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Biology

Un Protocolo de Pantalla Mutante de Señalización de Señalización de Fuerza Táctil Y Repetible para el Estudio de la Thigmomorfogénesis de una Planta Modelo Arabidopsis thaliana

doi: 10.3791/59392 Published: August 6, 2019

Summary

Una suave máquina de carga de fuerza táctil está construida a partir de cepillos de pelo humanos, brazos robóticos y un controlador. Los cepillos para el cabello son accionados por brazos robóticos instalados en la máquina y se mueven periódicamente para aplicar la fuerza táctil en las plantas. La fuerza de los toques capilares accionados por máquina es comparable a la de los toques aplicados manualmente.

Abstract

Las plantas que responden a las estimulaciones mecánicas intracelulares y extracelulares (o señales de fuerza) y desarrollan cambios morfológicos especiales, un llamado thigmomorfogénesis. En las últimas décadas, se han identificado y reportado varios componentes de señalización por estar involucrados en la mechanotransducción (por ejemplo, proteínas de unión a iones de calcio y enzimas de biosíntesis de ácido jasmónico). Sin embargo, el ritmo relativamente lento de la investigación en el estudio de la señalización de la fuerza o thigmomorfogénesis se atribuye en gran medida a dos razones: el requisito de la inducción táctil humana laboriosa de la thigmomorfogénesis y los errores de fuerza de la fuerza asociados con el tacto manual de las personas. Para mejorar la eficiencia de la carga de fuerza externa en un organismo vegetal, se construyó una máquina de carga automática de fuerza táctil. Estos toques robóticos de cepillodes de pelo impulsados por brazos proporcionan una simulación de fuerza táctil fácilmente repetible y ahorradora de mano de obra, rondas ilimitadas de repetición táctil y fuerza táctil ajustable. Esta máquina de carga de fuerza táctil para el cabello se puede utilizar tanto para el cribado a gran escala de mutantes de señalización de fuerza táctil como para el estudio fenomics de la thigmomorfogénesis vegetal. Además, los materiales táctiles como el cabello humano, se pueden reemplazar con otros materiales naturales como el cabello animal, hilos de seda y fibras de algodón. Los brazos móviles automatizados de la máquina pueden estar equipados con boquillas de aspersión de agua y sopladores de aire para imitar las fuerzas naturales de las gotas de lluvia y el viento, respectivamente. Mediante el uso de esta máquina automática de carga de fuerza táctil para el cabello en combinación con el toque de hisopo de algodón realizado a mano, hemos investigado la respuesta táctil de dos mutantes de señalización de fuerza, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) y plantas MKK2 . Los fenomemos de las plantas de tipo salvaje cargadas por fuerza táctil y dos mutantes fueron evaluados estadísticamente. Han mostrado diferencias significativas en la respuesta táctil.

Introduction

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Thigmomorfogénesis vegetal es un término que fue acuñado por Jaffe, MJ en 19731. Es un tropismo vegetal pero diferente del conocido fototropismo o gravitropismo causado por losestímulos de la luz solar o la gravedad 2,3. Describe alteraciones fenotípicas asociadas con estimulaciones mecánicas periódicas, que han sido observadas con frecuencia por los botánicos en tiempos anteriores4,5. Las gotas de lluvia, el viento, las plantas, los toques animales y humanos, incluso las mordedurasde animales, se consideran diferentes tipos de estímulos mecanonos que activan la señalización de fuerza en las plantas 4,5. Las características de la thigmomorfogénesis vegetal incluyen el retraso del atornillado, un tallo más corto, un tamaño más pequeño de roseta/hoja en plantas herbáceas, y tallo más grueso en plantas leñosas6,7,8. Esto es diferente de la respuesta thigmonástica o thigmotrópica que a menudo se encuentra en la planta de Mimosa u otras vides sensibles al mecano, donde estas respuestas táctiles rápidas son más fáciles de observar1,9,10. La thigmomorfogénesis, por otro lado, es relativamente difícil de observar debido a su lenta respuesta al crecimiento. La thigmomorfogénesis generalmente se observa después de semanas o incluso años de estimulación continua de carga de fuerza. Esta naturaleza única de la respuesta táctil de la planta hace que sea difícil realizar una pantalla genética hacia adelante utilizando la estimulación táctil de la mano humana para aislar a los mutantes resistentes a la señalización de la fuerza táctil de una manera robusta.

