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Bioengineering

過偏光のスピン格子緩和磁場依存性の測定[1-13C]ピルビン酸

Published: September 13, 2019 doi: 10.3791/59399
Automatic Translation
1, 2, 1,2,3
1Department of Medical Biophysics, Western University, 2Imaging Research Laboratory, Robarts Research Institute, Western University, 3Ontario Institute for Cancer Research

Summary

我々は、高速フィールドサイクル緩和測定を用いて、動的核偏光によって過偏光する13C濃縮化合物のスピン格子緩和時間の磁場依存性を測定するプロトコルを提示する。具体的には[1-13 C]ピルビン酸でこれを実証しましたが、プロトコルは他の過分極基板に拡張することができます。

Abstract

過偏光13C濃縮化合物の生体内イメージング用途における基本的な限界は、有限スピン格子緩和時間である。バッファー組成、溶液 pH、温度、磁場など、さまざまな要因が緩和率に影響します。この最後の点では、スピン格子緩和時間は臨床分野の強さで測定することができますが、これらの化合物が偏光子から分配され、MRIに輸送される低い分野では、リラクゼーションはさらに速く、測定が困難です。輸送中に失われた磁化量をより深く理解するために、高速電界循環リラクセメトリーを用し、13C核の磁気共鳴検出を~0.75Tで用し、核磁気共鳴分散を測定した。過偏光[1-13 C]ピルビン酸のスピン格子緩和時間。溶解動的核偏光は、80mmol/Lおよび生理学的pH(〜7.8)の濃度でピルビン酸の過分極サンプルを生成するために使用された。これらの溶液は、サンプル磁化の緩和を校正された小さなフリップ角度(3°-5°)を使用して時間の関数として測定できるように、高速フィールドサイクリングリラクソメーターに迅速に転送されました。ピルビン酸のC-1のT1分散をマッピングするために、0.237 mTから0.705Tの範囲の異なる緩和フィールドのデータを記録した。この情報を基に、前述の磁場範囲内の超偏光基板のスピン格子緩和を推定する経験式を決定した。これらの結果は、輸送中に失われる磁化量を予測し、信号損失を最小限に抑えるための実験設計を改善するために使用することができます。

Introduction

磁気共鳴分光イメージング(MRSI)は、分光イメージングによって検出された代謝産物の空間マップを生成することができますが、その実用的な使用は、多くの場合、その比較的低い感度によって制限されます。生体内磁気共鳴イメージングおよび分光法のこの低感度は、体温と合理的な磁場強度で達成可能な核磁化の小さな程度に由来します。しかし、この制限は、動的核偏光(DNP)を使用して液体基板のインインビトロ磁化を大幅に強化し、その後MRSI1,2を用いて生体内代謝をプローブするために注入することによって克服することができる。,3,4.DNPは、非ゼロ核スピンでほとんどの核の磁化を高めることができるとピルビン酸5、6、重炭酸塩などの13 C濃縮化合物の生体内MRSI感度を高めるために使用されています7、8、噴酸塩9、乳酸塩10、グルタミン11、およびマグニチュード12の4つ以上の注文によって他。その用途は、血管疾患13、14、15、臓器灌流13、16、17、18、癌のイメージングを含む検出1,19,20,21,22, 腫瘍ステージング23,24, および治療応答の定量化2,6,23歳,24歳,25名,26.

遅いスピン格子リラクゼーションは、MRSIを用いる生体内検出に不可欠です。スピンラティスリラクゼーション時間(T1秒)は、溶液中の小分子内のジャイロ磁気比が低い核に対して数十秒の順に可能です。いくつかの物理的要因は、核スピン転移とその環境(格子)との間のエネルギーの移動に影響を与え、磁場強度、温度、および分子立体構造27を含む緩和につながる。二極緩和は、陽子が直接付着していない炭素位置の分子において減少し、溶解媒体の重水素化により、分子間二極緩和をさらに低減することができます。残念ながら、過熱溶媒は生体内のリラクゼーションに拡張する能力が限られています。カルボニルまたはカルボキシリン酸(ピルビン酸など)の弛緩の増加は、化学シフトの対向性により高い磁場強度で起こりうる。偏光後の溶解中の流体経路からの常磁性不純物の存在は、急速な緩和を引き起こす可能性があり、キレートを使用して避けるか、または排除する必要があります。

低いフィールドでの13のC含有化合物の緩和のためのデータはほとんど存在しません, スピン格子の緩和が大幅に高速になる可能性があります.しかし、過偏光造影剤は通常、地球の近くまたは地球のDNP装置から分配されるので、生体内イメージングに使用される薬剤の調製時にリラクゼーションを理解するために、低いフィールドでT1を測定することが重要です。フィールド。13C濃縮基板濃度、溶液pH、バッファーおよび温度などの追加の物理的要因も緩和に影響を与え、その結果、薬剤の製剤に影響を及ぼす。これらの要因はすべて、DNP溶解プロセスを最適化する上で重要なパラメータの決定、およびDNP装置からイメージング磁石へのサンプルの輸送中に発生する信号損失の大きさの計算に不可欠です。

