Summary
このプロトコルの 3 つの重要なステップは、i) 開発右の組成と細孔構造と忠実度良い形と寸法、iii) のデモとセルロースのヒドロゲル インク、ii) 3 D に様々 な足場の印刷の一貫性、軟骨再生のための擬似生体条件の機械的性質は。
Abstract
この作品では、立方多孔質セルロース ナノコンポジット型ヒドロゲル インクを用いたコントロールされた細孔構造と力学特性を生成する三次元 (3 D) 印刷の使用方法を示します。セルロース微結晶 (Cnc、69.62 wt %)(アルギン酸ナトリウム ・ ゼラチン) に基づいてゲル インクが開発した、制服とグラデーションの細孔構造 (110 1,100 μ m) の足場に 3 D 印刷します。足場を示した圧縮弾性率 0.20 0.45 の範囲で MPa でテストしたときは (37 ° C で蒸留水) の生体内での条件をシミュレートします。細孔径と軟骨再生アプリケーションの要件と一致する 3 D 足場の圧縮弾性率。この作品は、インクの一貫性は、前駆体の濃度によって制御できますと気孔率は、3 D 印刷プロセスによって制御でき、これらの要因の両方は見返り機械を定義を示しますプロパティ 3 d 印刷多孔質ハイドロゲルの足場。このプロセスのメソッドは、患者の特定のニーズに応じてカスタマイズ構造と組成の足場を作製するため使用できます。
Introduction
セルロースは β の鎖 (1-4) リンクされた D-グルコース単位で構成される多糖類です。地球上最も豊富な天然高分子であり、さまざまな海洋動物 (例えば、アステラス製薬)、植物 (例えば、木材、綿、小麦わら) もアメーバ (原生動物、菌類、藻類 (例えば、Valonia) などの細菌のソースなど、ソースから抽出されました。)1,2。ナノファイバー (CNF) とナノスケールの少なくとも 1 つのディメンションを持つセルロース結晶 (CNC) は機械処置・ セルロースからの酸加水分解で得られます。彼らはセルロース化学修飾、低毒性、生体適合性、生分解性、再生可能エネルギーの可能性などの性質を有するだけでなく、高表面積のようなナノスケール特性もあります高い機械的性質、レオロジー的・光学的性質。これらの魅力的な特性をした Cnf と Cnc 生物医学アプリケーションに適した、3 次元 (3 D) の形で主にゲル骨格の3。これらの足場は、コントロールされた細孔構造と相互接続された間隙率とカスタマイズされた寸法を必要とします。当社グループは、他の人は、鋳造、エレクトロスピニング4,5,6,7、8を凍結して作製した三次元多孔性セルロース ナノコンポジットを報告しています。ただし、細孔構造の制御し、複雑な形状の加工は、これらの伝統的な技術によって達成されていません。
3 D プリントは、3 D オブジェクトをインク9コンピューター制御蒸着層を作成、添加剤の製造技術です。伝統的なテクニック 3 D 印刷の利点は、デザインの自由度制御マクロとマイクロの寸法、複雑なアーキテクチャ、カスタマイズ、および再現性の作製に含まれます。 さらに、CNFs と Cnc の 3 D プリントも提供ナノ粒子のせん断誘起配向方向、勾配の気孔率を優先し、3 D バイオプリンティング10、11,12,に簡単に拡張することができます。13,14,15. 最近では、3 D プリントの中に配置されている Cnc の動態報告16,17。3 D 印刷ティッシュおよび器官選択やキャリア インク、印刷圧力とノズル径18 の構成細胞と成長因子の濃度関係の挑戦にもかかわらず、バイオプリンティングの分野の進歩が可能に ,,1920。
気孔率および軟骨再生の足場の強度は、その効率性とパフォーマンスを規定する重要なプロパティです。孔径は、接着、分化、栄養素、代謝廃棄物21の交換と同様に細胞の増殖に重要な役割を果たしています。ただし、理想的な値と見なすことができる明確な細孔径がない、孔径が大きいとより良い軟骨再生を示した他のいくつかの小さな孔を示した高い活性研究します。隙 (< 500 μ m) 孔 (150-250 μ m) を促進細胞接着・優れた機械的性質22,23組織の石灰化、栄養供給、廃棄物の除去を容易にします。注入の足場は、処理時間から十分な力学的整合性を持つ必要があります注入とその目的の目的の完了まで。0.1-2 の範囲にある関節軟骨の天然骨材の圧縮弾性率は報告によって年齢、性別およびテスト位置4,24,25,26,27 MPa ,,2829。