Para dilucidar las vías de transducción de la señal de fuerza y los mecanismos moleculares subyacentes a la thigmomorfogénesis6,11, se han realizado experimentos biológicos moleculares y celulares en los últimos6, 12,13,14. Estos estudios han propuesto que los receptores de señal de fuerza vegetal consisten principalmente en canales iónicos mecanosensibles (MSC) y los complejos MSC atados compuestos por complejos multiméricos de proteínas de expansión de membrana11,14 , 15. El pico transitorio Cytoplasmic Ca2+ generado en cuestión de segundos del toque inicial. La estimulación del viento, la lluvia o la gravi-estimulación puede interactuar con los sensores de calcio aguas abajo para transducir las señales de fuerza a eventos nucleares14,16,17,18. Además de los estudios moleculares y celulares, la pantalla genética delantera con el dedo manual de las plantas ha encontrado que las fitohormonas y los metabolitos secundarios están involucrados en la consiguiente expresión génica inductible del tacto (TCH) después de la carga de fuerza táctil13,19. Por ejemplo, aos y opr320 mutantes han sido identificados hasta ahora lejos de los estudios genéticos. Sin embargo, el principal problema asociado con la aplicación de la genética delantera en el estudio de la thigmomorphogenesis sigue siendo el trabajo intensivo necesario para cuantificar el nivel de respuesta táctil y tocar a una gran población de plantas individuales. El problema que consume mucho tiempo también persiste en la pantalla mutante basada en tocar la mano14,20. Por ejemplo, para completar una ronda de estimulación de la fuerza táctil, una persona necesita tocar 30-60 veces (un toque por segundo) en una planta individual. Con el fin de tener un número suficiente de plantas para el análisis estadístico de fenotipo, 20-50 plantas individuales del mismo genotipo son normalmente necesarias para el proceso de carga de la fuerza táctil. Este régimen de carga de fuerza táctil significa que una persona necesita realizar repetitivamente 600-3,000 toques en un genotipo de elección. Este tipo de toque normalmente necesita repetirse de 3 a 5 rondas al día, lo que equivale a aproximadamente 1.800-15.000 toques de dedo o hisopo de algodón por día por genotipo de plantas. Una persona bien entrenada normalmente se requiere para mantener la fuerza y la fuerza de múltiples toques dentro de un rango deseable a lo largo de muchas rondas de repetición en un día para evitar la gran variación en la fuerza y la fuerza. Como es bien sabido que la thigmomorfogénesis es un proceso saturable y dependiente de la dosis6,21, fuerza táctil / fuerza se convierte en fundamental para un éxito en la activación de la respuesta táctil de una planta.

Para eliminar la carga de fuerza táctil dependiente de la persona y mantener la aplicación mecánica dentro de un rango de error aceptable14,por lo tanto, diseñamos una máquina de carga automática de fuerza táctil para reemplazar los toques manipulados a mano. La máquina tiene 4 brazos móviles construidos, cada uno de los cuales está equipado con un cepillo de pelo humano. Esta versión se llama Modelo K1 para especificar su característica de la carga de fuerza táctil del cabello humano. Si se miden 4 genotipos cuantitativamente para su thigmomorfogénesis o respuesta táctil en una sola máquina, se pueden medir 40-48 individuos por genotipo. Cada ronda de repetición táctil (menos de 60 veces de tacto por planta) dura menos de 5 minutos utilizando un brazo robótico ajustable a velocidad móvil. Por lo tanto, las plantas en una máquina táctil Modelo K1 se pueden estimular mecánicamente para múltiples rondas al día, ya sea con una carga de fuerza táctil constante o diferentes niveles de fortalezas como se programó inicialmente.

Arabidopsis thaliana,un organismo vegetal modelo, fue elegido como la especie vegetal objetivo para probar la aplicación de la máquina de carga táctil de pelo totalmente automática. Debido a que hay varios grandes bancos de semillas disponibles para recuperar los diversos germens de mutantes y el tamaño de la floración, Arabidopsis se adapta bien al espacio disponible en el estante de crecimiento montado con la máquina táctil Model K1.

La máquina táctil automática Model K1 consta de tres componentes principales: (1) el bastidor metálico en forma de H compuesto por dos actuadores lineales accionados por correa, (2) brazos metálicos robóticos equipados con cepillos para el cabello y (3) un controlador. Para una máquina táctil Model K1 personalizada, cada módulo de eje X/Y se compone de un carril guía accionado por correa, dos bloques deslizantes (rojo) y un motor paso a paso 57 (preinstalado y desmontable) (Figura1A,B). El actuador horizontal superior permite que el brazo metálico robótico se mueva a la izquierda y a la derecha horizontalmente, el actuador lineal vertical inferior accionado por correa permite que el brazo metálico robótico se mueva hacia arriba y hacia abajo verticalmente (Figura1B, Figura 2A ). Se instalaron cuatro brazos robóticos desmontables en el actuador vertical (Figura1C, Figura 2B). Cuatro cepillos de pelo humano se unieron a cuatro brazos robóticos, respectivamente (Figura1C, Figura 2B). Todas las piezas mecánicas para construir la máquina táctil Modelo K1 en negrita a continuación están marcadas en la Figura 1C (consulte también la Tabla de materiales).

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Protocol

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1. Preparación de semillas

NOTA: Las semillas de Arabidopsis de tipo silvestre(Col-0) así como los mutantes de pérdida de función mkk1 y mkk2 utilizados fueron compradas en el Centro de Recursos Biológicos de Arabidopsis (ABRC, https://www.arabidopsis.org, Columbus, OH).

  1. Calcular cuántos individuos de planta de cada genotipo se utilizarán para un análisis estadístico fiable. Preparar un número suficiente de semillas en función de la tasa de germinación de cada línea, por lo general 4-5 veces más de lo que se necesita para un experimento. Asegúrese de que se puede utilizar un número suficiente de plantas de tamaño sano y uniforme para el ensayo de respuesta táctil. Según este protocolo, 300-500 semillas por genotipo se utilizan generalmente para producir 80-90 plantas de tamaño similar.
  2. Sumerja las semillas en agua fría y guárdelas en 4 oC (cubiertas con papel de aluminio para mantenerlas en la oscuridad) para la imbibición de semillas. Siembra las semillas 5-7 días después de la imbibición.

