Summary
Denna lägre dödande analys används för att jämföra förmågan hos fagocytos immunceller för att svara på och döda bakterier baserat på olika behandlingar och/eller villkor. Klassiskt, serverar denna analys som den gyllene standarden för att bedöma effektor funktioner av antikroppar mot en bakterie som opsonin.
Abstract
En viktig aspekt av immunsvaret mot bakteriell kolonisering av värden är fagocytos. Ett lägre dödande test (OPKA) är en experimentell förfarande där Fagocytos celler är samtidig odlade med bakteriell enheter. Immuncellerna kommer phagocytose och döda bakteriekulturerna i en Komplementberoende sätt. Effektiviteten i immunmedierade cell dödandet är beroende av ett antal faktorer och kan användas för att avgöra hur olika bakteriella kulturer jämföra när det gäller motstånd mot celldöd. På detta sätt kan effekten av potentiella immun-baserade therapeutics bedömas mot specifika bakteriestammar och/eller serotyper. I detta protokoll beskriver vi en förenklad OPKA som använder grundläggande odlingsbetingelser och cell inventering för att bestämma bakteriell cellernas viabilitet efter samtidig kultur med behandling villkor och HL-60 immunceller. Denna metod har använts framgångsrikt med ett antal olika pneumokock serotyper, kapsulära och acapsular stammar och andra bakteriearter. Fördelarna med detta OPKA protokoll är dess enkelhet, mångsidighet (som denna analys inte är begränsat till antikropp behandlingar som opsonins), och minimering av tid och reagenser till bedöma grundläggande experimentella grupper.
Introduction
Den lägre döda assay (OPKA) är ett kritiskt verktyg för att länka förändringar i bakteriell struktur eller funktion till efterföljande förändringar i immunförsvaret och funktion. Som sådan, används det ofta som en kompletterande analys för att bestämma immun-baserade effekten av antikropp behandlingar, vaccinkandidater, enzym optimering, etc. Medan Invivo analyser är nödvändigt att fastställa effektiva clearance eller skydd i en bakteriell infektion modell, OPKA kan användas för att bedöma immun bidrag till bakteriell celldöd på den mest grundläggande komponenter: bakterier, immunceller, och experimentella behandlingar. Tidigare studier har visat att OPKAs kan ändras och används för en mängd bakterier och serotyper, inklusive Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Dessutom kan dessa optimerade analyser användas för att bedöma olika experimentella behandlingar, inklusive möjligheten av ett enzym att göra bakterien mer tillgänglig för komplement-medierad immunceller4 och antikropp behandlingar för att förbättra Opsonization5. Klassiskt, OPKA assay har använts framgångsrikt i basal och klinisk forskning inställningar som en kraftfull indikator för skydd induceras av patogen-specifika antikroppar6,7,8,9 .
Olika typer av immunceller kan användas för bedömning av lägre dödande. En vanligt förekommande fagocytos befolkning är HL-60 mänsklig leukemic cell linjen. Denna cellinje kan hållas som inaktiverade promyelocyter i kultur; de kan dock skiljas in olika aktiverade staterna via olika läkemedel behandlingar10,11. Behandling av HL60 med N, N-dimetylformamid gör åtskillnad mellan den cellen fodrar in aktiverade neutrofiler med stark fagocytisk aktivitet11. HL-60 celler har optimerats och används ofta för dessa fagocytos analyser10, kan andra primära polymorfonukleära leukocyter användas som experiment12immun arm.
Dessutom dessa analyser kan vara förenklade13 eller multiplexed14 att titta på flera antibiotikaresistenta stammar av bakterier som ska testas. Metoden multiplexade har gjorts mer genomförbart genom utveckling av programvara som effektivt kan räkna bakteriell kolonibildande enheter (CFUs) per plats på en agar tallrik15. Här beskriver vi en strömlinjeformad metod där en bakteriestam, HL-60 celler, baby kanin komplement och blod agarplattor. Med den här metoden kan flera behandlingar bedömas snabbt för att lösa specifika forskningsfrågor på hur medfödda immunsvaret mot bakterieinfektion kan anpassas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kultur, differentiering och validering av HL-60 celler
- Förbereda HL-60 cell kulturmassmedia består av 500 mL RPMI med L-glutamin och 50 mL Värmeinaktiverade fetalt bovint serum. Lägg inte antibiotika eftersom detta kan påverka differentiering av HL-60 cellerna.
