Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

زرع الكلي الفئران العظام: نهج الجراحية الجديدة والمبسطة

Published: May 7, 2019 doi: 10.3791/59403
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

الغرض من هذه المخطوطة والبروتوكول هو شرح وتوضيح بالتفصيل الاجراء الجراحي لزرع الكلي التقويمي في الفئران. يتم تبسيط هذه الطريقة لتحقيق التروية الصحيحة من الكلي المتبرع وتقصير الوقت ضخ باستخدام تقنيه انسموسيس الوريدي والكفة حالب.

Abstract

زراعه الكلي يقدم زيادة معدلات البقاء علي قيد الحياة وتحسين نوعيه المعيشة للمرضي الذين يعانون من مرض كلوي في نهاية المرحلة ، بالمقارنة مع اي نوع من العلاج باستبدال الكلي. علي مدي العقود القليلة الماضية ، تم استخدام نموذج زراعه الكلي الفئران لدراسة الظواهر المناعية للرفض والتسامح. وقد أصبح هذا النموذج أداه لا غني عنها لاختبار الادويه المناعية الجديدة والنظم العلاجية قبل المضي قدما في دراسات الحيوانية الكبيرة الباهظة الثمن.

يوفر هذا البروتوكول نظره عامه مفصله حول كيفيه اجراء عمليه زرع الكلي التقويمية بشكل موثوق في الفئران. يتضمن هذا البروتوكول ثلاث خطوات مميزه تزيد من احتماليه النجاح: التروية الكلوية المتبرع بها عن طريق المسح من خلال الوريد المدخل واستخدام نظام الكفة لانسز الاورده الكلوية والحالب ، التالي تقليل البرد والدفء مرات نقص التروية. باستخدام هذه التقنية ، حققنا معدلات البقاء علي قيد الحياة بعد 6 أشهر مع الكرياتينين المصل العادي في الماشية مع عمليات زرع الكلي أو متسامحة. اعتمادا علي الهدف من الدراسة ، يمكن تعديل هذا النموذج عن طريق العلاجات قبل أو بعد الزرع لدراسة الرفض الحاد ، المزمن ، الخلوي ، أو بوساطة الأجسام المضادة. وهو نموذج حيواني قابل للتكرار وموثوق به وفعال من حيث التكلفة لدراسة الجوانب المختلفة لزراعه الكلي.

Introduction

تاريخيا ، تم اجراء أول دراسات رفض الزراعة من قبل برنت ومدور باستخدام زرع الجلد في القوارض1. سرعان ما أصبح من الواضح ان الجلد له ميزات مناعية متميزة ، مما يجعل من جهاز مناعي للغاية التي تختلف في الرفض من غيرها من الاجهزه الصلبة الاوعيه الدموية2. وعاده ما تقتصر دراسات الفئران لرفض زرع الأعضاء الصلبة علي زرع القلب والكبد والكلي. علي الرغم من ان كل من هذه الاجهزه هي مناسبه لدراسة الرفض ، وهناك مزايا وعيوب لكل منهم. وغالبا ما يتم زرع زرع القلب في البطن والانسام إلى الشريان الابهر والوريد الأجوف ، مع القلب الأصلي للمستلم في المكان3. وهذا لا يعيد الظروف السريرية والتشريحية والفسيولوجية البشرية. بالاضافه إلى ذلك ، قلوب حساسة جدا لنقص التروية الباردة ويجب ان يكون reperfusedها بشكل تفضيلي داخل 1 ح من أجل ان تكون قادره علي استعاده وظيفتها4. تعتبر عمليات زرع الكبد بشكل عام أكثر صعوبة وحساسية من الوقت لأداء الجراحة. بعد أزاله الكبد الام, الكبد المتبرع يجب ان تكون مزروعة وأعاده استخدامها في غضون 30 دقيقه كما المتلقيين لا يمكن ان تستمر لفتره أطول دون الكبد يعمل5. الشريان الكبدي ، الوريد البابي ، وخاصه أعاده بناء القناة الصفراوية يتطلب المهارات الجراحية المكررة. إلى جانب التحديات الجراحية ، ومن المعروف ان الكبد تمتلك خصائص التحمل والقوارض والبشر يمكن ان تصبح متسامحة من الناحية التشغيلية6،7،8. الكلي ، علي عكس الأعضاء المذكورة أنفا ، يمكن زرعها في الأزياء التقويمية ، ومن المعروف ان يكون الجهاز المناعي مع حلقات الرفض متسقة وقابله للتكرار (ان لم يكن المناعي) ، ويسمح لفترات طويلة الباردة نقص التروية مرات من عده ساعات. وهذا يجعل زراعه الكلي الفئران نموذجا مثاليا لدراسة رفض الطعم المخلوط والتسامح.

