Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

3D afgedrukt poreuze Cellulose nanocomposietmaterialen Hydrogel steigers

Published: April 24, 2019 doi: 10.3791/59401

Summary

De drie essentiële stappen van dit protocol zijn i) ontwikkeling van de juiste samenstelling en consistentie van de cellulose hydrogel inkt, ii) 3D printen van steigers in diverse poriën structuren met trouw van goede vorm en de afmetingen en de iii) demonstratie van de mechanische eigenschappen in gesimuleerde lichaam voorwaarden voor regeneratie van het kraakbeen.

Abstract

Dit werk toont het gebruik van driedimensionale (3D) afdrukken op het produceren van poreuze kubieke steigers met cellulose nanocomposietmaterialen hydrogel inkt, met gecontroleerde poriënstructuur en mechanische eigenschappen. Cellulose nanokristallen (CNCs, 69.62 wt %) gebaseerde hydrogel inkt met matrix (natriumalginaat en gelatine) werd ontwikkeld en 3D op steigers met uniforme en kleurovergang poriënstructuur (110-1100 µm) gedrukt. De steigers toonde compressie modulus in het bereik van 0.20-0,45 gesimuleerd MPa wanneer getest omstandigheden in vivo (in gedistilleerd water bij 37 ° C). De porie-grootte en de compressie modulus van de 3D steigers die gepaard gaan met de eisen die nodig zijn voor kraakbeen regeneratie toepassingen. Dit werk toont aan dat de consistentie van de inkt kan worden gecontroleerd door de concentratie van de precursoren en porositeit kan worden gecontroleerd door het 3D afdrukproces en beide van deze factoren bepaalt in ruil daarvoor de mechanische eigenschappen van het 3D afgedrukt poreuze hydrogel steiger. Dit proces-methode kan daarom worden gebruikt om fabriceren structureel en qua samenstelling aangepaste steigers volgens de specifieke behoeften van patiënten.

Introduction

Cellulose is een polysaccharide, bestaande uit lineaire ketens van β (1-4) gekoppelde D-glucose-eenheden. Het is de meest voorkomende natuurlijke polymeer op aarde en wordt gewonnen uit een verscheidenheid van bronnen, met inbegrip van zeedieren (b.v., manteldieren), planten (bijv. hout, katoen, tarwestro) en bacteriële bronnen, zoals algen (bijvoorbeeld Valonia), schimmels, en zelfs Amoebe (protozoa )1,2. Cellulose nanofibers (CNF) en cellulose nanokristallen (CNC) met ten minste één dimensie op nanoschaal zijn verkregen door middel van mechanische behandelingen en zure hydrolyse van cellulose. Zij beschikken niet alleen over de eigenschappen van cellulose, zoals potentieel voor chemische modificatie, lage toxiciteit, biocompatibiliteit, biologisch afbreekbaar en hernieuwbare, maar heeft ook kenmerken van de nanoschaal zoals hoge specifieke oppervlakte, hoge mechanische eigenschappen , rheologische en optische eigenschappen. Deze aantrekkelijke eigenschappen hebben CNFs en CNCs geschikt voor biomedische toepassingen, voornamelijk in de vorm van 3-dimensionale (3D) hydrogel steigers3. Deze steigers vereist aangepaste afmetingen met gecontroleerde poriënstructuur en onderling verbonden porositeit. Onze fractie en anderen hebben gemeld 3D poreuze cellulose nanocomposieten bereid door gieten, electrospinning en trekkers4,5,,6,,7,8. Echter controle over de structuur van de porie en fabricage van complexe geometrie wordt niet bereikt door deze traditionele technieken.

3D printen is een additief productietechniek, waarin 3D-objecten worden gemaakt laag voor laag door de computergestuurde afzetting van de inkt-9. De voordelen van 3D printen op traditionele technieken omvat ontwerpvrijheid, gecontroleerde macro en micro afmetingen, fabricage van complexe architecturen, aanpassing en reproduceerbaarheid.  Daarnaast biedt 3D printen van CNFs en CNCs ook schuintrekken-geïnduceerde uitlijning van nanodeeltjes, voorkeur directionaliteit, kleurovergang porositeit en kan gemakkelijk worden uitgebreid tot 3D bioprinting10,11,12, 13 , 14 , 15. de dynamiek van CNCs uitlijning tijdens het afdrukken in 3D geweest rapporteerde onlangs,16,17. Vooruitgang op het gebied van bioprinting hebben inschakelen 3D bedrukte weefsels en organen ondanks de betrokken uitdaging zoals keuze en concentratie van levende cellen en groeifactoren, samenstelling van de inkt van de vervoerder, afdrukken van druk en mondstuk diameters18 ,19,20.

