Jog R- per abbassare i bracci e i pennelli robotici. Lasciare che la punta dei capelli spazzola 0,5 cm più in basso del bordo della tazza. Premere il set di zero. Pre-eseguire la macchina 1-2 cicli per assicurarsi che tutti gli individui dell'impianto vengono toccati. Regolare e calibrare le spazzole e le punte dei capelli alla stessa altezza ogni giorno durante l'intero periodo di contatto.
- Utilizzare una scala elettronica per misurare la forza di tocco (caricamento verticale) e mantenere il livello di forza tocco a 1-2 mN14.
- Impostare manualmente la posizione iniziale dei bracci macchina lungo la quota orizzontale (asse X). Lasciare che i pennelli per capelli appesi al bordo di ogni vassoio e assicurarsi che nessuna pianta venga toccata prima dell'inizio dell'esperimento toccante. Premere Jog F/Jog R- per spostare il braccio della macchina orizzontalmente a poco a poco per impostare la posizione di partenza.
- Impostare la distanza di percorrenza del pennello per capelli nella dimensione orizzontale (asse X) su 365 mm premendo il pulsante Viaggi. Premere R- per spostare i bracci della macchina per ottenere una distanza di viaggio completa e assicurarsi che tutte le piante trattate vengano toccate durante l'intero esperimento di contatto.
- Impostare la velocità di movimento lungo l'asse X dei bracci macchina a 5.000 mm/min premendo il pulsante Velocità automatica. Mantenere la stessa velocità di movimento durante l'intero esperimento di tocco.
- Impostare il tempo di tocco in 20 prove premendo il pulsante Ciclo secondario. Mantenere lo stesso numero di tocchi per round durante l'intero esperimento di tocco.
NOTA: Un Ciclo Minore equivale a due distanze di viaggio, il che significa che i bracci della macchina si sposteranno dalla posizione di partenza alla posizione finale e poi di nuovo alla posizione di partenza. Un ciclo secondario genera due tocchi. Le spazzole per capelli toccano le piante 40 volte in 20 prove (2 tocchi x 20 prove - 40 tocchi). Il 40-touch è definito per essere un giro di carico touch-force. - Impostare l'intervallo di ripetizione del round a tocco a 480 min al giorno premendo il pulsante Periodo principale. Mantenere la stessa frequenza di turni di tocco durante un intero esperimento di tocco.
NOTA: Questo permette alle spazzole per capelli di toccare le piante per 3 giri al giorno, e l'intervallo di tempo tra ogni round è di 480 min (8 h). Il numero blu visualizzato rappresenta l'intervallo di tempo di ogni round di tocco. La macchina avvierà automaticamente un nuovo giro di tocco quando il conto alla rovescia sotto (numero rosso) si trasforma in 0000. - Impostare il ciclo principale a 12 prove, il che significa che la macchina toccherà le piante per 12 colpi entro un periodo di 4 giorni automaticamente. Questa impostazione di 12 prove viene utilizzata per evitare errori umani nel saltare un giorno di contatto.
- Premere il pulsante di avvio per avviare il programma preimpostato. La macchina touch Model K1 eseguirà automaticamente il caricamento della forza tocco in base alle impostazioni.
6. Raccolta e analisi dei dati fisiologici
-
Giorni di bullolaggio: Registrare il giorno di bullolaggio di ogni pianta singolarmente all'interno di un esperimento toccante. Il bullonaggio è un simbolo che una pianta cambia la sua fase di crescita dalla fase vegetativa alla fase riproduttiva. Nell'Arabidopsis, il giorno di bullolazione è definito come il numero di giorni utilizzati da una pianta per avere il suo primo stelo di infiorescenza raggiunge 1 cm di lunghezza.
NOTA: In base alle condizioni di crescita sopra descritte, l'imbullonatura delle piante di tipo selvatico inizia normalmente da 19 a 23 giorni dopo la semina del seme e termina a 28-32 giorni. -
Rosette Raggio: Misurare la distanza dal centro della rosetta alla punta della foglia più lunga.
