Summary
En blid touch-Force loading maskine er bygget af menneskehår børster, robotarme og en controller. Hårbørster er drevet af robotarme installeret på maskinen og bevæge sig periodisk for at anvende touch-kraft på planter. Styrken af maskindrevne hårberøringer kan sammenlignes med de manuelt anvendte berøringer.
Abstract
Planter reagerer på både intracellulære og ekstracellulære mekaniske stimuleringer (eller Force-signaler) og udvikle særlige morfologiske ændringer, en kaldet thigmomorphogenesis. I de seneste årtier er flere signalerings komponenter blevet identificeret og rapporteret for at være involveret i mekanisering (f. eks. calcium-ion bindende proteiner og jasmoninsyre-biosyntese enzymer). Men den relativt langsomme forskning i studiet af force signalering eller thigmomorphogenesis er i vid udstrækning tilskrives to grunde: kravet om omstændelig menneskelig hånd-manipuleret touch induktion af thigmomorphogenesis og Force Strength fejl forbundet med folks hånd-touch. For at øge effektiviteten af ekstern kraft lastning på en plante organisme, en automatisk touch-Force lastning maskine blev bygget. Denne robot arm-drevne hårbørste rører giver en arbejdsbesparende og let gentagelig touch-Force simulation, ubegrænset runder af touch gentagelse og justerbar touch styrke. Denne hår touch-kraft lastning maskine kan bruges til både storstilet screening af touch-Force signalering mutanter og fænomics undersøgelse af plante thigmomorphogenesis. Hertil kommer, touch materialer såsom menneskehår, kan erstattes med andre naturlige materialer som animalsk hår, silketråde og bomuld fibre. De automatiserede bevægelige arme på maskinen kan være udstyret med vand overbrusning dyser og luftblæsere til at efterligne de fysiske kræfter i regn dråber og vind, hhv. Ved at bruge denne automatiske hår touch-kraft lastning maskine i kombination med hånd-udført bomuld vatpind rørende, har vi undersøgt touch respons af to kraft signalering mutanter, MAP kinase kinase 1 (MKK1) og MKK2 planter . Fænomerne af touch-Force loaded vilde type planter og to mutanter blev evalueret statistisk. De har udstillet betydelige forskelle i touch respons.
Introduction
Plant thigmomorphogenesis er et begreb, der blev opfundet af Jaffe, MJ i 19731. Det er en plante tropisme, men adskiller sig fra den velkendte foto tropisme eller gravitropisme forårsaget af stimuli af sollys eller tyngdekraften2,3. Det beskriver fænotypiske ændringer i forbindelse med periodiske mekaniske stimuleringer, som ofte er observeret af botanikere i tidligere tider4,5. Regndråber, vind, plante, dyr og menneskelige rører, selv animalske bid, er alle anses for at være forskellige typer af mechano-stimuli, der udløserkraften signalering i planter4,5. Karakteristik af planten thigmomorphogenesis omfatter forsinkelsen af bolte, en kortere stilk, mindre Rosette/blad størrelse i urteagtige planter, og tykkere stilk i træagtige planter6,7,8. Dette er i modsætning til den thigmonastiske eller thigmotropic respons ofte findes i Mimosa planten eller andre mechano-følsomme vinstokke, hvor disse hurtige touch svar er lettere at blive observeret1,9,10. Thigmomorphogenesis, på den anden side, er relativt vanskeligt at blive observeret på grund af sin langsomme vækst respons. Thigmomorphogenesis observeres normalt efter uger eller endda år af kontinuerlig kraft-loading stimulation. Denne unikke karakter af Plant touch respons gør det vanskeligt at udføre en fremad genetisk skærm ved hjælp af menneskelig hånd touch stimulation for at isolere touch-Force signalering resistente mutanter på en robust måde.