De porositeit en druksterkte van kraakbeen regeneratieve steigers zijn belangrijke eigenschappen die dicteert de efficiëntie en prestaties. Poriegrootte speelt een belangrijke rol voor de hechting, differentiatie en proliferatie van cellen, alsook wat betreft de uitwisseling van voedingsstoffen en metabolische afvalstoffen21. Echter, er is geen duidelijke poriegrootte die kan worden beschouwd als een ideale waarde, sommige studies bleek hoger topicale met kleinere poriën, terwijl anderen betere regeneratie van het kraakbeen met grotere poriën toonde. Macroporiën (< 500 µm) weefsel mineralisatie-, nutriënten aan- en afvoer van de afvalstoffen te vergemakkelijken terwijl micropores (150-250 µm) cel gehechtheid en betere mechanische eigenschappen22,23 vergemakkelijken. De geïmplanteerde steiger moet voldoende mechanische integriteit vanaf het moment van behandeling, implantatie en tot de voltooiing van het gewenste doel. De statistische druksterkte modulus voor natuurlijke articulair kraakbeen is gemeld dat in de range van 0.1-2 MPa afhankelijk van leeftijd, geslacht en geteste locatie4,24,25,26,27 2928, ,.

In onze eerdere werk11, werd 3D printen gebruikt voor het fabriceren van poreuze bioscaffolds van een dubbele kruisverwijzende interpenetratie van polymeer network (IPN) van een hydrogel inkt met versterkte CNCs in een matrix van natriumalginaat en gelatine. Het 3D printen traject is geoptimaliseerd om 3D steigers met uniforme en kleurovergang porie structuren (80-2,125 µm) waar nanokristallen oriënteren bij voorkeur in de afdrukken richting (mate van oriëntatie tussen 61-76%). Hier presenteren wij onze de voortzetting van dit werk en toont het effect van de porositeit op de mechanische eigenschappen van 3D afgedrukt hydrogel steigers in gesimuleerde lichaam voorwaarden. CNCs hier, gebruikt werden eerder gemeld door ons cytocompatible en niet-toxisch (dat wil zeggen, celgroei na 15 dagen incubatie was bevestigd30). Bovendien, steigers bereid via freeze-drying met behulp van de dezelfde CNCs, natriumalginaat en gelatine toonde hoge poreusheid, hoge opname van fosfaat buffer zoutoplossing en cytocompatibility richting mesenchymale stamcellen5. Het doel van dit werk is om aan te tonen de hydrogel inkt verwerking, 3D printen van poreuze steigers en het testen van de compressie. Schema's van de route van de verwerking is afgebeeld in Figuur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van precursoren

  1. Voorbereiding van cellulose nanokristallen schorsing
    Opmerking: De isolatie van cellulose nanokristallen gebeurt volgens de procedure die is gerapporteerd door Mathew, et al.30.
    1. Verdunde 17 wt % opschorting van cellulose nanokristallen 2 wt % door het toevoegen van gedestilleerd water om een totaal volume van 2 L. Mix grondig met behulp van ultra ultrasoonapparaat en gebruik kleinere batches (250-300 mL) voor het efficiënt mengen.
    2. Doorgeven van de sonified ophanging door middel van de homogenizer 10 keer bij een druk van 500-600 bar. Op dit punt wordt een dikke transparante gel van 2 wt % cellulose nanokristallen verkregen.
    3. Concentreren 2 wt % cellulose nanokristallen gel tot 11 wt % via centrifugations bij 24.500 x g gedurende 1,5 h. Decant water uit tussen elke 30 min.
      Opmerking: Experiment kan hier worden gepauzeerd.
  2. Voorbereiding van matrix fasen
    1. Bereiden homogene oplossing van 6 wt % natriumalginaat (SA) in gedistilleerd water van 60 ° C onder continu roeren.
    2. Bereiden homogene oplossing van 12 wt % gelatine (Gel) in gedistilleerd water van 60 ° C onder continu roeren.
      Opmerking: Een volume van 20 mL voorbereiden matrix oplossingen en bewaar in de koelkast.
  3. Voorbereiding van crosslinkers
    1. Bereid de oplossing van 3 wt % calcium chloride in gedistilleerd water op kamertemperatuur onder continu roeren.
    2. Bereid de oplossing van 3 wt % Glutaaraldehyde in gedistilleerd water op kamertemperatuur onder continu roeren.
      Opmerking: Een volume van 50 mL voorbereiden crosslinking oplossingen en bewaar op kamertemperatuur. Verwijzen naar de Tabel van materialen voor leveranciersgegevens. Experiment kan hier worden gepauzeerd.

