Summary
这种光吞噬杀灭方法用于比较吞噬免疫细胞根据不同的处理方法和条件对细菌做出反应和杀灭细菌的能力。传统上, 这种检测方法是评估针对视黄素细菌产生的抗体的效应功能的黄金标准。
Abstract
对宿主细菌定植的免疫反应的一个关键方面是吞噬。声嗜肺细胞杀伤试验 (OPKA) 是一种实验性方法, 其中吞噬细胞与细菌单位共同培养。免疫细胞会吞噬细胞, 以一种与互补有关的方式杀死细菌培养物。免疫介导的细胞杀伤效率取决于许多因素, 可以用来确定不同的细菌培养物在抵抗细胞死亡方面的比较。通过这种方式, 可以评估潜在的免疫疗法的有效性, 以适应特定的细菌菌株和/或血清型。在该协议中, 我们描述了一个简化的 OPKA, 利用基本的培养条件和细胞计数来确定细菌细胞的活力后, 共同培养的治疗条件和 HL-60 免疫细胞。该方法已成功地应用于多种肺炎球菌血清型、囊囊株和囊状菌株及其他细菌种类。该 OPKA 协议的优点是其简单、多功能 (因为此检测方法不限于作为视黄素的抗体处理), 以及最大限度地减少时间和试剂以评估基本实验组。
Introduction
光吞噬杀灭试验 (OPKA) 是将细菌结构或功能的改变与随后免疫反应和功能的变化联系起来的重要工具。因此, 它经常被用作一种补充检测方法, 以确定抗体治疗、候选疫苗、酶优化等基于免疫的疗效。虽然体内检测是确定细菌感染模型中有效清除或保护的必要条件, 但 OPKA 可用于评估细菌、免疫细胞和实验等最基本成分对细菌细胞死亡的免疫贡献治疗。以往的研究表明, opka 可以被修改和用于各种细菌和血清型, 包括肺炎链球菌1, 金黄色葡萄球菌 2, 铜绿假单胞菌3。此外, 这些优化的检测方法可用于评估不同的实验治疗方法, 包括酶使细菌更容易接触补充介导的免疫细胞4和抗体治疗以改善抗体的能力光圣化5。传统上, opka 检测已成功应用于基础和临床研究环境中, 作为由病原体特异性抗体6、7、8、9诱导的有力保护指标.
不同类型的免疫细胞可用于评估声超核细胞的杀伤。一个常用的吞噬种群是 HL-60 人白血病细胞系。该细胞系可作为培养中的灭活早幼粒细胞保存;然而, 他们可以通过不同的药物治疗区分成不同的激活状态10,11。用 N、n-二甲基甲酰胺处理 HL60 可将细胞系分化为具有较强吞噬活性的活化中性粒细胞11。虽然 HL-60 细胞已得到优化, 并经常用于这些吞噬检测 10, 其他原代多核白细胞可作为免疫臂的实验 12。
此外, 这些检测可以简化13或多路复用14 , 以查看要测试的细菌的多种抗生素耐药菌株。通过开发能够有效计算琼脂板15号单点细菌菌落形成单元 (Cfu) 的软件, 使多路复用方法更加可行.在这里, 我们描述了一种流线型的方法, 使用一种细菌菌株, hl-60 细胞, 小兔补充, 和血琼脂板。通过这种方法, 可以快速评估多种治疗方法, 以解决如何调节细菌感染的先天免疫反应的具体研究问题。
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Protocol
1. HL-60 细胞的培养、分化和验证
- 用 l-谷氨酰胺和50毫升热灭活的胎儿牛血清制备由500毫升 RPMI 组成的 HL-60 细胞培养培养基。不要添加抗生素, 因为这可能会影响 HL-60 细胞的分化。
- 为了 HL-60 细胞的繁殖/维持, 在37°c 和 5% co 2 的75厘米2通风瓶中, 在 hl-60 细胞培养基 10 毫升中培养 5 x 10 6 细胞.每3-4天通过一次细胞, 以保持最佳的细胞浓度。
请注意:细胞浓度不应超过 5x10 6/ll。 - 通过在 HL60 培养基中引用大约 1 x 10 6 cellsl, 将10% 的二甲基亚硫醚 (DMSO) 转化为1毫升低温管, 生成 HL-60 细胞的工作库.