私たち以前仕事で11、3 D プリントはアルギン酸ナトリウムとゼラチンのマトリックスの補強の Cnc を含むゲル インクから二重架橋高分子ネットワーク (IPN) を相互貫入の多孔性 bioscaffolds の作製に使用されました。3 D 印刷経路に制服とグラデーションの細孔構造 (2,125 80 μ m) ナノ結晶が印刷方向 (61-76% 間向きの程度) に好ましく向きの 3 D 足場を達成するために最適化されました。ここでは、我々 は現在この継続作業し、3 D の機械的特性に及ぼす気孔率印刷ハイドロゲルの足場模擬体の状態を示します。ここでは、Cnc は私たちによって cytocompatible と非毒性 (すなわち、細胞増殖確認30インキュベーションの 15 日後) に以前報告されました。また、足場凍結乾燥使用同じ Cnc アルギン酸ナトリウム、ゼラチンを示した高気孔率、高吸収リン酸バッファー生理食塩水と5間葉系幹細胞への細胞の準備。この作業の目的は、ハイドロゲル インク処理、多孔質材料の 3 D 印刷、圧縮テストを示すことです。処理経路の模式図を図 1に示します。
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Protocol
1. 前駆体の調製
- セルロース微結晶懸濁液の準備
注: マシュー、によって報告された手順に従ってセルロース結晶の分離を行うら30。- ナノ結晶セルロースを追加して 2 wt % の希薄 17 wt % サスペンションに蒸留水 2 l. ミックス超超音波処理と使用より小さいバッチ (250-300 mL) を使用して徹底的に効率的なミキシングのための総ボリュームを作成します。
- 500-600 バールの圧力で sonified 濁液、ホモジナイザーの 10 回を渡します。この時点で、2 wt % セルロース結晶の厚さの透明のゲルが得られます。
- 11 wt %1.5 におけるすべての 30 分の間にデカント水 24,500 x gで遠心へのナノ結晶のゲル 2 wt % セルロースを集中します。
注: 実験はここで一時停止することができます。
- マトリックス相の調製
- 連続的に攪拌下 60 ° C で蒸留水で 6 wt % アルギン酸ナトリウム (SA) の均一溶液を準備します。
- 連続的に攪拌下 60 ° C で蒸留水で 12 wt % のゼラチン (ゲル) の均一溶液を準備します。
注: 溶液の 20 mL の容積を準備、冷蔵庫で保存します。
- 塗料の硬化剤の準備
- Wt % 塩化カルシウムの 3 連続的に攪拌下で室温で蒸留水でのソリューションを準備します。
- 連続的に攪拌下で室温で蒸留水で 3 wt % グルタルアルデヒド溶液を準備します。
注: は架橋向け量 50 mL を準備し、常温で保存します。仕入先情報のテーブルの材料を参照してください。実験はここで一時停止することができます。
2. ハイドロゲル インクの準備
- 11 wt %、CNC を混合することによってのポリスチレン容器にゲル インク 40 mL を準備 6 wt % の SA、12 wt % ゲル ウェット (wt %) を取得するにはCNC/SA/ゲル/水の組成: 6.87/1.50/1.50/90.12。
- 滑らかなペーストが得られるまで、ヘラで 40 ° C とミックスに混合物を熱する。
- 60 mL シリンジに混合物を転送します。機械的クランプの助けを借りて、別の 60 mL シリンジに一連の異なる直径を持つノズルを通して混合物を渡します。ハイドロゲル インクのスムーズに押し出されたフィラメントが得られるまで手順を繰り返します。最大径 800 μ m、続いて 600 μ m と 400 μ m ノズルを開始します。
- 軽く遠心分離機 (4,000 x g) を削除するハイドロゲル インク満ちている注射器の空気を閉じ込められています。
注: 実験はここで一時停止することができます。
3. ゲルのレオロジー的性質の測定
NTE: 滑らかなコーン プレート ジオメトリを使用して物性を実行 CP25-2-SN7617、直径 25 mm、2 度公称とギャップ高さ 25 ° C で 0.05 mm
- レオメーター、空気圧縮機、温度コントロール ボックスをオンにします。ソフトウェアを初期化します。
- レオメータの測定ツールをマウントし、ゼロのギャップを設定します。
- レオメータ プラットフォーム上のハイドロゲル インクの約 1 mL を押し出します。
- 剪断速度の関数として粘度を測定します。0.001 から 1000 にせん断率の範囲を選択します。