- Scattare foto di tutto il vassoio dall'alto. Scattare foto del gruppo di controllo e del gruppo trattato con il tocco separatamente.
- Scaricare il software appropriato. Utilizzare il software libero scaricato ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html) per esempio.
- Aprire un file di foto, utilizzare la funzione di zoom per ingrandire la foto in una dimensione appropriata.
- Scegliere lo strumento Retteper disegnare una linea retta tra il centro della rosetta e la punta di una foglia più lunga per misurare il raggio della rosetta.
- Selezionare una pianta e premere il pulsante sinistro per disegnare una linea retta dal centro della rosetta alla punta foglia più lunga.
- Scegliere la funzione Analyze-Measure o premere Ctrl s M per analizzare la distanza della linea.
- Selezionare una tazza e ripetere i due passaggi precedenti per analizzare contemporaneamente il diametro di ogni tazza di plastica. Utilizzare questi dati per eseguire il calcolo per eliminare la distorsione risultante dalla foto-presa.
NOTA: l'equazione è:
Ra/Da : Rm/Dm
(Ra, l'effettivo Rosette Radius di una pianta; Da, il diametro effettivo della tazza di plastica; Rm, la Rosette Radius misurata della stessa pianta determinata da un software; Dm, il diametro misurato della tazza di plastica che viene utilizzato per coltivare la stessa pianta)
-
Area Rosette: Misura l'area orizzontale della superficie 2 dimensionale delle foglie di rosetta.
- Rimuovere l'infiorescenza senza influenzare il resto degli organi della rosetta.
- Scattare foto dalla parte superiore di ogni pianta insieme a un righello in scala posizionato nelle vicinanze.
- Utilizzare un plugin gratuito di ImageJ, Rosette Tracker e seguire il protocollo pubblicato in precedenza22.
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Representative Results
La macchina automatica di caricamento a contatto con i capelli
Per l'osservazione dei cambiamenti morfologici sulle piante, sia le condizioni di crescita riproducibili che i metodi di trattamento sono fondamentali per ottenere risultati ripetibili. Questo screening mutante ad alta velocità effettiva e automatico di segnalazione a pressione viene ottenuto dalla macchina di caricamento a pressione dei capelli appena costruita, Model K1 (Figura 1, Figura 2). Queste spazzole per capelli possono toccare un massimo di 4 vassoi di piante contemporaneamente. C'erano 24 tazze collocate in un vassoio, e 12 tazze di piante in un gruppo utilizzato sia come controllo e le piante trattate (Figura 2C,D). In ogni tazza sono state coltivate quattro piante e un totale di 48 individui vegetali sono stati toccati dalla stessa spazzola per capelli, che garantisce un numero sufficiente di piante per analisi statistiche successive. Un massimo di 4 genotipi di piante possono essere trattati contemporaneamente su una macchina touch Model K1. Uno dei punti chiave è l'impostazione del braccio/altezza dei capelli della macchina touch perché la tigmomorfogenesi dipende dalla dose6,21. Diverse posizioni dei capelli rispetto alla posizione foglia rosette pianta generano diverse forze tattili, che possono generare risultati totalmente diversi di tigmomorfogenesi. Nei nostri esperimenti, la punta dei peli che contatta le piante deve essere posizionata 0,5 cm più in basso rispetto al bordo della tazza (Figura 2E), che genera forze simili alla forza di tocco pubblicata in precedenza14. Un controller programmabile installato in un pannello a sfioramento viene utilizzato per controllare l'intera macchina di caricamento touch-force (Figura2F, vedere Tabella dei materiali).