请注意:工作库存可储存在-80°c。主库存应存放在-120°c。 - 通过在 HL-60 细胞培养基 15 ml 中培养 1.5 x 10 7 细胞, 在37°c 下使用 0.6% n, n-二甲基甲酰胺 (dmf), 在 opka之前3天的无菌过滤封盖中培养 5% CO 2, 从而分化 hl-60 细胞。
- 通过根据已建立的流式细胞仪协议 16、17测试活力和细胞表面标记, 验证 hl-60 细胞是否已成功分化, 并适合用于 opka 检测. 18,19。分化后, 收获 HL-60 细胞, 用荧光共轭抗体染色染色约 1 x 104细胞, 以发现 CD71、cd35、环素 v 和碘化物。
请注意:分化细胞应≥65% 的活性, ≥55% CD35+, ≤20% cd71+ , 通过建立的验证协议14 (图 1)。
2. OPKA 缓冲器和试剂的制备
- 将 42.5 mL 的不育1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 与 Ca2 +mL 2+、5毫升的热失活胎牛血清和0.1% 的不育明胶混合, 制备50毫升的无菌光化缓冲液 b (obb)。存放在4°C。
- 获得小兔补体, 并储存在-80°c。
- 获取或准备细菌培养板 (即 15 x 100 毫米2 5% 的羊的血琼脂板)。
3. 细菌库存样本的制备
- 获取要测试的细菌菌株的库存。
请注意:对于该协议, 使用血清型3 肺炎链球菌(wu2, 由 Moon Nahm 博士慷慨提供)。 - 在37°c 条件下, 在适当的肉汤中生长细菌菌株 (即 Tod-hewitt 肉汤 + 0.5% 酵母提取物, 用于此 WU2 菌株), 时间约为2-4小时。
请注意:在600纳米 (OD600) 的培养物的光学密度应在0.6 至0.8 之间。 - 通过离心在 6, 000 x克的情况下将细菌颗粒状, 每次 2分钟, 并在适当的肉汤中重新悬浮在 10-30 ml 15% 甘油中的细胞。将细菌培养物 (500μl/aliquot) 添加到无菌 1.5 mL 离心管中, 并储存在-80°c。
- 在37°c 的水浴中解冻一小瓶细菌。在无菌条件下, 将细菌细胞颗粒并重新悬浮在500Μl 的 OBB 中。
- 在 OBB 中制备不同的细菌库存稀释 (即10μl 无稀释, 10μl 为 1:10, 10μl 为1:10 等)。进行 OPKA 检测 (第4-6 节, 包括 Hl-60 补合培养), 如下所述, 使用未经处理的细菌库存的各种稀释。在 30°c (无 CO2) 下培养板材过夜。
请注意:Wu2 的温度为 30°C, 以防止过度生长;其他滤网/血清型在37°c 下生长最佳。 - 计数菌落的每一次稀释未经处理的细菌库存与 HL-60 细胞和补体共同培养。确定细菌的稀释产生最佳数量的可数菌落 (约 80-120个 Cfu 用于与 HL-60 细胞共同培养的未经处理的细菌)。请注意这种稀释为未来的 Opka 涉及这种细菌库存。
4. 细菌治疗和培养
- 解冻步骤3.3 中制备的一管细菌库存。颗粒细菌 (6, 000 x 克, 2分钟), 并在步骤3.6 确定的最佳稀释下重新悬浮 obb 中的细胞颗粒。
- 在圆底96孔细胞培养板中, 每口井的移液器10μl 的再悬浮细菌稀释。
- 在每个实验井中添加20Μl 适当的抗体或药物治疗, 一式两份。
请注意:在该方案中, 在小鼠体内产生的血清素特异性抗体作为治疗 x 添加, 并添加一种已知降解血清型3多糖胶囊的糖苷水解酶作为治疗 y (图 2)4,20。对于控制井, 请使用 1x PBS 或 OBB, 具体取决于用于处理井的缓冲液。 - 在室温下, 以大约90转/分的速度摇晃样品板1小时。根据所测试的处理的最佳温度或晃动条件调整这些条件。
5. hl-60 细菌共培养
- 通过将三天前 (见步骤 1.4) 用 DMF 处理的 HL-60 分化细胞制备 HL-60 细胞, 形成 15 mL 锥形管。将细胞颗粒 (500 x g, 3分钟), 丢弃上清液, 用至少10毫升的 1X pbs 清洗。
- 将被清洗的细胞颗粒 (500 x g, 3分钟), 丢弃上清液, 并重新悬浮 obb 中的细胞 (从 Obb 1 毫升开始, 并在细胞计数后调整为 1 x 10 7/ml 的最终浓度)。
- 添加小兔补体 (不育, 未稀释的小兔血清, 3-4周) 在 1: 5 最后卷。
请注意:HL-60 补体混合物的最终浓度应为 1x10 7/ll。如果测试补体依赖, 则可使用含有活性 HL-60 细胞并具有热灭活补体的第二种溶液 (补体可通过在 & gt;55 的水浴中孵育至少30分钟而灭活)。 - 在1小时细菌培养完成后 (步骤 4.4), 将每个样品 (即每个30μl 样品中的 10μl, 很好地分为两组的重复井) 分为两组 (即只使用20Μl 的原始30Μl 共培养, 以考虑移液错误): 一套将与 HL-60 补体共同培养, 一套将只包括细菌。在每一组试验井 (授权 + hl-60) 中加入50μl 的 Hl-60 补体混合物 (从步骤 5.3);仅在细菌井中添加 50μl OBB (委派的 HL-60)。
请注意:在本例中, 大约800个细菌 Cfu 用于初始共培养 5x 105/50ΜL Hl-60 细胞。如果这种感染的多样性过高或过低, 如最终菌落数所示, 请调整最初的细菌稀释, 而不是 HL-60 细胞计数。 - 在37°c 下摇晃96孔板 1小时 (无 CO2)。
6. 样品电镀和隔夜孵化
- 用 OBB 稀释每个井 1: 5, 使每个样品的体积至少为50Μl。
- 将每个样品的移液器50μl 直接放到细菌培养板的指定区域, 确保样品之间有足够的间距。对于 15 x 100 毫米2圆形琼脂板, 将大约4个样品移入一个板。
- 盖上盖子, 使样品在室温下干燥约15分钟。
- 在 30°c (无 CO2) 下连夜反转板材和培养。或者, 在厌氧罐中培养板材, 以测试缺氧条件是否影响细菌生长或控制形态。
- 经过一夜的培养, 计算每个指定样本区域的殖民地。通过将每组活细胞的数量与不接受 hl-60 细胞共培养的相应对照和样本进行比较来分析数据 (表明100% 细胞存活, 0% 细胞死亡)。
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Representative Results
在启动 OPKA 之前, 应进行 HL-60 分化的验证。这可以通过流式细胞仪来确定 CD11b、CD35、CD71 和附件素 v 的细胞外表达 (图 1)。碘化钾也可作为一种生存能力的标记。用 DMF 治疗3天后, CD35 的表达应增加 (≥55% 的所有细胞), CD71 的表达应减少 (≤20% 的所有细胞)。环素 V + 和碘化丙酯 (PI +) 细胞的百分比应为 & lt;35, 以确保足够的细胞活力。如果这些百分比不符合最低要求, 则应按讨论中的说明调整培养条件。
从6.5 步获得的 Cfu 数量可用于比较不同组与未经治疗的对照组 (100% 细胞存活率) 的细菌细胞存活情况, 如图 2所示。例如, 从没有接受治疗但与 HL-60 共同培养的水井获得的平均数量应与没有接受 HL-60 治疗和共培养的细胞数量相对接近, 这将表明细胞存活率为 100%, 即0细胞死亡的百分比。有效治疗后, HL-60 共培养和无 HL-60 细胞之间的菌落数量应更加不同 (图 2和图 3)。HL-60 和无 HL-60 组之间较大的差异表明更有效的吞噬能力。然而, 这种治疗方法实际上可能会改善不与 HL-60 细胞共同培养的集合中的细菌细胞生长。应注意到经过处理的样品和未经处理的样品之间的这种差异。如果细菌稀释未得到优化 (步骤 3.6) 或电镀后未仔细观察菌落生长 (步骤6.5 或见讨论), 则菌落的过度生长可能会妨碍对菌落的准确计数 (图 4)。
图 1: 通过流式细胞仪验证 HL-60 细胞分化。在 1 x10 5细胞 pbs 中采集、清洗和再悬浮分化的 hl-60 细胞。然后将细胞加入96孔板中的12口井 (100μl/井)。然后用荧光共轭抗 CD35、抗 CD71、附件素 v 和碘化丙酯染色细胞。未染色的细胞或用荧光共轭同型抗体染色的细胞作为对照。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 治疗 y 可改善 HL-60 介导的细胞对细菌的杀灭。用治疗 x (抗体) 或治疗 y (酶) 治疗肺炎杆菌样品。根据该协议进行了 OPKA 手术, 并对细菌 Cfu 进行了一式两份的计算。未使用 HL-60 细胞处理的样品被用作对照 (100% 细胞存活率)。显示的是 HL-60 治疗组细菌 Cfu 与相应的非 hl-60 治疗组的平均百分比。条形图表示标准错误。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 在 OPKA 和隔夜培养后的细菌 Cfu.细菌样本在37°c 时, 在没有 (a) 或 (b) Hl-60 细胞的情况下进行了1小时的处理和共培养。根据协议对样品进行稀释, 并在 30°c (无二氧化碳)下连夜在血琼脂板上电镀。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 细菌 CFU 过度生长.对细菌样本进行了处理, 并进行了 OPKA。样品在 37°c (无二氧化碳)下被稀释并在血琼脂板上进行了隔夜电镀。由于显示了群体的过度生长, 无法确定对菌落数量的准确评估。由于 37°c (无 CO 2) 导致细菌过度生长, 未来板材的孵化温度降低到 30°c (无 co2), 以保持菌落的可计数性。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
Opka 在评估疫苗6,8引起的抗体介导的免疫反应中发挥着至关重要的作用。这种简化的 OPKA 的主要意义是在需要测试的条件 (即抗体、酶处理等) 中的适应性。从这个意义上说, 虽然这种检测方法可以用来测试视黄素 (即抗体) 在吞噬中的贡献, 但也可以用来评估如何克服通常抑制吞噬途径的毒力因素 (即胶囊多糖)。最大限度地减少多路复用 OPKA 中通常使用的步骤数, 可能会最大限度地减少出现可能影响实验结果的技术错误的机会, 并减少用于获取可用数据的故障排除和优化量。由于该协议适用于处理条件的变化, 因此可以实现很大的多功能性。
通过 HL-60 培养和建立细菌储备来预先建立检测方法, 对于防止在执行 OPKA 时采取无关的优化步骤具有重要意义。在进行实验之前, 必须投入时间来确保所有试剂和细胞类型都准备好并正常工作。这些步骤包括在培养中繁殖 hl-60 细胞系 (约两周), 验证 DMF 的特定浓度有效区分 hl-60 细胞 (约一周), 以及建立无污染和优化的细菌种群稀释 (约两周)。
该协议的某些步骤对于获得可计数的菌落和足够的数据至关重要。该协议使用 HL-60 细胞作为吞噬细胞, 因为很容易使用人类细胞系, 可以在培养中保持和区分, 而步骤相对较少。也可使用人外周血单个核细胞 (Pbmc);然而, 获得这些细胞并优化其使用的条件可能更具挑战性。HL-60 细胞必须分化, 才能起到对抗细菌的吞噬细胞的作用。为了验证 DMF 3天治疗后的分化情况, 应使用流式细胞术在尝试任何 OPKA 之前检测大多数细胞的 CD11b 和 CD35 的表达, 如步骤1.5 中所述。细胞活力也应得到验证 (最好用环素 V 和碘化丙酯染色)。如果流式细胞术观察到大量细胞死亡、凋亡或未分化, RPMI 培养基中 DMF 为0.6% 的3天分化可以修改 (0.4%-0.8% DMF, 2-6 天培养时间), 直到细胞活力和分化标记物被分化改进。这种分化应该是 OPKA 的第一个优化, 因为 HL-60 函数是有效的细菌杀灭的关键。我们建议在每次 OPKA 实验之前验证 HL-60 分化。
最初分配到96孔板中的细菌 Cfu (步骤 3.6) 的数量也很关键: 分配过多的细胞会使计数变得困难和不准确 (步骤 6.5), 并可能减少从 HL-60 共培养中观察到的细胞死亡, 而配药细胞过少可能会增加重复物之间的偏差量, HL-60 共培养后可能不会出现任何可计数的菌落。因此, 优化库存稀释是至关重要的, 必须使用完整协议进行测试, 包括 Hl-60 补体共培养。
补充的重要性也可以通过包括两套样本来测试: 一组是有活性的婴儿兔子补体, 另一组是热灭活补体。Hl-60 细胞应与这两组同时培养, 但仅细菌集仍应作为100% 细胞存活基线包括在内。
对于某些细菌血清型, 菌落的形态可能会使细胞计数或可见性出现问题。例如, 3 型肺炎链球菌等粘液血清型很容易过度生长, 减少 cfu 的计数。在测试影响胶囊的治疗方法时, 这可能会被证明是特别有问题的, 因为在治疗组可以防止过度生长, 但会计算出更多的小群体。为了防止这种差异, 控制细胞生长至关重要。在30°c 的温度下培养镀层菌落, 可能会改善对细菌生长的监测, 当所有菌落达到可区分的可数大小时, 可以去除这些板。此外, 不同的琼脂板可以用来提高个别菌落的能见度。这样, 这种协议是有利的, 因为优化条件的小变化可以用来解释一些细菌株或各种治疗方案。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢穆恩·纳姆博士 (伯明翰阿拉巴马大学) 在我们的实验室建立 OPKA 检测方面提供的宝贵协助。这项工作得到了国家卫生研究院1R1AI123383-01A1 至 FYA 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
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