- För förökning/underhåll av HL-60 celler ventilerade kultur 5 x 106 celler i 10 mL av HL-60 cell kultur media i 75 cm2 kolvar på 37 ° C och 5% CO2. Passagen celler var 3,4 dagar för att upprätthålla optimal cell koncentrationer.
Obs: Cellkoncentrationen bör inte överstiga6/5 x 10 ml. - Generera fungerande lager av HL-60 celler genom alikvotering ca 1 x 106 celler/mL i HL60 kultur media med 10% dimetyl sulfoxid (DMSO) till 1 mL Kryogen rör.
Obs: Arbeta bestånd kan förvaras vid-80 ° C. Master beståndet ska förvaras vid-120 ° C. - Skilja mellan HL-60 celler genom odling 1,5 x 107 celler i 15 mL HL-60 cell kultur media med 0,6% N, N-dimetylformamid (DMF) vid 37 ° C och 5% CO2 i sterila filter-capped 75 cm2 kolvar i 3 dagar före OPKA.
- Validera att HL-60 cellerna har varit framgångsrikt differentierade och är lämpliga för användning i OPKA-analysen genom att testa livskraft och cell ytmarkörer enligt etablerade flöde flödescytometri protokoll16,17, 18,19. Efter differentiering, skörda HL-60 celler och fläcken ca 1 x 104 celler med fluorescently-konjugerade antikroppar/fläckar för CD71, CD35, annexin V och propidium jodid.
Obs: Differentierade celler bör vara ≥ 65% livskraftiga, ≥55% CD35+, och ≤20% CD71+ som bestämts genom etablerade validering protokoll14 (figur 1).
2. förberedelse av OPKA buffertar och reagenser
- Förbereda 50 mL steril opsonization buffert B (OBB) genom att blanda 42,5 mL steril 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med Ca2 +/Mg2 +5 mL Värmeinaktiverade fetalt bovint serum och 2,5 mL av 0,1% steril gelatin. Förvaras vid 4 ° C.
- Hämta baby kanin komplement och lagra vid-80 ° C.
- Skaffa eller förbereda bakterieodling plattor (dvs. 15 x 100 mm2 5% fårmjölk blodagar pläterar).
3. beredning av bakteriell lager prover
- Skaffa ett lager av bakteriell nomenklaturkod ska testas.
Obs: För detta protokoll, serotyp 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, generöst som tillhandahålls av Dr Moon Nahm) används. - Växer bakteriestam i en lämplig buljong (dvs. Todd-Hewitt buljong + 0,5% jästextrakt för denna WU2 stam) för ungefär 2−4 h vid 37 ° C.
Obs: Optisk densitet vid 600 nm (OD600) av kultur bör vara mellan 0,6 och 0,8. - Pellet bakterierna genom centrifugering vid 6000 x g i 2 min och resuspendera cellerna i 10−30 mL 15% glycerol i lämplig buljong. Alikvot bakteriella kulturen (500 µL per alikvot) in i sterila 1,5 mL centrifugrör och förvaras vid-80 ° C.
- Tina upp en injektionsflaska med bakteriell lager i 37 ° C vattenbad. Pellet bakteriecellerna och resuspendera i 500 µL OBB under sterila förhållanden.
- Förbereda olika spädningar av bakteriell beståndet i OBB (dvs 10 µL ingen utspädning, 10 µL av 1:10, 10 µL av 1: 100, etc.). Utför OPKA analysen (avsnitt 4 – 6, inklusive HL-60/komplement samtidig kultur) som beskrivs nedan med olika spädningar av obehandlad bakteriell beståndet. Kultur plattorna över natten vid 30 ° C (CO2).
Obs: Temperatur 30 ° C är specifik för WU2 att förhindra överväxt; andra stammar/serotyper kan växa optimalt vid 37 ° C. - Räkna kolonierna för varje utspädning av obehandlad bakteriell stock co odlade med HL-60 celler och komplement. Avgöra vilken utspädning av bakterier ger det optimala antalet räknebart kolonier (cirka 80−120 CFUs för obehandlade bakterier tillsammans odlade med HL-60 celler). Observera denna utspädning för framtida OPKAs som involverar detta bakteriell bestånd.