2. voorbereiding van hydrogel inkt

  1. 40 mL hydrogel inkt in een polystyreen container voor te bereiden door het mengen van 11 wt % CNC, 6 wt % SA en 12 wt % Gel te verkrijgen van een natte (wt %) samenstelling van CNC/SA/Gel/Water: 6.87/1.50/1.50/90.12.
  2. Verwarm het mengsel tot 40 ° C en mix met een spatel tot een gladde pasta wordt verkregen.
  3. Breng het mengsel in een injectiespuit 60 mL. Laat het mengsel door middel van een reeks van sproeiers met verschillende diameters in een andere 60 mL spuit, met behulp van mechanische klem. Herhaal dit proces totdat soepel geëxtrudeerde filamenten van hydrogel inkt worden verkregen. Begin met mondstuk met een grootste diameter van 800 µm, gevolgd door de 600 µm en 400 µm.
  4. Zachtjes centrifuge (4000 x g) de spuit gevuld met hydrogel inkt verwijderen gevangen lucht.
    Opmerking: Experiment kan hier worden gepauzeerd.

3. meting van de reologische eigenschappen hydrogel

NTE: Uitvoeren de Rheologische eigenschappen met behulp van een soepele kegel-op-plaat geometrie, CP25-2-SN7617, diameter 25 mm, 2 ° nominale hoek en hoogte van de kloof 0.05 mm bij 25 ° C.

  1. Inschakelen van de rheometer, luchtcompressor en temperatuur controle box. Initialiseren van de software.
  2. Monteren van het meetinstrument in het rheometer en instellen van nul-gap.
  3. Diepte ongeveer 1 mL van de hydrogel inkt op het platform rheometer.
  4. De viscositeit als een functie van shear rate te meten. Selecteer de shear rate bereik uit 0.001 tot 1.000.
  5. Na de meting wordt gedaan, reinigen van het rheometer platform en meetinstrument. Extruderen 1 mL verse hydrogel inkt weer op het rheometer platform.
  6. Meten van opslag modules (G′) en verlies modules (G″) als een functie van shear stress bij een frequentie van 1 Hz. Selecteer de schuifspanning bereik uit 103 tot en met 107.
  7. Zodra de tests zijn voltooid, kopieer de gegevens naar een tekstbestand en plot Rheologische krommen in een logaritmische schaal.

4. file voorbereiding voor afdrukken in 3D

Opmerking: Cura 2.4.0 software wordt gebruikt voor het ontwerpen van 3D-steigers (20 mm3) hebben drie soorten poriën. 1-uniform poriën van 0,6 mm, 2-uniform poriën van 1,0 mm en 3-verloop poriën van bereik van 0.5-1 mm.

  1. Download van stereolithografie (stl) bestand van een stevige kubus van thingsinverse.com en open het bestand in Cura.
  2. Klik op het geladen model en verplaats het naar X/Y/Z: 0/0/0 mm. Klik op schaal, uncheck de doos voor uniforme schalen en stel de afmetingen op X/Y/Z: 20/20/20 mm. Klik op draaien en draai de kubus door 45 ° in XY-vlak.
  3. In het zijpaneel, in mondstuk & materiaal, Selecteer 0,4 mm en plak van het profiel. Discov3ry volledige als de printer selecteren
  4. Selecteer in het zijpaneel, aangepast voor Printerinstelling. Voer onder kwaliteit sectie 0.2 mm voor alle sub-secties. Voer onder de sectie van de Shell , 0 mm voor alle sub-secties. Voer onder materiaal sectie 26 ° C voor temperatuur, 1 mm Diameter en 100% stromen. Geef 30 mm/s als Afdruksnelheden en 120 mm/s als Reizen snelheidonder de snelheid sectie. Onder gedeelte, uncheck de doos voor Ondersteuning inschakelen. Onder Bouwen plaat hechting sectie Selecteer rok, voert 3 mm als de Afstand van de rok en 150 mm als rok/rand minimumlengte.
  5. Voor steigers met uniforme poriegrootte, 0,6 of 1 mm "Infill" lijn afstand invoeren en selecteer "Infill" rasterpatroon.
  6. Voor kleurovergang porositeit steigers, wordt samenvoegen en groeperen van hulpmiddel gebruikt. Klik met de rechtermuisknop het geladen model, selecteer Meerdere modellen, typ 2 en druk op OK. Elk model als X/Y/Z schaal: 20/20/7 mm. plaats de modellen boven op elkaar. Typ "Infill" lijn afstand als 0.3, 0,5 en 0,7 mm voor onder-, Midden- en bovenkant model, respectievelijk. Selecteer alle drie de modellen (Ctrl + A), klik met de rechtermuisknop en klik op Groep modellen.
  7. De modellen op de zeker Digitaal (SD) kaart opgeslagen. Cura automatisch opslaan als gcode die kan worden gelezen door de printer.