核磁気共鳴分散(NMRD)測定、すなわち、T1測定は、磁場の機能として、典型的にはNMR分光計を用いて取得される。これらの測定値を取得するために、サンプルが最初に分光計からシャトルされ、磁石28、29、30のフリンジフィールドでの位置によって決定されるいくつかのフィールドでリラックスするシャトル方法を使用することができます。そして、その残りの磁石を測定するために、急速にNMR磁石に戻って転送されます。このプロセスを磁場の同じ点で繰り返すことによって、緩和の期間が長くなるので、緩和曲線を得ることができ、T1を推定するために分析することができる。

我々は、高速フィールドサイクリングリラクセメトリー31、32、33として知られている代替技術を使用して、NMRDデータを取得します。我々は、過偏光13C核を含む溶液のT1測定のための市販のフィールドサイクリングリラクセタメーター(材料の表を参照)を変更しました。シャトル方式と比較して、このリラクソメーターは、より小さい磁場(0.25 mT~1T)でNMRDデータを系統的に取得することができます。これは、磁場内のサンプル位置ではなく、磁場自体を急速に変化させることです。したがって、サンプルは、高い電界強度で磁化し、より低いフィールド強度で「リラックス」し、次いで、固定フィールド(およびLarmor周波数)での自由誘導減衰を獲得して測定し、信号を最大化することができる。これは、測定中にサンプル温度を制御することができ、NMRプローブは、磁場範囲全体にわたって自動集録を促進する各リラクゼーションフィールドで調整する必要がないことを意味します。

低磁界における過偏光溶液の分配と輸送の効果に焦点を当て、高速を用いて超偏光13C-ピルビン酸のスピン格子緩和時間を測定する詳細な方法論を提示する。0.237 mT ~0.705 Tの範囲の磁場に対するフィールドサイクリング緩和量。この方法論を用いた主な結果は、ラジカル濃度および溶解pHなどの他の要因が有する[1-13 C]ピルビン酸ナトリウムおよび13C濃縮ナトリウムおよびセシウム重炭酸塩35について以前に提示されている。研究も行っています。

