Summary
Denne opsonophagocytic drepe analysen brukes til å sammenligne evne til phagocytic immunceller svare og drepe bakterier basert på ulike behandlinger og/eller betingelser. Klassisk, fungerer denne analysen som gullstandarden for vurdering funksjoner effektor av antistoffer reist mot en bakterie som opsonin.
Abstract
En viktig del av immunforsvaret til bakteriell kolonisering av verten er fagocytose. Opsonophagocytic drepe analysen (OPKA) er en eksperimentell prosedyre der phagocytic cellene er co kulturperler med bakteriell enheter. Immunceller vil phagocytose og dreper bakteriekulturer i en komplement-avhengige måte. Effektiviteten av immun-mediert celle drapet er avhengig av flere faktorer og kan brukes til å bestemme hvordan ulike bakteriell kulturer sammenligne med hensyn til motstand mot celledød. På denne måten kan effekten av potensielle immun-baserte therapeutics vurderes mot spesifikke bakteriell stammer og/eller serotyper. I denne protokollen beskriver vi en forenklet OPKA som benytter grunnleggende oppdrettsforholdene og celle teller for å fastslå bakteriell celle levedyktighet etter co kultur med behandling betingelser og HL-60 immunceller. Denne metoden har blitt vellykket utnyttet med en rekke forskjellige pneumokokk serotyper, capsular og acapsular stammer, og andre bakterie-art. Fordelene med denne OPKA protokollen er dens enkelhet, allsidighet (som denne analysen ikke er begrenset til antistoff behandlinger som opsonins), og minimering av tid og reagenser å vurdere eksperimentelle standardgrupper.
Introduction
Opsonophagocytic drepe analysen (OPKA) er et kritisk verktøy for å koble endringer i bakteriell strukturen eller funksjon til etterfølgende endringer i immunforsvaret og funksjon. Som sådan, er det ofte brukt som en komplementær analysen for å bestemme immun-baserte effekten av antistoff behandlinger, vaksine kandidater, enzym optimalisering, etc. Mens i vivo analyser er nødvendig for å bestemme effektiv klarering eller beskyttelse i en bakteriell infeksjon modell, OPKA kan brukes til å vurdere immun bidrag til bakteriell celledød på de grunnleggende komponentene: bakterier, immunceller, og eksperimentelle behandlinger. Tidligere studier har vist at OPKAs kan endres og brukes til en rekke bakterier og serotyper, inkludert Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Videre kan disse optimalisert analyser brukes til å vurdere ulike eksperimentelle behandlinger, inkludert muligheten for et enzym å gjøre bakterien mer tilgjengelig for komplement-mediert immunceller4 og antistoff behandlinger for å forbedre opsonization5. Tradisjonelt OPKA analysen har blitt brukt i grunnleggende og klinisk forskning som en mektig indikator for beskyttelse indusert av patogen-spesifikke antistoffer6,7,8,9 .
Ulike immunceller kan brukes for vurdering av opsonophagocytic drap. En brukte phagocytic befolkningen er HL-60 human leukemic celle linjen. Denne cellen linjen kan holdes som deaktivert promyelocytes i kultur; Imidlertid kan de differensieres i ulike aktivert stater via ulike behandlinger10,11. Behandling av HL60 n, N-vannistedenfor skiller celle linjen i aktivert nøytrofile med sterke phagocytic aktivitet11. Mens HL-60 celler er optimalisert og brukes ofte for disse fagocytose analyser10, kan andre primære polymorfonukleære leukocytter brukes som immun armen av eksperimentet12.
I tillegg disse analyser kan være forenklet13 eller multiplekset14 å se på flere antibiotika-resistente stammer av bakterier skal testes. Metoden multiplex er gjort mer mulig gjennom utvikling av programvare som kan effektivt telle bakterie kolonien danner enheter (CFUs) per plass på en agar plate15. Her beskriver vi en strømlinjeformet metode som bruker en bakteriell stamme, HL-60 celler, baby kaninen supplement og blod agar plater. Med denne metoden kan flere behandlinger vurderes raskt for å løse spesifikke problemstillinger på hvordan medfødte immunforsvaret til bakteriell infeksjon kan være modulert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kultur, differensiering, og validering av HL-60 celler
- Forberede HL-60 celle kultur medier består av 500 mL RPMI med L-glutamin og 50 mL inaktivert fosterets bovin serum. Ikke Legg antibiotika som dette kan påvirke differensiering av HL-60 cellene.