5. 3D printen poreuze steigers

  1. De verbindingsleiding invoegen de nozzle-houder en 400 µm mondstuk verbinden. Niveau de plaat te bouwen om de juiste afstand tussen de build plaat en mondstuk.
  2. Laden van de gecentrifugeerde spuit in de cartridge en sluit deze aan de andere kant van de verbindingsleiding.
  3. Plaats de SD-kaart in de printer, selecteer snel opruimen en start de hydrogel inkt wissen tot het begint te extruderen van de verstuiver. Blijven zuiveren voor 2-3 min te verkrijgen van een homogene stroom.
  4. Van de SD-kaart, selecteert u de opgeslagen bestanden voor uniforme en kleurovergang porositeit steigers en beginnen met afdrukken. Houd een oogje op het tarief van de extrusie. Indien nodig, de snelheid en stroom tarief dienovereenkomstig aanpassen. Gebruik voor kleinere poriegrootte, sneller snelheid, gecombineerd met lage stroomsnelheid (50 mm/s en 70%).
    Opmerking: Raak niet de 3D gedrukte steigers.

6. Crosslinking van 3D afgedrukt steigers

  1. Nadat het 3D printen voltooid is, voeg voorzichtig 3 wt % CaCl2 druppels naar het schavot totdat het volledig nat wordt. 5 min wachten.
  2. Zeer zorgvuldig overbrengen de steiger van de printer naar een 50 mL flacon gevuld met 3 wt % CaCl2. Laten overnachten.
  3. Grondig wassen met gedestilleerd water en breng het schavot aan een 50 mL-container gevuld met 3 wt % Glutaaraldehyde. Laten overnachten.
  4. Grondig wassen en op te slaan van de 3D gedrukte steiger in gedestilleerd water.

7. compressie testen

Opmerking: Voer compressie tests met 100 N load cel in water bij 37 ° C.

  1. Vul de container uitgerust met Onderdompelbare compressie basisplaat met 2 L water en opstarten van het verwarmingssysteem tot 37 ° C.
  2. Initialiseren Bluehill universele software en instellen van de testmethode. Selecteert u rechthoekige specimen geometrie en kies de optie dimensies invoeren voor het testen van elk monster.  Stelt het tarief van de stam naar 2 mm/min en einde van resultaat als de druksterkte stam 80% samen met 90 N kracht.
  3. Selecteer in de sectie meting kracht, verplaatsing, drukspanning en druksterkte stam. Kies de optie om gegevens te exporteren als tekstbestanden voor toekomstige uitzetten.
  4. Het nulpunt van extensie instellen met behulp van de besturingselementen jog tot lagere crosshead plaat zo dicht mogelijk op basis van de plaat.
  5. Meten en Let op de afmetingen van de monsters moeten worden getest.
  6. Wanneer de temperatuur van het water tot 37 ° C bereikt, leg het monster op de grondplaat.  Beveilig het monster door het bewegen van de crosshead plaat, zodat deze begint te raken van het monster.
  7. Omhoog het waterbad, zodat de platen met de monster tussen hen worden ondergedompeld in water.
  8. Voer monster naam en afmetingen. Start de test.
  9. Nadat de test voltooid is, eerst het waterbad omlaag en vervolgens verhogen de crosshead plaat.
  10. Verwijder het monster en de stukken, als een, beide de platen schoon en laden van een nieuw monster.
  11. Nadat alle monsters worden getest, de ruwe gegevens exporteren. Plot drukspanning vs. druksterkte stam curven en bepalen de druksterkte tangent modulus op stam waarden van 1-5% en 25-30%.
    Opmerking: Plaats de kleurovergang kubus op een zodanige wijze dat de grotere gaten worden geconfronteerd met de grondplaat van briefpapier.
    Eerst veilige het schavot tussen de handvatten en vervolgens start/stop de meting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CNCs gebaseerd nanocomposietmaterialen hydrogel inkt toont een sterke niet-Newtoniaanse schuintrekken uitdunnen van gedrag (Figuur 2een). De schijnbare viscositeit van 1.55 × 105 Pa.s met een lage schuintrekken snelheid (0,001 s-1) daalt door vijf Ordes van grootte een waarde van 22.60 Pa.s met een snelheid van de afschuiving van 50 s-1 (≈50 s-1 wordt een typische schuintrekken tarief ervaren tijdens 3D printen)31 . De hydrogel inkt een solide gedrag van Visco, vertoont als de opslag modulus G' (4.42 × 107 Pa) is een orde van grootte groter is dan het verlies modulus G'' (8.26 × 106 Pa) bij lage shear stress, met een welomschreven dynamische opbrengst stress waarde (G'= G'') voor 5.59 × 104 Pa (Figuur 2b). De 3D afgedrukt poreuze nanocomposietmaterialen hydrogel steigers afgebeeld in Figuur 3 zijn. Voor alle de gedrukte steigers, zijn de vorm en de afmetingen zeer goed behouden na het afdrukken en na dubbele crosslinking. De grootte van de poriën van de steigers, 110-1100 µm, zijn in het bereik van 100-400 µm, dat wordt beschouwd als een benchmark voor32regeneratie kraakbeen.