For at belyse kraft signaltransduktionsvejene og de molekylære mekanismer, der lå til grund for den thigmomorfogenese6,11, molekylære og cellulære biologiske eksperimenter er blevet udført i de sidste6, 12,13,14. Disse undersøgelser har foreslået, at kraft signal receptorerne hovedsageligt består af mekaniske Ionkanaler (msc) og de tøjerede MSC komplekser komponeret af multimeriske komplekser af membran-spænder proteiner11,14 , 15. cytoplasmatiske ca2 + forbigående Spike genereret inden for sekunder af den første berøring. Vind-, regn-eller gravi-stimulation kan interagere med downstream-calcium følerne for at overføre kraft signalerne til nukleare begivenheder14,16,17,18. Ud over molekylære og cellulære undersøgelser har den fremad genetiske skærm med manuel fingerberøring af planterne fundet, at Phytohormoner og de sekundære metabolitter er involveret i det deraf følgende berørings inducerbare (TCH) genekspression efter Tryk-kraft lastning13,19. For eksempler, AOS og opr320 mutanter er blevet identificeret hidtil fra de genetiske undersøgelser. Men det store problem i forbindelse med anvendelsen af Forward genetik i studiet af thigmomorphogenesis er stadig den intensive arbejdskraft, der kræves for at kvantitere niveauet af touch respons og røre en stor population af genetisk muteret individuelle planter. Den tidskrævende problem fortsætter også i den hånd rørende-baserede mutant skærm14,20. For et eksempel, for at fuldføre en runde af touch-Force stimulation, en person skal røre 30-60 gange (One touch per sekund) på en individuel plante. For at have tilstrækkeligt mange anlæg til statistisk fænotype analyse, 20-50 individuelle planter af samme genotype er normalt kræves for touch-kraft lastning proces. Denne touch-Force loading regime betyder, at en person har brug for at repetitivt udføre 600-3000 rører på en genotype valg. Denne type berøring skal normalt gentages 3 til 5 runder om dagen, hvilket svarer til ca. 1800-15000 fingre eller vatpind berøringer pr. dag pr. genotype af planter. En veluddannet person er normalt forpligtet til at opretholde styrken og kraften af flere berøringer inden for et ønskværdigt område i løbet af mange runder af gentagelser på en dag for at undgå den store variation i kraft og styrke. Da det er velkendt, at thigmomorphogenesis er en mætbar og dosis-afhængig proces6,21, trykkraft/styrke bliver afgørende for en succes i udløser touch respons af en plante.
For at fjerne den person afhængige berørings kraft lastning og for at opretholde mekanisk anvendelse inden for et acceptabelt fejlområde14, vi derfor designet en automatisk touch-kraft lastning maskine til at erstatte de hånd-manipulerede rører. Maskinen har 4 bevægelige arme bygget, som hver er udstyret med en menneskelig hårbørste. Denne version hedder model K1 at specificere sin funktion af menneskehår touch-kraft lastning. Hvis 4 genotyper måles kvantitativt for deres thigmomorfogenesis eller berørings respons under én maskine, kan 40-48 individer pr. genotype måles. Hver runde af berøring gentagelse (mindre end 60 gange af berøring pr. plante) varer mindre end 5 minutter ved hjælp af en bevægelige hastighed justerbar robot arm. Således kan planter på en model K1 touch Machine mekanisk stimuleres til flere runder om dagen enten med en konstant touch-kraft lastning eller forskellige niveauer af styrker som oprindeligt programmeret.
Arabidopsis thaliana, en model plante organisme, blev derfor valgt som målet plantearter til afprøvning af fuldautomatisk hår touch-kraft lastning maskine ansøgning. Fordi der er flere store Seedbanks til rådighed for at hente de forskellige germplasms af mutanter og størrelsen af blomstring, Arabidopsis passer godt til den plads til rådighed i vækst hylden monteret med modellen K1 touch Machine.
Modellen K1 automatiske berørings maskine består af tre hovedkomponenter: (1) H-form metal stativet består af to bælte drevne lineære aktuatorer, (2) robot metal arme udstyret med hårbørster, og (3) en controller. For en tilpasset model K1 touch Machine er hvert X/Y-akse modul sammensat af en bælte styret føringsskinne, to glide blokke (rød) og 1 57 stepper motor (pre-installeret og afmonterbar) (figur 1a,B). Den øvre vandrette aktuator gør det muligt for robot metalarmen at bevæge sig til venstre og højre vandret, og den nedre lodrette bælte drevne aktuator gør det muligt for robot metalarmen at bevæge sig op og ned lodret (figur 1B, figur 2A ). Der blev installeret fire umonterbare robotarme på den lodrette aktuator (figur 1C, figur 2B). Fire menneskehår børster var bundet til fire robotarme henholdsvis (figur 1C, figur 2B). Alle mekaniske dele til at konstruere modellen K1 touch Machine i fed skrift nedenfor er markeret i figur 1C (også se tabellen over materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af frø
Bemærk: Arabidopsis frø af både vildtype (Col-0) samt mkk1 og mkk2 tab-of-funktion mutanter blev købt fra ARABIDOPSIS biologisk ressource Center (ABRC, https://www.Arabidopsis.org, Columbus, OH).
- Beregn, hvor mange plante individer af hver genotype der skal anvendes til en pålidelig statistisk analyse. Forbered et tilstrækkeligt antal frø baseret på spire hastigheden af hver linje, normalt 4-5 gange mere end hvad der er nødvendigt for et eksperiment. Sikre nok antal sunde og ensartet størrelse planter kan bruges til touch respons assay. Ifølge denne protokol, 300-500 frø pr genotype normalt anvendes til at producere 80-90 planter af samme størrelse.
- Nedsænk frøene i koldt vand og opbevar dem i 4 °C (dækket med aluminiumsfolie for at holde sig i mørke) for frøimbibition. So frøene 5-7 dage efter imbibition.