Il confronto di due diversi metodi touch
Per confrontare questo metodo automatico dei capelli guidati da macchine con il metodo tradizionale dicontatto del tampone di cotone manualmente, sono stati eseguiti due esperimenti indipendenti sul Col-0 (Figura 3). Nel gruppo di contatto del tampone di cotone, il contatto è partito da piante di 12 giorni. Ogni round aveva 40 tocchi (1 tatto/i). In totale, sono stati eseguiti 3 turni al giorno (Figura 3A). Ha mostrato 1,7 giorni di ritardo nell'imbullorazione dopo un trattamento continuo con il tatto del tampone di cotone (22,1 x 0,2 giorni contro 23,8 x 0,2 giorni). Allo stesso modo, per il tocco automatico dei capelli guidato dalla macchina, il caricamento a motore a motore iniziato da piante vecchie di 14 giorni e 40 volte di tocco (entro 3 min) sono stati applicati per un giro. In totale, sono stati eseguiti 3 turni di tocchi al giorno con esattamente 8 ore di intervallo (Figura 3B). L'imbullogiamento ritardato è stato osservato per gli impianti Col-0. Il tempo medio di bullonazione è stato di 23,0 - 0,3 giorni, mentre il tempo di bullonazione degli impianti trattati a macchina del modello K1 è stato di 24,7 x 0,2 giorni. Le differenze tra le piante controllate dal tatto e le piante trattate tramite tocco sono state quindi analizzate con il modello univariato di rischio proporzionale Cox. Ha offerto il rapporto di rischio stimato (HR) di 0,31 (tocco di cotone) e 0,52 (tocco di capelli guidato da macchine), rispettivamente (Figura 3C),il che significa che il rischio di bulloniazione/probabilità delle piante nel gruppo toccato è del 31% e del 52% rispetto a rispettivamente nel gruppo di controllo. Ciò indica che la possibilità di imbullonatura delle piante di tipo selvatico toccate è di circa la metà rispetto a quella degli impianti di controllo intatti, indipendentemente dal fatto che si tratti di tocco manuale con un tampone di cotone o il tocco automatico dei capelli.
I risultati futuri su diversi mutanti touch
Recenti dati preliminari hanno suggerito che MKK1 e MKK2 potrebbero svolgere un ruolo importante nella risposta al tocco di Arabidopsis14. Abbiamo selezionato questi due mutanti e condotto esperimenti touch su questi mutanti di risposta al tocco putative utilizzando la macchina di caricamento automatico del tocco di capelli (Figura 4,Tabella 1). Gli impianti di controllo di tipo selvaggio hanno mostrato 1,8 giorni di ritardo di bullonatura (24,1 x 0,3 giorni rispetto a 25,9 - 0,2 giorni, figura 4A)proprio come il rapporto precedente14 mentre questo ritardo di bullonatura non è stato osservato sui mutanti di inserimento t-DNA, mkk1 (24,6 - 0,2 giorni prima del tempo rispetto alle 24,4 x 0,3 giorni, Figura 4B e Tabella 1) e mkk2 (23,9 x 0,1 giorni contro 24,2 x 0,2 giorni, Figura 4C e Tabella 1). Analizzando questi dati con il modello univariate Cox ai rischi proporzionali, solo il tipo selvaggio Col-0 presentava una differenza significativa tra le piante di controllo e le piante toccate con una stima di 0,41 (Figura 4D). Questi esperimenti di caricamento touch-force condotti dalla macchina automatica di caricamento a pressione tatto dei capelli hanno dimostrato che i mutanti mkk1 e mkk2 sono mutanti di risposta al tocco.
