Summary
Los tres pasos críticos de este protocolo son i) el desarrollo de la correcta composición y consistencia de la tinta de hidrogel de celulosa, ii) 3D impresión de andamios en vario poro estructuras con fidelidad de buena forma y dimensiones y iii) demostración de la propiedades mecánicas en condiciones simuladas de cuerpo para la regeneración del cartílago.
Abstract
Este trabajo muestra el uso de la impresión tridimensional (3D) para producir andamios porosos cúbicos usando tinta de hidrogel de nanocompuestos de celulosa, con propiedades mecánicas y estructura de poro controlado. Nanocristales de celulosa (CNCs, 69,62% peso) tinta de hidrogel basado con el matriz (alginato de sodio y gelatina) fue desarrollada y 3D impreso en andamios con estructura de poro uniforme y degradado (1.100 110 μm). Los andamios demostraron módulo de compresión en el rango de 0.20-0.45 MPa en simula condiciones en vivo (en agua destilada a 37 ° C). Los tamaños de poro y el módulo de compresión de los andamios 3D con los requisitos necesarios para los usos de la regeneración de cartílago. Este trabajo demuestra que la consistencia de la tinta puede ser controlada por la concentración de los precursores y porosidad puede ser controlada por el proceso de impresión 3D y a cambio de estos factores define la mecánica propiedades del 3D impresión poroso andamio de hidrogel. Por lo tanto, este método de proceso puede utilizarse para fabricar andamios estructuralmente y compositivamente modificado para requisitos particulares según las necesidades específicas de los pacientes.
Introduction
La celulosa es un polisacárido formado por cadenas lineales de β (1-4) unidades de D-glucosa enlazadas. Es el polímero natural más abundante en la tierra y se extrae de una variedad de fuentes, incluyendo fuentes bacterianas, como las algas (por ejemplo, Valonia), hongos e incluso amebas (protozoos, animales marinos (e.g., tunicados) y plantas (por ejemplo, madera, algodón, paja de trigo) )1,2. Nanofibras de celulosa (CNF) y celulosa nanocristales (CNC) con al menos una dimensión de nanoescala se obtienen a través de tratamientos mecánicos y la hidrólisis ácida de la celulosa. No sólo poseen las propiedades de la celulosa, tales como potencial de modificación química, baja toxicidad, biocompatibilidad, biodegradable y renovable, pero también tiene características de la nanoescala como superficie específica alta, altas características mecánicas , propiedades reológicas y el ópticos. Estas propiedades atractivas han hecho CNFs y CNCs conveniente para aplicaciones biomédicas, principalmente en forma de 3 dimensiones (3D) hidrogel andamios3. Los andamios requieren dimensiones modificadas para requisitos particulares con estructura de poro controlado y porosidad interconectada. Nuestro grupo y otros han reportado 3D celulosa porosa nanocompuestos preparados por fundición, electrospinning y liofilización4,5,6,7,8. Sin embargo, control sobre la estructura de poro y fabricación de geometría compleja no se logra a través de estas técnicas tradicionales.
La impresión 3D es una técnica de fabricación aditiva, en el cual se crean objetos 3D capa por capa a través de la deposición controlada por ordenador de los de tinta9. Las ventajas de la impresión 3D sobre técnicas tradicionales incluye libertad de diseño, control macro y micro dimensiones, fabricación de arquitecturas complejas, personalización y reproducibilidad. Además, la impresión 3D de la CNFs y CNCs ofrece alineaciones por cizalla de nanopartículas, prefirió direccionalidad, porosidad gradiente y puede ampliarse fácilmente a 3D bioprinting10,11,12, 13 , 14 , 15. la dinámica de la CNCs alineación durante la impresión en 3D ha sido divulgado recientemente,16,17. Han permitido avances en el campo de bioprinting 3D impresos tejidos y órganos a pesar del desafío involucrado como elección y concentración de las células vivas y factores de crecimiento, composición del portador de la impresión de tinta, presiones y diámetros de boquilla18 ,19,20.