2. Crecimiento de la planta

  1. Seleccione el suelo adecuado para el crecimiento de la planta (véase la Tabla de Materiales). Evite los grumos grandes y mezcle de forma homogénea.
  2. Preparar 24 vasos de plástico: la capacidad de retención es de 207 ml y el diámetro del borde superior es de 7,4 cm. Taladre tres orificios redondos en la parte inferior de una taza para fines de riego.
  3. Llene estas tazas de plástico con el suelo mezclado. Deje que el suelo se acumule hasta 1-2 cm más alto que el borde de la copa y aplanar suavemente la superficie del suelo apilado.
  4. Transfiera 24 tazas en una bandeja de plástico (21 pulgadas x 10,8 pulgadas x 2,5 pulgadas) y coloque la bandeja en condiciones de luz constante (ver más abajo).
  5. Añadir 2,5 L de agua en cada bandeja dos horas antes de la siembra de semillas. Deje que el suelo absorba el agua de los agujeros situados en el fondo de las tazas y espere a que la superficie del suelo caiga al nivel del borde de la copa.
  6. Siembra 3-4 semillas en un solo lugar, y 4 puntos distribuidos uniformemente dentro de una taza.
  7. Coloque una cubierta de plástico transparente sobre cada bandeja y deje que las semillas germinen durante una semana. A continuación, retire la cubierta y deje que las plántulas crezcan durante otra semana.
  8. Retire las plantas adicionales adelgazando y mantenga 4 individuos de plantas de tamaño similar en cada taza 9-10 días después de la siembra de semillas.
  9. Irrigar las plantas con 1,5 L de agua cada dos días después de que las semillas germinan.

3. Condición de crecimiento

  1. Ajustar la temperatura de la cámara de crecimiento a 23,5 oC y humedad entre el 35 y el 45 %.
  2. Ajuste la intensidad de la luz entre 180 y 240 ém-2s-1 (medido por el radiómetro de investigación IL 1700, Luz Internacional)14. La radiación activa fotosintética es de 90 a 120 e-m-2s-1.
  3. Ajuste la condición de luz a constante de 24 h.

4. La construcción de la máquina de carga de fuerza táctil

NOTA: Esta máquina robótica de carga de fuerza táctil para el cabello (Modelo K1) está diseñada para servir a los propósitos tanto de la detección mutante de señalización de fuerza táctil como de la generación de thigmomorfogénesis vegetal (Figura1, Figura 2).

  1. Módulos de preinstalación (desmontables, Figura 1C)
    1. Instale dos bloques de deslizamiento (I) y un motor paso a paso 57 (II) en el módulo de guía-carril del eje X/Y (III/V).
    2. Instale dos bloques deslizantes (I) en la viga auxiliar del eje X/Y (IV/VI).
  2. Instalación de otras piezas mecánicas (Figura 1C)
    1. Fije el módulo de guía-carril del eje X (III) y la viga auxiliar del eje X (IV) juntas mediante el montaje de dos placas de unión (VII) en cada extremo de la guía-carril.
    2. Fije el módulo de guía-carril del eje Y (V) en el dorsal de dos bloques de deslizamiento (eje X) en una posición de cruce mediante el montaje de dos placas de unión (VIII) en el medio.
    3. Fije la viga auxiliar del eje Y (VI) en la dorsal de los otros dos bloques de deslizamiento (eje X) en una posición de cruce mediante el montaje de dos placas de unión (VIII) en el medio.
    4. Montar el soporte de brazos robóticos (IX) en la parte delantera de dos bloques deslizantes (eje Y) en una posición de cruce con una placa de unión (Figura2A).
    5. Montar 4 cepillos para el cabello (X) en brazos robóticos (IX) con abrazaderas (Figura2B).

5. Ajuste de la máquina de carga Touch-Force

NOTA: Todos los parámetros de control para configurar la máquina táctil Modelo K1 en negrita a continuación se muestran en el panel de control (Figura2F).