La misurazione di altri indici morfologici
I cambiamenti morfologici associati alla tigmomorfogenesi non si limitano al ritardo dell'imbullorazione. Sia lo stelo più corto che la dimensione più piccola della foglia di rosette sono anche i componenti della thigmomorfogenesi6,7,9,14. Quindi, abbiamo segnalato qui due ulteriori tipi di misurazioni su indici morfologici di risposta al tocco, lunghezza del raggio di rosetta / foglia e area rosette (proiettato) (Figura 5). Simile al cambiamento di fenotipo osservato in precedenza, l'impianto Col-0 di tipo selvatico ha mostrato un raggio di rosette significativamente più piccolo e una lunghezza inferiore della foglia dopo 3 giorni di tocco di capelli automatico costante e ripetitivo guidato dalla macchina (1,777 0,05 cm rispetto a 1,50 x 0,04 cm, Figura 5A). L'area della rosette proiettata è stata modificata da 20,32 , 0,53 cm2 a 16,19 x 0,48 cm2 dopo 13 giorni di contatto (Figura 5B). Sia mkk1 che mkk2 avevano il raggio e l'area della rosetta ridotta simili. Nel loro insieme, questi dati hanno dimostrato che le proteine MKK1 e MKK2 sono importanti per il ritardo di bullosità dell'Arabidopsis e non sono necessarie per modellare le dimensioni della rosetta e l'area della rosetta.
Analisi statistica
Per quanto riguarda i grafici a scatola e baffi illustrati nella Figura 2 e Figura 3 e gli istogrammi illustrati nella Figura 5, la rilevanza statistica è stata analizzata dal test t dello studente a due code, con significato rappresentato da , con significato rappresentato da , e n.s. < 0.001 e p > 0,05, rispettivamente. Per i grafici Kaplan-Meier illustrati nella figura 2 e nella figura3, è stata utilizzata un'analisi unificata dei pericoli di Cox per analizzare l'effetto del trattamento tattile sull'evento di bulloniatura23,24. Nelle tabelle seguenti sono disponibili il rapporto di rischio (HR), l'intervallo di confidenza del 95% (95% CI) e il valore p. Ad esempio, HR - 0,5 significa che in un giorno specifico, il rischio di bulloniazione/probabilità delle piante nel gruppo toccato è stato dello 0,5 o 50% rispetto a tali piante del gruppo di controllo.
Figura 1 . La costruzione e i parametri della macchina di caricamento automatico del tocco tattile. (A) Schemi predefiniti dell'attuatore lineare. Il pannello in alto a sinistra è la vista laterale e il pannello inferiore sinistro è la vista dorsale. Le lunghezze totali del modulo dell'asse X e del modulo dell'asse Y sono rispettivamente 843 mm e 1.038 mm. Ogni modulo X/Y predefinito è composto da una guide-rail, un blocco slide e un motore da 57 stepper (preinstallato e smontabile). Per una macchina touch Model K1 personalizzata, ogni modulo X/Y è composto da due blocchi di scorrimento (rosso). La piastra di giunzione del modulo X è ingrandita da 56 mm a 100 mm per offrire una migliore connessione e supporto. Il pannello in alto a destra è la sezione trasversale della guide-rail e il pannello in basso a destra è il motore da 57 stepper. (B) Schemi del doppio asse X costruito e degli attuatori lineari a doppio asse Y. Questa è la parte principale della macchina di carico touch-force. Il pannello in basso a sinistra è la vista dorsale degli attuatori lineari costruiti. Il pannello in alto a sinistra è la vista laterale del modulo dell'asse X (843 mm). Il pannello centrale è la vista laterale del modulo dell'asse Y (1.038 mm). Il pannello in alto a destra è la vista dorsale di 4 blocchi di scorrimento sul modulo Y e sulla trave ausiliaria Y. Il pannello in basso a destra è la vista dorsale della piastra di giunzione sul modulo X. (C) Il diagramma di flusso dell'assieme della parte macchina. Diverse parti sono contrassegnate e denominate nella figura. I processi di assemblaggio dettagliati sono stati descritti nel protocollo. L'unità mostrata è questa figura è mm. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Il design complessivo della macchina di caricamento automatico del tocco tattile. (A) La macchina touch Model K1 finita. La foto è stata scattata dal lato anteriore. L'attuatore lineare superiore controlla il braccio robotizzato che si muove orizzontalmente e l'attuatore lineare inferiore controlla il braccio robotico che si muove verticalmente. (B) La vista laterale che mostra bracci robotici smontabili. Le spazzole per capelli sono state attaccate ai bracci robotici. (C e D) Foto che mostrano come i peli umani spazzole toccare le piante, che sono state prese dal lato anteriore e il lato laterale, rispettivamente. (E) La vista laterale che mostra come impostare l'altezza del pennello per capelli contro il bordo della tazza. Sono