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Protocol

1. サンプル調製

注: 手順 1.1-1.8 は 1 回だけ実行されます。

  1. ストック13C濃縮ピルビン酸溶液の1mLを調製し、生体内研究1、2、5、6、トリアリルメチルラジカルの15mmol/Lからなる[1--13歳C]ピルビン酸(材料の表を参照)。このストックソリューションのアリコートは、個別に偏光され、その後、異なる磁場での弛緩測定を受けるサンプルに使用されます。[1-13C]ピルビン酸分子の表現を図1に示す。
  2. 動的核偏光子ソフトウェアインターフェイス(材料の表を参照)で、冷却ダウンボタンをクリックして可変温度インサート(VTI)の温度を1.4Kに下げます。
  3. DNPが所望の温度に達したら、サンプルカップにストック溶液の10 μLをロードし、タレットドアを開き、このタスクのために特別に設計された挿入杖を使用してカップをVTIに挿入します。
  4. その後、すぐに杖を抽出し、カップが解放されていることを確認してください。その後、砲塔のドアを閉じ、VTIの温度が1.4 Kに戻る間、次の手順を続けます。
  5. ストック溶液の過分極に最適なRF周波数を見つけるために、マイクロ波スイープを実行するようにDNPを準備します。
    1. 分光計(DNPシステムの一部)を制御するコンピュータ上で、以前に適切なシリアル通信で設定されたハイパーターミナルアイコンをダブルクリックして、分光計とDNP制御ソフトウェア間の通信を確立します。パラメーター。
    2. 通信が確立したら、RINMR ソフトウェアを起動し、そのコマンドラインに入力します。ハイパーセンセンセンMRを押し、を押します。
    3. その後、新しいウィンドウが画面に表示され、そのウィンドウに[構成番号]フィールドに 1 番 (1) と入力します。次に、[構成の選択]ボタンをクリックします。
    4. [電子レンジスイープを行う]ボタンをクリックします。秒の降下カウンターを持つ小さなウィンドウが起動され、分光計の準備が整い、DNP制御ソフトウェアから来る定期的なトリガ信号が偏光をサンプリングするのを待つことを示します。
    5. DNP制御ソフトウェアで、[キャリブレーション]タブを選択し、[生成]ボタンをクリックします。
    6. キャリブレーション設定ウィンドウを使用して、次の情報を入力します: 開始周波数 = 94.117 GHz、終了周波数 = 94.137 GHz、ステップサイズ = 1 MHz、ステップデュレーション = 300 s、電力 = 50 mW、液体ヘリウムレベル = 65%、温度 = 1.4 K。
    7. [生成]ボタンをクリックすると、セットアップ ウィンドウが閉じ、[キャリブレーション]タブに戻り、必要な電子レンジ スイープの実行に必要な歩数と時間が表示されます。
    8. 目的のVTI温度が達成されたら、[有効にする]ボタンをクリックし、開始してマイクロ波スイーププロセスを初期化します。
  6. マイクロ波スイープの終わりに、サンプルを回収し、最大偏光が達成される最適な周波数を記録します。この最適な周波数は、図 2に示すように最大偏光を提供する偏光周波数として定義されます。この周波数は、ピルビン酸のその特定のストック溶液から得られたすべてのアリコートを過分極するために使用されます。
  7. 40mmol/Lトリスベース、塩化ナトリウム50mmol/L、脱イオン水中の水酸化ナトリウム80mmol/Lの溶液を使用して、250 mLのストック溶解培地を調製します。エチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)を100mg/Lの濃度で添加し、金属イオン汚染を隔離します。ピルビン酸ストック溶液と同様に、この溶解培地は偏光されるすべての異なるサンプルに使用されます。使用する化学物質の詳細については、材料の表を参照してください。
  8. また、脱イオン水に溶解した100mg/L EDTAからなるストック洗浄液500mLを調剤する。この洗浄液の約10mLは、DNPの溶解経路を洗浄するために各偏光後に使用される。
    注: ステップ 1.9 ~ 1.27 は、個々のサンプルごとに実行されます。
  9. DNP本体を1.4Kに冷却し、DNPメインウィンドウのクールダウンボタンを押して[1-13 C]ピルビン酸サンプルを過偏分化する準備をします。
  10. 分光計に使用するソフトウェアが、構成1を選択した状態で既にアクティブな場合は、次の手順に進みます。それ以外の場合は、手順 1.5.1 から 1.5.3 を実行し、次の手順に進みます。
  11. DNPの分光計を制御するウィンドウで設定1が選択されていることを確認したら、[ソリッドビルドアップ]ボタンをクリックします。
  12. ファイル名 SSBuilupXXX を入力します。この数は、ソフトウェアによって自動的に増分されます。次に、[OK]をクリックします。マイクロ波スイープケースと同様に、分光計の準備が整い、DNP制御ソフトウェアから来る周期的なトリガ信号を待ち、偏光をサンプリングすることを示す小さなウィンドウが起動されます。.
  13. ピルビン酸を用いて - OX063ストック溶液をステップ1.1で調製し、サンプルカップで30mgの重量を量る。
  14. 所望の VTI 温度が達成されると (1.4 K) サンプルの挿入をクリックし、[正規サンプル]を選択し、[次へ]をクリックします。画面に表示される安全上の注意事項に従って、このタスクのために特別に設計された長い杖を使用して、冷たいDNP装置にカップを挿入します。
  15. カップを挿入すると杖が取り外され、DNP ドアが閉じられ、[次へ]をクリックして[完了]をクリックします。その時点で、過二極化システムは、部分的に充填された照射室にサンプルカップを下げる(65%)液体ヘリウムと。
  16. 温度が1.4Kに戻るまで待ってから、[偏光サンプル]ボタンをクリックします。
  17. 新しいポップアップ ウィンドウで、手順 1.6 でマイクロ波 スイープから取得した周波数値を設定します。同じウィンドウで、電源を 50 mW に設定し、サンプリング時間を 300 s に設定します[次へ] をクリックし、[ビルドアップ監視を有効にする] チェック ボックスをオンにしてから、[完了]をクリックします。
    注:偏光が開始されると、DNP制御ソフトウェアは300sごとにトリガ信号を生成し、小さな先端角度を使用して偏光をサンプリングするように分光計に指示します。このように、分光計ソフトウェアは、ソリッドステート磁化曲線にサンプルポイントを追加し、分光計ソフトウェアとタブ偏光ビルドアップの下のDNP制御ソフトウェアの両方に表示されます。4番目のサンプルとその後のすべてのサンプルの後、分光計ソフトウェアは、フォームの指数関数に曲線にフィットします。