  1. Instale cepillos táctiles para el cabello en los brazos robóticos. Utilice una regla de acero de 330 mm de largo como soporte para fijar una capa de pelo humano (3.600-4.600 pelos/cepillo) uniformemente. La longitud del cabello es de 126 mm (Figura1C).
  2. Fije esas reglas de acero en los brazos robóticos con dos abrazaderas metálicas.
  3. Establezca primero la altura de los brazos de la máquina a lo largo de la dimensión vertical (eje Y). Pulse Jog F+ para subir y Jog R- para bajar los brazos y cepillos robóticos. Deje que la punta de los cepillos para el cabello 0,5 cm sea más baja que el borde de la taza. Pulse el ajuste CERO. Pre-ejecutar la máquina 1-2 ciclos para asegurarse de que todos los individuos de la planta están siendo tocados. Ajusta y calibra los cepillos y las puntas del cabello a la misma altura todos los días durante todo el período de contacto.
  4. Utilice una báscula electrónica para medir la fuerza táctil (carga vertical) y mantener el nivel de fuerza táctil a 1-2 mN14.
  5. Establezca manualmente la posición inicial de los brazos de la máquina a lo largo de la cota horizontal (eje X). Permita que los cepillos de pelo cuelguen en el borde de cada bandeja y asegúrese de que no se toque ninguna planta antes de que comience el experimento conmovedor. Pulse Jog F+/Jog R- para mover el brazo de la máquina horizontalmente poco a poco para establecer la posición inicial.
  6. Establezca la distancia de desplazamiento del cepillo de cabello en la dimensión horizontal (eje X) en 365 mm pulsando el botón Viaje. Pulse Inc. F+/Inc. R- para mover los brazos de la máquina para obtener una distancia de viaje completa y asegurarse de que todas las plantas tratadas están siendo tocadas durante todo el experimento de tocar.
  7. Ajuste la velocidad de movimiento a lo largo del eje X de los brazos de la máquina a 5.000 mm/min pulsando el botón Velocidad automática. Mantenga la misma velocidad de movimiento durante todo el experimento de contacto.
  8. Ajuste el tiempo de contacto en 20 pruebas pulsando el botón Ciclo menor. Mantenga el mismo número de toques por ronda durante todo el experimento conmovedor.
    NOTA: Un ciclo menor es igual a dos distancias de viaje, lo que significa que los brazos de la máquina se moverán de la posición inicial a la posición final y luego de vuelta a la posición inicial. Un ciclo menor genera dos toques. Los cepillos para el cabello tocan las plantas 40 veces dentro de 20 ensayos (2 toques x 20 ensayos a 40 toques). El 40-touch se define como una ronda de carga de fuerza táctil.
  9. Establezca el intervalo de repetición de la touch-round a 480 min por día pulsando el botón Período mayor. Mantenga la misma frecuencia de rondas táctiles durante todo un experimento conmovedor.
    NOTA: Esto permite que los cepillos de pelo toquen las plantas durante 3 rondas al día, y el tiempo de intervalo entre cada ronda es de 480 min (8 h). El número azul mostrado representa el tiempo de intervalo de cada ronda táctil. La máquina iniciará una nueva ronda de toque automáticamente cuando la cuenta regresiva por debajo (número rojo) se convierta a 0000.
  10. Ajuste el Ciclo Mayor en 12 ensayos, lo que significa que la máquina tocará las plantas durante 12 rondas en un período de 4 días automáticamente. Este ajuste de 12 ensayos se utiliza para evitar errores humanos al saltarse un día de contacto.
  11. Pulse el botón de inicio para iniciar el programa predefinido. La máquina táctil Model K1 realizará automáticamente la carga de fuerza táctil de acuerdo con la configuración.

6. Recopilación y análisis de datos fisiológicos

  1. Días para atornillar: Registre el día de atornillado de cada planta individualmente dentro de un experimento conmovedor. El atornillado es un símbolo de que una planta cambia su etapa de crecimiento de la fase vegetativa a la fase reproductiva. En Arabidopsis, el día de atornillado se define como el número de días utilizados por una planta para que su primer tallo de inflorescencia alcance 1 cm de longitud.
    NOTA: Bajo la condición de crecimiento descrita anteriormente, el atornillado de plantas de tipo silvestre normalmente se inicia de 19 a 23 días después de la siembra de semillas y termina a los 28-32 días.
  2. Radio de roseta: Mida la distancia desde el centro de la roseta hasta la punta de la hoja más larga.
    1. Tome fotos de toda la bandeja desde la parte superior. Tome fotos del grupo de control y del grupo tratado táctil por separado.
    2. Descargue el software adecuado. Utilice el software descargado gratis ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html) por ejemplo.
    3. Abra un archivo de foto, utilice la función de zoom para ampliar la foto a un tamaño adecuado.
    4. Elija la herramienta Recta para dibujar una línea recta entre el centro de la roseta y la punta de una hoja más larga para medir el radio de la roseta.
    5. Seleccione una planta y pulse el botón izquierdo para dibujar una línea recta desde el centro de la roseta hasta la punta de hoja más larga.
    6. Elija la función Analizar-Medida o pulse Ctrl + M para analizar la distancia de línea.
    7. Seleccione una taza y repita los dos pasos anteriores para analizar el diámetro de cada taza de plástico al mismo tiempo. Utilice estos datos para realizar el cálculo para eliminar el sesgo resultante de la toma de fotos.
      NOTA: La ecuación es:
      Ra /Da áR m/Dm
      (Ra, el radio Rosette real de una planta; Da , el diámetro real de la copa de plástico; Rm, el radio Rosette medido de la misma planta determinado por un software; Dm, el diámetro medido de la copa de plástico que se utiliza para el cultivo de la misma planta)
  3. Zona de roseta: Mida el área horizontal de la superficie de 2 dimensiones de las hojas de roseta.
    1. Retire la inflorescencia sin afectar el resto de órganos de roseta.
    2. Tome fotos de la parte superior de cada planta junto con una regla de escala colocada cerca.
    3. Utilice un plugin gratuito de ImageJ, Rosette Tracker y siga el protocolo publicado anteriormente22.