visibili sia le braccia della macchina che le spazzole per capelli. (F) L'interfaccia operativa della macchina touch Model K1. Un controller programmabile (AFPX-C30T) collegato a un touch panel (MT6070i) viene utilizzato per controllare l'intera macchina. Le impostazioni dettagliate e le procedure operative sono descritte nel protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Confrontando gli effetti di due metodi tattili sulla thigmomorfogenesi. (A-B) Il confronto del tocco manuale del tampone di cotone (A) e del tocco dei capelli umani guidato rispettivamente dalla macchina di caricamento automatico a contatto (B). I grafici a scatola e baffo sono mostrati nel pannello di sinistra, che mostrano il confronto del giorno medio di bullonatura tra il gruppo di controllo e il gruppo toccato. Mezzi: vengono visualizzati i mezzi se. L'analisi statistica è stata eseguita da un test t di Student. Significato a p < 0.001 viene visualizzato come . I grafici Kaplan-Meier sono mostrati al centro, che sono la percentuale di piante imbullonata nel tempo di crescita (giorni dopo la semina). Il pannello di destra mostra individui rappresentativi di controllo intatto e piante toccate che mostrano la differenza nel tempo di bullolazione e altezza del gambo di infiorescenza. (C) La tabella riepilogativa: i numeri numerici nelle colonne di controllo e toccate sono il numero dell'impianto utilizzato per l'analisi statistica. Sono offerti il rapporto di rischio (HR), l'intervallo di confidenza del 95% (95% CI) e il valore p nella sezione dell'analisi dei pericoli univariti di Cox. Il rischio di bullonato e la probabilità di piante nel gruppo toccato sono stati rispettivamente del 31% e del 52% rispetto al gruppo intatto. L'analisi univariate del rischio Cox è stata stimata da SPSS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . La thigmomorphogenesidei dei mutanti mkk1 e mkk2 così come la pianta di tipo selvaggio (Col-0) indotta dal tocco automatico dei capelli. (A-C) La potenziale risposta di tocco di Col-0 (A), mkk1 (B) e mkk2 (C) generata attraverso la ripetizione di tocchi di capelli umani guidati dalla macchina di caricamento automatico della forza di tocco. I grafici a scatola e baffo sono mostrati nel pannello di sinistra, che sono il confronto del giorno medio di bullonatura tra il gruppo di controllo e il gruppo toccato. Mezzi: vengono visualizzati i mezzi se. L'analisi statistica è stata eseguita da un test t di Student. I file , e n.s. rappresentano rispettivamente p < 0.001 e p > 0,05. I grafici Kaplan-Meier sono mostrati al centro, che sono la percentuale di piante di bulloxazione nel periodo di crescita (giorni dopo la semina). Il pannello di destra mostra gli individui rappresentativi del controllo intatto e le piante toccate che mostrano la differenza di bullolaggio. I dati di mkk1 (B) e mkk2 (C) sono stati compilati da due e tre repliche biologiche, rispettivamente. I numeri dettagliati delle piante utilizzati in ogni replica sono stati mostrati nella Tabella 1. (D) La tabella riepilogativa: i numeri sotto controllo e le colonne di tocco erano rispettivamente il numero di impianto utilizzato/analizzato in questi due gruppi. Sono stati offerti il valore HR, 95% CI e p nella sezione dell'analisi univariata dei rischi di Cox. Il rischio/probabilità di bullonatura delle piante di tipo selvatico nel gruppo toccato è del 41% rispetto al gruppo di controllo. L'analisi univariate del rischio Cox è stata stimata da SPSS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Il raggio della rosette e la misurazione dell'area per la definizione della thigmomorfogenesi. (A-B) Il raggio della rosette e l'area della rosetta del tipo selvatico sono stati misurati rispettivamente al giorno 17 e al giorno 27 dopo la semina di semi. Le barre visualizzate nel pannello in alto a sinistra sono confrontati rispettivamente il raggio della rosette o l'area della rosetta tra il gruppo di controllo e il gruppo toccato. Mezzi: vengono visualizzati i mezzi se. L'analisi statistica è stata eseguita dal test t di Student; p < 0.001. Le foto mostrate nel pannello in alto a destra sono singole piante rappresentative. Le tabelle riepilogate di seguito mostrano il numero di impianto analizzato nel gruppo di controllo e il gruppo toccato. Vengono visualizzate sia il raggio della rosette (cm)al giorno 17 che l'area della rosette (cm 2) al giorno 27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. I dati di bullolaggio di diverse repliche biologiche. La tabella riassunta contiene due repliche biologiche di mkk1 e tre repliche biologiche di mkk2.