    S = A *exp(-t/Tp)+ y0

    ここで Aは偏光振幅で、任意の単位ではtはサンプリング時間、Tp は偏光時間定数 (両方とも秒単位)、y 0 はオフセットです。 適合パラメータに基づいて、ソフトウェアは、DNPの偏光ステータスタブにも表示される、その時点まで達成された偏光率を計算します。
  18. 固体磁化の蓄積が最大の95%(約1時間)に達するまで偏光します。
  19. サンプルが偏光している間、以下のセクション2で説明するように、高速フィールドサイクリングリラクサメータを準備します。
  20. 所望の偏光が達成したら、[溶解を実行]をクリックし、[方法]の下で、[ピルビック酸試験]を選択します。次に、をクリックします。
  21. 画面の指示に従って、DNPタレットドアを開き、セクション1.5で調製された溶解媒体の約4.55 mLで装置の上部に加熱および加圧室をロードし、80-mmol/Lピルビン酸の濃度を生成します。pHで~7.75°C、温度~37°Cで溶解します。
  22. 回復杖を正しい位置に配置し、タレットドアを閉じ、コンピュータで[次へ]をクリックしてから[完了]をクリックします。その時点で、溶解媒体は圧力が10棒に達するまで過熱される。
  23. 10気圧に到達すると、凍結および過分極ピルビン酸は液体ヘリウム浴から自動的に持ち上げられ、迅速に混合され、過熱溶解媒体と解凍され、毛細血管チューブを介して梨状のフラスコに排出されます。過分極ピルビン酸/溶解媒体混合物が排出される間、常に均質な混合物を確保するためにフラスコを旋回する。
  24. すべての混合物が排出されると、液体の1.1 mLをシリンジに素早く引き込み、予め温めた(37°C)10mm径NMRチューブに移し、フィールドサイクリングリラクセモメーターに迅速に搬送します(ステップ2.2.12参照)。
  25. すべてのピルビン酸溶解の残りのアリコートを0.55-TベンチトップNMR分光計(材料の表を参照)に分配し、可能な系統的な実験効果を確認します。
  26. クリーンな溶解培地を用いてDNP流体経路を直ちに洗浄し、続いてエタノールを用いた。流体経路を通してヘリウムガスを吹き飛ばし、残りの洗浄液を除去し、酸素のパージ経路を除去します。すべてのガラス製品をきれいにします。
  27. 各測定の後、ベンチトップ分光計とフィールドサイクリングリラクザメータの両方からのサンプルのpHを記録します。
    注:各T1測定は、DNP装置から独立した過分極溶解であり、サンプル組成物の測定から測定の再現性を保証するために注意が必要です。これは最終的な過偏光溶液の正確で、再生可能な準備を保証するために0.1 mgの精密ですべての薬剤および溶媒を重量を量ることによって達成される。

2. リラックスメトリー

注: 次の手順で説明するさまざまなパラメータの選択と使用について理解を深めるには、表 1を参照してください。溶解する前に、リラクソーメーターのフリップ角度を計算し、リラクザメを設定し、過偏光溶液の測定の準備をする必要があります(下記参照)。