2. plantevækst
- Vælg den relevante jord til plantevækst (Se tabellen over materialer). Undgå store klumper og bland dem homogent.
- Forbered 24 plastik kopper: holde kapaciteten er 207 mL og den øvre fælgdiameter er 7,4 cm. bor tre runde huller i bunden af en kop til kunstvandingsformål.
- Fyld disse plastik kopper med den blandede jord. Lad jorden hobe op til 1-2 cm højere end Cup fælgen og fladere overfladen af stablet jord blødt.
- Overfør 24 kopper til en plastik bakke (21 tommer x 10,8 tommer x 2,5 tommer), og Anbring bakken under konstant lysforhold (se nedenfor).
- Tilsæt 2,5 L vand i hver bakke to timer før såning. Lad jorden til at absorbere vandet fra huller placeret på bunden af kopper og vente på overfladen af jorden til at falde til Cup RIM niveau.
- SOW 3-4 frø til et enkelt sted, og 4 jævnt fordelte pletter i en kop.
- Placer et gennemsigtigt plastik dæksel over hver bakke, og lad frøene spire i en uge. Derefter fjerne dækslet og tillade frøplanter til at vokse for en anden uge.
- Fjern ekstra planter ved udtynding og holde 4 plante individer af samme størrelse i hver kop 9-10 dage efter frøsåning.
- Skyl planter med 1,5 L vand hver anden dag efter frøene spire.
3. vækst tilstand
- Indstil temperaturen i vækst kammeret ved 23,5 ± 1,5 °C og fugtighed mellem 35 og 45%.
- Indstil lysintensiteten mellem 180 og 240 μE ∙ m-2∙ s-1 (målt ved Il 1700 Research Radiometer, internationalt lys)14. Den fotosyntetiske aktive stråling er fra 90 til 120 μE ∙ m-2∙ s-1.
- Indstil lysforholdene til at være 24 h konstant.
4. opførelsen af touch-kraft lastning maskine
Bemærk: denne robot hår touch-kraft lastning maskine (model K1) er designet til at tjene formål af både touch-Force signalering mutant screening og Plant thigmomorfogenesis generation (figur 1, figur 2).
- Pre-installation moduler (umonterbar, figur 1C)
- Installer to slide blokke (I) og en 57 stepper motor (II) på X/Y-akse styret-skinne modul (III/V).
- Installer to slide blokke (I) på X/Y-aksens ekstra Girder (IV/vi).
- Montering af andre mekaniske dele (figur 1C)
- Fastgør X-aksen guide-Rail modul (III) og x-akse ekstra Girder (IV) sammen ved at samle to samle plader (VII) i hver ende af føringsskinnen.
- Fastgør Y-akse styret-skinne modul (V) på dorsalen af to glide blokke (X-akse) i en krydsnings position ved at samle to samle plader (VIII) i mellem.
- Fastgør Y-aksen ekstra Girder (vi) på dorsalen af de to andre glide blokke (X-aksen) i en krydsnings position ved at samle to samle plader (VIII) i mellem.
- Monter holderen til robotarme (IX) på forsiden af to glide blokke (Y-aksen) i en krydsnings position med en samle plade (figur 2a).
- Saml 4 hårbørster (X) på robotarme (IX) med klemmer (figur 2B).
5. Tryk-Force lastning maskine indstilling
Bemærk: alle kontrollerende parametre for at indstille modellen K1 touch Machine i fed skrift nedenfor vises i kontrolpanelet (figur 2F).
- Installer touch hårbørster på robotarmene. Brug en 330 mm lang stål lineal som holder til at fastgøre et lag menneskehår (3600-4600 hår/børste) jævnt. Længden af håret er 126 mm (figur 1C).
- Fastgør disse stål linealer på robotarmene med to metal klemmer.
- Indstil højden på maskin armene langs den lodrette dimension (Y-aksen) først. Tryk på jog f + for at hæve og jog R- for at sænke robotarmene og børsterne. Lad spidsen af håret børster 0,5 cm lavere end Cup fælgen. Tryk på nulsættet. Pre-Run maskinen 1-2 cyklusser for at sikre, at alle plante individer bliver rørt. Juster og Kalibrer børster og hårspidser til samme højde hver dag i hele rørende perioden.
- Brug et elektronisk målestoksforhold til at måle berørings kraften (lodret belastning) og opretholde berørings kraften på 1-2 mN14.
- Indstil startpositionen for maskin armene langs den vandrette dimension (X-aksen) manuelt. Lad hårbørster til at hænge i kanten af hver bakke og sørg for, at ingen plante bliver rørt, før den rørende eksperiment starter. Tryk på jog f +/jog R- for at flytte maskin armen horisontalt lidt efter lidt for at indstille startpositionen.