La porosidad y resistencia a la compresión de andamios regenerador de cartílago son propiedades importantes que dicta su eficiencia y rendimiento. Tamaño de poro desempeña un papel importante para la adhesión, diferenciación y proliferación de las células, así como para el intercambio de nutrientes y residuos metabólicos21. Sin embargo, no hay ningún tamaño de poro definido que puede ser considerado como un valor ideal, algunos estudios demostraron mayor bioactividad con poros más pequeños, mientras que otros mostraron mejor regeneración del cartílago con poros más grandes. Macroporos (< 500 μm) facilitan la mineralización del tejido, fuente de nutrientes y eliminación de desechos, mientras que microporos (150-250 μm) facilitan el accesorio de celular y mejores propiedades mecánicas22,23. El andamio implantado debe tener suficiente integridad mecánica desde los tiempos de manejo, implantación y hasta la realización de su propósito deseado. El módulo de compresión agregado para cartílago articular natural se divulga para estar en el rango de 0.1-2 MPa dependiendo de la edad, sexo y ubicación probado4,24,25,26,27 ,28,29.
En nuestro anterior trabajo11, impresión 3D se utilizó para fabricar bioscaffolds porosa de un reticulado doble compenetrados red de polímero (IPN) de una tinta de hidrogel que contiene CNCs reforzados en una matriz de alginato de sodio y gelatina. La vía de impresión 3D se ha optimizado para conseguir andamios 3D con las estructuras de poro uniforme y degradado (2.125 80 μm) donde nanocristales se orientan preferentemente en la dirección de la impresión (grado de orientación entre 61-76%). Aquí te presentamos la continuación de este trabajo y demuestra el efecto de la porosidad en las propiedades mecánicas de 3D impreso andamios de hidrogel en condición corporal simulado. CNCs utilizados aquí, antes informaron nos cytocompatible y no tóxico (es decir, crecimiento de la célula después de 15 días de incubación fue confirmado30). Por otra parte, andamios preparan mediante liofilización usando el mismo CNCs, alginato de sodio y gelatina demostraron alta porosidad, alta absorción de la solución salina buffer fosfato y cytocompatibility hacia las células madre mesenquimales5. El objetivo de este trabajo es demostrar el proceso de la tinta de hidrogel, impresión 3D de andamios porosos y la prueba de compresión. Esquemas de la ruta de procesamiento se muestra en la figura 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparación de precursores
- Preparación de la suspensión de nanocristales de celulosa
Nota: El aislamiento de celulosa nanocristales se realiza de acuerdo al procedimiento reportado por Mathew, y otros30.- Diluir 17 wt % suspensión de nanocristales de celulosa al 2% de peso mediante la adición de agua destilada agua para hacer un volumen total de mezcla de L. 2 con ultra sonicación y uso lotes más pequeños (250-300 mL) para la mezcla eficaz.
- Pasar la suspensión sonified por el homogeneizador 10 veces a una presión de 500-600 bar. En este punto, se obtiene un gel transparente grueso de 2 wt % celulosa nanocristales.
- Se concentran 2 wt % de celulosa gel de nanocristales a 11% de peso a través de centrifugados a 24.500 x g de 1,5 h. decantar agua entre cada 30 minutos.
Nota: Experimento puede hacer una pausa aquí.
- Preparación de las fases de la matriz
- Preparar una solución homogénea de peso 6% alginato de sodio (SA) en agua destilada a 60 º C bajo agitación continua.
- Preparar una solución homogénea de 12 wt % de gelatina (Gel) en agua destilada a 60 º C bajo agitación continua.
Nota: Preparar un volumen de 20 mL para las soluciones de matrix y almacenar en el refrigerador.
- Preparación de reticulantes
- Preparar la solución 3 wt % de cloruro de calcio en agua destilada a temperatura ambiente con agitación continua.
- Preparar la solución de glutaraldehído de % wt 3 en agua destilada a temperatura ambiente con agitación continua.
Nota: Preparar un volumen de 50 mL para soluciones de reticulación y almacenar en temperatura ambiente. Consulte la Tabla de materiales para la información del vendedor. Experimento puede hacer una pausa aquí.
2. preparación de la tinta de hidrogel
- Preparar 40 mL de tinta de hidrogel en un contenedor de poliestireno mediante la mezcla de 11% en CNC, 6 wt % SA y 12% en Gel para obtener un mojado (wt %) composición de la CNC, SA, Gel, agua: 6.87/1.50/1.50/90.12.