De 3D gedrukte steigers werden getest in compressie. Dit is de aangewezen wijze van mechanische testen voor kraakbeen materialen, omdat de rol van natuurlijke kraakbeen te dragen lasten in compressie. Om na te bootsen de omstandigheden in vivo, werden steigers getest in water bij 37 ° C. Tabel 1 en Figuur 4een vertegenwoordigt de druksterkte gegevens verkregen voor verschillende poreuze nanocomposietmaterialen hydrogel steigers op de snelheid van een stam van 2 mm/min. Bij lage spanning tarieven (1-5%), de druksterkte modulus (~ 0,17 MPa) is min of meer vergelijkbaar voor alle types poreuze steigers. Dit toont aan dat het elastische karakter van de hydrogel inkt behouden zelfs in de aanwezigheden van de macroporiën blijft. Echter bij hoge stam tarieven (25-30%), de hoogste absolute waarde van 0,45 MPa wordt opgehaald voor referentie steiger met geen poreusheid. Echter, zodra de poriegrootte toeneemt, afneemt de absolute waarde, als gevolg van de afname van de dichtheid met vermelding van de verwachte verhouding tussen porositeit van de steigers en de bijbehorende mechanische eigenschappen. In het geval van de kleurovergang poreuze steigers is de absolute waarde hoger (0,34 MPa) in vergelijking met uniforme poreuze steigers (0,20 en 0,26 MPa) vanwege de aanwezigheid van porie kleinere en meer solide muren. Bovendien, de druksterkte modulus van de 3D hydrogel steigers toeneemt naarmate de compressie tarief toeneemt (Figuur 4,b), tentoonstellen en het nabootsen van de viscoelasticity van natuurlijke kraakbeen weefsels die wordt beschouwd als gunstig voor de belasting dragende steigers33. De druksterkte modulus van 0,20 MPa stam snelheid van 2 mm/min stijgt tot 0.35 MPa op 5 mm/min en verder stijgt tot 0.47 MPa op 120 mm/min en is in het bereik gemeld voor natuurlijke kraakbeen (dat wil zeggen, druksterkte modulus van 0.1-2 MPa).

Figure 1
Figuur 1 . Schema's van de verwerking route. (een) voorbereiding van de nanocomposietmaterialen hydrogel inkt. (b) 3D printen poreuze steigers. (c) dubbele crosslinking van 3D afgedrukt steigers. (d) compressie testen van 3D poreuze steigers in water bij 37 ° C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Log-log percelen nanocomposietmaterialen hydrogel inkt. (een) viscositeit vs. shear rate en (b) G' en G'' vs. schuifspanning. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . 3D afgedrukt poreuze steigers. Schaal: 500 µm. (een) verwijzing met geen gaten. (b) 1 mm poriegrootte. (c) 0.60 mm poriegrootte. (d) verloop porositeit 110-800 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Representatieve spanning-spanning curven voor 3D afgedrukt poreuze nanocomposietmaterialen hydrogel steigers. (een) van 2 mm/s. (b) bij verschillende stam tempo constante spanning porie tarieven voor 1 mm grootte steiger. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Porie doelgrootte (µm) Gemiddelde poriegrootte (µm) Druksterkte modulus op 1-5% stam (MPa) Druksterkte modulus bij 25-30% stam (MPa)
Referentie 0 0,19 ± 0,04 0,45 ± 0,03
1.000 850-1100 0,17 ± 0,02 0,2 ± 0,01
600 480-650 0.16 ± 0,01 0,26 ± 0,05
Verloop 110-800 0.16 ± 0,01 0,34 ± 0,04