4. bakteriell behandling och kultur
- Tina en tub bakteriell lager bereddes i steg 3.3. Pellet bakterier (6 000 x g i 2 min) och återsuspendera cellpelleten i OBB på optimal utspädning som bestäms i steg 3.6.
- Pipettera 10 µL återsuspenderad bakteriell utspädning per brunn i en runda-botten 96 brunnar cell kultur plattan.
- Tillsätt 20 µL av lämplig antikropp eller drogmissbruk behandling till varje experimentella brunn i två exemplar.
Obs: I detta protokoll, en serotypspecifika antikropp genereras i möss läggs som behandling X och en glykosid hydrolas enzym känt att försämra den serotyp 3 polysackarid kapseln är till som behandling Y (figur 2)4,20. Använd 1 x PBS eller OBB, beroende på den buffert som används för behandling brunnar för kontrollbrunnar. - Skaka provet plattan på ca 90 rpm för 1 h i rumstemperatur. Justera dessa beroende på optimal temperatur eller skakningar tillstånd av de behandlingar som testas.
5. HL-60 samtidig bakterieodling
- Förbereda HL-60 celler genom att skörda de HL-60 differentierade celler som behandlas med DMF tre dagar tidigare (se steg 1.4) i 15 mL koniska rör. Pellet cellerna (500 x g, 3 min), avlägsna supernatanten och tvätta med minst 10 mL 1 x PBS.
- Pellet tvättade cellerna (500 x g, 3 min), avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i OBB (börja med 1 mL OBB och justera för en slutlig koncentration på 1 x 107/ml efter cell räknar).
- Lägg till baby kanin komplement (steril, outspädd baby kaninserum, ålder 3,4 veckor) på en 1:5 slutlig volym.
Obs: HL-60-komplement blandningen slutliga koncentration bör7/1 x 10 ml. Om testning komplement beroende, en andra lösning innehållande aktiva HL-60 celler med Värmeinaktiverade komplement kan användas (komplement kan inaktiveras genom ruvning i ett vattenbad vid > 55 ° C i minst 30 min). - Efter 1 h bakterieodling är komplett (steg 4,4), dela varje prov (dvs 10 µL av varje 30 µL prov långt in två nya brunnar) i dubbla brunnar för två grupper (dvs, Använd endast 20 µL av de ursprungliga 30 µL samtidig kulturen för pipettering fel) : en uppsättning blir co odlade med HL-60-komplement och en kommer att innehålla bakterier bara. Tillsätt 50 µL av HL-60-komplement (från steg 5.3) så att varje experimentell uppsättning wells (delegerade + HL-60); Tillsätt 50 µL OBB ensam i brunnarna bakterier bara (delegerade -HL-60).
Obs: Det här exemplet används cirka 800 bakteriell CFUs för den ursprungliga co kulturen med 5 x 105/50 µL HL-60 celler. Om denna multiplicity av infektion är för hög eller för låg vilket framgår av sista koloni nummer, justera den ursprungliga bakteriella utspädningen i motsats till det HL-60 celltalet. - Skaka plattan med 96 brunnar vid 37 ° C för 1 h (CO2).
6. prova plätering och natten inkubation
- Späd varje brunn 1:5 med OBB, så att varje prov har en volym på minst 50 µL.
- Överför med pipett 50 μl av varje prov direkt på ett utvalt område av en bakterieodling plattan, att säkerställa tillräckliga avstånd mellan prover. För 15 x 100 mm runda2 agarplattor, Pipettera cirka 4 prover på en tallrik.
- Täck och låt prover torka i cirka 15 min i rumstemperatur.
- Invertera plattorna och kultur övernattning på 30 ° C (CO2). Alternativt, kultur plattor i anaerob burkar för att testa om syrefria förhållanden påverka bakterietillväxt eller kontroll för morfologi.