- Calienta la mezcla a 40 ° C y mezclar con una espátula hasta obtener una pasta suave.
- Transferir la mezcla en una jeringa de 60 mL. Pasar la mezcla a través de una serie de boquillas de diferentes diámetros en otra jeringa de 60 mL, con la ayuda de la abrazadera mecánica. Repita el proceso hasta que se obtienen filamentos suavemente sacados de hidrogel tinta. Comience con la boquilla con diámetro mayor de 800 μm, seguido de 600 μm y μm 400.
- Suavemente la centrifugadora (4.000 x g) la jeringa llena de tinta de hidrogel para eliminar aire atrapado.
Nota: Experimento puede hacer una pausa aquí.
3. medición de propiedades reológicas de hidrogel
NTE: Llevar a cabo las propiedades reológicas con una geometría de cono sobre la placa lisa, CP25-2-SN7617, diámetro 25 mm, 2 ° ángulo nominal y altura del entrehierro 0,05 mm a 25 ° C.
- Encienda el Reómetro, compresor de aire y caja de control de temperatura. Inicializar el software.
- Monte el aparato de medición en el Reómetro y ajuste zero-gap.
- Extraer aproximadamente 1 mL de la tinta de hidrogel en la plataforma de reómetro.
- Medir la viscosidad en función de la tarifa del esquileo. Seleccione el rango de velocidad de cizalla de 0,001 a 1000.
- Después de la medición, limpie la plataforma del reómetro y herramienta de medición. 1 mL de tinta de hidrogel fresco otra vez en la plataforma de reómetro de extrusión.
- Medir módulos de almacenamiento de información (G′) y módulos de pérdida (G″) como una función de la tensión de esquileo en una frecuencia de 1 Hz. Seleccione el rango de tensión de esquileo de 103 107.
- Una vez finalizadas las pruebas, copiar los datos en archivo de texto y trazar curvas reológicas en escala logarítmica.
4. preparación para la impresión 3D de archivos
Nota: Cura 2.4.0 software se utiliza para el diseño 3D andamios (20 mm3) tiene tres tipos de poros. 1-uniforme poros de 0,6 mm, 2-uniforme poros de 1,0 mm y poros 3-degradado de rango 0.5-1 mm.
- Descargar archivo de la estereolitografía (stl) de un cubo sólido de thingsinverse.com y abra el archivo en la Cura.
- Haga clic en el modelo cargado y a X/Y/Z: 0/0/0 mm. Haga clic en escala, desmarque la casilla de escala uniforme y establecer las dimensiones en X/Y/Z: 20/20/20 mm. Haga clic en girar y girar el cubo de 45 ° en plano XY.
- En el panel lateral, en Material y boquilla, seleccione 0,4 mm y el perfil de la goma. Seleccione Discov3ry completa como la impresora.
- En el lado del panel, seleccione personalizada para la Configuración de impresión. En la sección de calidad , entre 0,2 mm para todas las secciones de la sub. En la sección Shell , introduzca 0 mm para todas las secciones de la sub. En la sección de Material , introduzca 26 ° C de temperatura, fluyen de 1 mm de diámetro y 100%. Tramo de velocidad , introduzca 30 mm/s Velocidad de impresión y 120 mm/s como Velocidad de desplazamiento. En la sección de apoyo , desmarque la casilla para Activar. En la sección Construir placa de adherencia , seleccione falda, entrar en 3 mm como la Distancia de la falda y 150 mm longitud de la Falda/borde mínimo.
- Para andamios con tamaño de poro uniforme, ingrese 0.6 o 1 mm de Distancia de línea de relleno y seleccione el Patrón de relleno de cuadrícula.
- Para andamios de porosidad gradiente, fusión y agrupación de herramienta se utilizan. Haga clic con el botón derecho el modelo cargado, seleccione Múltiples modelos, escriba 2 y pulse OK. Escala de cada modelo como X/Y/Z: 7/20/20 mm. Coloque los modelos encima de la otra. Entrar en Distancia de línea de relleno como 0.3, 0.5 y 0.7 mm para el modelo inferior, medio y superior, respectivamente. Seleccione los tres modelos (Ctrl + A), haga clic derecho y haga clic en Grupo de modelos.