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Representative Results

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La máquina de carga automática de fuerza táctil para el cabello
Para la observación de cambios morfológicos en las plantas, tanto las condiciones de crecimiento reproducibles como los métodos de tratamiento son clave para obtener resultados repetibles. Este cribado mutante de señalización de fuerza táctil automática y de alto rendimiento es logrado por la máquina de carga de fuerza táctil para el cabello de nueva construcción, Modelo K1 (Figura1, Figura 2). Estos cepillos de pelo pueden tocar un máximo de 4 bandejas de plantas simultáneamente. Se colocaron 24 tazas en una bandeja, y 12 tazas de plantas en un grupo utilizado como plantas de control y tratadas (Figura2C,D). En cada taza, se cultivaban cuatro plantas y un total de 48 o menos individuos de plantas fueron tocados por el mismo cepillo de pelo, lo que garantiza suficientes plantas para su posterior análisis estadístico. Un máximo de 4 genotipos de plantas se pueden tratar al tacto simultáneamente en una máquina táctil Model K1. Uno de los puntos clave es la configuración de la altura del brazo/pelo de la máquina táctil porque la thigmomorfogénesis depende de la dosis6,21. Diferentes posiciones del cabello con respecto a la posición de la hoja de roseta de la planta generan diferentes fuerzas táctiles, que pueden generar resultados totalmente diferentes de thigmomorfogénesis. En nuestros experimentos, la punta de contacto vegetal de los pelos debe colocarse 0,5 cm más abajo que el borde de la copa (Figura2E),que genera fuerzas similares a la fuerza táctil publicada anteriormente14. Se utiliza un controlador programable instalado en un panel táctil para controlar toda la máquina de carga de fuerza táctil (Figura2F, ver Tabla de materiales).

La comparación de dos métodos táctiles diferentes
Para comparar este método automático de cabello accionado por máquina con el método convencional de tocar hisopos de algodón manualmente, se realizaron dos experimentos independientes en Col-0 (Figura3). En el grupo de toque de hisopo de algodón, los toques comenzaron a partir de plantas de 12 días de edad. Cada ronda tenía 40 toques (1 toque/s). En total, se realizaron 3 rondas cada día (Figura3A). Mostró 1,7 días de retraso en el atornillado después de un tratamiento continuo de toque de hisopo de algodón (22,1 x 0,2 días frente a 23,8 a 0,2 días). Del mismo modo, para el toque automático del cabello accionado por máquina, se aplicó la carga de fuerza táctil iniciada desde plantas de 14 días de edad y 40 veces de tacto (dentro de 3 min) para una ronda. En total, se realizaron 3 rondas de toques al día con exactamente 8 horas de intervalo (Figura3B). Se observó atornillado retrasado para las plantas de Col-0. El tiempo medio de atornillado fue de 23,0 a 0,3 días, mientras que el tiempo de atornillado de las plantas tratadas por máquina táctil Es de 24,7 a 0,2 días. En consecuencia, las diferencias entre las plantas de control y tratadas al tacto se analizaron con el modelo univariado de riesgos proporcionales de Cox. Ofreció la relación de peligro estimada (HR) de 0,31 (toque de hisopo de algodón) y 0,52 (toque de pelo accionado por máquina), respectivamente (Figura3C),lo que significa que el riesgo/probabilidad de atornillado de las plantas en el grupo tocado es del 31% y 52% en comparación con plantas del grupo de control, respectivamente. Esto indica que la posibilidad de atornillar las plantas de tipo silvestre tocadas es alrededor de la mitad en comparación con la de las plantas de control intactas, independientemente de si se trata de un toque manual con un hisopo de algodón o el toque automático del cabello.

Los resultados prospectivos de diferentes mutantes táctiles
Los datos preliminares recientes sugirieron que MKK1 y MKK2 podrían desempeñar un papel importante en la respuesta táctil de Arabidopsis14. Seleccionamos estos dos mutantes y realizamos experimentos táctiles en estos mutantes derespuesta táctil putativa usando la máquina de carga automática de fuerza táctil para el cabello (Figura 4,Tabla 1). Las plantas de control de tipo silvestre mostraron 1,8 días de retraso en el atornillado (24,1 a 0,3 días frente a 25,9 a 0,2 días, Figura 4A) al igual que el informe anterior14, mientras que este retraso de atornillado no se observó en mutantes de inserción de ADN-T, mkk1 (24,6 x 0,2 días frente a 24,4 a 0,3 días, Figura 4B y Tabla 1) y mkk2 (23,9 a 0,1 días frente a 24,2 a 0,2 días, Figura 4C y Tabla 1). Al analizar estos datos con el modelo univariado de riesgos proporcionales de Cox, sólo el tipo silvestre Col-0 exhibió una diferencia significativa entre las plantas de control y las plantas tocadas con una HR estimada de 0,41 (Figura4D). Estos experimentos de carga de fuerza táctil llevados a cabo por la máquina de carga automática de fuerza táctil para el cabello demostraron que los mutantes mkk1 y mkk2 son mutantes de respuesta táctil.

La medición de otros índices morfológicos
Los cambios morfológicos asociados con la thigmomorfogénesis no se limitan al retraso del atornillado. Tanto el tallo más corto como el tamaño más pequeñode la hoja de roseta son también los componentes de la thigmomorfogénesis 6,7,9,14. Por lo tanto, informamos aquí dos tipos adicionales de mediciones sobre índices morfológicos de respuesta táctil, radio de roseta/longitud de hoja y área de roseta (proyectada) (Figura5). Al igual que el cambio de fenotipo observado anteriormente, la planta de tipo salvaje Col-0 mostró un radio de roseta significativamente más pequeño y una longitud de hoja más corta después de 3 días de toque automático constante y repetitivo del cabello accionado por máquina (1,77 x 0,05 cm frente a 1,50 a 0,04 cm, Figura 5A). El área de roseta proyectada se cambió de 20,32 a 0,53 cm2 a 16,19 a 0,48 cm2 después de 13 días de contacto (Figura5B). Tanto mkk1 como mkk2 tenían el radio y el área de roseta reducida similares. En conjunto, estos datos demostraron que las proteínas MKK1 y MKK2 son importantes para el retraso de atornillado de Arabidopsis y no son necesarios para dar forma al tamaño de la roseta y el área de roseta.