- 測定が終わったら、レオメータ プラットフォームをきれいにし測定ツール。レオメータ プラットフォームに再び新鮮なハイドロゲル インクの 1 mL を押し出します。
- 周波数 1 Hz。 のせん断応力の関数は 10 からせん断応力範囲を選択として貯蔵弾性率 (み重) と損失係数 (G″) を測定3 107。
- テストが完了すると、テキスト ファイルにデータをコピーし、対数スケールの流動曲線をプロットします。
4. ファイルの 3 D プリントのための準備
注: クーラ 2.4.0 ソフトウェアは、毛穴の 3 つのタイプを持つ 3 D 足場 (20 mm3) を設計するために使用されます。1 制服の 0.6 mm、1.0 mm の 2 制服毛穴、0.5-1 の範囲の 3 グラデーション毛穴毛穴 mm。
- Thingsinverse.com から立方体の stl (ステレオリソグラフィー) ファイルをダウンロードし、クーラでファイルを開きます。
- 読み込まれたモデルをクリックし、X、Y、Z に移動: 0/0/0 mm。 クリックスケール、均一なスケール チェック ボックスをオフし、X、Y、z 寸法を設定: 20/20/20 ミリメートル。 クリック回転キューブを XY 平面に 45 ° 回転し。
- ノズルと材料は、左側のパネルで 0.4 mm を選択し、プロファイルを貼り付けます。プリンターとして完全な Discov3ryを選択します。
- 左側のパネルでプリンターの設定のカスタムを選択します。[品質] セクションで、すべてのサブ セクションの 0.2 mm を入力します。[シェル] セクションで、すべてのサブ セクションの 0 mm を入力します。[素材] セクションで温度、1 mm の直径、100% 流 26 ° C を入力します。[速度] セクションで、印刷速度と走行速度として 120 mm/秒として 30 mm/秒を入力します。サポートセクションの下でサポートの有効化のチェック ボックスをオフします。メッキ密着性のビルドのセクションの下でスカートを選択、スカート/つばの長さとして 3 mmスカート距離として、150 mm を入力します。
- 足場の均一な細孔径を持つため、0.6 または 1 mm面材ラインを入力し、グリッド面材のパターンを選択します。
- グラデーションの気孔率足場結合とグループ化ツールを使用します。読み込むモデルを右クリックして、複数のモデルを選択、2 を入力し、 [ok]を押します。X、Y、Z 各モデルをスケール: 20/20/7 mm。 互いの上にモデルを配置します。0.3、0.5、0.7 mm のインフィルの行間を下部、中間、上部のモデルをそれぞれ入力します。すべての 3 つのモデル (Ctrl + A) を選択して右クリックし、グループ モデルをクリックします。
- 必ずデジタル (SD) カードにモデルを保存します。クーラは自動的にプリンターによって読み取られる gcode として、ファイルを保存します。
5. 3 D 多孔質材料を印刷
- ノズル ホルダーに転送管を挿入し、400 μ m ノズルを接続します。レベル プレートを構築ビルド プレートとノズルの間の正しい距離を取得します。
- カートリッジに遠心シリンジを読み込み、転送管の反対側に接続します。
- プリンターに SD カードを挿入、高速消去を選択し、ハイドロゲル インクのノズルから押し出し始めるまでパージを開始します。均一なフローを取得する 2 〜 3 分の削除を続行します。
- SD カードから足場の制服とグラデーションの気孔率保存したファイルを選択し、印刷を開始します。押出速度に目が離せない。必要な場合は、それに応じて速度と流れの速度を調整します。小さい気孔のサイズ、低流速率 (50 mm/s および 70%) と組み合わせて高速を使用します。
注: 3 D プリントの足場を触れないでください。
6. 3 D の架橋印刷足場
- 3 D 印刷が完了したら、それは完全にウェットになるまで足場に 3 wt % CaCl2滴を追加する優しく。5 分待ちます。
- 非常に慎重に足場をプリンターから 3 wt % CaCl2を入れた 50 mL 容器に転送します。一晩置いておきます。
- 蒸留水で洗し、足場を 3 wt % グルタルアルデヒドを入れた 50 mL 容器に転送します。一晩置いておきます。
- 徹底的に洗浄し、蒸留水で 3 D プリント足場を格納します。
7. 圧縮試験
注: は、37 ° C で水に 100 N ロードセルと圧縮テストを実行します。