زراعه الكلي (KT) هو الخيار المفضل لعلاج المرضي الذين يعانون من مرض كلوي في نهاية المرحلة. علي مدي العقود القليلة الماضية ، تحسنت نتائج البقاء علي المدى القصير بعد KT بشكل كبير ، ولكن نتائج البقاء علي المدى الطويل راكدة9. الانظمه التقليدية المثبطة للمناعة تبقي العلاج القياسي المضاد للرفض. ومع ذلك ، فان الاستخدام المزمن للعلاجات المثبطة للمناعة يسبب اعتلالات ووفاات كبيره ، مثل السمية الكلوية ، ومرض السكري ، والأورام الخبيثة الثانوية10،11،12. وعلي المدى الطويل ، يهدد الرفض المزمن للأجسام المضادة والخلايا الخلوية بقاء الكسب غير المرتبط بالطعم ، مع توافر خيارات علاجيه محدوده.

ويتمثل أحد الأهداف الرئيسية لعمليه الزرع في الحث علي تحمل الزراعة من أجل تفادي الحاجة إلى كبت المناعة المزمن. نموذج KT الفئران هو أداه قويه للتحقيق في عمليه الرفض المناعي وتقييم النهج الجديدة للمناعة والتسامح زرع. الجرذ أيضا بمثابه نموذج مناسب لدراسة الخلايا الحاده والمزمنة والرفض بوساطة الأجسام المضادة13،14،15،16،17. وقد اثبت هذا النموذج الجراحي انه أداه موثوقه وقابله للتكرار وفعاله من حيث التكلفة لدراسة مختلف جوانب رفض الكسب غير المزروع والتسامح. وغالبا ما يستخدم لاختبار البروتوكولات الجديدة التي تحفز التسامح قبل القيام بدراسات الحيوانية الكبيرة المكلفة والمرهقة. تنفيذ KT في الفئران يتطلب التدريب الجراحي واسعه النطاق والخبرة للوصول إلى معدلات البقاء علي قيد الحياة من > 90 ٪. في هذه المخطوطة وفي الفيديو التعليمي المصاحب لها ، نقدم لك مخططا تفصيليا لخطوه بخطوه في الفئران ، كما تم تنفيذه بنجاح لسنوات عديده في مؤسستنا.

قبل البدء في اي اجراء ، اختيار المانحين والمتلقيين أمر بالغ الاهميه ويعتمد علي طبيعة التجربة. ومن الناحية المثالية ، ينبغي ان تزن الجهات المانحة والمتلقية ما بين 220 – 260 غ وان تتراوح أعمارهم بين 8 و 12 أسبوعا. الحيوانية تحت 220 g لديها الشرايين الصغيرة القطر ، والاورده ، والحالب ، مما يجعل الانسمام في المتلقي تحديا بشكل خاص. فقدان الدم البسيط يمكن ان يسبب نقص الكالسيوم ويؤدي إلى الموت في الكائنات الصغيرة. الحيوانية أثقل من 260 g عرض المزيد من الدهون حول السفن الخاصة بهم ، وعزل السفينة سوف تتطلب المزيد من الوقت المنطوق وزيادة الوقت الاسكيميه الباردة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

لويس (RT11) و أجووتي الظلام (DA) (RT1Aa) تم شراء الفئران من الباعة التجاريين (انظر جدول المواد). وغالبا ما تستخدم هذه السلالات غير متطابقة MHC تماما لدراسة الرفض الحاد لكسب الطعم الكلوي. تم إسكان جميع الكائنات وصيانتها وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة في منشاه محدده خاليه من العوامل المسببة للمرض في جامعه جونز هوبكنز. وتمت الموافقة علي جميع الإجراءات من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي.