- Guardar los modelos de la tarjeta Digital segura (SD). Cura automáticamente guardar el archivo como gcode que es leída por la impresora.
5. 3D impresión andamios porosos
- Inserte el tubo de transferencia en el portainyector y conectarse 400 μm boquilla. Nivel de la placa de la construcción para obtener la distancia correcta entre la acumulación de placa y la boquilla.
- Cargar la jeringa de centrifugado en el cartucho y conectarlo al otro lado del tubo de transferencia.
- Inserte la tarjeta SD en la impresora, seleccione purgar rápidamente y empezar a purgar el hidrogel de tinta hasta que comience a sacar de la boquilla. Continuar la purga durante 2-3 minutos obtener un flujo homogéneo.
- Desde la tarjeta SD, seleccione los archivos guardados para andamios de porosidad uniforme y degradado y comenzar la impresión. Mantener un ojo en la tasa de extrusión. Si es necesario, ajustar la velocidad de flujo y velocidad por consiguiente. De tamaño de poro más pequeño, usar una velocidad más rápida combinada con bajo caudal (50 mm/s y el 70%).
Nota: No toque los andamios impresos 3D.
6. entrecruzamiento de 3D impreso andamios
- Una vez finalizada la impresión 3D, suavemente añadir gotas de 3% en peso de CaCl2 al andamio hasta que esté completamente húmeda. Espere 5 minutos.
- Transferencia muy cuidadosamente el andamio de la impresora a un recipiente de 50 mL con 3% en peso de CaCl2. Dejarlo durante la noche.
- Lave bien con agua destilada y transferir al cadalso a un recipiente de 50 mL llenado de glutaraldehído de % wt 3. Dejarlo durante la noche.
- Lave bien y almacenar el andamio impreso 3D en agua destilada.
7. ensayos de compresión de
Nota: Realizar pruebas de compresión con célula de carga de 100 N en agua a 37 ° C.
- Llenar el contenedor equipado con placa base compresión sumergible con 2 L de agua y empezar el sistema de calefacción para alcanzar los 37 ° C.
- Software Bluehill Universal de inicializar y configurar el método de prueba. Seleccione la geometría rectangular de la muestra y elegir la opción de introducir dimensiones antes de probar cada muestra. Establecer el grado de deformación de 2 mm/min y al final del resultado como 80% tensión compresiva junto con N de fuerza de 90.
- En la sección de medición , seleccione fuerza, desplazamiento, esfuerzo de compresión y tensión a la compresión. Elija la opción de exportar datos a archivos de texto para un futuro.
- Establecer el punto cero extensión mediante los controles de avance lento para bajar la placa de la cruceta lo más cerca posible a la placa base.
- Mida y tenga en cuenta las dimensiones de las muestras a ensayar.
- Cuando la temperatura del agua llega a 37 ° C, coloque la muestra en la placa base. Fije la muestra moviendo la placa de la cruceta para que comience a tocar la muestra.
- Mueva la bañera de agua, para que las placas con el medio de la muestra ellos se sumergen en agua.
- Entrar en dimensiones y nombre de la muestra. Iniciar la prueba.
- Una vez finalizada la prueba, primero baje el baño de agua y entonces levante la placa de la cruceta.
- Retire la muestra y sus piezas, si, limpiar las placas de ambos y una nueva muestra de la carga.
- Después de todas las muestras se prueban, exportar los datos en bruto. Diagrama de esfuerzo de compresión vs curvas de deformación compresiva y determinar el módulo tangente a la compresión en los valores de tensión de 1-5% y un 25-30%.
Nota: Coloque el cubo degradado de tal manera que los agujeros más grandes frente a la placa base de escritorio.