Tabel 1. Compressie gegevens voor 3D geprint nanocomposietmaterialen hydrogel steigers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3D printen vereist geschikt Rheologische eigenschappen van de hydrogel inkt. De hoge viscositeit inkt vergt extreme druk voor de extrusie terwijl lage viscositeit inkt niet zijn vorm na extrusie behouden zal. De viscositeit van de hydrogel inkt kan worden gecontroleerd door middel van de concentratie van de ingrediënten. In vergelijking met onze vorige werk11, wordt het gehalte aan vaste stof van de hydrogel inkt verhoogd van 5,4 tot 9,9% van de wt resulterend in geconcentreerde hydrogel inkt die helpt bij het verbeteren van de resolutie van de afgedrukte steiger. Opgemerkt kan worden dat, in tegenstelling tot lange flexibele CNFs, stijve staaf zoals CNCs inkten met hogere vaste inhoud op een bepaalde viscositeit te wijten aan de afwezigheid van fysieke verwikkelingen14kan produceren. Een ander belangrijk aspect waarmee bedrukbaarheid is de homogeniteit van de inkt. Er werd opgemerkt dat de inkt van de hydrogel bij een temperatuur van 40 ° C verwarming bevordert het homogeen mengen van de CNCs met de fase van de matrix. Om verder de gladheid van de hydrogel inkt, werd het doorgegeven door middel van een aantal sproeiers, beginnend met de grootste diameter van 800 µm, dan 600 µm en ten slotte 400 µm. Tijdens deze passen, kan de verstuiver verstopt worden die aangeeft de aanwezigheden van grote brokken, maar na deze passen de hydrogel inkt geëxtrudeerd moeiteloos in de vorm van een continue gloeidraad. De beweging van de sproeier te verkrijgen van 3D afgedrukte constructies is ook van groot belang, zoals blijkt uit onze eerdere werk11. Het mondstuk traject moet Vermijd repetitieve bewegingen en overtollige afzettingen van de hydrogel inkt zodat de resolutie van de 3D print is bewaard gebleven.

De poreusheid verkregen in de steigers 3D afgedrukte-hydrogel is in het acceptabele bereik ten opzichte van de gerichte poreusheid (tabel 1). Een exacte overeenkomst niet kan worden verwacht vanwege de zwelling aard van de hydrogel inkt.  De consistentie van de inkt hydrogel is een belangrijke factor, vooral als ex-situ crosslinking gebeuren moet, dat wil zeggen crosslinking na het drukken van de 3D constructie. Er werd opgemerkt dat de hydrogel inkt was geconcentreerd genoeg (stof gehalte van 9.9 wt %) om de vorm, structuur en afmetingen tijdens en na het afdrukproces.

De poriegrootte van het schavot speelt een essentiële rol in cel interacties, diffusie van zuurstof en afval verwijdering samen met haar mechanische eigenschappen uit te voeren en de gewenste functionaliteit ondersteunen. Steigers met kleurovergang porositeit hebben de mogelijkheid om beter vertegenwoordigen de feitelijke omstandigheden in vivo waar cellen worden blootgesteld aan lagen van verschillende weefsels met verschillende structurele eigenschappen22,-23,34. De porositeit en mechanische eigenschappen zijn omgekeerd verwant, maar de samenstelling van de hydrogel steiger kan een belangrijke rol spelen. CNCs is geselecteerd als het belangrijkste ingrediënt van de hydrogel inkt vanwege haar bekende mechanische eigenschappen2,35,,36. De hydrogel inkt hier verzonnen, bezitten zijn elasticiteit zelfs in de aanwezigheden van de poriën, heeft een optimale poriegrootte (110-1100 µm) en een geschikte druksterkte modulus (0.20-0,45 MPa) vereist voor kraakbeen regeneratie toepassingen.

Compressie testen werd gedaan in water en op lichaamstemperatuur aan de omstandigheden in vivo zoveel mogelijk nabootsen. Er was geen drogen stap betrokken tussen 3D printen en mechanische testen. In natuurlijke weefsels, wordt een porositeit verloop in plaats van één uniforme poriegrootte waargenomen. Hetzelfde geldt voor de waarden van de compressie voor dragende natuurlijke weefsels, zoals de druksterkte van de absolute waarde hangt af van de leeftijd, geslacht en de geteste locatie.