Análisis estadístico
En cuanto a las gráficas de caja y bigote que se muestran en la Figura 2 y la Figura 3 y los gráficos de columnas que se muestran en la Figura 5, la significación estadística fue analizada por la prueba t del alumno de dos colas, con la importancia representada por *** y n.s. en p y n.s. en p < 0.001 y p > 0.05, respectivamente. Para las gráficas Kaplan-Meier que se muestran en la Figura 2 y en la Figura 3, se utilizó un análisis de peligro Cox univariado para analizar el efecto del tratamiento táctil en el evento de atornillado23,24. La relación de peligro (HR), el intervalo de confianza del 95% (IC 95%) y el valor p se ofrecen en las tablas siguientes. Por ejemplo, HR 0,5 significa que en un día específico, el riesgo/probabilidad de atornillado de las plantas en el grupo tocado fue del 0,5 o 50% en comparación con las plantas del grupo de control.

Figure 1
Figura 1 . La construcción y los parámetros de la máquina de carga automática de fuerza táctil para el cabello. (A) Esquemas predeterminados del actuador lineal. El panel superior izquierdo es la vista lateral y el panel inferior izquierdo es la vista dorsal. Las longitudes totales del módulo del eje X y del módulo del eje Y son de 843 mm y 1.038 mm, respectivamente. Cada módulo X/Y predeterminado se compone de un guía-carril, un bloque deslizante y un motor paso a paso 57 (preinstalado y desmontable). Para una máquina táctil Model K1 personalizada, cada módulo X/Y se compone de dos bloques deslizantes (rojo). La placa de unión del módulo X se amplía de 56 mm a 100 mm para ofrecer una mejor conexión y soporte. El panel superior derecho es la sección transversal del carril guía y el panel inferior derecho es el motor paso a paso 57. (B) Esquemas de los actuadores lineales de doble eje X y doble eje Y construidos. Esta es la mayor parte de la máquina de carga de fuerza táctil. El panel inferior izquierdo es la vista dorsal de los actuadores lineales construidos. El panel superior izquierdo es la vista lateral del módulo del eje X (843 mm). El panel central es la vista lateral del módulo del eje Y (1.038 mm). El panel superior derecho es la vista dorsal de 4 bloques deslizantes en el módulo Y y la viga auxiliar Y. El panel inferior derecho es la vista dorsal de la placa de unión en el módulo X. (C) El diagrama de flujo del ensamblaje de la pieza de la máquina. Diferentes partes se marcan y se nombran en la figura. Los procesos de montaje detallados se describieron en el protocolo. La unidad que se muestra es esta figura es mm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . El diseño general de la máquina de carga automática de fuerza táctil para el cabello. (A) La máquina táctil Modelo K1 terminada. La foto fue tomada desde el lado frontal. El actuador lineal superior controla el brazo del robot moviéndose horizontalmente y el actuador lineal inferior controla el brazo robótico moviéndose verticalmente. (B) La vista lateral que muestra brazos robóticos desmontables. Los cepillos para el cabello se sujetaban a los brazos robóticos. (C y D) Fotos que muestran cómo los cepillos de pelos humanos tocan las plantas, que fueron tomadas desde el lado frontal y el lado lateral, respectivamente. (E) La vista lateral que muestra cómo ajustar la altura del cepillo de pelo contra el borde de la copa. Tanto los brazos de la máquina como los cepillos para el cabello son visibles. (F) La interfaz de funcionamiento de la máquina táctil Modelo K1. Se utiliza un controlador programable (AFPX-C30T) vinculado a un panel táctil (MT6070i) para controlar toda la máquina. La configuración detallada y los procedimientos operativos se describen en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Comparación de los efectos de dos métodos táctiles en la thigmomorfogénesis. (A-B) La comparación del hisopo de algodón manual touch (A) y el tacto del cabello humano impulsado por la máquina de carga automática de fuerza táctil (B), respectivamente. Las gráficas de caja y bigote se muestran en el panel izquierdo, que muestran la comparación del día medio de atornillado entre el grupo de control y el grupo tocado. Se muestran las medias de SE. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de un estudiante. La importancia en p < 0.001 se muestra como ***. Las parcelas Deplan-Meier se muestran en el centro, que son el porcentaje de plantas atornilladas durante el tiempo de crecimiento (días después de la siembra). El panel derecho muestra individuos representativos de control intacto y plantas tocadas que muestran la diferencia en el tiempo de atornillado y la altura del tallo de inflorescencia. (C) La tabla resumida: los números numéricos en el control y las columnas tocadas son el número de planta utilizado para el análisis estadístico. Se ofrecen la relación de peligro (HR), el intervalo de confianza del 95% (IC del 95%) y el valor p en la sección de análisis univariado de peligro de Cox. El riesgo de atornillado y la probabilidad de las plantas en el grupo tocado fueron del 31% y 52% en comparación con el grupo intacto, respectivamente. SPSS estimó el análisis univariado del peligro de Cox. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . La thigmomorfogénesis de los mutantes mkk1 y mkk2, así como la planta de tipo silvestre (Col-0) inducida por el toque automático del cabello. (A-C) La posible respuesta táctil de Col-0 (A), mkk1 (B) y mkk2 (C) generada a través de la repetición de toques de cabello humano impulsados por la máquina de carga automática de fuerza táctil. Las gráficas de caja y bigote se muestran en el panel izquierdo, que son la comparación del día medio de atornillado entre el grupo de control y el grupo tocado. Se muestran las medias de SE. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de un estudiante. *** y n.s. representan p < 0.001 y p > 0.05, respectivamente. Las parcelas Kaplan-Meier se muestran en el centro, que son el porcentaje de plantas atornilladas durante el período de crecimiento (días después de la siembra). El panel derecho muestra a los individuos representativos del control intacto y las plantas tocadas que muestran la diferencia de atornillado. Los datos de mkk1 (B) y mkk2 (C) se compilaron a partir de dos y tres réplicas biológicas, respectivamente. Los números detallados de las plantas utilizadas en cada réplica se muestran en el Cuadro1. (D) La tabla resumida: los números bajo control y columnas táctiles fueron el número de planta utilizado/analizado en estos dos grupos, respectivamente. Se ofrecieron el valor HR, IC del 95% y p bajo la sección de análisis univariado sandi de peligro de Cox. El riesgo/probabilidad de atornillado de las plantas de tipo silvestre en el grupo tocado es del 41% en comparación con el grupo de control. SPSS estimó el análisis univariado del peligro de Cox. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . El radio de roseta y la medición del área para definir la thigmomorfogénesis. (A-B) El radio de la roseta y el área de roseta del tipo salvaje se midieron en el día 17 y el día 27 después de la siembra de semillas, respectivamente. Las barras que se muestran en el panel superior izquierdo son las comparaciones del radio de la roseta o del área de roseta entre el grupo de control y el grupo tocado, respectivamente. Se muestran las medias de SE. El análisis estadístico fue realizado por la prueba t del estudiante; p < 0.001. Las fotos que se muestran en el panel superior derecho son plantas individuales representativas. Las tablas resumidas a continuación muestran el número de centro analizado en el grupo de control y el grupo tocado. También se muestran tanto el radio de roseta(cm) en el día 17 como el área de roseta (cm 2) en el día 27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Table 1
Tabla 1. Los datos de atornillado de diferentes réplicas biológicas. El cuadro resumido contiene dos réplicas biológicas de mkk1 y tres réplicas biológicas de mkk2.