Primero fijar el andamio entre los puños y luego iniciar/detener la medida.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CNCs base de nanocompuestos hidrogel tinta muestra un fuerte esquileo no newtonianos del adelgazamiento del comportamiento (figura 2a). La viscosidad aparente de 1.55 x 105 Pa.s a una velocidad de corte baja (0,001 s-1) cae en cinco órdenes de magnitud a un valor de 22,60 Pa.s a una velocidad de corte de 50 s-1 (≈50 s-1 siendo una tarifa del esquileo típica experimentada durante la impresión en 3D)31 . La tinta de hidrogel exhibe un comportamiento sólido viscoelástico, como el módulo de almacenamiento G' (4.42 × 107 Pa) es un orden de magnitud mayor que el módulo de pérdida G'' (8.26 x 106 Pa) en baja tensión de esquileo, con un valor de estrés de rendimiento dinámico bien definidos (G'= G'') de 5.59 × 104 Pa (figura 2b). El 3D impreso poroso nanocompuesto hidrogel andamios están en se muestra en la figura 3. Para todas las matrices de soporte impresos, la forma y dimensiones se conservan muy bien después de la impresión, así como después de doble entrecruzamiento. Los tamaños de poro de los andamios, 1.100 110 μm, están en el rango de 100-400 μm que se considera un punto de referencia para regeneración de cartílago32.
Los andamios impresos 3D fueron probados en el modo de compresión. Este es el modo preferido de ensayos mecánicos para materiales de cartílago porque el papel del cartílago natural debe soportar cargas en compresión. Para imitar las condiciones in vivo, los andamios fueron probados en agua a 37 ° C. Tabla 1 y figura 4una representa los datos a la compresión obtenidos para diferentes poroso nanocompuesto andamios de hidrogel con un grado de deformación de 2 mm/min. En tarifas de baja tensión (1-5%), el módulo de resistencia a la compresión (~ 0,17 MPa) es más o menos similar para todos los tipos de andamios porosos. Esto demuestra que la naturaleza elástica de la tinta de hidrogel se conserva incluso en las presencias de los macroporos. Sin embargo, en tarifas de alta tensión (25-30%), el módulo mayor de 0.45 MPa se obtiene para andamio de referencia con ninguna porosidad. Sin embargo, tan pronto como aumenta el tamaño del poro, el módulo disminuye, debido a la disminución en la densidad que indica la relación esperada entre la porosidad de los andamios y las propiedades mecánicas correspondientes. En el caso de los andamios porosos degradados, el módulo es mayor (0.34 MPa) en comparación con los andamios porosos uniforme (0.26 y 0.20 MPa) debido a la presencia de tamaños de poros más pequeños y de paredes más sólidas. Además, el módulo a la compresión del hidrogel 3D andamios aumenta medida que aumenta la tasa de compresión (figura 4b), exhibiendo y mímico la viscoelasticidad de los tejidos de cartílago natural que se considera favorable para la carga rodamiento de andamios33. El módulo a la compresión de 0,20 MPa en el grado de deformación de 2 mm/min aumenta a 0.35 MPa a 5 mm/min y aumenta aún más a 0,47 MPa a 120 mm/min y está en el rango reportado para cartílago natural (es decir, a la compresión módulo de 0.1-2 MPa).
Figura 1 . Esquemas de la ruta de procesamiento de. (a) preparación de la tinta de hidrogel de nanocompuestos. (b) andamios porosos impresión 3D. (c) doble reticulación 3D impreso andamios. (d) compresión prueba de andamios porosos 3D en agua a 37 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Gráficas log – log de nanocompuestos hidrogel tinta. (un) viscosidad vs corte tasa y (b) G' y G'' vs tensión de esquileo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . 3D impreso andamios porosos. Escala: 500 μm. (una) referencia sin los agujeros. tamaño de poro de 1 mm (b). tamaño de poro de 0.60 mm (c). (d) gradiente porosidad 110-800 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Curvas tensión-deformación representativas para 3D impresión poroso nanocompuesto hidrogel andamios. (a) con grado de deformación constante de 2 m/s. (b) en la tensión diferentes tarifas para 1 mm poro andamio de tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Destino tamaño del poro (μm) | Tamaño medio del poro (μm) | Módulo a la compresión en la 1-5% tensión (MPa) | Módulo a la compresión a 25-30% de la tensión (MPa) |