Het voordeel van de hier gepresenteerde studie is dat de laatste porositeit en druksterkte modulus waarden van 3D poreuze steiger kunnen worden gecontroleerd en via hydrogel inkt samenstelling en 3D drukproces aangepast. Dit protocol is flexibel en kan worden gewijzigd volgens de specifieke eisen. Het 3D printen is een krachtige techniek en in de toekomst kan worden verkend om steigers met complexe structurele en compositorische functies. Multi materiële toedieningseenheden kan introduceren revolutie door het beheersen van de samenstelling van de steigers, concentratie van cellen of groeifactoren, structurele kenmerken zoals directionaliteit of porositeit, mechanische eigenschappen en de aantasting van het tarief in verschillende delen van de 3D constructies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie wordt financieel gesteund door Knut en Alice Wallenberg Foundation (Wallenberg hout Science Center), Zweedse Raad voor onderzoek, VR (DNR 2016-05709, Bioheal en DNR 2017-04254).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mL syringe Structur3D Printing
Alginic acid sodium salt Sigma-Aldrich 9005-38-3
Anhydrous calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
Clamps, three pronged, Talon VWR 241-0404 102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm
Cura 2.4.0 Ultimaker Free slicing software
Discov3ry Complete Structur3D Printing Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder
Gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O Sigma-Aldrich 111-30-8
homogenizer SPX APV-2000
Instron 5960 Instron Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C,
Physica MCR 301 rheometer Anton Paar CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C
Sorvall Lynx 6000 centrifuge AB Ninolab s/n 41881692 F12-rotor (6x500 ml)
stainless steel nozzle Structur3D Printing 800, 600 and 400 µm
thingsinverse MakerBot's  sharing and downloading 3D printable things in form of stl files
ultra sonication Qsonica, LLC Q500
Unbarked wood chips Norway spruce(Picea abies) dry matter content of 50–55%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moon, R. J., Martini, A., Nairn, J., Simonsen, J., Youngblood, J. Cellulose nanomaterials review: structure, properties and nanocomposites. Chemical Society Reviews. 40 (7), 3941-3994 (2011).
  2. Dufresne, A. Nanocellulose: a new ageless bionanomaterial. Materials Today. 16 (6), 220-227 (2013).
  3. Chinga-Carrasco, G. Potential and limitations of nanocelluloses as components in biocomposite inks for three-dimensional bioprinting and for biomedical devices. Biomacromolecules. 19 (3), 701-711 (2018).
  4. Naseri, N., Poirier, J., Girandon, L., Fröhlich, M., Oksman, K., Mathew, A. P. 3-Dimensional porous nanocomposite scaffolds based on cellulose nanofibers for cartilage tissue engineering: tailoring of porosity and mechanical performance. Royal Society of Chemistry Advances. 6 (8), 5999-6007 (2016).
  5. Naseri, N., Deepa, B., Mathew, A. P., Oksman, K., Girandon, L. Nanocellulose-Based Interpenetrating Polymer Network (IPN) Hydrogels for Cartilage Applications. Biomacromolecules. 17 (11), 3714-3723 (2016).
  6. Naseri, N., Mathew, A. P., Girandon, L., Fröhlich, M., Oksman, K. Porous electrospun nanocomposite mats based on chitosan-cellulose nanocrystals for wound dressing: effect of surface characteristics of nanocrystals. Cellulose. 22 (1), 521-534 (2015).
  7. Xing, Q., Zhao, F., Chen, S., McNamara, J., DeCoster, M. A., Lvov, Y. M. Porous biocompatible three-dimensional scaffolds of cellulose microfiber/gelatin composites for cell culture. Acta Biomaterialia. 6 (6), 2132-2139 (2010).
  8. Nandgaonkar, A., Krause, W., Lucia, L. Fabrication of cellulosic composite scaffolds for cartilage tissue engineering. Nanocomposites for musculoskeletal tissue regeneration. , Elsevier. 187-212 (2016).
  9. Gross, B. C., Erkal, J. L., Lockwood, S. Y., Chen, C., Spence, D. M. Evaluation of 3D printing and its potential impact on biotechnology and the chemical sciences. Analytical Chemistry. 86 (7), 3240-3253 (2014).
  10. Markstedt, K., Mantas, A., Tournier, I., Martínez Ávila, H., Hägg, D., Gatenholm, P. 3D bioprinting human chondrocytes with nanocellulose-alginate bioink for cartilage tissue engineering applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
  11. Sultan, S., Mathew, A. P. 3D printed scaffolds with gradient porosity based on a cellulose nanocrystal hydrogel. Nanoscale. 10, 4421-4431 (2018).
  12. Sultan, S., Siqueira, G., Zimmermann, T., Mathew, A. P. 3D printing of nano-cellulosic biomaterials for medical applications. Current Opinion in Biomedical Engineering. 2, 29-34 (2017).