  1. フリップアングルキャリブレーション
    1. NMRチューブに1mLのきちんとした[1-13 C]ピルビン酸を調製し、ガドリニウム造影剤を添加して、13C核のT1を200ミリ秒未満、50ミリ秒未満の値に減らす。
    2. NMRチューブをシールして、キャリブレーション規格として複数回使用できます。
    3. リラクサメーターの深度計を使用して、NMRチューブの挿入の深さを適切な高さに設定し、サンプルがリラクセットメーターRFコイルの中心に配置されることを確認します。
    4. 13 Cピルビン酸キャリブレーション規格の挿入深さを粘着テープでマークし、再現性を確保します。
    5. NMRチューブの深さストッパーをテープで示された位置に置き、このキャリブレーション規格をフィールドサイクリングリラクショメータのボアに挿入します。NMRチューブを位置に保つために重量を使用してください。
    6. 器械の空気弁を開き、リラックス器の前部パネルから温度コントローラーを37 °Cに置く。それは実験の間に熱した空気を使用して37°C(±0.5°C)でサンプルの温度を維持する。
    7. フィールドサイクリングリラクコメータハードウェアをセットアップして、13個のC核信号を取得します。これには、外部シムコイルの取り付けと通電(材料の表参照)、RFコイルを8MHz(13C核の場合は〜0.75 T)にチューニングしてマッチングし、適切なλ/4ケーブルを使用することが含まれます。
    8. 計測器ソフトウェアで、次の手順を実行します。
      1. [メイン パー]タブを選択します。
      2. [実験]というラベルの横にあるセルをクリックし、ポップアップ ウィンドウで下にスクロールしてパルス シーケンス "13CANGLE" を選択します。FFC ".
      3. 次の取得パラメータを設定します: RFA = 5;SWT = 0.005、RD = 0.5、BPOL = 30 MHz、TPOL = 0.5。
      4. [Acq. par]タブを選択し、[基本]サブタブを選択します。
      5. [Nucleus]というラベルの横にあるセルをクリックし、ポップアップ ウィンドウで下にスクロールして13Cを選択します。
      6. 次に、次のパラメータを設定します: SF = 8 MHz、SW = 1000000、BS = 652、FLTR = 100000、MS = 32。
      7. [Conf]タブを選択します。
      8. 次のパラメーターを設定します: RINH = 25、ACQD = 25。
      9. nDimサブタブを選択します。
      10. NBLK = 32、BINI = 2、ベンド = 62 を設定します。
      11. [評価]タブを選択し、[パラメータ]サブタブを選択します。
      12. 次のパラメーターを設定します: EWIP = 10、EWEP = 128、EWIB = 1、EWEB = 32。
      13. 次に、[取得の開始]アイコンをクリックして、パルス シーケンスを実行します。
    9. 取得が完了したら、データを保存し、[評価] ダイアログアイコンを選択し、[分析] メニューから[WAM ウィンドウ: 絶対大きさ]を選択します。次に、レポートシート、グラフ、エクスポートファイルを選択し、最後に[実行]をクリックします。
    10. [レポート] ウィンドウで、最大振幅を提供する RF パルス幅を検索し、図 3の一番下の行に示すプロットに似た、表示されたグラフのカーソルの助けを借りて値を微調整します。このパルス幅は、以下の実験のパラメータPW90に使用されます。
    11. F1アイコンをクリックして、リラクオメーターの周波数シフトを調整します。
      注:WAMウィンドウ:絶対マグニチュードは、EWIPによって定義されたポイントからEWEPによって指定されたポイントとブロックから、単一または一連の自由誘導減衰獲得(FID)の大きさを統合する手順です。EWIBによってEWEBによって指定されたブロックに定義されます。
  2. T1-測定値
    1. 外部シムコイルが取り付けられ、通電されていることを確認します。
    2. 計測器ソフトウェアでは、次の手順を実行します。
      1. [メイン パー]タブを選択します。
      2. [実験]というラベルの横にあるセルをクリックし、ポップアップ ウィンドウで下にスクロールして、図 4に示すパルス シーケンスHPUB/Sを選択します。
      3. 次の取得パラメータを設定します: RFA = 25、T1MX = 3 と 5 の値。SWT = 0.2, RD = 0, BRLX = MHzの所望の緩和フィールド(陽子ラルモル周波数)。
      4. [Acq. par]タブを選択し、[基本]サブタブを選択します。
      5. [Nucleus]というラベルの横にあるセルをクリックし、ポップアップ ウィンドウで下にスクロールして13Cを選択します。
      6. 次に、次のパラメータを設定します: SF = 8 MHz、SW = 1000000、BS = 652、FLTR = 50000。
      7. [Conf]タブを選択します。
      8. 次のパラメーターを設定します: PW90 はステップ 2.1.10 で見つかった値と等しくなります, RINH = 25, ACQD = 25.
      9. パルスサブタブを選択し、PW = 5を設定します。
      10. nDimサブタブを選択し、NBLK = 100 を設定します。
      11. データ取得を開始するために、過偏光ソリューションを受け取る準備をしばらく待ちます。
      12. リラクサメータにサンプルを挿入する直前に、手動でコンソールからパルスシーケンスを開始し、サンプルがヌル磁場に挿入されないようにします。このため、データ分析中に最初のフリー誘導減衰 (FID) を無視することが重要です。
      13. 取得が完了したら、[保存]ボタンをクリックしてデータを保存します。
    3. 分析ソフトウェアを使用して、各FID信号の大きさを統合し、時間の関数としてサンプル磁化で構成されるデータ系列を生成します。
    4. 商用分析ソフトウェアに実装された標準的な非線形最小二乗フィッティングアルゴリズムを使用して、3パラメータ指数モデルからスピンラティス緩和時間を抽出します(材料の表を参照)。すべてのデータ:
      Equation 1
      ここで Aは初期信号振幅(y-intercept)であり、T1はスピン ラティス緩和時間であり、T Rは既知の値である繰り返し時間であり、y 0はシグナルです。オフセット、およびcos(n-1)(α)は、フリップ角、αのn番目の測定における縦方向磁化の損失に対する補正である。

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Representative Results

図2は、ピルビン酸に対する高解像度フルレンジマイクロ波スイープの例を示す。提示された場合、最適なマイクロ波周波数は94.128 GHzに対応し、図インサートで強調表示されている。当社のDNPシステムは、通常、1MHzのステップサイズ、最大600sの偏光時間、および最大100mWの電力で93.750 GHzから94.241 GHzの範囲で動作することができます。周波数の全範囲は、新しい基板に対してのみ調査されます。しかし、13C-ピルビン酸のこれまでの経験に基づいて、最適な周波数は約94.127 GHzであると予想されます。したがって、94.117 GHz から 94.137 GHz のスキャン範囲は、ステップ サイズが 1 MHz で、サンプリング時間が 50 mW の場合は 300 s が通常使用されます。

図3の左の列は、パルスを決定するために直線的に変化するRFパルス持続時間の関数として一連の信号測定を獲得することを含む[1-13 C]ピルビン酸の先端角度キャリブレーションの結果を示しています。13C核のための90°および180°のフリップ角度に対応する幅。最大振幅を提供するパルス幅は90°のフリップ角度に対応し、ゼロ交差は180°のフリップ角度に対応しています。2 つのパルス幅の関係は 2 の係数にする必要があります。