| Referencia | 0 | 0.19 ± 0.04 | 0,45 ± 0,03 |
| 1.000 | 850-1.100 | 0,17 ± 0,02 | ± 0.2 0.01 |
| 600 | 480-650 | 0.16 ± 0.01 | 0,26 ± 0.05 |
| Gradiente de | 110-800 | 0.16 ± 0.01 | 0.34 ± 0.04 |
Tabla 1. Datos de compresión para 3D impresión nanocompuestos hidrogel andamios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Impresión 3D requiere adecuadas propiedades reológicas de la tinta de hidrogel. La tinta de alta viscosidad requiere presiones extremas para su extrusión mientras que tinta de baja viscosidad no mantiene su forma después de la extrusión. La viscosidad de la tinta del hidrogel puede controlarse a través de la concentración de los ingredientes. En comparación con nuestro anterior trabajo11, el contenido de sólidos de la tinta de hidrogel aumenta de 5.4 a 9,9% de peso, dando por resultado la tinta concentrada hidrogel que ayuda a mejorar la resolución del andamio impreso. Cabe señalar que, a diferencia de la CNFs largo flexibles, barra rígida como CNCs puede producir tintas con alto contenido sólido en una determinada viscosidad debido a las ausencias de enredos física14. Otro aspecto importante que afecta la capacidad de impresión es la homogeneidad de la tinta. Se observó que la tinta de hidrogel a una temperatura de 40 º C la calefacción promueve la mezcla homogénea de CNCs con la fase de matriz. Para asegurar la fluidez de la tinta de hidrogel, se pasó por una serie de boquillas, empezando con el diámetro mayor de 800 μm, entonces 600 μm y finalmente 400. Durante estos pasos, la boquilla puede estar tapada que indica la presencia de grumos grandes pero después de estos pasos la tinta hidrogel extruida sin esfuerzo en la forma de un filamento continuo. El movimiento de la boquilla para obtener construcciones impresas 3D es también de gran importancia como lo indica nuestro anterior trabajo11. La vía de la boquilla debe evitar movimientos repetitivos y deposiciones de exceso de la tinta de hidrogel para que se conserve la resolución de la impresión 3D.
La porosidad obtenida en los andamios de hidrogel impreso 3D está en el rango aceptable en comparación con la porosidad específica (tabla 1). No se puede esperar una coincidencia exacta debido a la naturaleza de la inflamación de la tinta de hidrogel. La consistencia de la tinta de hidrogel es un factor importante especialmente cuando ex-situ entrecruzamiento se tiene que hacer, es decir, cura después de la impresión de la construcción 3D. Se observó que la tinta de hidrogel se concentró suficiente (contenido de sólidos de 9,9% en peso) para mantener su forma, dimensiones y estructura durante y después del proceso de impresión.
El tamaño del poro del andamio juega un papel esencial en las interacciones celulares, difusión de oxígeno y eliminación de desechos junto con sus propiedades mecánicas para realizar y apoyar la funcionalidad deseada. Andamios con porosidad gradiente tienen la capacidad para representar mejor las condiciones reales en vivo donde las células se exponen a las capas de tejidos diferentes con diferentes propiedades estructurales22,23,34. La porosidad y propiedades mecánicas están relacionadas inversamente pero la composición del andamio hidrogel puede jugar un papel importante. CNCs ha sido seleccionado como el ingrediente principal de la tinta de hidrogel debido a sus conocidas propiedades mecánicas2,35,36. La tinta de hidrogel fabricado aquí, poseen su elasticidad incluso en las presencias de los poros, tiene un tamaño de poro óptimo (1.100 110 μm) y un módulo de compresión adecuado (0.20-0.45 MPa) para aplicaciones de regeneración de cartílago.
Ensayos de compresión se realizó en agua a temperatura corporal para imitar las condiciones in vivo tanto como sea posibles. No participó de ningún paso de secado entre impresión 3D y ensayos mecánicos. En tejidos naturales, se observa un gradiente de porosidad en lugar de tamaño de poro uniforme uno. Lo mismo vale para los valores de compresión para carga de tejidos naturales, como el módulo a la compresión depende de la edad, sexo y la ubicación de prueba.