- Efter övernattning kultur, räkna kolonierna i varje utsedda prov område. Analysera data genom att jämföra antalet levande celler i varje uppsättning av motsvarande kontroll eller prover som inte får HL-60 samtidig cellkultur (av 100% cellöverlevnad, 0% cell dödande).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering av HL-60 differentiering bör utföras innan OPKA. Detta kan åstadkommas med flödescytometri för att avgöra det extracellulära uttrycket för CD11b, CD35, CD71 och annexin V (figur 1). Propidium jodid kan också användas som livskraft markör. Efter behandlas med DMF för 3 dagar, uttryck av CD35 bör ökas (≥55% av alla celler) och uttryck för CD71 minskas (≤20% av alla celler). Procentandelen av annexin V + och propidium jodid (PI +) celler grupp bör vara < 35% att säkerställa tillräcklig cellviabilitet. Om dessa procentsatser inte uppfyller minimikraven, bör kultur villkoren justeras enligt beskrivningen i diskussionen.
Antalet CFUs som erhållits från steg 6,5 kan användas för att jämföra bakteriecell överlevnad i olika grupper jämfört med obehandlade kontrollgruppen (100% cellöverlevnad) som visas i figur 2. Till exempel bör den genomsnittliga räknas som erhållits från brunnar som inte fick någon behandling, men samtidig odlade med HL-60 vara relativt nära i nummer till de celler som fick ingen behandling och ingen samtidig kultur HL-60, vilket skulle vara vägledande för 100% cellöverlevnad eller 0 % celldöd. Med en effektiv behandling bör antalet kolonier mer skilja mellan HL-60 samtidig kultur och inga HL-60 celler (figur 2 och figur 3). Större skillnader mellan HL-60 och ingen HL-60 uppsättningar är vägledande för effektivare fagocytos. Men kan behandling faktiskt förbättra bakteriell celltillväxt i den uppsättning som inte är samtidig odlade med HL-60 celler. Denna skillnad i behandlat och obehandlat prov bör noteras. Om bakteriell utspädning inte optimerad (steg 3.6) eller kolonin tillväxten observeras inte noggrant efter plätering (steg 6,5 eller se diskussion), överväxt av kolonierna kan förhindra korrekt räkning av kolonier (figur 4).
Figur 1 : Validering av HL-60 celldifferentiering via flödescytometri. Differentierade HL-60 celler var skördas, tvättas och resuspended i 1 x 105 celler/mL PBS. Cellerna var sedan aliquoted i 12 brunnar (100 µL per brunn) i en plattan med 96 brunnar. Cellerna var sedan färgas med fluorescently konjugerade anti-CD35, anti-CD71, annexin V och propidium jodid. Ofärgade celler eller celler som färgas med fluorescently konjugerade isotypen antikroppar användes som kontroller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Behandling Y förbättrar HL-60-medierad cell dödandet av bakterier. S. pneumoniae prover behandlades med behandling X (antikropp) eller behandling Y (enzym). OPKA utfördes enligt protokollet och bakteriell CFUs räknades i två exemplar. Prover som inte behandlades med HL-60 celler användes som en kontroll (100% cellöverlevnad). Visas de genomsnittliga procentsatserna för bakteriell CFUs i HL-60 behandlade grupperna jämfört med motsvarande icke-HL-60-behandlade grupperna. Staplarna representerar medelfelet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Bakteriell CFUs efter OPKA och övernattning kultur. Bakteriella prover behandlades och samtidig odlade utan (A) eller (B) HL-60 celler för 1 h vid 37 ° C. Proverna var utspädd enligt protokollet och ströks på blodagar plattor över natten vid 30 ° C (CO2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Bakteriell CFU överväxt. Bakteriella prover behandlades och OPKA utfördes. Proverna var utspädd och ströks på blodagar plattor över natten vid 37 ° C (CO2). Korrekt bedömning av kolonin nummer inte kan fastställas som överväxt av kolonier visas. Som 37 ° C (CO2) ledde till bakteriell överväxt, inkubation temperaturen för framtida plattor sänktes till 30 ° C (CO2) att upprätthålla krävandet av kolonierna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OPKAs tjäna viktiga roller vid bedömningen av antikropp medierad immunsvar induceras av vaccinationer6,8. Den huvudsakliga betydelsen av denna förenklade OPKA är anpassningsförmåga i de villkor som ska testas (dvs, antikroppar, enzym behandlingar, etc.). I denna mening, medan denna analys kan användas för att testa bidrag opsonins (dvs antikroppar) i fagocytos, kan det också användas för att bedöma olika sätt att övervinna virulensfaktorer (dvs kapsulära polysackarider) som normalt hämmar fagocytos vägar. Minimera antalet steg som vanligtvis används i en multiplex OPKA potentiellt minimerar risken för tekniska fel som kan påverka experimentella resultat och minskar mängden av felsökning och optimering för att få användbara data. Eftersom detta protokoll är lämpad för variationer behandling villkor, möjliggör det stor mångsidighet.