- 2 L の水と水中圧縮ベース プレート搭載コンテナーを入力し、37 ° C に到達する暖房システムを開始
- Bluehill ユニバーサル ソフトウェアを初期化し、テスト メソッドを設定します。長方形の試験片形状を選択し、それぞれのサンプルをテストする前に寸法を入力するオプションを選択します。 2 mm/分と結果の末尾に 90 N の力と共に 80% 圧縮ひずみとひずみ速度を設定します。
- 測定では、力、変位、圧縮応力と圧縮ひずみを選択します。将来のプロットにテキスト ファイルとしてデータをエクスポートするオプションを選択します。
- ゼロの拡張ポイントを設定するには、ベース プレートにできるだけ近いクロスヘッド プレートを下げるためジョグ コントロールを使用します。
- 測定し、テストされるべきサンプルの寸法に注意してください。
- 水の温度は 37 ° c に達すると場合、は、ベース プレートにサンプルを配置します。 クロスヘッド プレートのサンプルのタッチを開始に移動しようとしている場合、サンプルを固定します。
- サンプル間にプレートに没頭しているように、風呂の水を移動水。
- サンプル名と寸法を入力します。テストを開始します。
- テストが完了したら、まず風呂の水を下に移動、クロスヘッド プレートを持ち上げます。
- 存在する場合、両方のプレートをきれい、新しいサンプルを読み込むサンプルとその作品を削除します。
- すべてのサンプルをテストすると、raw データをエクスポートします。圧縮応力と圧縮ひずみ曲線をプロットし、ひずみ値 1 5%、25-30% の圧縮の接線弾性率を決定します。
注: は、文房具のベース プレートを大きな穴に直面するようにグラデーションのキューブを配置します。
まず、グリップの間に足場を確保し、測定を開始/停止します。
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Representative Results
Cnc によるナノコンポジット型ヒドロゲル インクは、強い非ニュー トンせん断間伐 (図 2、) の動作を示しています。22.60 Pa.s 50 s-1 (≈50 の-1が 3 D プリントの中に経験豊富な典型的なせん断速度) のせん断速度での値に 5 つの一桁によって 1.55 × 105 Pa.s 低剪断速度 (0.001 秒-1) での見かけの粘度低下31.ハイドロゲル インク貯蔵弾性率 G としての固体粘の展示 '(4.42 × 107 Pa) は損失係数 G を超える大きさの順序「(8.26 × 106 Pa) 低いせん断応力分布、明確な動的降伏点応力の値で (G'= G' ')5.59 × 104 pa (図 2b)。3 D 印刷多孔性ナノコンポジット型ヒドロゲルの足場は、図 3に示す。すべての印刷された足場の形状及び寸法は、非常によく二重架橋結合の後だけでなく、印刷後を保持されます。足場, 110 1,100 μ m の細孔径は、軟骨再生32のためのベンチマークと見なされます 100-400 μ m の範囲です。
3 D 印刷の足場は、圧縮モードでテストされました。自然な軟骨の役割は圧縮の荷重を負担するため、軟骨材料の機械試験の優先モードです。生体内での条件を模倣するように足場が 37 ° C で水でテストしました。2 mm/分のひずみ速度で異なる多孔性ナノコンポジット型ヒドロゲル足場の得られる圧縮データを表 1および図 4を表します。低ひずみ速度 (1-5%)、圧縮弾性率 (~ 0.17 MPa) はもっとまたはより少なく類似している多孔質材料のすべてのタイプ。これは、ハイドロゲル インクの弾性の性質が隙のプレゼンスにも保持されることを示します。ただし、高批ずみ速度 (25-30%) で最高弾性係数 0.45 MPa は参照足場が得ない気孔率。しかし、気孔のサイズが増加すると、すぐに係数低下、足場の気孔率と対応する機械的性質の予想される関係を示す密度の減少に伴う。グラデーションの多孔質の場合です高い (0.34 MPa) 均一な多孔質 (0.20 と 0.26 MPa) と比較して小さい細孔サイズとより強固な壁の存在のため。さらに、3 D ゲルの圧縮弾性率骨格につれて圧縮率の増加 (図 4b)、出展と負荷のために好ましいと考えられる自然な軟骨組織の粘弾性特性を模倣ベアリングは骨格33をです。0.20 MPa 2 mm/分のひずみ速度で 5 mm/分で 0.35 MPa に増加する 120 mm/分で 0.47 MPa まで上がるし、範囲は、圧縮弾性係数は自然な軟骨の報告 (0.1-2 のすなわち、圧縮弾性率 MPa)。