- Indstil hårbørste rejseafstanden i den vandrette dimension (X-aksen) til 365 mm ved at trykke på knappen rejse . Tryk på Inc. F +/Inc. R- for at flytte maskin armene for at opnå en fuld rejseafstand og for at sikre, at alle de behandlede planter bliver rørt under hele det rørende eksperiment.
- Indstil bevægelseshastigheden langs X-aksen på maskin armene til 5.000 mm/min ved at trykke på knappen Auto Speed . Hold samme bevægelseshastighed under hele det rørende eksperiment.
- Indstil berørings tiden ved 20 forsøg ved at trykke på knappen for mindre cyklus . Hold det samme antal berøringer pr. runde under hele det rørende eksperiment.
Bemærk: en mindre cyklus er lig med to rejse afstande, hvilket betyder, at maskin armene vil bevæge sig fra udgangspositionen til slutpositionen og derefter tilbage til udgangspositionen. En mindre cyklus genererer to berøringer. Hårbørster røre planter 40 gange inden for 20 forsøg (2 rører x 20 forsøg = 40 rører). 40-touch er defineret til at være en runde af touch-kraft lastning. - Indstil gentagelsesintervallet for berørings runden til 480 min pr. dag ved at trykke på knappen for større periode . Hold den samme frekvens af berørings runder under et helt rørende eksperiment.
Bemærk: Dette tillader hårbørster at røre planter for 3 runder om dagen, og intervallet tid mellem hver runde er 480 min (8 h). Det viste blå tal står for intervaltiden for hver berørings runde. Maskinen vil automatisk starte en ny runde af berøring, når nedtællingen nedenfor (rødt tal) bliver til 0000. - Indstil den store cyklus ved 12 forsøg, hvilket betyder, at maskinen vil røre planter for 12 runder inden for en periode på 4 dage automatisk. Denne indstilling af 12 forsøg bruges til at undgå menneskelige fejl i at springe en dag med berøring.
- Tryk på Start -knappen for at starte det forudindstillede program. Model K1 touch Machine vil automatisk udføre touch Force loading i henhold til indstillinger.
6. indsamling og analyse af fysiologiske data
-
Dage til at bolte: Optag den daglige fridag for hvert enkelt anlæg i et rørende eksperiment. Bolte er et symbol på, at en plante ændrer sin vækstfase fra den vegetativt fase til den reproduktive fase. I Arabidopsis, er den bølmende dag defineret som antallet af dage, der anvendes af en plante til at have sin første Blomsterstanden stamme nå 1 cm i længden.
Bemærk: under vækst betingelsen, der er beskrevet ovenfor, starter bolte af vilde type planter normalt fra 19 til 23 dage efter såning og slutter ved 28-32 dage. -
Rosette radius: mål afstanden fra Rosette Center til spidsen af det længste blad.
- Tag billeder af hele bakken fra toppen. Tag billeder af kontrolgruppen og den berørings behandlede gruppe separat.
- Download den relevante software. Brug den gratis downloadede software ImageJ (https://ImageJ.NIH.gov/IJ/download.html) for eksempel.
- Åbn en fotofil, brug zoom-funktionen til at zoome fotoet til en passende størrelse.
- Vælg det lige værktøj til at tegne en lige linje mellem Rosette centrum og spidsen af et længste blad for at måle Rosette radius.
- Vælg et anlæg, og tryk på den venstre knap for at tegne en lige linje fra Rosette centeret til den længste blad spids.
- Vælg funktionen Analysér-mål , eller tryk på CTRL + M for at analysere linjeafstanden.
- Vælg en kop og Gentag de foregående to trin for at analysere diameteren af hver plastik kop på samme tid. Brug disse data til at udføre beregningen for at eliminere bias som følge af foto-tager.
Bemærk: ligningen er:
Ra/da = rm/dm
(Ra, den faktiske Rosette radius for et anlæg Da, den faktiske diameter af plastik kop; Rm, den målte Rosette radius for samme plante bestemt af en software Dm, den målte diameter af plastikbæger, som anvendes til dyrkning af samme plante)
-
Rosette område: mål den horisontale 2-dimensionelle overfladeareal af Rosette blade.
- Fjern Blomsterstanden uden at påvirke resten af Rosette organerne.
- Tag billeder fra toppen af hver plante sammen med en skala lineal placeret i nærheden.