Före upprättandet av analysen genom kultur HL-60 och inrättandet av bakteriell bestånd är viktigt att förhindra att främmande optimering steg när du utför OPKA. Tid måste ägnas åt att se till att alla reagenser och celltyper är redo och funktionella innan experimentet utförs. Åtgärderna omfattar bland annat förökningsmaterial HL-60 cell linjen i kultur (ca två veckor), validera att särskilda koncentrationer av DMF effektivt differentiera HL-60 cellerna (ungefär en vecka) och inrättande av förorening-fri och optimerad bakteriell lager utspädningar (ca två veckor).
Vissa steg i detta protokoll är kritiska för att erhålla räknebart kolonier och adekvata data. Detta protokoll använder HL-60 celler som fagocyter på grund av hur lätt med en human cellinje som kan bibehållas i kultur och differentierade med relativt få steg. Människans perifera mononukleära blodceller (PBMC) kan också användas; att erhålla dessa celler och optimera villkoren för deras användning kan dock mer utmanande. HL-60 cellerna måste differentieras för att fungera som fagocyter mot bakterier. Kontrollera differentiering efter 3 dagars behandling med DMF, bör flödescytometri användas för att testa av uttryck för CD11b och CD35 på en majoritet av cellerna innan någon OPKA görs, som diskuterats i steg 1,5. Cellernas viabilitet bör också kontrolleras (helst med annexin V och propidium jodid färgning). Om ett stort antal celler är döda, apoptotiska, eller odifferentierade som observerats med flödescytometri, 3 dagars differentiering med 0,6% DMF i RPMI media kan ändras (0,4% −0. 8% DMF, 2−6 kultur dagtid) tills cellen livskraft och differentiering markörer är förbättrats. Denna differentiering bör första optimering av OPKA som HL-60 funktion är avgörande för effektiv bakterie dödande. Vi rekommenderar att validera HL-60 differentiering före varje OPKA experiment.
Antalet bakteriella CFUs (steg 3.6) initialt dispenseras i plattan med 96 brunnar (steg 4,2) är också kritisk: dispensering för många celler kommer att göra räkna svåra och felaktig (steg 6,5) och kan minska den celldöd som observeras från HL-60 samtidig kultur, medan dosering för få celler kan öka mängden av avvikelsen mellan dubbletter och visar inte någon räknebart kolonier efter HL-60 samtidig kultur. Optimera lager utspädning är därför kritisk, och måste testas med fullständiga protokoll, inklusive HL-60/komplement samtidig kultur.
Vikten av komplement kan också testas med detta protokoll av inklusive två uppsättningar av prover: en med aktiv baby kanin komplement och en med Värmeinaktiverade komplement. HL-60 celler bör vara tillsammans odlade med båda uppsättningar, men en endast bakterier-uppsättning fortfarande bör ingå som en 100% cell överlevnad originalplan.
För vissa bakteriella serotyper får morfologi av kolonierna cellen räknar eller synlighet problematiska. Slemmig serotyp såsom typ 3 Streptococcus pneumoniae, exempelvis kan växa över och enkelt minska CFU räkningarna. Detta kan vara särskilt problematiskt när du testar behandlingar som påverkar kapseln, som överväxt skulle hindras i gruppen behandlade men större antal mindre kolonier skulle räknas. För att förhindra denna diskrepans, är kontroll av celltillväxt kritisk. Odlingsskålar guldpläterade kolonierna vid 30 ° C över natten kommer sannolikt möjliggör förbättrad övervakning av bakterietillväxt och plåtarna kan tas bort när alla kolonier nå urskiljbara, räknebart storlekar. Dessutom kan olika agarplattor användas för att förbättra synligheten för enskilda kolonier. På detta sätt är detta protokoll fördelaktigt eftersom små förändringar att optimera villkor kan således användas för att redovisa ett antal bakteriestammar eller olika behandlingsalternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) för hans ovärderliga stöd i upprättandet av OPKA analyser i vårt laboratorium. Detta arbete stöds av nationella institut för hälsa Grant 1R01AI123383-01A1 att FYA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