図 1.処理ルートの概略図。(、) ナノコンポジット型ヒドロゲル インクの準備。(b) 3 D 印刷多孔質材料。(c) 二重架橋 3 d 印刷足場です。(d) 圧縮が 37 ° C で水の 3次元多孔質材料のテストこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.ナノコンポジット型ヒドロゲルのインクのログ-ログ プロットします。(、) 粘度とせん断速度と (b) G'、G ' せん断応力対。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3. 3 D プリントされた多孔質。規模: 500 μ m. (、) 参照穴無しで。(b) 1 mm 孔径。(c) 0.60 mm の細孔サイズ。グラデーション (d) 気孔率 110 800 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.3 D のための代表的な応力-ひずみ曲線は、多孔性ナノコンポジット型ヒドロゲル足場を印刷しました。(、) 別の系統で 2 mm/s (b) の定ひずみ速度で 1 mm の料金細孔サイズ足場。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ターゲット細孔径 (μ m) | 平均孔径 (μ m) | 1-5% ひずみ (MPa) 時の圧縮係数 | 25-30% ひずみ (MPa) 時の圧縮係数 |
| 参照 | 0 | 0.19 ± 0.04 | 0.45 ± 0.03 |
| 1,000 | 850-1,100 | 0.17 ± 0.02 | 0.2 ± 0.01 |
| 600 | 480-650 | 0.16 ± 0.01 | 0.26 ± 0.05 |
| グラデーション | 110 800 | 0.16 ± 0.01 | 0.34 ± 0.04 |
表 1。3 D のための圧縮データは、ナノコンポジット型ヒドロゲル足場を印刷しました。
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Discussion
3 D 印刷では、ハイドロゲル インクのレオロジー特性を適切な必要があります。高粘度インクは、低粘度インクが押出成形後の形状を保持していない間の押し出しの極端な圧力を必要があります。ハイドロゲル インキの粘度は、成分の濃度を制御できます。私たち以前作業11に比べてハイドロゲル インクの固形分は 9.9 wt % 濃縮ゲル インク印刷の足場の解像度を改善するのに役立ちます、5.4 から増加しました。長く柔軟な Cnf とは異なり、Cnc のような剛直が物理的なもつれ14の欠席により指定された粘度の高い固形インクを作り出すことができることが注意されるかもしれない。印刷適性に影響を与えるもう一つの重要な側面は、インクの均一性です。40 ° C の温度でハイドロゲルにインクを加熱がマトリックス相と Cnc の均質混合を促進することが認められた.さらにゲル インクの滑らかさをノズル、最大径 800 μ m、600 μ m と最後に 400 μ m から始まるシリーズを通して渡されました。これらのパスの中に大きなしこりが、これらのパスは、ハイドロゲル インクは連続的なフィラメントの形で難なく押出後のプレゼンスを示すノズルが詰まってできます。私たちの以前の仕事11で示されるように、3 D 印刷構造体を取得するノズル動きは大きい重要性のまたです。ノズルの経路は、3 D 印刷の解像度は保持されるように反復的な動きとゲル インクの過剰沈着を避ける必要があります。
3 D 印刷ハイドロゲル足場で得られた気孔率は目標空隙率 (表 1) と比較して許容範囲内です。完全一致は、ハイドロゲル インクの腫れの性質のため期待できません。 ハイドロゲル インクの一貫性ex situ架橋架橋 3 D 構造の印刷後、すなわち、行う必要がある場合は特に重要な要因であります。ハイドロゲル インクが十分 (9.9 wt % の固形分) を集中していたことがわかりました。中および印刷の処理後は、その形状、構造、寸法を維持します。