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Discussion

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La thigmomorfogénesis es una respuesta compleja de crecimiento de la planta hacia perturbaciones mecánicas, que implica una red de señalización celular y acción de las fitohormonas. Es una consecuencia de la evolución adaptativa de las plantas para sobrevivir en las condiciones ambientales indeseables25,26. El tacto mecánico, especialmente el toque de los dedos humanos y el toque de hisopo de algodón de mano, han sido seleccionados para estudiar estos cambios morfológicos en estudios previamente thigmomorfogenetico114,20. Esta versión simplificada de la carga de fuerza táctil para activar la respuesta táctil de la planta es más fácil de controlar y aplicar. Además, este tipo de método de carga de fuerza táctil puede de alguna manera imitar las señales de fuerza estimuladas por caída sin viento y lluvia producidas en el medio natural19. La fuerza táctil es capaz de desencadenar picos de calcio, inducir la fosforilación proteica14 y la expresión génica descendente mediando la respuesta táctil19. Del mismo modo, los cepillos de pelo humano montados en brazos móviles automatizados también pueden generar la respuesta táctil de la planta imitando los toques manipulados a mano. Para diversificar los tipos de aplicación de la fuerza, las boquillas de aspersión de agua y/o los sopladores de viento también se pueden instalar en los brazos robóticos de la máquina y utilizarse para un experimento fisiológico (Figura2). La característica única hace que la máquina de carga automática de fuerza mecánica sea más versátil en los estudios morfogenéticos y fisiológicos. La mayor ventaja de esta máquina de carga automática de fuerza mecánica es probablemente su característica libre de mano de obra, repetible y que ahorra tiempo, lo que permite realizar una selección específica de fenotipos mutantes de un gran número de individuos mutagenizados. A diferencia de las horas de toques manipulados a mano, la máquina táctil Model K1 puede tocar varios mutantes simultáneamente y completar una ronda de toque en un plazo de 3 a 5 minutos. El marco de tiempo para una ronda de contacto depende en gran medida de la configuración del programa al comienzo del tratamiento. Si cada planta individual se tocara 40 veces en una ronda, la máquina Modelo K1 sólo necesitaría 9-15 minutos para terminar tres rondas de tratamiento táctil dentro de un día. El tiempo de intervalo entre cada ronda de toques se puede controlar con precisión; es menos probable que los seres humanos logren tal precisión.

Otra cuestión importante con respecto al tratamiento táctil es en qué etapa del crecimiento de la planta debe aplicarse la fuerza táctil. En nuestra práctica, los tocamientos comenzaron 14 días después de la siembra de semillas tanto para el tipo salvaje como para dos mutantes, ya que las tasas de crecimiento de estos tres genotipos son similares. Para aquellos mutantes que tienen una diferencia significativa en el tiempo de desarrollo del tipo salvaje, uno puede elegir un día inicial diferente para comenzar el contacto. Realizar la prueba de ANOVA unidireccional en los datos de atornillado tanto de la planta de tipo salvaje como de los mutantes para múltiples comparaciones puede ayudar a14. Este análisis estadístico puede ofrecer la conclusión adecuada sobre las diferencias de tiempo de atornillado generadas por los genotipos. En este caso, se debe utilizar un análisis de riesgo proporcional de Cox multivariante para considerar dos parámetros variables.