- Overføring/vedlikehold av HL-60 celler, kultur 5 x 106 celler i 10 mL av HL-60 celle kultur medier i 75 cm2 luftet kolber på 37 ° C og 5% CO2. Passasjen cellene hver 3−4 dager for å opprettholde optimal celle konsentrasjoner.
Merk: Cellen konsentrasjonen bør ikke overstige 5 x 106/mL. - Generere arbeider aksjer HL-60 celler ved aliquoting ca 1 x 106 celler/mL i HL60 kultur medier med 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) i 1 mL kryogene rør.
Merk: Arbeider aksjer kan lagres på-80 ° C. Master aksjen skal lagres på-120 ° C. - Skille HL-60 celler av dyrking 1,5 x 107 celler i 15 mL HL-60 celle kultur medier med 0,6% N, N-vannistedenfor (DMF) på 37 ° C og 5% CO2 i sterilt filter-capped 75 cm2 flasker i 3 dager før OPKA.
- Validere at HL-60 cellene har vært vellykket differensiert og er egnet for bruk på OPKA analysen ved å teste levedyktighet og celle overflate markører i henhold til etablerte flyt cytometri protokoller16,17, 18,19. Etter differensiering, høste HL-60 celler og flekken ca 1 x 104 celler med fluorescently-konjugerte antistoffer/flekker for CD71, CD35, annexin V og propidium iodide.
Merk: Differensierte celler skal ≥65 levedyktig, ≥55% CD35+, og ≤20% CD71+ som gjennom etablert validering protokoller14 (figur 1).
2. forberedelse av OPKA buffere og reagenser
- Forberede 50 mL steril opsonization buffer B (OBB) ved å blande 42,5 mL steril 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) med Ca2 +/Mg2 +5 mL av inaktivert fosterets bovin serum og 2,5 mL 0,1% sterilt gelatin. Butikken på 4 ° C.
- Få baby kaninen supplement og lagre på-80 ° C.
- Få eller forberede bakteriell kultur plater (dvs. 15 x 100 mm2 5% sau blod agar plater).
3. forberedelse av bakteriell lager prøver
- Få et lager av bakteriell strain(s) skal testes.
Merk: For denne protokollen, serotype 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, sjenerøst gitt av Dr. Moon Nahm) brukes. - Vokse bakterielle belastningen i en passende kjøttkraft (dvs. Todd-Hewitt kjøttkraft + 0,5% gjærekstrakt for denne WU2 stamme) for ca 2−4 h på 37 ° C.
Merk: Optisk densitet ved 600 nm (OD600) av kultur bør være mellom 0,6 og 0,8. - Pellets bakterier med sentrifugering 6000 x g i 2 minutter og resuspend cellene i 10−30 mL 15% glyserol i riktig buljong. Aliquot bakteriell kultur (500 µL per aliquot) til bakteriefri 1.5 mL sentrifuge rør og butikk på-80 ° C.
- Thaw ut en flaske av bakteriell aksjer i et 37 ° C vannbad. Pellets bakterieceller og resuspend i 500 µL av OBB under sterile forhold.
- Klargjør ulike fortynninger av bakteriell bestanden i OBB (dvs. 10 µL av ingen utvanning, 10 µL av 1:10, 10 µL av 1: 100, etc.). Utføre OPKA analysen (seksjoner 4 – 6: inkludert HL-60/komplement co kultur) som beskrevet nedenfor bruker ulike fortynninger av Ubehandlet bakterielle aksjen. Kultur platene overnatting på 30 ° C (ingen CO2).
Merk: Temperaturen 30 ° C er spesifikk for WU2 å hindre overvekst; andre stammer/serotyper kan vokse optimalt på 37 ° C. - Telle koloniene for hver fortynning av Ubehandlet bakterielle lager co kultivert HL-60 celler og supplement. Bestemme hvilke fortynning av bakterier gir det optimale antallet countable kolonier (ca 80−120 CFUs for ubehandlede bakterier co kultivert med HL-60 celler). Merk dette fortynning for fremtidige OPKAs som involverer dette bakteriell lager.
4. bakteriell behandling og kultur
- Tine en tube av bakteriell lager i trinn 3.3. Pellets bakterier (6000 x g i 2 minutter) og resuspend celle pellet i OBB på optimal fortynning som bestemmes i trinn 3.6.
- Pipetter 10 µL av resuspended bakteriell fortynning per brønn i en runde bunn 96-brønns celle kultur plate.
- Legge til 20 µL av riktig antistoff eller narkotika behandling i alle eksperimentelle brønnene i duplikat.
Merk: I denne protokollen, legges en serotype-spesifikke antistoffer generert i mus som behandling X og en glycoside hydrolase enzym kjent for å svekke serotype 3 polysakkarid kapsel legges som behandling Y (figur 2)4,20. Kontroll brønner, bruke 1 x PBS eller OBB, avhengig av bufferen behandling brønner. - Riste eksempel platen på ca 90 rpm 1t ved romtemperatur. Juster disse forholdene avhengig av optimal temperatur eller risting forhold behandlinger blir testet.
5. HL-60 bakteriell co kultur
- Klargjør HL-60 celler ved høsting HL-60 differensiert cellene behandles med DMF tre dager før (se trinn 1.4) til 15 mL konisk rør. Pellets cellene (500 x g, 3 min), forkaste nedbryting og vask med minst 10 mL 1 x PBS.
- Pellets vasket cellene (500 x g, 3 min), forkaste nedbryting og resuspend cellene i OBB (starter med 1 mL OBB og justere for en siste konsentrasjon av 1 x 107/mL etter celle teller).
- Legge til baby kaninen supplement (sterilt, ufortynnet baby kaninen serum, alder 3−4 uker) med 1:5 siste volum.
Merk: Siste konsentrasjonen av HL-60-komplement blandingen skal 1 x 107/mL. Hvis du tester supplement avhengighet, en andre løsning som inneholder aktive HL-60 celler med inaktivert supplement kan brukes (supplement kan deaktiveres ved rugende i et vannbad på > 55 ° C i minst 30 min). - Etter 1 h bakteriell kultur er fullført (trinn 4.4), dele hver prøve (dvs. 10 µL av hvert 30 µL utvalg godt inn to nye brønner) i like brønner for to grupper (dvs. Bruk bare 20 µL av opprinnelige 30 µL co kultur kontoen for pipettering feil) : ett sett blir co kulturperler med HL-60-komplement og en vil inneholde bakterier bare. Legge til 50 µL av HL-60-komplement blandingen (fra trinn 5.3) til hver eksperimentelle sett brønner (delegert + HL-60); legge til 50 µL av OBB alene i brønnene bakterier bare (delegert -HL-60).
Merk: I dette eksemplet brukes ca 800 bakteriell CFUs første co kulturen med 5 x 105/50 µL HL-60 celler. Hvis dette mangfoldet av infeksjon er for høyt eller for lavt som indikert av siste koloni tall, justere den første bakterielle fortynning i motsetning til celletall HL-60. - Riste 96-brønns platen ved 37 ° C i 1 time (ingen CO2).
6. prøve Plating og overnatting inkubasjon
- Fortynn hver vel 1:5 med OBB, slik at hvert utvalg har et volum på minst 50 µL.
- Pipetter 50 µL av hver prøve direkte på et angitt område i en bakteriell kultur plate, sikrer tilstrekkelig avstanden mellom eksempler. For 15 x 100 mm runde2 agar plater, Pipetter ca 4 eksempler på en plate.
- Dekk og la prøver å tørke i ca 15 min ved romtemperatur.
- Invertere plater og kultur overnatting på 30 ° C (ingen CO2). Alternativt kultur plater i anaerob glass for å teste om anoksisk forhold påvirker bakteriell vekst eller kontroll for morfologi.
- Etter natten kultur, telle koloniene i hver angitt område. Analysere data ved å sammenligne antall levende celler i hvert sett til tilsvarende kontroll og/eller prøver som ikke mottar HL-60 cellekultur co (indikativ av 100% celle overlevelse, 0% celle drepe).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering av HL-60 differensiering skal utføres før OPKA. Dette kan oppnås ved å bruke flowcytometri til å bestemme den ekstracellulære uttrykket for CD11b, CD35, CD71 og annexin V (figur 1). Propidium iodide kan også brukes som en levedyktighet markør. Etter behandling med DMF for 3 dager, uttrykk for CD35 bør økes (≥55% av alle celler) og uttrykk for CD71 bør reduseres (≤20% av alle celler). Andelen annexin V + og propidium iodide (PI +) celler sammen skal < 35% å sikre tilstrekkelig celle levedyktighet. Hvis disse andelene ikke oppfyller minimumskravene, bør oppdrettsforholdene justeres som beskrevet i diskusjonen.
Antall CFUs fra trinn 6.5 kan brukes til å sammenligne bakteriell celle overlevelse av ulike forhold til ubehandlet kontrollgruppen (100% celle overlevelse) som vist i figur 2. For eksempel bør gjennomsnittlig teller fra brønner som fikk ingen behandling, men ble co kulturperler med HL-60 være relativt nær i antall celler som fikk ingen behandling og ingen co kultur HL-60, som kan være indikasjon på 100% celle overlevelse eller 0 % celledød. Med en effektiv behandling skal antall kolonier flere forskjellige mellom HL-60 co kultur og ingen HL-60 celler (figur 2 og Figur 3). Større forskjeller mellom HL-60 og ingen HL-60-sett er tegn på mer effektiv fagocytose. Men kan behandling faktisk forbedre bakteriell cellevekst i settet som ikke er co kulturperler med HL-60 celler. Denne forskjellen i behandlet og ubehandlet prøver bør bemerkes. Hvis bakterielle fortynning ikke optimalisert (trinn 3.6) eller koloni veksten er ikke nøye observert etter plating (trinn 6.5 eller se diskusjon), overvekst av koloniene kan hindre nøyaktig telling av kolonier (Figur 4).
Figur 1 : Validering av HL-60 celledifferensiering via flowcytometri. Differensierte HL-60 celler ble høstet, vasket og resuspended i 1 x 105 celler/mL PBS. Celler var da aliquoted i 12 brønner (100 µL/vel) i en 96-brønns plate. Cellene ble deretter farget med fluorescently konjugert anti-CD35, anti-CD71, annexin V og propidium iodide. Unstained kvinne celler eller celler med fluorescently konjugert isotype antistoffer ble brukt som kontroller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Behandling Y forbedrer HL-60-mediert celle drepe bakterier. S. pneumoniae prøver ble behandlet med behandling X (antistoffer) eller behandling Y (enzym). OPKA ble utført i henhold til protokollen og bakteriell CFUs ble regnet i duplikat. Prøver som ikke ble behandlet med HL-60 celler ble brukt som en kontroll (100% celle overlevelse). Vises gjennomsnittlig prosenter av bakteriell CFUs i HL-60 behandlet grupper sammenlignet med tilsvarende ikke-HL-60-behandlet gruppene. Stolper representerer standardfeil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Bakteriell CFUs etter OPKA og natten kultur. Bakteriell prøver ble behandlet og co kultivert uten (A) eller (B) HL-60 cellene 1t på 37 ° C. Prøvene ble utvannet i henhold til protokollen og tallerken på blodet agar plater overnatting på 30 ° C (ingen CO2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Bakteriell CFU overvekst. Bakteriell prøver ble behandlet og OPKA ble utført. Prøvene ble utvannet og tallerken på blodet agar plater overnatting på 37 ° C (ingen CO2). Kan ikke fastsette nøyaktig vurdering av kolonien tall som overvekst av koloniene er vist. 37 ° C (ingen CO2) ledet til bakteriell overgrowth, inkubasjon temperaturen for fremtidige platene ble senket til 30 ° C (ingen CO2) å opprettholde countability koloniene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OPKAs tjene viktige roller i å vurdere antistoff mediert immunreaksjoner indusert av vaksiner6,8. Viktigste betydningen av dette forenklet OPKA er tilpasningsevne i forhold til testes (dvs. antistoffer, enzym behandlinger, etc.). I denne forstand, mens denne analysen kan brukes til å teste bidrag av opsonins (dvs. antistoffer) i fagocytose, kan det også brukes til å vurdere måter å overvinne virulens faktorer (dvs. capsular polysakkarider) som normalt hemme phagocytic trasé. Redusere antall trinn som vanligvis brukes i en multiplex OPKA potensielt minimerer sjansen for tekniske feil som kan påvirke de eksperimentelle resultatene og reduserer feilsøking og optimalisering for å få brukbare data. Denne protokollen er egnet til variasjoner behandling forhold, gir det mye allsidighet.
Før etablering analysen gjennom kultur HL-60 og etablering av bakteriell aksjer er viktig å unngå overflødig optimering skritt når OPKA. Tid må være dedikert til å sørge for reagenser og celletyper er klar og funksjonelle før eksperimentet utføres. Disse trinnene omfatter spre HL-60 celle linjen i kultur (ca to uker), validere at bestemte konsentrasjoner av DMF effektivt skille HL-60 cellene (ca en uke) og etablere forurensning-fri og optimalisert bakteriell lager fortynninger (ca to uker).
Noen trinn i denne protokollen er kritiske countable kolonier og tilstrekkelig data. Denne protokollen bruker HL-60 celler som phagocytes på grunn av enkelt å bruke en human celle linje som kan opprettholdes i kultur og differensiert med relativt få skritt. Menneskelige perifert blod mononukleære celler (PBMCs) kan også brukes; men kan å få disse cellene og optimalisere vilkårene for bruken være mer utfordrende. HL-60 cellene må differensieres for å fungere som phagocytes mot bakterier. For å bekrefte differensiering etter 3 dagers behandling med DMF, skal flowcytometri brukes til å teste uttrykk for CD11b og CD35 på et flertall av cellene før alle OPKA er forsøkt, som omtalt i trinn 1.5. Cellen levedyktighet bør også bekreftes (fortrinnsvis med annexin V og propidium iodide flekker). Hvis et stort antall celler er døde, apoptotisk, eller udifferensierte observert med flowcytometri, 3 dagers differensiering med 0,6% DMF i RPMI medier kan endres (0,4% −0. 8% DMF, 2−6 dag kultur tid) til celle levedyktighet og differensiering markører er forbedret. Denne differensieringen bør være første optimalisering av OPKA som HL-60 funksjonen er avgjørende for effektiv bakteriell drepe. Vi anbefaler validere HL-60 differensiering før hver OPKA eksperiment.
Bakteriell CFUs (trinn 3.6) først utlevert i 96-brønnen platen (trinn 4.2) er også kritisk: utlevering for mange celler gjør opptelling vanskelig og unøyaktig (trinn 6.5) og kan redusere celledød fra HL-60 co kultur, mens dispensing for noen celler kan øke mengden av avvik mellom duplikater og kan ikke vise countable kolonier etter HL-60 co kultur. Optimalisere lager fortynning er derfor kritisk, og må være testet med full protokollen, inkludert HL-60/komplement co kultur.
Betydningen av komplement kan også testes med denne protokollen ved inkludert to sett med eksempler: med aktive baby kaninen supplement og med inaktivert supplement. HL-60 celler skal co kulturperler med settene, men et bakterier-bare sett bør fortsatt være inkludert som en 100% celle overlevelse plan.
For noen bakteriell serotyper, kan morfologi av koloniene gjøre cellen teller eller synlighet problematisk. Mucoid serotyper som type 3 Streptococcus pneumoniae, for eksempel, enkelt overgrow og redusere CFU teller. Dette kan være spesielt problematisk når testing behandlinger som påvirker kapselen, som overvekst ville bli forhindret i gruppen behandlet, men større antall koloniene ville bli regnet. For å forhindre dette avviket, er kontroll av cellevekst kritiske. Dyrking belagt koloniene på 30 ° C over natten vil trolig tillate bedre overvåking av bakterievekst og platene kan fjernes når alle koloniene skilles, countable størrelser. I tillegg kan ulike agar plater brukes til å forbedre synligheten av enkelte koloniene. På denne måten er denne protokollen fordelaktig som små endringer å optimalisere forhold kan dermed brukes til kontoen for en rekke bakterielle stammer eller ulike behandlingsalternativer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) for hans uvurderlig hjelp i å etablere OPKA analyser i vårt laboratorium. Dette arbeidet ble støttet av nasjonale institutter for helse Grant 1R01AI123383-01A1 til FYA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