- Brug en gratis plugin af ImageJ, Rosette tracker og følg protokollen offentliggjort tidligere22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den automatiske hår touch-kraft lastning maskine
Til observation af morfologiske ændringer på planter, både de reproducerbare vækstbetingelser og behandlingsmetoder er nøglen til at opnå gentagelig resultater. Denne high-gennemløb og automatisk touch-Force signalering mutant screening opnås ved den nybyggede hår touch-kraft lastning maskine, model K1 (figur 1, figur 2). Disse hårbørster kan røre maksimalt 4 bakker af planter samtidigt. Der var 24 kopper placeret i en bakke, og 12 kopper af planter i en gruppe, der anvendes som både kontrol og de behandlede planter (figur 2C, D). I hver kop, blev fire planter dyrket og i alt 48 eller mindre plante individer blev rørt af den samme hårbørste, som garanterer nok planter til senere statistisk analyse. Maksimalt 4 genotyper af planter kan være berørings behandlet samtidigt på en model K1 touch Machine. Et af de vigtigste punkter er indstillingen af touch Machine arm/hårhøjde, fordi thigmomorphogenesis er dosisafhængig6,21. Forskellige hårpositioner med hensyn til planten Rosette blad position generere forskellige touch kræfter, som kan generere helt forskellige thigmomorphogenesis resultater. I vores eksperimenter skal den plante-kontaktspidsen af hår placeres 0,5 cm lavere end Cup fælgen (figur 2E), som genererer kræfter, der ligner den tidligere offentliggjorte touch Force14. En programmerbar controller, der er installeret i et berøringspanel, bruges til at styre hele den berørings drevne læssemaskine (figur 2F, Se tabel over materialer).
Sammenligningen af to forskellige berørings metoder
For at sammenligne denne automatiske maskindrevne hårmetode med den konventionelle manuelt vatpind berørende metode, blev der udført to uafhængige eksperimenter på Col-0 (figur 3). I bomuld vatpind touch gruppe, rørende startet fra 12-dages gamle planter. Hver runde havde 40 berøringer (1 Touch/s). I alt blev der udført 3 runder hver dag (figur 3A). Det viste 1,7 dages forsinkelse i bolte efter en kontinuerlig vatpind berørings behandling (22,1 ± 0,2 dage vs. 23,8 ± 0,2 dage). På samme måde, for den automatiske maskine-drevet hår touch, touch-kraft lastning initieret fra 14-dages gamle planter og 40 gange med berøring (inden for 3 min) blev anvendt til en runde. I alt blev der udført 3 runder af berøringer en dag med nøjagtig 8 timers interval (figur 3B). Forsinket bolte blev observeret for Col-0 planter. Den gennemsnitlige bolte tid var 23,0 ± 0,3 dage, mens bolte tiden for modellen K1 touch Machine-behandlede planter var 24,7 ± 0,2 dage. Forskellene mellem kontrol-og berørings behandlede planter blev derfor analyseret med univariat Cox proportional-hazards-modellen. Det tilbød den anslåede Hazard ratio (hr) på 0,31 (vatpind berøring) og 0,52 (maskindrevet hårberøring) (figur 3C), hvilket betyder, at den bolte risiko/sandsynlighed for planter i den rørte gruppe er 31% og 52% sammenlignet med anlæg i henholdsvis kontrolgruppen. Dette indikerer, at muligheden for at bolte de rørte vilde type planter er omkring halvdelen i forhold til de uberørte kontrolanlæg, uanset om det er manuel berøring med en vatpind eller den automatiserede hårberøring.
De potentielle resultater på forskellige berørings mutanter
Nylige foreløbige data tyder på, at MKK1 og MKK2 kan spille en vigtig rolle i touch respons af Arabidopsis14. Vi valgte disse to mutanter og gennemførte touch eksperimenter på disse formodede touch respons mutanter ved hjælp af den automatiske hår touch-kraft lastning maskine (figur 4, tabel 1). De vilde type kontrolanlæg viste 1,8 dage med bolte forsinkelse (24,1 ± 0,3 dage vs. 25,9 ± 0,2 dage, figur 4A) ligesom den foregående rapport14 , mens denne friktions forsinkelse ikke blev observeret på T-DNA-indløde mutanter, mkk1 (24,6 ± 0,2 24,4 ± 0,3 dage, figur 4B og tabel 1) og mkk2 (23,9 ± 0,1 dage vs. 24,2 ± 0,2 dage, figur 4C og tabel 1). Ved at analysere disse data med univariat Cox proportional-hazards-modellen udviste kun vildtype Col-0 en signifikant forskel mellem kontrol og rørte planter med en anslået HR på 0,41 (figur 4D). Disse touch-Force lastning eksperimenter udført af den automatiske hår touch-kraft lastning maskine viste, at mkk1 og mkk2 mutanter er touch respons mutanter.