足場の細孔径は、細胞間相互作用、酸素の拡散とその機械的性質を実行し、必要な機能をサポートすると共に廃棄物の除去に重要な役割を果たしています。空隙率の勾配足場細胞がさまざまな構造特性22,23,34異なったティッシュの層にさらされている生体内で実態をより良く表現する能力があります。気孔率と機械的性質は逆に関連が、ハイドロゲル足場の構成が重要な役割を果たしています。Cnc のよく知られている機械的性質2,35,36ハイドロゲル インクの主成分として選択されています。ハイドロゲル インクここで作製した、毛穴のプレゼンスにおいても弾力性を持って、最適な細孔サイズ (110 1,100 μ m) があり、適切な圧縮弾性率 (0.20 0.45 MPa) 軟骨再生アプリケーションに必要な。
圧縮試験は、水と生体内で可能な限り多くの条件を模倣する体温で行われていた。3 D プリントと機械試験の関係乾燥段階はないです。自然の組織で 1 つの均一な細孔径ではなく密度勾配が観察されます。同じは、圧縮弾性率は、年齢、性別とテストの位置によって決まる荷重自然組織の圧縮値に対して真。
ここで示される調査の利点は、最終的な気孔率と 3次元多孔質足場材料の圧縮弾性率の値を制御、ハイドロゲル インク組成と 3 D 印刷プロセスを使用してカスタマイズします。このプロトコルは柔軟性と固有の要件に応じて変更することができます。3 D プリントの強力な手法し、構造・組成の複雑な機能の足場を開発する将来的に調べることができます。マルチ材料ディスペンシング、足場の構成細胞や成長因子、方向性や気孔率、機械的性質、別の分解速度など構造的特徴の濃度を制御することで革命を導入することが3 D の部分を構築します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は、クヌート ・ アリス バレンベリー財団 (バレンベリー木材科学センター)、スウェーデン研究評議会、VR (Bioheal、DNR 2016-05709 と DNR 2017-04254) によって財政上支えられます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mL syringe | Structur3D Printing | ||
| Alginic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | 9005-38-3 | |
| Anhydrous calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamps, three pronged, Talon | VWR | 241-0404 | 102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm |
| Cura 2.4.0 | Ultimaker | Free slicing software | |
| Discov3ry Complete | Structur3D Printing | Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| homogenizer | SPX | APV-2000 | |
| Instron 5960 | Instron | Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C, | |
| Physica MCR 301 rheometer | Anton Paar | CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C | |
| Sorvall Lynx 6000 centrifuge | AB Ninolab | s/n 41881692 | F12-rotor (6x500 ml) |
| stainless steel nozzle | Structur3D Printing | 800, 600 and 400 µm | |
| thingsinverse | MakerBot's | sharing and downloading 3D printable things in form of stl files | |
| ultra sonication | Qsonica, LLC | Q500 | |
| Unbarked wood chips | Norway spruce(Picea abies) | dry matter content of 50–55% |
References
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