Para ajustar el nivel de fuerza táctil de los pelos humanos montados en la máquina táctil Modelo K1, ajustamos tanto la altura (fuerza vertical) como la velocidad (fuerza horizontal) de los cepillos para el cabello (Figura2E). Los ajustes correctos se determinaron sobre la base de los datos preliminares recopilados de muchas rondas de pruebas de nivel de fuerza en una planta de Arabidopsis colocada a escala electrónica. Como hemos encontrado, mantener la altura del cabello y la velocidad sin cambios a lo largo de todo el experimento de respuesta táctil producirá un fenotipo thigmomorfogenético similar y constante entre las réplicas de una línea de Arabidopsis. Una fuerza táctil demasiado pesada puede matar a las plántulas jóvenes, ya que los cepillos de pelo en movimiento rápido pueden provocar heridas en la superficie de una hoja. Por el contrario, una fuerza táctil demasiado ligera puede no ser suficiente para desencadenar el retraso del atornillado dentro de las 2 semanas posteriores a la repetición de la retoque. En nuestro experimento anterior, hemos determinado que la carga de fuerza táctil adecuada es de 1-2 mN por toque14,19. La longitud del cabello de 0,5 cm más baja que el borde de la copa se utiliza para generar una fuerza táctil vertical similar en el tacto del cabello basado en máquina Model K1 con una suave velocidad de movimiento horizontal 5000 mm/min (Figura2E). Este ajuste fijo de la máquina Modelo K1 reduce la variación de la fuerza de fuerza resultante del error humano.

En general, los toques capilares realizados por la máquina de carga automática de fuerza táctil proporcionan sólo una carga de fuerza táctil promedio en las plantas. La fuerza táctil precisa aplicada, especialmente la fuerza horizontal cargada, es difícil de calcular para un solo cabello o un grupo de pelos en un cepillo. Además, la varianza de la forma de la planta y la altura del tallo puede interferir con la aplicación de la fuerza horizontal. La medición de este tipo de fuerza física o estrés necesita un sensor de presión más preciso conectado a un cabello o un grupo de pelos. Se cree que el sensor de presión más preciso y el modelado matemático se aplicarán para mejorar la máquina de carga automática de fuerza táctil en el futuro. Las condiciones de crecimiento, como la intensidad de la luz, la humedad del suelo y la temperatura del invernadero, así como el suministro de nutrientes, juegan un papel crucial en el desarrollo del fenotipo de respuesta táctil. Cualquier condición de tensión, como la sequía, la condición de luz débil con menos de 90 oE-2s-1, y una temperatura más alta o menor que pueda afectar al crecimiento normal de Arabidopsis interferirá con la medición de la respuesta táctil de ambos tipos silvestres y mutantes.

En resumen, esta máquina de carga automática de fuerza táctil puede ofrecer una carga de fuerza táctil promedio uniforme y de ahorro de mano de obra que el tacto de los dedos humanos y el toque de hisopo de algodón. Se espera que la máquina táctil Modelo K1 se aplique en varios análisis mutantes de señalización de fuerza táctil de alto rendimiento y análisis de respuesta táctil entre cultivos agrícolas o probablemente modelos animales con algunas modificaciones de la carga de la fuerza táctil Máquina.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por las siguientes subvenciones: 31370315, 31570187, 31870231 (National Science Foundation of China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC de Hong Kong). Los autores quieren agradecer a Ju Feng Precision and Automation Technology Limited (Shenzhen, China) por su oferta de varios esquemas que se muestran en la Figura1.

Los autores también quieren agradecer a S. K. Cheung y W. C. Lee por su contribución al desarrollo de la máquina de carga de fuerza táctil.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 hair brushes customized
4 robot arms with one holder customized 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm
57 stepper motor 57HS22-A
All purpose potting soil Plantmate, Hong Kong
Arabidopsis plant seeds Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH For arabidopsis seed purchase
BIO-MIX potting substratum Jiffy Products International BV, the Netherlands 1000682050 Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and  BIO-MIX is 1:2
IL 1700 research radiometer International Light, Newburyport, MA The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured.
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html Free downloaded software
Ju Feng Precision and Automation Technology Limited Shenzhen, China For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase
Junction plate of the slide block To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks
Junction plate of the X axis module customized To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder
Slide block
WDT4045 X axis guide-rail module 843 mm, customized Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor
WDT4045 Y axis guide-rail module 1038 mm, customized Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor
X axis auxiliary girder 843 mm, customized Pre-installed with two slide blocks
Y axis auxiliary girder 1038 mm, customized Pre-installed with two slide blocks

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References

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Un Protocolo de Pantalla Mutante de Señalización de Señalización de Fuerza Táctil Y Repetible para el Estudio de la Thigmomorfogénesis de una Planta Modelo <em>Arabidopsis thaliana</em>
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Wang, K., Law, K., Leung, M., Wong, W., Li, N. A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (150), e59392, doi:10.3791/59392 (2019).More

Wang, K., Law, K., Leung, M., Wong, W., Li, N. A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (150), e59392, doi:10.3791/59392 (2019).

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