上記の13C先端角度キャリブレーションの取得パラメータは、フィールドサイクルリラクソメーターの送信電力、サンプルのT1、およびシステムのノイズ特性に応じて、いくつかの調整を必要とする場合があります。刺激されたエコー、アンプ飽和度、SNRの不良の影響を受けずに、90°と180°を適切に見つけるには、いくつかの試行錯誤が必要な場合があります。

この手順は、正確ではあるが、熱偏光13C化合物の貧弱なSNRは多くの平均を必要とするので、通常は時間がかかる。別の、より速い方法は、ガドリニウムドープ1Hファントムでフリップ角をキャリブレーションし、90°RFパルスの持続時間を13Cに拡大し、90°-1HRFパルスの持続時間を比比比べて、1H/13 Cのジャイロ磁気比は3.976の係数に相当する。この場合、標準取得パラメータは EXP = 角度である必要があります。FFC、 NUC = 1H、TPOL = 0.1 s、BPOL = 30 MHz、 SWT = 0.005, BINI = 0 μs, ベンド = 15.5 μs, NBLK = 32, MS = 1, RFA = 25, RD = 0.1 秒, BS = 652, SW = 1 MHz, FLTR = 100 KHz, SF = 8, RINH = 25, ACQD = 25, EW12、および EWEB = 32。この代替方法の結果は、図 3 の右側の列に示されています。比較として、提示された症例では、13Cの先端角度キャリブレーションの合計取得時間は13.5分であったのに対し、1Hは7.1秒であった。

図 5は、過偏光磁化がサンプリングされる一般的な一連の減衰 FID を示しています。所定のBRLXにおける各T1測定は、DNP装置から別個の過分極溶解である。この特定のケースでは、リラクゼーションフィールド(BRelax)は0.2916 mTで、繰り返し時間は3.4s、フリップ角度は5°でした。すべてのサンプル温度を37°C(±0.5°C)に制御した。

図6は、前図のデータから得られた過偏光[1-13C]ピルビン酸の緩和曲線を示す。カーブ上の各青い点は、FID の下の領域を表します。T1値(53.9±0.6s)は、励起に使用されるフリップ角度の効果を含む減衰曲線データに対する信号方程式の非線形最小二乗適合によって得られた。適合度の良さは、データポイントの重み付けも想定して、R2値(0.9995)を計算することによって評価されました。継手残差(データフィット)は、開いている三角形として表示されます。

図 7は、37 °C (±0.5 °C) で 0.237 mT および 0.705 T の範囲で 26 回の測定値すべてに対するT1結果を表示します。T1は、すべての結果に対して±0.33sの平均フィッティング不確実性を持っていた。特定の緩和場で繰り返される測定値の散乱の分析は、1.91のT1で、上記の統計的不確実性よりも数倍大きい実験再現性を生み出した。2.24 sの不確実性は、上記で引用した2つの不確実性の合計として計算されたすべてのT1測定値に控えめに割り当てられました。T1-分散データは、経験式T1 = (3.74 ± 0.52) x log10(Bリラックス)+ (63.0 ± 1.2) s によってよく特徴付けられます。Bリラックスはテスラで測定されたリラクゼーションフィールドです。適合パラメータの不確実性は、1 つの標準偏差を表します。図 7の実線は、数式と 95% の信頼バンドを表す破線を表します。これらのサンプルのpHsは7.63から7.93の範囲で、平均pHは7.75、標準偏差は0.09でした。結果の分析では、C-1核の緩和時間は、地球の磁場(0.05 mT)で約46.9sであり、3Tで~65sと比較して、28%の減少を表す。

Figure 1
図 1: [1-13C]ピルビン酸分子。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2:最適な偏光周波数を示すフルレンジマイクロ波スイープとズームインセクション。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3 :13C(左)および1H(右)サンプルのための先端の角度の口径測定。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: フィールドサイクルパルス配列(HPUB/S)は、特定のリラクゼーション場(BRLX)における過偏分サンプルのT-リラクゼーション時間を測定する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: HPUB/Sパルス配列で得られたFIDの配列。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図 6:リラクゼーション信号(青い点)、カーブフィッティング(赤線)、およびFIDのシーケンスから得られるフィッティング誤差(開いた三角形)。図 5.この図は Chattergoon et al. 201334の許可を受けて変更されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: 低磁界における過偏分[1-13 C]ピルビン酸のNMRDプロファイル。この図は Chattergoon et al. 201334の許可を受けて変更されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