  13. Sultan, S., Abdelhamid, H. N., Zou, X., Mathew, A. P. CelloMOF: Nanocellulose Enabled 3D Printing of Metal-Organic Frameworks. Advanced Functional Materials. , 1805372-1805384 (2018).
  14. Siqueira, G., et al. Cellulose Nanocrystal Inks for 3D Printing of Textured Cellular Architectures. Advanced Functional Materials. 27 (12), 1604619-1604629 (2017).
  15. Wang, J., et al. All-in-One Cellulose Nanocrystals for 3D Printing of Nanocomposite Hydrogels. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2353-2356 (2018).
  16. Hausmann, M. K., et al. Dynamics of Cellulose Nanocrystal Alignment during 3D Printing. ACS Nano. 12 (7), 6926-6937 (2018).
  17. Liu, Y., et al. Nanoscale assembly of cellulose nanocrystals during drying and redispersion. ACS Macro Letters. 7 (2), 172-177 (2018).
  18. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  19. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature communications. 5, 3935 (2014).
  20. Xia, Z., Jin, S., Ye, K. Tissue and organ 3D bioprinting. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (4), 301-314 (2018).
  21. Zhang, Q., Lu, H., Kawazoe, N., Chen, G. Pore size effect of collagen scaffolds on cartilage regeneration. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2005-2013 (2014).
  22. Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: role of porosity and pore size. Tissue Engineering, Part B: Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
  23. Bružauskaitė, I., Bironaitė, D., Bagdonas, E., Bernotienė, E. Scaffolds and cells for tissue regeneration: different scaffold pore sizes-different cell effects. Cytotechnology. 68 (3), 355-369 (2016).
  24. Zhang, L., Hu, J., Athanasiou, K. A. The role of tissue engineering in articular cartilage repair and regeneration. Critical Reviews™ in Biomedical Engineering. 37 (1-2), (2009).
  25. Athanasiou, K., Rosenwasser, M., Buckwalter, J., Malinin, T., Mow, V. Interspecies comparisons of in situ intrinsic mechanical properties of distal femoral cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 9 (3), 330-340 (1991).
  26. Schinagl, R. M., Gurskis, D., Chen, A. C., Sah, R. L. Depth-dependent confined compression modulus of full-thickness bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 15 (4), 499-506 (1997).
  27. Athanasiou, K., Niederauer, G., Schenck, R. Biomechanical topography of human ankle cartilage. Annals Biomedical Engineering. 23 (5), 697-704 (1995).
  28. Athanasiou, K. A., Liu, G. T., Lavery, L. A., Lanctot, D. R., Schenck, R. C. Biomechanical topography of human articular cartilage in the first metatarsophalangeal joint. Clinical Orthopaedics and Related Research. 348, 269-281 (1998).
  29. Guilak, F., Jones, W. R., Ting-Beall, H. P., Lee, G. M. The deformation behavior and mechanical properties of chondrocytes in articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (1), 59-70 (1999).
  30. Mathew, A. P., Oksman, K., Karim, Z., Liu, P., Khan, S. A., Naseri, N. Process scale up and characterization of wood cellulose nanocrystals hydrolysed using bioethanol pilot plant. Industrial Crops and Products. 58, 212-219 (2014).
  31. Compton, B. G., Lewis, J. A. 3D-printing of lightweight cellular composites. Advanced Materials. 26 (34), 5930-5935 (2014).
  32. Sarem, M., Moztarzadeh, F., Mozafari, M. How can genipin assist gelatin/carbohydrate chitosan scaffolds to act as replacements of load-bearing soft tissues. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 635-643 (2013).
  33. Chia, H. N., Hull, M. Compressive moduli of the human medial meniscus in the axial and radial directions at equilibrium and at a physiological strain rate. Journal of orthopaedic research. 26 (7), 951-956 (2008).
  34. Zhang, K., Fan, Y., Dunne, N., Li, X. Effect of microporosity on scaffolds for bone tissue engineering. Regenerative biomaterials. 5 (2), 115-124 (2018).
  35. Lin, N., Dufresne, A. Nanocellulose in biomedicine: Current status and future prospect. European Polymer Journal. 59, 302-325 (2014).
  36. Domingues, R. M., Gomes, M. E., Reis, R. L. The potential of cellulose nanocrystals in tissue engineering strategies. Biomacromolecules. 15 (7), 2327-2346 (2014).

Tags

Bioengineering kwestie 146 3D printen cellulose nanokristallen hydrogel poreuze steigers biomedische applicaties compressie modulus
3D afgedrukt poreuze Cellulose nanocomposietmaterialen Hydrogel steigers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed More

Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds. J. Vis. Exp. (146), e59401, doi:10.3791/59401 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter