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Bioengineering

三维印刷多孔纤维素纳米复合水凝胶脚手架

Published: April 24, 2019 doi: 10.3791/59401
Automatic Translation
1, 1
1Department of Materials and Environmental Chemistry, Stockholm University

Summary

本协议的三个关键步骤是: (i) 开发纤维素水凝胶油墨的正确成分和一致性, (ii) 将支架三维打印到形状保真度和尺寸良好的各种孔隙结构中, 以及 (三)在模拟身体条件下的机械性能, 用于软骨再生。

Abstract

这项工作演示了使用三维 (3D) 打印生产多孔立方支架使用纤维素纳米复合水凝胶油墨, 具有受控制的孔隙结构和机械性能。纤维素纳米晶 (Cnc, 6.962 wt%)开发了以基质 (海藻酸钠和明胶) 为基础的水凝胶油墨, 并将三维印刷成具有均匀梯度孔隙结构 (110-1100μm) 的支架。在体内模拟条件下 (37°c 的蒸馏水) 中进行测试时, 支架的压缩模量在 0.20-0.45 MPa 之间。三维支架的孔径和压缩模量符合软骨再生应用所需的要求。这项工作表明, 油墨的一致性可以通过前体的浓度来控制, 孔隙度可以通过三维打印过程来控制, 而这两个因素反过来都决定了三维打印多孔的机械性能水凝胶脚手架。因此, 这种工艺方法可用于根据患者的具体需要制作结构和组合定制的支架。

Introduction

纤维素是由β (1-4) 连接 d-葡萄糖单位的线性链组成的多糖。它是地球上最丰富的天然聚合物, 从各种来源提取, 包括海洋动物 (如金枪鱼)、植物 (如木材、棉花、小麦秸秆) 和细菌来源, 如藻类 (如 valonia)、真菌, 甚至阿米巴 (原生动物))1,2。纤维素纳米纤维 (CNF) 和纤维素纳米晶 (CNC), 通过机械处理和纤维素酸水解得到, 纳米尺度上至少有一个维度。它们不仅具有化学改性、低毒性、生物相容性、生物降解、可再生等特性, 而且具有高比表面积、高机械性能等纳米级特性、流变和光学特性。这些吸引人的特性使 Cnf 和 Cnc 适合生物医学应用, 主要是以三维 (3D) 水凝胶支架3的形式。这些支架需要定制的尺寸, 具有可控的孔隙结构和相互关联的孔隙率。我们的小组和其他人报告了通过铸造、电纺和冷冻干燥制备的3d 多孔纤维素纳米复合材料 4,5,6, 7,8。然而, 通过这些传统技术, 并不能实现对孔隙结构的控制和复杂几何的制作。

3D 打印是一种添加剂制造技术, 在这种技术中, 3D 对象通过计算机控制的墨迹沉积9逐层创建。与传统技术相比, 3D 打印的优势包括设计自由度、控制的宏观和微观尺寸、复杂架构的制作、定制和可重复性。 此外, Cnf 和 Cnc 的3D 打印还提供了剪切诱导的纳米粒子对齐、首选方向性、梯度孔隙率, 并且可以很容易地扩展到3D 生物印迹10,11, 12,13,14,15. 最近, 据报告, 3d 打印过程中的氯化萘对齐动态为16,17。生物冲洗领域的进步使3D 印刷组织和器官得以实现, 尽管存在相关的挑战, 如活细胞的选择和浓度和生长因子, 载体油墨的组成, 印刷压力和喷嘴直径18 ,19,20。

软骨再生支架的孔隙率和抗压强度是决定其效率和性能的重要特性。孔大小对细胞的粘附、分化和增殖以及营养物质和代谢废物的交换起着重要作用。然而, 目前还没有确定的孔径可以被认为是理想的值, 一些研究表明, 毛孔较小的生物活性较高, 而另一些研究则显示出更大的毛孔的软骨再生较好。大孔隙 (& lt;500 微米) 促进组织矿化、养分供应和废物清除, 而微孔 (15-250μm) 促进细胞附着和更好的机械性能22,23。植入的支架必须具有足够的机械完整性, 从处理、植入到完成其预期目的。据报告, 自然关节软骨的总体压缩模量在 0.1-2 兆帕之间, 具体取决于年龄、性别和测试位置4,24,25,26, 27 ,28,29。

在我们之前的工作11中, 3d 打印被用来制造一个双交联互穿聚合物网络 (ipn) 的多孔生物咖啡因从一个含有增强的 cnc 的水凝胶油墨在海藻酸钠和明胶的矩阵。对三维打印路径进行了优化, 以实现具有均匀梯度孔隙结构 (80-2125μm) 的三维支架, 其中纳米晶最好在打印方向定向 (取向程度在61-76 之间)。在这里, 我们提出了这项工作的延续, 并演示了孔隙率对模拟身体条件下三维印刷水凝胶支架力学性能的影响。这里使用的 Cnc, 我们早些时候报告说, 细胞相容性和无毒 (即, 细胞生长后15天的孵化被确认为 30)。此外, 使用相同的 Cnc、海藻酸钠和明胶通过冷冻干燥制备的支架具有较高的孔隙率、较高的磷酸盐缓冲碱吸收率和细胞与间充质干细胞的相容性5。本工作的目的是展示水凝胶油墨的加工、多孔支架的三维打印和压缩测试。处理路线的原理图如图 1所示。

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Protocol

1. 前体的制备

  1. 纤维素纳米晶悬浮液的制备
    注: 纤维素纳米晶的分离是按照 Mathew 等人报告的程序进行的.
    1. 加入蒸馏水, 将纤维素纳米晶的 17 wt% 悬浮液稀释至 2 wt%, 使其总量彻底为 2 L 混合, 使用超超声, 并使用较小的批次 (250-300 mL) 进行高效混合。
    2. 在 500-600 bar 的压力下, 10次通过均质机通过声纳悬浮液。此时, 得到了 2 wt% 纤维素纳米晶的厚透明凝胶。
    3. 以 24,500 x 克的离心法将 2 wt% 的纤维素纳米晶体凝胶浓缩至 11 wt% , 每30分钟内达到1.5 小时。
      注: 实验可以在此处暂停。
  2. 矩阵相的制备
    1. 在连续搅拌的情况下, 在60°c 蒸馏水中制备均匀的 6 wt% 海藻酸钠 (SA)。
    2. 在连续搅拌的情况下, 在60°c 的蒸馏水中制备 12 wt% 明胶 (凝胶) 的均匀溶液。
      注: 为矩阵溶液准备20毫升的体积, 并存储在冰箱中。
  3. 交联剂的制备
    1. 在常温下连续搅拌的情况下, 在蒸馏水中制备 3 wt% 的氯化钙溶液。
    2. 在常温下连续搅拌的情况下, 在蒸馏水中制备3% 戊二醛溶液。
      注: 为交联溶液准备50毫升的体积, 并存储在室温下。有关供应商信息, 请参阅物料表。实验可以在这里暂停。

2. 水凝胶油墨的制备

  1. 将 11 wt% CNC、6wt% SA 和 12 wt% 凝胶混合在聚苯乙烯容器中制备40毫升的水凝胶油墨, 以获得湿 (wt%)Cnc/Sasa/gelp/水的成分: 6.87/1.50/1.50/90.12。
  2. 将混合物加热至 40°c, 并与铲子混合, 直到得到光滑的糊状物。
  3. 将混合物转移到60毫升注射器中。在机械夹具的帮助下, 将混合物通过一系列不同直径的喷嘴传递到另一个60毫升的注射器中。重复此过程, 直到得到水凝胶油墨的光滑挤压细丝。从最大直径为800μm 的喷嘴开始, 然后是600μm 和400μm。
  4. 轻轻离心机 (4, 000 x g) 用水凝胶墨水填充注射器, 以去除被困的空气。
    注: 实验可以在此处暂停。

3. 水凝胶流变性能的测量

NTE: 在25°C 时, 使用光滑的面板上几何形状 CP25-2-SN7617, 直径 25 mm, 2°标称角度和直径 0.05 mm 来实现流变特性。

  1. 打开流变仪、空压机和温度控制箱。初始化软件。
  2. 将测量工具安装在流变仪中, 并设置零间隙。
  3. 将大约1毫升的水凝胶油墨挤出流变仪平台上。
  4. 测量粘度作为剪切速率的函数。选择从0.001 到 1, 000 的剪切速率范围。
  5. 测量完成后, 清洁流变仪平台和测量工具。在流变仪平台上再次挤出1毫升的新鲜水凝胶油墨。
  6. 测量存储模量 (G ') 和损失模量 (G ") 作为 1 Hz 频率下剪切应力的函数. 选择剪切应力范围从 10 3 到 10 7.
  7. 测试完成后, 将数据复制到文本文件中, 并以对数标度绘制流变曲线。

4. 3D 打印的文件准备

注: 2.4.0 软件用于设计具有三种类型毛孔的3D 支架 (20 mm3)。1-0.6 毫米均匀毛孔, 2-均匀毛孔1.0 毫米, 3 梯度毛孔直径 0.5-1 毫米。

  1. 从东西 sinvere. com 下载一个固体立方体的立体平版印刷 (stl) 文件, 并在库拉打开该文件。
  2. 单击加载的模型并将其移动到 X/YZ:0\ 0 mm. 单击"缩放", 取消统一缩放复选框, 并将尺寸设置为 X/YZ:20/20 Mm. 单击 "旋转" 并在 xy 平面中将多维数据集旋转45°。
  3. 在侧面面板中的 "喷嘴 &Amp; 材质" 中, 选择 0.4 mm 并粘贴型材。选择 "完成"作为打印机。
  4. 在侧面面板中, 选择"打印设置的自定义" 。在 "质量" 下, 为所有子部分输入 0.2 mm。在"外壳"部分下, 为所有子部分输入 0 mm。在材料部分下, 输入26°c 的温度, 1 毫米直径和100% 流量。在"速度" 部分下, 输入 30 Mm2 作为"打印速度" ,以 "行驶速度" 的身份输入 120 mm/s。在"支持" 部分下, 取消选中 "启用支持" 复选框。在"构建板材粘附" 部分下, 选择"裙子", 输入3毫米作为裙子距离, 150 毫米作为裙子/刷的最小长度。
  5. 对于孔径均匀的脚手架, 输入0.6 或 1 mm填充线距离, 然后选择网格填充图案。
  6. 对于梯度孔隙度支架, 采用了合并和分组工具。右键单击加载的模型, 选择 "多个模型", 输入 2, 然后按"确定"。将每个型号缩放为 X/YZ:20/. 将模型放在彼此的顶部。输入底部、中间和顶部型号的填充线距离分别为0.3、0.5 和 0.7 mm。选择所有三种型号 (Ctrl + a), 右键单击并单击 "组模型"。
  7. 将模型保存在 "可靠数字" (SD) 卡上。Ura 会自动将文件另存为打印机读取的 gcode。

5. 3D 打印多孔支架

  1. 将转移管插入喷嘴支架, 并将400μm 喷嘴连接到喷嘴上。对生成板进行水平化, 以获得生成板和喷嘴之间的正确距离。
  2. 将离心注射器装入墨盒, 并将其连接到转移管的另一侧。
  3. 将 SD 卡插入打印机, 选择"快速清洗", 并开始清除水凝胶油墨, 直到它开始从喷嘴中挤出。继续清除 2-3分钟, 以获得均匀的流量。
  4. 从 SD 卡中, 选择保存的文件以实现均匀和梯度孔隙率脚手架, 然后开始打印。密切关注挤出率。如果需要, 请相应调整速度和流量。对于较小的孔径, 使用更快的速度与较低的流速 (50 mm 和 70%) 相结合。
    注: 请勿触摸3D 打印的脚手架。

6. 3D 打印脚手架的交联

  1. 3D 打印完成后, 轻轻地将 3 wt% Ccl2滴到脚手架上, 直到它完全湿。等待5分钟。
  2. 非常小心地将脚手架从打印机转移到一个装有 3 wt% Ccl2的50毫升容器上。把它留一夜。
  3. 用蒸馏水彻底清洗, 并将脚手架转移到一个装有 3 Wt% 戊二醛的50毫升容器中。把它留一夜。
  4. 彻底清洗并将3D 打印的脚手架存放在蒸馏水中。

7. 压缩测试

注: 在37°c 的水中使用 100 N 称重传感器进行压缩测试。

  1. 将装有潜水压缩基板的容器装上2升的水, 并启动加热系统, 使其达到37°c。
  2. 初始化蓝山通用软件并建立测试方法。选择矩形试样几何形状, 然后选择在测试每个样品之前输入尺寸的选项。 将应变速率设置为 2 mm/min, 结果为80% 的压缩应变和 90 N 力。
  3. 在测量部分, 选择力、位移、压缩应力和压缩应变。选择将数据导出为文本文件以供将来绘制的选项。
  4. 通过使用慢跑控制将横梁板尽可能靠近基板来设置零扩展点。
  5. 测量并记下要测试的样品的尺寸。
  6. 当水温达到37°c 时, 将样品放在基板上。 通过移动横梁板来固定样品, 使其开始接触样品。
  7. 将水浴向上移动, 使板与样品之间浸入水中。
  8. 输入示例名称和尺寸。开始测试。
  9. 测试完成后, 先将水浴向下移动, 然后将横梁板抬起。
  10. 取出样品及其片断 (如果有), 清洁两个板材并加载新样品。
  11. 测试完所有样品后, 导出原始数据。在1-5 和25-30 的应变值下, 测量压缩应力与压缩应变曲线, 并确定压缩切角模量。
    注: 放置渐变立方体的方式, 较大的孔面对文具基板。
    首先将脚手架固定在夹具之间, 然后启动停止测量。

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Representative Results

基于 Cnc 的纳米复合水凝胶油墨表现出很强的非牛顿剪切变薄行为 (图 2a)。在低剪切速率 (0.001 s-1) 下, 1.55x10 5 pa. s 的表观粘度在50秒-1 (50s-1是3d 打印过程中经历的典型剪切速率) 下降到22.60 帕. s 的5个数量级。.水凝胶油墨表现出粘弹性固体行为, 因为在低剪切应力下, 储存在模量 G ' (4.42x107 pa)大于损失模量 G ' ' (8.26x10 6 帕), 具有明确定义的动态屈服应力值 (g ' = g ' ')(图 2b).三维印刷多孔纳米复合水凝胶支架如图 3所示。对于所有印刷的脚手架, 形状和尺寸在打印后以及双交联后都保留得很好。支架的孔径为 110-1100μm, 在100-400 微米的范围内, 被认为是软骨再生的基准32。

3D 打印支架在压缩模式下进行了测试。这是软骨材料机械测试的首选模式, 因为天然软骨的作用是承受压缩负荷。为了模仿体内条件, 支架在37°c 的水中进行了测试。表 1和图 4a表示不同多孔纳米复合水凝胶支架在应变速率为2mm/min 的情况下获得的压缩数据。在低应变速率 (1-5) 下, 所有类型的多孔支架的压缩模量 (~ 0.17 MPa) 基本相似。这表明, 即使在大毛孔的存在中, 水凝胶油墨的弹性也得以保留。然而, 在高应变率 (25-30) 下, 对于无孔隙率的参考支架, 其最大模量为 0.45 MPa。然而, 一旦孔径增大, 模量就会减小, 这表明了支架孔隙率与相应机械性能之间的预期关系。在梯度多孔支架的情况下, 模量较高 (0.34 MPa), 而均匀多孔支架 (0.34 和 0.34 MPa), 因为存在较小的孔隙尺寸和更坚固的壁。此外, 随着压缩率的增加, 三维水凝胶支架的压缩模量也会增加 (图 4b), 显示和模拟被认为有利于负载的天然软骨组织的粘弹性轴承脚手架33。在 2 mm/min 的应变速率下, 0.20 MPa 的压缩模量增加到 0.20 MPa, 在 2.5 mm/min 时进一步增加到 0.20 MPa, 并且在报告的天然软骨的范围内 (即 0.1-2 MPa 的压缩模量)。

Figure 1
图 1.处理路线的原理图.(a) 纳米复合水凝胶油墨的制备。(b) 3d 打印多孔脚手架。(c) 3d 打印脚手架的双重交联。(d) 在37°c 的水中对三维多孔支架进行压缩试验。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.纳米复合水凝胶油墨的测井图.(a) 粘度与剪切速率和 (b) g ' 和 g ' 与剪切应力。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3. 3d 打印多孔支架.刻度: 500μm. (a) 无孔的参考。(b) 1 毫米孔径。(c) 0.60 毫米孔径。(d) 梯度孔隙度 110-800μm. 请点击此处查看这一数字的更大版本.

Figure 4
图 4.三维印刷多孔纳米复合水凝胶支架的应力应变曲线。(a) 1 毫米孔径脚手架以不相同的应变速率保持 2毫米的恒定应变率。请点击这里查看此图的较大版本.

目标孔径 (μm) 平均孔径 (μm) 1-5 应变时的压缩模量 (MPa) 25-30 应变时的压缩模量 (MPa)
参考 0 0.19±0.04 0.45±0.03
1, 000 850-1100 0.17±0.02 0.2±0.01
600元 480-650 0.16±0.01 0.26±0.05
梯度 110-800 0.16±0.01 0.34±0.04

表1。三维打印纳米复合水凝胶支架的压缩数据。

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Discussion

3D 打印需要适当的水凝胶油墨流变特性。高粘度油墨的挤出需要极高的压力, 而低粘度油墨在挤出后不会保持其形状。水凝胶油墨的粘度可以通过成分的浓度来控制。与我们之前的工作11相比, 水凝胶油墨的固体含量从 5.4% 增加到 9.9 wt%, 从而产生浓缩的水凝胶油墨, 这有助于提高印刷脚手架的分辨率。可以注意的是, 与长柔性氯化萘不同的是, 由于物理纠缠的缺失, 像氯化萘这样的刚性棒可以在给定的粘度下产生固体含量较高的油墨。影响印刷性能的另一个重要方面是油墨的均匀性。研究表明, 在40°c 的温度下加热水凝胶油墨可促进氯化萘与基体相的均匀混合。为了进一步确保水凝胶油墨的平滑性, 它通过一系列喷嘴, 从最大直径800μm 开始, 然后是 600μm, 最后是400μm。在这些通过过程中, 喷嘴可能会堵塞, 这表明存在大块状, 但在这些流之后, 水凝胶油墨以连续长丝的形式毫不费力地挤出。正如我们以前的工作11所表明的那样, 获得3D 打印结构的喷嘴运动也非常重要。喷嘴通道应避免水凝胶油墨的重复运动和多余的沉积, 以保持3D 打印的分辨率。

与目标孔隙率相比, 3D 打印水凝胶支架中获得的孔隙率在可接受的范围内 (表 1)。由于水凝胶油墨的膨胀性质, 无法预料会有精确的匹配。 水凝胶油墨的一致性是一个重要因素, 尤其是在必须进行原位交联时, 即三维结构打印后的交联。据指出, 水凝胶油墨浓度足够高 (固体含量为 9.9 wt)在印刷过程中和之后保持其形状、结构和尺寸。

脚手架的孔径在细胞相互作用、氧扩散和废物清除以及其机械性能方面发挥着至关重要的作用, 以执行和支持所需的功能。具有梯度孔隙率的支架能够更好地表示体内的实际条件, 即细胞暴露在不同组织层, 结构特性为 22、23、34。孔隙率和力学性能成反比, 但水凝胶支架的组成可以发挥重要作用。Cnc 以其众所周知的力学性能2、35、36被选定为水凝胶油墨的主要成分。这里制造的水凝胶油墨, 即使在毛孔的存在中也具有弹性, 具有最佳的孔径 (110-1100μm) 和软骨再生应用所需的合适压缩模量 (0.20-0.45 MPa)。

在水中和体温下进行压缩测试, 以尽可能模仿体内条件。3D 打印和机械测试之间不涉及干燥步骤。在自然组织中, 观察到的是孔隙率梯度, 而不是一个均匀的孔径。承重的自然组织的压缩值也是如此, 因为压缩模量取决于年龄、性别和测试位置。

本文研究的优点是, 通过水凝胶油墨组合和三维印刷工艺, 可以控制和定制三维多孔支架的最终孔隙率和压缩模量值。该协议是灵活的, 可以根据具体要求进行修改。3D 打印是一种功能强大的技术, 可在未来探索开发具有复杂结构和成分特征的脚手架。多材料点胶可以通过控制支架的组成、细胞浓度或生长因子、结构特征 (如方向性或孔隙率)、不同的机械性能和降解率来引入旋转。部分的3D 结构。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了 Knut 和 Alice Walenberg 基金会 (Wallenberg Wood 科学中心)、瑞典研究理事会、VR (Bi顾名思义、DNR 2016-05709 和 DNR 2017-04254) 的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mL syringe Structur3D Printing
Alginic acid sodium salt Sigma-Aldrich 9005-38-3
Anhydrous calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
Clamps, three pronged, Talon VWR 241-0404 102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm
Cura 2.4.0 Ultimaker Free slicing software
Discov3ry Complete Structur3D Printing Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder
Gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O Sigma-Aldrich 111-30-8
homogenizer SPX APV-2000
Instron 5960 Instron Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C,
Physica MCR 301 rheometer Anton Paar CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C
Sorvall Lynx 6000 centrifuge AB Ninolab s/n 41881692 F12-rotor (6x500 ml)
stainless steel nozzle Structur3D Printing 800, 600 and 400 µm
thingsinverse MakerBot's  sharing and downloading 3D printable things in form of stl files
ultra sonication Qsonica, LLC Q500
Unbarked wood chips Norway spruce(Picea abies) dry matter content of 50–55%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds. J. Vis. Exp. (146), e59401, doi:10.3791/59401 (2019).

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