パラメーター 短い説明 コメント 単位
ACQD 取得の遅延 移行後およびデータ取得前に磁場が定常状態に達するために必要な遅延 Μ s
バッカ 取得フィールド 1H ラルモア周波数によって指定される Mhz
ベンド 終了値 配列パラメータの最終値
ビニ 初期値 配列パラメータの最初の値
Bpol 偏光フィールド 1H ラルモア周波数によって指定される Mhz
BRLX リラクゼーションフィールド 1H ラルモア周波数によって指定される Mhz
Bs ブロックサイズ 1 つのブロック内のデータ ポイントの数
Eウェブ 終了ブロック ブロック数 (NBLK) の範囲内の整数。0 は "all" を意味します。
エウェップ 終点 ブロック・サイズ (BS) の範囲内の整数。0 は "all" を意味します。
エウイブ 初期ブロック 1 からブロック数 (NBLK)
エウェップ 初期点 1 からブロック サイズ (BS) まで
Exp 実験 使用するパルス シーケンスの名前
フルー フィルタを観察する オーディオ信号フィルタのカットオフ周波数 Hz
さん 最大スキャン 平均の所望数
NBLK ブロック数 配列パラメーターのセクション数。配列パラメータは、「13CANGLE」と「ANGLE」パルスシーケンスの「PW90」、パルスシーケンスの「T1MX」です。PW90 は繰り返しごとに変更されますが、T1MX は一定のままです。
ヌーク 核 このプロトコル13C または1H の場合
Pw メイン RF パルス 先端角度 度 (°)
PW90 90デグパルス 90度パルスの持続時間 Μ s
路 リサイクル遅延 事前スキャン磁石冷却間隔 S
Rfa RF 減衰 RFレシーバ減衰 Db
リン 受信機阻害 RFコイル呼び出し音の減衰を可能にするために必要な遅延 Μ s
Sf システム周波数 取得時に使用されるラーモア周波数 Mhz
Sw スイープ幅 スペクトルウィンドウ幅(ナイキスト周波数) Hz
Swt 切り替え時間 グローバル磁石切り替え時間 S
T1MX 最大 T1 HPUB/S パルス シーケンスによって使用されるパラメータは、各繰り返しの偏光時間を定義します。 S
TPOL 偏光時間 各繰り返しの偏光時間を定義するために「ANGLE」と「13CANGLE」パルスシーケンスで使用されるパラメータ S

表 1: フィールド サイクリング リラクソメーターで使用されるパラメータの説明。

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Discussion

信号集録を強化するためにDNPを使用することは、動物注射に使用されるものと同様に、限られた濃度で13C核から利用可能な不十分な磁気共鳴信号に対する技術的な解決策であるが、他の実験的課題を提示する。図7に示す各緩和測定は、再測定のために溶解後に再偏光することができないため、独自に調製されたサンプルの測定値を表す。これは必然的に、サンプルの計量時のサンプル調製のわずかな違いによる実験的変動、またはサンプルの不完全な抽出やサンプルの徹底的な混合など、溶解プロセス自体の変動に起因する。溶解メディアと。この変動性は、弛緩測定後の各ピルビン酸溶液のpHを測定することによって部分的に評価されてもよい。DNP装置に挿入する前にストックピルビン酸/ラジカル混合物および溶解培地を慎重に計量してミリグラムよりも優れているにもかかわらず、我々の実験ではpHsは5.5から8.3の範囲であった。pH範囲7.6~8.0以外のT1データを拒否することを選択しました。

上述したように、各試料の固体偏光レベルは少なくとも95%であり、これは約1時間で得られた。液体状態の偏光は、各サンプルについて推定されなかった。しかしながら、DNPシステムの周期的な品質保証は、同じサンプル調製を用いて、約15%の液体状態偏光レベルをもたらした。

試料調製中に、金属イオン汚染は、溶解媒体とDNP溶解流体経路との接触から生じることがある。この可能性は、金属イオン汚染のいずれかを隔離し、スピン格子緩和を維持するために、エチレン科ミンテトラセチン酸(EDTA)の添加を必要としました。

リファレンス28で使用されるシャトル方法と、このプロトコルで提示される高速フィールドサイクリングを比較すると、シャトル時間がリラクゼーション時間に比べて小さい場合にのみシャトル方式が可能であると言えます。それ以外の場合、シャトル時間中に経験される平均磁界は、大きな影響を及ぼす可能性があります。我々が使用した高速フィールドサイクリングリラクゼーションメーターを使用すると、ユーザーは3msまで低く行くことができるスイッチング時間を完全に制御できますが、過偏光基板の場合、アジアバティを維持し、偏光を破壊しないように遅い切り替え時間が必要です。ファイルされた遷移中のサンプル。私たちの経験では、過偏光13C-ピルビン酸の場合、50ミリ秒のスイッチング時間は偏光を維持しますが、100または200ミリ秒の切り替え時間を使用してより一貫した結果を観察しました。リラクゼーションフィールドへの取得とリラクゼーションフィールドへの戻りは、測定されたT1回と比較して無視でき、これらの測定に体系的な影響を及ぼしません。異なる磁場における異なる過極性基板のアジアバティシティの境界を確立するには、さらなる研究が必要であると考える。

2つの方法のもう一つの重要な違いは、シャトル方式では2mT~18.8T、フィールドサイクリングリラクソメーターでは0.237mT~0.705Tの磁場の範囲です。この点で、我々は2つの方法が互いに補完的であることがわかります。しかし、過分極化合物を用いた生体内研究では、最大3Tの磁場がより一般的です。

1mT未満の磁場強度では、周囲の物体からの浮遊磁場がリラクゼーション測定に体系的に影響を及ぼすと観察されました。これらのフィールドを排除するために、我々は、フィールドサイクリング磁石の周りにカスタム磁気シムを設計し、追加しました。これに対し、シャトル方式では、約2mTから0.2mTに磁場の急激な変化を生じるμ金属円筒シールドを使用しています。

サンプルの温度制御は、減衰曲線全体を捕捉するために300~510sを要する比較的長い取得時間のために重要でした。過分極溶液を分配する前にNMRチューブを予め温め、リラックスメトリー中に温めた温度調節(37°C)の空気をチューブ上に吹き付け、サンプル温度を維持しました。これは、測定中にサンプルが静止しているため、サンプルの温度を正確に制御できるため、シャトル方式上のフィールドサイクリングリラクソメーターの重要な利点です。

さらに、偏光器とリラクサメータ間の短い移動時間の間に、周囲温度と磁場へのサンプル暴露を制御することは実用的ではありませんでした。サンプルのT1は、既知の磁場とリラクソメーターによって制御される温度で測定されたため、輸送の影響は限られていました。輸送中の条件は、リラクソメーターで測定するために生き残る超分極の量にのみ影響を与えることができます。超偏光溶液をイメージング磁石またはリラクサモメーターに移すためのポータブル保持場磁石(10mT)を開発しました。しかし、この実験では、短い移動時間を考えると、その使用は価値はなかったが、より低い磁場でのT1-分散を有する他の超偏光液体に役立つ可能性がある。0.01 Tの保持フィールドは、輸送中にピルビン酸溶液のT1をほぼ18%増加させるだろう。しかし、8sの比較的短い転送時間では、これらの測定は、信号の2.3%の増加のみが観察されることを示唆しています。

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Disclosures

著者は開示を持っていません。

Acknowledgments

著者らは、オンタリオ州がん研究所、イメージング翻訳プログラム、カナダ自然科学工学研究評議会にこの研究に資金を提供してくれたことに感謝したいと思います。また、アルバート・チェン、GEヘルスケア、トロント、カナダ、ジャンニ・フェランテ、ステラーs.r.l.、イタリア、ウィリアム・マンダー、オックスフォード・インスツルメンツ、英国との有益な議論を認めるのも好きです。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[1-13C]Pyruvic Acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 677175
10mm NMR Tube Norell, Inc., Morganton NC, USA 1001-8
De-ionized water
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA E5134
HyperSense Dynamic Nuclear Polarizer Oxford Instruments, Abingdon, UK Includes the following: "DNP-NMR Polarizer" software used to control and monitor the whole DNP polarizer; "RINMR" used to monitor the solid state polarization levels; "HyperTerminal" used to communicate the DNP software with the RINMR software that monitors the solid state polarization level. Also includes the MQC bench top spectrometer to monitor the liquid state polarization in conjunction with it own RINMR software
MATLAB R2017b MathWorks, Natick, MA Include scripts for non-linear fitting of magnetization decay over time and T1 NMRD analysis of hyperpolarized pyruvic acid.
OX063 Triarylmethyl radical Oxford Instruments, Abingdon, UK
pH meter - SympHony VWR International, Mississauga, ON., Canada SB70P
ProHance Bracco Diagnostics Inc. Gadoteridol, Gd-HP-DO3A
Pure Ethanol (100% pure) Commercial Alcohols, Toronto, ON, Canada P016EAAN
Shim Coil Developed in-house
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA S7653
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA S8045 
SpinMaster FFC2000 1T C/DC Stelar s.r.l., Mede (PV) Italy Includes the software "AcqNMR" that is used to set experimental parameters, monitor the tuning and matching of the RF coil, loading different pulse sequences, calibrate flip angle, data acquisition and curve fitting, among other functions. Also includes a depth gauge, some weights and a depth stopper.
Trizma Pre-Set Crystals (pH 7.6) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA T7943

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References

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バイオエンジニアリング、問題151、ピルビン酸、スピン格子緩和、動的核偏光、フィールドサイクリングリラクゼーション、核磁気緩和分散(NMRD)、ハイパーポラライゼーション
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Kim, S., Martinez-Santiesteban, F., Scholl, T. J. Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate. J. Vis. Exp. (151), e59399, doi:10.3791/59399 (2019).

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