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Discussion
La thigmomorfogenesi è una risposta complessa alla crescita delle piante verso le perturbazioni meccaniche, che coinvolge una rete di segnalazione cellulare e l'azione dei fitoormoni. È una conseguenza dell'evoluzione adattativa delle piante per sopravvivere sotto le condizioni ambientali indesiderabili25,26. Il tocco meccanico, in particolare il tocco delle dita umane e il tocco di tampone di cotone portatile, sono stati selezionati per studiare questi cambiamenti morfologici in studi precedentemente tigmomorfogenetici14,20. Questa versione semplificata del caricamento a forza di tocco per attivare la risposta al tocco dell'impianto è più facile da controllare e applicare. Inoltre, questo tipo di metodo di carico touch-force può in qualche modo imitare i segnali di forza stimolati dal vento e dalla pioggia prodotti nell'ambiente naturale19. La forza touch è in grado di innescare picchi di calcio, indurre la fosforolalazione proteica14 e l'espressione genica a valle che media la risposta al tocco19. Allo stesso modo, le spazzole per capelli umani montate su bracci mobili automatizzati possono anche generare la risposta al tocco della pianta imitando i tocchi manipolati a mano dall'uomo. Per diversificare i tipi di applicazione della forza, gli ugelli di spolverata d'acqua e/o i soffiatori del vento possono essere installati anche sui bracci robotici della macchina e utilizzati per un esperimento fisiologico (Figura 2). La caratteristica unica rende la macchina di carico a forza meccanica automatica più versatile negli studi morfogenetici e fisiologici. Il più grande vantaggio di questa macchina di carico automatico a forza meccanica è probabilmente la sua funzione senza lavoro, ripetibile e che consente di risparmiare tempo, che consente di eseguire una specifica selezione di fenotipi mutanti da un gran numero di individui mutagenizzati. A differenza di ore di tocchi umani manipolati a mano, la macchina touch Model K1 può toccare vari mutanti contemporaneamente e completare un giro di tocco entro 3-5 minuti. L'intervallo di tempo per un giro di tocco dipende in gran parte dall'impostazione del programma all'inizio del trattamento. Se ogni singola pianta fosse toccata 40 volte in un round, la macchina Model K1 avrebbe bisogno solo di 9-15 min per finire tre cicli di trattamento touch in un giorno. Il tempo di intervallo tra ogni giro di tocchi può essere controllato con precisione; è meno probabile che gli esseri umani raggiungano tale precisione.
Un'altra questione importante per quanto riguarda il trattamento tattile è quale fase di crescita delle piante deve essere applicata la forza tocco. Nella nostra pratica, il contatto è iniziato 14 giorni dopo la semina del seme sia per il tipo selvatico che per due mutanti, poiché i tassi di crescita di questi tre genotipi sono simili. Per quei mutanti che hanno una differenza significativa nel tempo di sviluppo dal tipo selvaggio, si può scegliere un giorno iniziale diverso per iniziare il tocco. L'esecuzione del test ANOVA di sola andata sui dati di bullonatura di entrambe le piante di tipo selvaggio e dei mutanti per confronti multipli può aiutare14. Questa analisi statistica può offrire la giusta conclusione sulle differenze di tempo di bullogazione generate dai genotipi. In questo caso, un'analisi multivariata del pericolo proporzionale Cox dovrebbe essere utilizzata per considerare due parametri variabili.
Per impostare il livello di touch-force dei peli umani montati sulla macchina touch Model K1, abbiamo regolato sia l'altezza (forza verticale) che la velocità (forza orizzontale) dei pennelli per capelli (Figura 2E). Le impostazioni giuste sono state determinate sulla base dei dati preliminari raccolti da molti cicli di test a livello di forza su un impianto di Arabidopsis collocato su scala elettronica. Come abbiamo scoperto, mantenere sia l'altezza dei capelli che la velocità invariata durante l'intero esperimento di risposta al tatto produrrà un fenotipo tigmomorgenetico simile e costante tra le repliche per una linea di Arabidopsis. Una forza di tocco troppo pesante può uccidere le giovani piantine poiché le spazzole per capelli in rapido movimento possono portare a ferite sulla superficie di una foglia. Al contrario, una forza di tocco troppo leggera potrebbe non essere sufficiente a innescare il ritardo dell'imbulloramento entro 2 settimane dalla ripetizione del tocco. Nel nostro esperimento precedente, abbiamo determinato che il caricamento della forza di tocco appropriato è di 1-2 mN per tocco14,19. La lunghezza dei capelli di 0,5 cm inferiore al bordo della tazza viene utilizzata per generare una forza di tocco verticale simile sul tocco dei capelli basato su macchina Del Modello K1 con una leggera velocità di movimento orizzontale di 5000 mm/min (Figura 2E). Questa impostazione fissa della macchina Modello K1 riduce la variazione della forza di forza derivante dall'errore umano.
Nel complesso, i tocchi di capelli eseguiti dalla macchina di caricamento automatico a motore di tatto forniscono solo un carico medio di touch-force sulle piante. La forza di tocco precisa applicata, in particolare la forza orizzontale caricata, è difficile da calcolare sia per un singolo capello che per un gruppo di peli su un pennello. Inoltre, la varianza della forma della pianta e dell'altezza del gambo può interferire con l'applicazione della forza orizzontale. Misurare questo tipo di forza fisica o stress richiede un sensore di pressione più preciso collegato a un capello o un gruppo di peli. Si ritiene che un sensore di pressione più preciso e la modellazione matematica saranno applicati per migliorare la macchina di caricamento automatico a contatto in futuro. Le condizioni di crescita, come l'intensità della luce, l'umidità del suolo e la temperatura della serra, nonché i nutrienti che forniscono, giocano tutti un ruolo cruciale nello sviluppo del fenotipo della risposta al tocco. Eventuali condizioni di stress, come la siccità, condizioni di luce debole con meno di 90 s-2s-1e una temperatura più alta o inferiore che può influenzare la normale crescita dell'Arabidopsis interferirà con la misurazione della risposta al tocco di entrambi i tipi selvatici e mutanti.
In breve, questa macchina di caricamento automatico touch-force può offrire più lavoro di risparmio e uniforme carico di touch-force rispetto al tocco delle dita umane e al tocco di cotone. Si prevede che la macchina touch Model K1 sarà applicata in vari controlli touch-force ad alta produttività che segnalano lo screening mutante e l'analisi della risposta al tatto tra colture agricole o probabilmente modelli animali con alcune modifiche del carico a motore touch macchina.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: 31370315, 31570187, 31870231 (Fondazione Nazionale della Scienza della Cina), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (Hong Kong). Gli autori desiderano ringraziare Ju Feng Precision and Automation Technology Limited (Shenzhen, Cina) per la loro offerta di diversi schemi illustrati nella Figura 1.
Gli autori desiderano anche ringraziare S. K. Cheung e W. C. Lee per il loro contributo allo sviluppo della macchina di caricamento touch-force.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
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