Måling af andre morfologiske indekser
Morfologiske ændringer forbundet med thigmomorphogenesis er ikke begrænset til forsinkelsen af bolte. Både kortere stilk og mindre Rosette blad størrelse er også komponenterne i thigmomorphogenesis6,7,9,14. Derfor har vi rapporteret her to yderligere typer af målinger på morfologiske indekser af touch respons, Rosette radius/bladlængde og Rosette (projiceret) område (figur 5). I samme grad som den tidligere observerede fænotype ændring viste Wild type Col-0- planten signifikant mindre Rosette radius og kortere bladlængde efter 3 dages konstant og gentagende automatisk maskindrevet hårkontakt (1,77 ± 0,05 cm vs. 1,50 ± 0,04 cm, figur 5A). Det projekterede Rosette område blev ændret fra 20,32 ± 0,53 cm2 til 16,19 ± 0,48 cm2 efter 13 dages berøring (figur 5B). Både mkk1 og mkk2 havde den tilsvarende reducerede Rosette radius og område. Tilsammen viste disse data, at MKK1-og MKK2 proteiner er vigtige for den dristige forsinkelse af Arabidopsis og ikke nødvendig i udformningen af Rosette-størrelsen og Rosette-området.
Statistisk analyse
Med hensyn til boksen og hale-plots, der er vist i figur 2 og figur 3 , og søjlediagrammerne i figur 5, blev den statistiske signifikans analyseret af to-sidet student's t-test, med betydning repræsenteret ved * * * og n.s. ved p henholdsvis < 0,001 og p > 0,05. For Kaplan-Meier-plottet, der er vist i figur 2 og figur 3, blev en univariat Cox-risikoanalyse anvendt til at analysere effekten af berørings behandling på bold hændelsen23,24. Hazard ratio (HR), 95% konfidensinterval (95% CI) og p -værdi tilbydes i tabellerne nedenfor. For eksempel, HR = 0,5 betyder, at på en bestemt dag, den bolte risiko/sandsynlighed for planter i den rørte gruppe var 0,5 eller 50% sammenlignet med disse planter i kontrolgruppen.
Figur 1 . Konstruktionen og parametrene for den automatiske hår touch-kraft lastning maskine. (A) standard skematik for den lineære aktuator. Det øverste venstre panel er den laterale visning, og det nederste venstre panel er rygvisningen. De samlede længder af X-akse modulet og Y-akse modulet er henholdsvis 843 mm og 1.038 mm. Hvert standard X/Y-modul består af en guide-Rail, en slide blok og 1 57 stepper motor (pre-installeret og frakoblet). For en tilpasset model K1 touch Machine er hvert X/Y-modul sammensat af to slide blokke (rød). X-modulets samle plade er forstørret fra 56 mm til 100 mm for at give bedre tilslutning og støtte. Øverste højre panel er tværsnit af guide-Rail og nederste højre panel er 57 stepper motor. B) skematik af den konstruerede dobbelte X-akse og de lineære aktuatorer med dobbelt Y-akse. Dette er den største del af touch-kraft lastning maskine. Nederste venstre panel er den dorsale visning af konstruerede lineære aktuatorer. Det øverste venstre panel er den laterale visning af X-akse modulet (843 mm). Midterpanelet er den laterale visning af Y-akse modulet (1.038 mm). Øverste højre panel er rygvisningen af 4 slide blokke på Y-modulet og Y-ekstra Girder. Panelet nederst til højre er den dorsale visning af samlings pladen på X-modulet. C) rutediagram over montage af maskindele. Forskellige dele er markeret og angivet i figuren. Detaljerede monteringsprocesser blev beskrevet i protokollen. Den viste enhed er dette tal er mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Det overordnede design af den automatiske hår touch-kraft lastning maskine. (A) den færdige model K1 touch Machine. Fotoet blev taget fra forsiden. Den øvre lineære aktuator styrer robotarmen, som bevæger sig horisontalt, og den nedre lineære aktuator styrer den robot arm, som bevæger sig lodret. B) den laterale visning, der viser de umonterbare robotarme. Hårbørster blev klemt fast på robotarmene. (C og D) Billeder, der viser, hvordan menneskelige hår børster rører planterne, som blev taget fra forsiden og den laterale side, hhv. (E) den laterale visning viser, hvordan du indstiller højden af hårbørsten mod Cup fælgen. Både maskin armene og hårbørsterne er synlige. F) betjenings grænsefladen for modellen K1 touch Machine. En programmerbar controller (AFPX-C30T), der er knyttet til et berøringspanel (MT6070i), bruges til at styre hele maskinen. Detaljerede indstillinger og driftsprocedurer er beskrevet i protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Sammenligne virkningerne af to touch metoder på thigmomorphogenesis. (A-B) sammenligningen af manuel vatpind touch (a) og menneskehår touch drevet af den automatiske berørings kraft lastning maskine (B), hhv. Boks og hale-plots er vist i venstre panel, som viser sammenligningen af den gennemsnitlige bolte dag mellem kontrolgruppen og den rørte gruppe. Betyder, at ± SE er vist. Statistisk analyse blev udført af en elevs t-test. Betydning ved p < 0,001 vises som * * *. Kaplan-Meier plots er vist i midten, som er den procentdel af bolte planter overvækst tiden (dage efter såning). Den højre panel viser repræsentative individer af uberørt kontrol og rørte planter, der viser forskellen i bolte tid og Blomsterstanden Stem højde. C) den opsummerede tabel: de numeriske tal i kontrol og rørte kolonner er det anlægsnummer, der anvendes til statistisk analyse. Hazard ratio (HR), 95% konfidensinterval (95% CI) og p -værdi under afsnittet af univariat Cox-risikoanalyse tilbydes. Den bolte risiko og sandsynlighed for planter i den rørte gruppe var 31% og 52% i forhold til den uberørte gruppe, hhv. Univariat Cox-risikoanalysen blev anslået af SPSS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Den thigmomorphogenesis af mkk1 og mkk2 mutanter samt Wild type planten (Col-0) induceret af den automatiske hårberøring. (A-C) den potentielle touch respons af Col-0 (a), mkk1 (B), og mkk2 (C) genereret gennem gentagelse af menneskehår rører drevet af den automatiske touch-kraft lastning maskine. Boks og hale-plots er vist i venstre panel, som er sammenligningen af den gennemsnitlige bolte dag mellem kontrolgruppen og den rørte gruppe. Betyder, at ± SE er vist. Statistisk analyse blev udført af en elevs t-test. Henholdsvis * * * og n.s. repræsenterer p < 0,001 og p > 0,05. Kaplan-Meier-parceller vises i midten, som er procentdelen af bolte planter i vækstperioden (dage efter såning). Den højre panel viser repræsentative individer af uberørt kontrol og de rørte planter, der viser den dristige forskel. Data fra henholdsvis mkk1 (B) og mkk2 (C) blev indsamlet fra to og tre biologiske replikater. De detaljerede plante numre, der blev anvendt i hver replikat, blev vist i tabel 1. D) den opsummerede tabel: numrene under kontrol-og berørings kolonner var det anlægsnummer, der blev anvendt/analyseret i disse to grupper. Den højtstående repræsentant, 95% CI og p -værdi under afsnittet af univariat Cox-risikoanalyse blev tilbudt. Den bolte risiko/sandsynlighed for vilde type planter i den rørte gruppe er 41% i forhold til kontrolgruppen. Univariat Cox-risikoanalysen blev anslået af SPSS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Rosette radius og areal måling til definering af thigmomorphogenesis. (A-B) Rosette-radiussen og Rosette-området af vildtypen blev målt på henholdsvis dag 17 og dag 27 efter såning. Søjler vist i øverste venstre panel er sammenligninger af enten Rosette radius eller Rosette område mellem kontrolgruppen og den rørte gruppe, hhv. Betyder, at ± SE er vist. Statistisk analyse blev udført af elevens t-test; p < 0,001. Billeder vist i øverste højre panel er repræsentative individuelle planter. De opsummerede tabeller nedenfor viser det plante nummer, som blev analyseret i kontrolgruppen og den rørte gruppe. Både Rosette radius (cm) på dag 17 og Rosette område (cm2) på dag 27 vises også. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Data fra forskellige biologiske replikater. Den opsummerede tabel indeholder to biologiske replikater af mkk1 og tre biologiske replikater af mkk2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Thigmomorphogenesis er en kompleks plantevækst respons mod mekaniske forstyrrelser, som involverer et netværk af cellulære signalering og handling af Phytohormoner. Det er en konsekvens af adaptiv udvikling af planter til at overleve under de uønskede miljømæssige betingelser25,26. Mekanisk berøring, især menneskelig fingerberøring og håndholdt vatpind touch, er blevet udvalgt til at studere denne morfologiske ændringer i tidligere thigmomorfogenetiske undersøgelser14,20. Denne forenklede version af touch-Force lastning til at udløse anlægget touch respons er lettere at kontrollere og anvende. Desuden kan denne type touch-Force loading metode på en eller anden måde efterligne vind-og regn drop-stimuleret kraft signaler produceret i det naturlige miljø19. Berørings kraften er i stand til at udløse calcium pigge, inducere protein fosforylering14 og downstream-genekspression, der formidler berørings respons19. På samme måde kan menneskehår børster monteret på automatiserede bevægelige arme også generere planten touch respons ved at efterligne de menneskelige hånd manipulerede rører. For at diversificere de forskellige typer kraftanvendelse kan vand stænknings dyser og/eller vind blæsere også monteres på maskinens robotarme og anvendes til et fysiologisk eksperiment (figur 2). Den unikke funktion gør den automatiske mekanisk kraft lastning maskine mere alsidig i morfogenetiske og fysiologiske undersøgelser. Den største fordel ved denne automatiske mekaniske-kraft loading maskine er formentlig dens Labor-fri, gentagelig og tidsbesparende funktion, som gør det muligt at udføre en specifik mutant fænotype udvælgelse fra et stort antal mutagenicerede individer. I modsætning til timevis af menneskelige hånd manipulerede berøringer kan modellen K1 touch Machine røre forskellige mutanter samtidigt og gennemføre en runde af berøring inden for 3 til 5 minutter. Tidsrammen for en runde af berøring afhænger i høj grad af program indstillingen i begyndelsen af behandlingen. Hvis hver enkelt plante ville blive rørt 40 gange i en runde, ville modellen K1 maskine kun brug for 9-15 min til at afslutte tre runder af touch behandling inden for en dag. Intervaltiden mellem hver runde af berøringer kan styres præcist; Det er mindre sandsynligt for mennesker at opnå en sådan præcision.
Et andet vigtigt spørgsmål vedrørende berøring behandling er, hvilken fase af plantevækst touch kraft skal anvendes på. I vores praksis begyndte rørende 14 dage efter frøsåning for både vildtype og to mutanter, da vækstraterne for disse tre genotyper er ens. For de mutanter, der har en betydelig forskel i udviklingsmæssige tid fra den vilde type, kan man vælge en anden første dag for at starte rørende. Udførelse af en-vejs ANOVA test på de bolte data af både vilde type plante og mutanter for flere sammenligninger kan hjælpe14. Denne statistiske analyse kan give den rette konklusion om forskellene i den tid, der genereres af genotyper. I dette tilfælde bør en multivariat Cox proportional risikoanalyse anvendes til at overveje to variable parametre.
For at indstille touch-Force-niveauet for de menneskelige hår monteret på modellen K1 touch Machine, justerede vi både højden (vertikal kraft) og hastigheden (horisontal kraft) af hårbørster (figur 2E). De rigtige indstillinger blev fastlagt på grundlag af de foreløbige data indsamlet fra mange runder af force level tests på et Arabidopsis anlæg placeret i elektronisk skala. Som vi har fundet, vil holde både hårhøjde og hastighed uændret i hele touch Response eksperiment producere en lignende og konstant thigmomorfogenetisk fænotype blandt replikater for en Arabidopsis linje. For tung en touch-Force kan dræbe de unge frøplanter, som den hurtigt bevægende hårbørster kan føre til at vaklede på overfladen af et blad. I modsætning, for lys en touch-Force kan ikke være nok til at udløse forsinkelsen af bolte inden for 2 uger af gentagelse af rørende. I vores tidligere eksperiment, har vi fastlagt den passende touch-kraft lastning til at være 1-2 mn per touch14,19. Hårlængden på 0,5 cm lavere end Cup fælgen bruges til at generere en lignende vertikal touch kraft på model K1 maskine-baseret hårkontakt med en blid horisontal bevægelseshastighed 5000 mm/min (figur 2E). Denne faste indstilling af model K1 maskine reducerer variationen af kraft styrke skyldes den menneskelige fejl.
Samlet set giver håret rører udført af den automatiske touch-Force lastning maskine kun en gennemsnitlig touch-kraft lastning på planter. Den præcise berørings kraft, der påføres, især den vandrette kraft, er svær at beregne enten for et enkelt hår eller en gruppe hår på en børste. Desuden kan variansen af plante form og stem højde interferere med anvendelsen af horisontal kraft. Måling af denne form for fysisk styrke eller stress har brug for en mere præcis tryksensor knyttet til et hår eller en gruppe af hår. Det menes, at mere præcis tryksensor og matematiske modellering vil blive anvendt til at forbedre den automatiske touch-kraft lastning maskine i fremtiden. De vækstbetingelser, såsom lysintensitet, fugt af jord og temperatur i drivhuset samt næringsstoffer leverer, alle spiller en afgørende rolle i touch respons fænotype udvikling. Eventuelle stressforhold, såsom tørke, svagt lys tilstand med mindre end 90 μE ∙ m-2∙ s-1, og en højere eller en lavere temperatur, der kan påvirke den normale vækst af Arabidopsis vil forstyrre målingen af touch respons af begge vilde type og mutanter.
Kort sagt, denne automatiske touch-Force lastning maskine kan tilbyde mere arbejdskraft-besparelse og uniformeret gennemsnitlig touch-Force lastning end menneskelig Finger touch og vatpind touch. Det forventes, at modellen K1 touch Machine vil blive anvendt i forskellige højt gennemløb touch-Force signalering mutant screening og touch responsanalyse blandt landbrugsafgrøder eller sandsynligvis dyremodeller med nogle ændringer af touch-kraft lastning Maskine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af følgende tilskud: 31370315, 31570187, 31870231 (National Science Foundation of China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC af Hongkong). Forfattere vil gerne takke Ju Feng Precision og Automation Technology Limited (Shenzhen, Kina) for deres tilbud af flere skemaer vist i figur 1.
Forfattere vil også gerne takke S. K. Cheung og W. C. Lee for deres bidrag til udviklingen af touch-Force lastning maskine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. The Flowering Process. , Macmillan. New York. (1963).
- Darwin, C. The Power of Movement in Plants. , Appleton. New York. (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , Germany. (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