La ventaja con el estudio presentado aquí es que los valores de módulo a la compresión del andamio poroso 3D y porosidad final pueden controlados y modificado para requisitos particulares a través de la composición de la tinta del hidrogel y el proceso de impresión 3D. Este protocolo es flexible y puede ser modificado según las necesidades. La impresión 3D es una técnica poderosa y puede explorarse en el futuro para el desarrollo de andamios con características estructurales y compositivas complejas. Multi material dispensado puede introducir la revolución mediante el control de la composición de los andamios, concentración de células o factores de crecimiento, características estructurales tales como la direccionalidad o porosidad, propiedades mecánicas y la velocidad de degradación en diferentes partes de las construcciones 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio es apoyado financieramente por Knut y Alice Wallenberg Foundation (centro de Ciencias de la madera del Wallenberg), Consejo de investigación sueco, VR (Bioheal, 05709 DNR 2016 y 2017 DNR 04254).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mL syringe | Structur3D Printing | ||
| Alginic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | 9005-38-3 | |
| Anhydrous calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamps, three pronged, Talon | VWR | 241-0404 | 102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm |
| Cura 2.4.0 | Ultimaker | Free slicing software | |
| Discov3ry Complete | Structur3D Printing | Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| homogenizer | SPX | APV-2000 | |
| Instron 5960 | Instron | Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C, | |
| Physica MCR 301 rheometer | Anton Paar | CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C | |
| Sorvall Lynx 6000 centrifuge | AB Ninolab | s/n 41881692 | F12-rotor (6x500 ml) |
| stainless steel nozzle | Structur3D Printing | 800, 600 and 400 µm | |
| thingsinverse | MakerBot's | sharing and downloading 3D printable things in form of stl files | |
| ultra sonication | Qsonica, LLC | Q500 | |
| Unbarked wood chips | Norway spruce(Picea abies) | dry matter content of 50–55% |
References
- Moon, R. J., Martini, A., Nairn, J., Simonsen, J., Youngblood, J. Cellulose nanomaterials review: structure, properties and nanocomposites. Chemical Society Reviews. 40 (7), 3941-3994 (2011).
- Dufresne, A. Nanocellulose: a new ageless bionanomaterial. Materials Today. 16 (6), 220-227 (2013).
- Chinga-Carrasco, G. Potential and limitations of nanocelluloses as components in biocomposite inks for three-dimensional bioprinting and for biomedical devices. Biomacromolecules. 19 (3), 701-711 (2018).
- Naseri, N., Poirier, J., Girandon, L., Fröhlich, M., Oksman, K., Mathew, A. P. 3-Dimensional porous nanocomposite scaffolds based on cellulose nanofibers for cartilage tissue engineering: tailoring of porosity and mechanical performance. Royal Society of Chemistry Advances. 6 (8), 5999-6007 (2016).
- Naseri, N., Deepa, B., Mathew, A. P., Oksman, K., Girandon, L. Nanocellulose-Based Interpenetrating Polymer Network (IPN) Hydrogels for Cartilage Applications. Biomacromolecules. 17 (11), 3714-3723 (2016).
- Naseri, N., Mathew, A. P., Girandon, L., Fröhlich, M., Oksman, K. Porous electrospun nanocomposite mats based on chitosan-cellulose nanocrystals for wound dressing: effect of surface characteristics of nanocrystals. Cellulose. 22 (1), 521-534 (2015).
- Xing, Q., Zhao, F., Chen, S., McNamara, J., DeCoster, M. A., Lvov, Y. M. Porous biocompatible three-dimensional scaffolds of cellulose microfiber/gelatin composites for cell culture. Acta Biomaterialia. 6 (6), 2132-2139 (2010).
- Nandgaonkar, A., Krause, W., Lucia, L. Fabrication of cellulosic composite scaffolds for cartilage tissue engineering. Nanocomposites for musculoskeletal tissue regeneration. , Elsevier. 187-212 (2016).
- Gross, B. C., Erkal, J. L., Lockwood, S. Y., Chen, C., Spence, D. M. Evaluation of 3D printing and its potential impact on biotechnology and the chemical sciences. Analytical Chemistry. 86 (7), 3240-3253 (2014).
- Markstedt, K., Mantas, A., Tournier, I., Martínez Ávila, H., Hägg, D., Gatenholm, P. 3D bioprinting human chondrocytes with nanocellulose-alginate bioink for cartilage tissue engineering applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
- Sultan, S., Mathew, A. P. 3D printed scaffolds with gradient porosity based on a cellulose nanocrystal hydrogel. Nanoscale. 10, 4421-4431 (2018).
- Sultan, S., Siqueira, G., Zimmermann, T., Mathew, A. P. 3D printing of nano-cellulosic biomaterials for medical applications. Current Opinion in Biomedical Engineering. 2, 29-34 (2017).
- Sultan, S., Abdelhamid, H. N., Zou, X., Mathew, A. P. CelloMOF: Nanocellulose Enabled 3D Printing of Metal-Organic Frameworks. Advanced Functional Materials. , 1805372-1805384 (2018).
- Siqueira, G., et al. Cellulose Nanocrystal Inks for 3D Printing of Textured Cellular Architectures. Advanced Functional Materials. 27 (12), 1604619-1604629 (2017).
- Wang, J., et al. All-in-One Cellulose Nanocrystals for 3D Printing of Nanocomposite Hydrogels. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2353-2356 (2018).
- Hausmann, M. K., et al. Dynamics of Cellulose Nanocrystal Alignment during 3D Printing. ACS Nano. 12 (7), 6926-6937 (2018).
- Liu, Y., et al. Nanoscale assembly of cellulose nanocrystals during drying and redispersion. ACS Macro Letters. 7 (2), 172-177 (2018).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature communications. 5, 3935 (2014).
- Xia, Z., Jin, S., Ye, K. Tissue and organ 3D bioprinting. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (4), 301-314 (2018).
- Zhang, Q., Lu, H., Kawazoe, N., Chen, G. Pore size effect of collagen scaffolds on cartilage regeneration. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2005-2013 (2014).
- Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: role of porosity and pore size. Tissue Engineering, Part B: Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
- Bružauskaitė, I., Bironaitė, D., Bagdonas, E., Bernotienė, E. Scaffolds and cells for tissue regeneration: different scaffold pore sizes-different cell effects. Cytotechnology. 68 (3), 355-369 (2016).
- Zhang, L., Hu, J., Athanasiou, K. A. The role of tissue engineering in articular cartilage repair and regeneration. Critical Reviews™ in Biomedical Engineering. 37 (1-2), (2009).
- Athanasiou, K., Rosenwasser, M., Buckwalter, J., Malinin, T., Mow, V. Interspecies comparisons of in situ intrinsic mechanical properties of distal femoral cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 9 (3), 330-340 (1991).
- Schinagl, R. M., Gurskis, D., Chen, A. C., Sah, R. L. Depth-dependent confined compression modulus of full-thickness bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 15 (4), 499-506 (1997).
- Athanasiou, K., Niederauer, G., Schenck, R. Biomechanical topography of human ankle cartilage. Annals Biomedical Engineering. 23 (5), 697-704 (1995).
- Athanasiou, K. A., Liu, G. T., Lavery, L. A., Lanctot, D. R., Schenck, R. C. Biomechanical topography of human articular cartilage in the first metatarsophalangeal joint. Clinical Orthopaedics and Related Research. 348, 269-281 (1998).
- Guilak, F., Jones, W. R., Ting-Beall, H. P., Lee, G. M. The deformation behavior and mechanical properties of chondrocytes in articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (1), 59-70 (1999).
- Mathew, A. P., Oksman, K., Karim, Z., Liu, P., Khan, S. A., Naseri, N. Process scale up and characterization of wood cellulose nanocrystals hydrolysed using bioethanol pilot plant. Industrial Crops and Products. 58, 212-219 (2014).
- Compton, B. G., Lewis, J. A. 3D-printing of lightweight cellular composites. Advanced Materials. 26 (34), 5930-5935 (2014).
- Sarem, M., Moztarzadeh, F., Mozafari, M. How can genipin assist gelatin/carbohydrate chitosan scaffolds to act as replacements of load-bearing soft tissues. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 635-643 (2013).
- Chia, H. N., Hull, M. Compressive moduli of the human medial meniscus in the axial and radial directions at equilibrium and at a physiological strain rate. Journal of orthopaedic research. 26 (7), 951-956 (2008).
- Zhang, K., Fan, Y., Dunne, N., Li, X. Effect of microporosity on scaffolds for bone tissue engineering. Regenerative biomaterials. 5 (2), 115-124 (2018).
- Lin, N., Dufresne, A. Nanocellulose in biomedicine: Current status and future prospect. European Polymer Journal. 59, 302-325 (2014).
- Domingues, R. M., Gomes, M. E., Reis, R. L. The potential of cellulose nanocrystals in tissue engineering strategies. Biomacromolecules. 15 (7), 2327-2346 (2014).