1-إجراءات المانحين

  1. اعداد والاوتوكلاف جميع الاداات الجراحية لاستخدامها في هذا الاجراء كوسيلة للتعقيم واستخدام قفازات معقمه القابل للتصرف لمنع المضاعفات المعدية.
  2. تخدير الفئران المتبرعة باستنشاق ايزوفلواني (الحث بنسبه 3 ٪-4 ٪ والصيانة بنسبه 1 ٪-2 ٪) لبقية الاجراء. إعطاء جميع المتبرعين والمتلقيين الحيوانية الاستباقية البوبرينورفين جلد في 0.1 ملغ/كغ وزن الجسم لتسكين.
  3. الآن ، وضع الفئران في موقف ضعيف وشل الأطراف مع الشريط إخفاء العقيمة.
  4. استخدام مقص الميكانيكية لأزاله الشعر من منطقه البطن.
    1. تطبيق زيوت التشحيم العين واستخدام الشاش المعقمة غارقه في povidone-اليود ، تليها الشاش غارقه في الكحول الايزوبروبيل ، لتعقيم المجال الجراحي.
    2. قبل الشق الأول ، تاكد من ان الفئران يتم تخديرها بشكل كاف عن طريق التحقق من عدم وجود منعكس سحب اصبع القدم.
  5. باستخدام مقص ، تبدا من خلال جعل الجلد الخط المتوسط الطولي كبير وشق العضلات من عانة الانحلال إلى xiphoid ، وادخل التجويف البريتوني.
  6. ادراج اثنين من الجرارات علي جانبي جدار البطن من أجل فضح تجويف داخل البطن.
  7. غطي الأمعاء بالشاش المعقم الرطب ونقله إلى الجانب الجانبي الأيمن من البطن ، مما يعرض الشريان الابهر والوريد الأجوف والكلية اليسرى. ضع 1 مل من المحلول الملحي المسخن مع حقنه 1 سم مكعب للحفاظ علي الأمعاء وأعضاء البطن رطبه وفي درجه حرارة طبيعيه.
    1. تطبيق الشاش رطبه ثانيه لتغطيه وتعبئة المعدة والطحال الجمجمة إلى الكلي والشاش رطبه صغيره لتغطيه الكلي المكشوفة (الشكل 1ا).
  8. استخدم ملقط التشريح المجهري لعزل وتعبئة الشريان الكلوي الأيسر والوريد من النسيج الضام وبعضهما البعض. عزل الوريد الكلوي الأيسر عن طريق الكي الوريد الغدد التناسلية اليسار وعزل الشريان الكلوي الأيسر عن طريق الكي الشريان الكظري. بعد ذلك ، تعبئة الشريان الابهر والوريد الأجوف متفوقة وادني من القمل الكلوي الأيسر عن طريق تشريح النسيج الضام مع تشريح الملقط (الشكل 1ب).
  9. تقسيم وتعبئة الحالب من النسيج الضام باستخدام ملقط تشريح ، واجراء شق قطري علي طول 2 سم تقاس من الحوض الكلوي ، وذلك باستخدام المقص الصغير. ادراج الكفة البولي اميد (انظر جدول المواد) في منتصف الطريق في الحالب وتامين الكفة من خلال وضع عقده مع 8-0 خياطه الحرير (الشكل 1ج).
    ملاحظه: من المهم عدم أزاله جميع الانسجه الضامة والدهون من الحالب ، لأنها توفر الحماية ضد الانسداد الناجم عن التصاقات ، وأزالها قد تسبب نخر حالب. إيلاء المزيد من الاهتمام للحفاظ علي السفينة التي تمد الحالب بالأكسجين.
  10. تعبئة الكلية اليسرى بفصلها عن الدهون الحالبه باستخدام ملقط التشريح أو المقص المجهري. ترك الكبسولة الدهنية من الكلي تعلق واستخدام هذا الموقع للتعامل مع الكلي.
    1. فضح الوريد الأجوف السفلي.
  11. أداره 200 وحدات من الهيبارين باستخدام حقنه مع 27 G ابره من خلال الوريد القضيب. الضغط علي موقع الحقن مع مسحه القطن لمده لا تقل عن 1 دقيقه لمنع النزيف.
  12. تحديد الوريد المدخل (pv) والأجوف السفلي (ivc) (الشكل 1د). مسح الكلي عن طريق حقن 50 مل من المالحة الباردة مختلطة مع 500 وحدات من الهيبارين في الوريد المدخل باستخدام ابره 16 G (الشكل 1ه). قبل التنظيف ، قطعي الوريد الأجوف السفلي علي المستوي الإينفراهيباتيك والوريد الوريدي المدخل في موقع إدخال الابره للسماح للدم بالخروج من الدورة الدموية. بدء تنظيف الكلي عن طريق غرس تدريجيا المحلول الملحي. لاحظ تغيير لون الكلي من الأحمر الداكن إلى لون رمادي موحد وشاحب (الشكل1و).
  13. بعد التنظيف ، ربط الشريان الكلوي والوريد القريب بالشريان الابهر والوريد الأجوف ووضع الكلية التي تم مسحها في طبق بيتري في محلول ملحي بارد علي الجليد. الشكل 2 (ا ) تمثل النظرة التخطيطية لإجراءات المانحين.
  14. بمجرد ان تكون الكلية في المحلول الملحي البارد ، وإصلاح وشل مقبض الكفة الوريد (انظر جدول المواد) وسحب بلطف الوريد الكلوي من خلال الكفة. ثم ، إصلاح الوريد الكلوي علي الكفة عن طريق وضع ثلاثه عقده باستخدام ثمانيه صفر خياطه الحرير (الشكل 2B).
    ملاحظه: إيلاء اهتمام خاص لاتجاه الوريد اثناء تامينه في مكانه. الاورده المستديرة تسبب انسداد في تدفق الدم وتؤدي إلى تخثر.

2-إجراءات المتلقي

  1. كرر الخطوات 1.1 – 1.11 من اجراء المتبرع.
  2. وضع اثنين من المشابك الصغيرة لا رضحي علي الشريان الكلوي الأيسر والوريد القريب إلى الشريان الابهر والوريد الأجوف (الشكل 3ا).
  3. Ligate الوريد الكلوي المتلقي القريب إلى مدخل الكلية. امسح الوريد الكلوي بمحلول ملحي heparinized لأزاله جميع الدم المتبقي من الوعاء.
  4. حرك الوريد الكلوي المربوط فوق الوريد الكلوي المكبل الذي كان متمركزا في الكلية المتبرعة وقم بتامينه ب8-0 خياطه الحرير (الشكل 3ب). الحفاظ علي نفس الاتجاه الموضعي عند تامين الوريد الكلوي علي الكفة.
  5. Ligate الحالب علي مستوي القطب السفلي من الكلية اليسرى. تعبئة الكلي من الدهون حالب.
  6. Ligate الشريان الكلوي القريب إلى مدخل الكلية المتلقية. امسحها بمحلول ملحي heparinized لأزاله اي دم زائد في الوعاء. قم باجراء العملية الجراحية النهائية لشريان الكلي مع 8 إلى 10 قطع الغرز باستخدام خياطه النايلون 10-0 (الشكل 3ج). مناوره الشريان باستخدام طبقه التهوية.
  7. أزاله المشابك السفينة لأعاده البدء في ضخ الكلي. تبدا بازاله المشبك علي الوريد تليها المشبك علي الشريان (الشكل 3د). استخدم مسحه قطنية معقمه للضغط بخفه علي اي مناطق ناز حول منطقه اناستاوسيس. وينبغي ان تكون بضع دقائق كافيه لتحقيق البراءة الاختراع.
  8. راقب بإيجاز الكلية ان يقيم ل [برفيوو] مناسبه. فورا بعد ضخ ، يجب علي الكلي تغيير اللون واستعاده تدريجيا لونه الأحمر الداكن الطبيعي بعد بضع دقائق (الشكل 3ه). ويلاحظ في بعض الأحيان التمعج مرئية من الحالب وإنتاج البول في الموقع.
  9. الانتهاء من خلال إدخال الطرف المكشوف من الكفة حالب في الحالب المتلقي وتامين الحالب المتلقي مع 8-0 خياطه الحرير (الشكل 2ج والشكل 3و).
  10. من أجل الحفاظ علي الجهات المانحة والمتلقي الحالب في الموقع ، والتعادل قباله نهايات كل جانب الحالب لبعضها البعض.
  11. وبشكل اختياري ، يمكن ان تكون الكلية اليمني بواسطة ربط قباله الشريان الكلوي الأيمن والوريد مع خياطه الحرير 4-0 وأزاله الكلي.
  12. أزاله جميع قماش من تجويف البطن ، وأعاده جميع الأعضاء إلى وضعها الطبيعي ، بخ 1 مل من المحلول الملحي علي الأمعاء للحفاظ عليها رطبه ، وإغلاق البطن باستخدام خياطه 4-0 قابل للامتصاص علي العضلات مستقيم وخياطه الحرير 4-0 لإغلاق الجلد وضع er بطريقه متقطعه.

3. الرعاية بعد الجراحة

  1. وضع الحيوانية في قفص نظيف مع الوصول إلى المياه والمواد الغذائية حسب الإعلان والسماح للانتعاش علي 37 درجه مئوية وساده التدفئة.
  2. حقن 0.1 ملغ/كغ بوبرينورفين جلد لتسكين ورصد الحيوانية للتعافي. قد تكون هناك حاجه إلى أداره مسكنات اضافيه في الأيام القليلة القادمة ، اعتمادا علي علامات الانزعاج أو الم. لا تدار المضادات الحيوية بشكل روتيني ، حيث ان المضاعفات المعدية نادره.
  3. مراقبه الانتعاش لمده 1-2 ساعة قبل أعاده الحيوانية مره أخرى إلى منشاه الحيوانية. فحص الحيوانية 2x-3x في اليوم لأول 24 ساعة ، تليها التفتيش اليومي. انتبه إلى علامات الم والكرب ، والمدخول الفموي ، والإخراج البولي.
  4. أزاله غرز 7-10 أيام بعد العملية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أجرينا التوليف (n = 5) وزرع الكلي الخيفيه (n = 5). وقد حققت الماشية ذات الزراعة المتزامنة البقاء علي المدى الطويل دون اي علاج مثبط للمناعة. الحيوانية التي تلقت زرع الجينات دون كبت المناعة رفضت الطعم واستسلمت للفشل الكلوي مع متوسط البقاء علي قيد الحياة من 8 أيام (الشكل 4ا). وزاد متوسط الكرياتينين في المصل بشكل متواضع في المجموعة المتزامنة بينما زاد بمقدار 14 ضعفا في المجموعة الخيفيه (0.5 ملغم/دل مقابل 7.0 ملغم/دل ، p < 0.01) (الشكل 4ب). وعند التوضيح ، لم تظهر النظرة المجهرية لترقيع الكلي المتزامن اي تشوات. بقي لون الكلي والهياكل الداخلية سليمه. وعلي النقيض من ذلك ، قدمت ترقيع الكلي للحيوانات المرفوضة بقعا نزفية حمراء مع تدمير الهياكل الداخلية (الشكل 4ج). وأظهرت البقع الهييوكسيلين و يوزين من الطعوم المتزامنة الشعرية الحلقات رقيقه مع الاعداد العادية من الخلايا البطانية و ميسانجيال. الطعوم المرفوضة المعروضة التي دمرت الهياكل الكبيبي مع علامات التهاب وتوبوتيتس (الشكل 4د). لتاكيد الرفض بوساطة الخلايا التائية ، قمنا بأداء CD8 + تلطيخ. في حين أظهرت الطعوم التركيبية عدد قليل جدا من الخلايا الايجابيه CD8 + T ، أظهرت الطعوم المرفوضة عددا اعلي بكثير من خلايا CD8 + في وحول الكبيبات والأنابيب (الشكل 4ه) ، مما يؤكد الرفض بوساطة الخلايا التائية.

Figure 1
الشكل 1 : استئصال الكلية المتبرعة. (ا) عند فتح البطن ، يتم عزل الكلية اليسرى بالغازات الرطبة. (ب) يتم عزل الشريان والوريد الكلوي الأيسر وتعبئته من الدهون المحيطة. (ج) الحالب مربوط ومكبل ومضمون بخيط حريري واحد. (د) يتم تحديد الوريد المدخل (pv) والوريد الأجوف السفلي (ivc) ويتم استخدام الكلي من خلال الوريد المدخل. (ه) يتم تنفيذ perfusion بنجاح كما الكلي الحق والكبد أصبحت شاحبه عن طريق مسح الوريد البوابة الحيوانية. (و) التروية الناجحة توضح الكلي الشاحب والاوعيه الجاهزة للزرع. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 : نظره عامه تخطيطيه لاجراء زراعه الكلي. (ا) لمحه عامه تخطيطيه عن إجراءات المانحين. (ب) نظره عامه تخطيطيه لوريد المتبرع المكبل. (ج) نظره عامه تخطيطيه علي الانسمام المتلقي والوريد المتبرع المكبل والانسمام للعحالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 : زرع الكلي في المتلقي. (ا) يتم تعبئة شريان المستلم ووريده من الدهون المحيطة ويتم فرضه بعد الانفصال. (ب) يتم إدخال الكلي المتبرع ، ويتم توصيل الاورده عن طريق تقنيه الكفة والمضمون مع 8-0 خياطه. (ج) يتم خياطه الشرايين بطريقه النهاية إلى النهاية. (د) يتم أزاله المشابك. (ه) يتم أعاده استخدام الكلي ويستعيد لونه الطبيعي دون اي نزيف. (و) وأخيرا ، فان الحالب هي المفاخر باستخدام الكفة وضعت سابقا والمضمون مع 8-0 خياطه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 : البقاء علي قيد الحياة زرع الكلي. (ا) يظهر الرقم الخاص بكابلان-ماير بقاء الجرذان مع زرع الكلي المتزامن أو الصناعي مع مرور الوقت. (ب) قياس ومقارنه الكرياتينين في المصل في الجرذان مع عمليات زرع الكلي المتزامنة أو المخلوطة مقارنه بالماشية غير المزروعة. (ج) لمحه عامه عن الكليتين المفسرتين لزراعه الكلي (العلوية) والمخلوطة (السفلية) في اليوم 8. وكانت الكائنات أليفه مع المالحة قبل اكسبلانتينج. تظهر اللوحتين الأخيرتين لمحه مجهريه عن (د) الهيلوكسيسين وتلطيخ ايوسين و (ه) CD8 + من الأورام الكلية (العلوية) والخيفيه (السفلية). يتم التقاط الصور تحت التكبير 200x. * اعتبرت النتائج ذات دلاله احصائيه إذا كانت p < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 الاداات الجراحية المطلوبة : . (1) مقص مستقيم. (2) مقص غرامه. (3) مقص الربيع الصغير 1 (ربط الحالب). (4) الصغرى الربيع مقص 2. (5) الصغرى الربيع مقص 3. (6) الصغيرة الحيوانية أعاده الجرارات الجراحية. (7) ملقط. (8) الملقط المجهري ، علي التوالي ، علي نحو سلس. (9) تشريح الملقط ، منحني. (10) مايكرو ابره حامل. (11) حامل ابره. (12) 8-0 مضفر خياطه الحرير دون ابره. (13) 4-0 خياطه الحرير. (14) المشابك السفينة الصغيرة (زوج واحد). (15) الصغرى السفينة المشبك applier. (16) غرامه غيض المشبك. (17) الهيبارين. (18) المشبك السفينة (حجم متوسط). (19) المشبك السفينة (كبير). (20) مسحات القطن المعقمة. (21) 10-0 الدقيقة خياطه مع ابره. (22) شاش معقم. (23) Heparinized حقنه الملحية دافق. (24) 60 cc حقنه مع ابره. (25) 10 cc حقنه. (26) 1 cc حقنه. (27) 25 ز 5/8 بوصه الابر. (28) 19 غرام الابر. (29) الانتهازي. (30) نظام الحذر ثنائي القطب. (31) شريط. (32) طبق بيتري مع 0.9 ٪ المالحة العادية. (33) 60 cc حقنه مع 50 cc heparinized محلول ملحي ل perfusion. (34) حقنه 10 cc مع 5 cc heparinized المالحة دافق. (35) الكفة الحالب. (36) صفعه الوريد. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المخطوطة ، نقوم بوصف الطريقة الجراحية للمفصل الهجائي في الجرذان بالتفصيل ، بما في ذلك جميع المعدات اللازمة لتنفيذ هذا الاجراء (الشكل 5). في 1965, نشر [فيشر] و ماوي التقرير اولي علي [كت] في فيران, اي أصبح البداية من مثيره تحقيق مجال18. ومنذ ذلك الحين ، أدخلت تعديلات كثيره لتحسين استنساخ هذا النموذج. وقد عملت كنموذج الحيوانية فعاله لدراسة نقص التروية-ضخ الإصابات والرفض زرع الكلي والتسامح ، وذلك بفضل توافر عده سلالات الفطرية والخارجية مع مجموعات عدم تطابق MHC الجزئي والكامل19. يمكن للنموذج KT الفئران بمثابه أداه لاختبار الفرضيات قبل توسيع نطاق التحقيقات إلى الخنازير ونماذج الرئيسيات غير البشرية من KT. الخيارات لدراسة رفض زرع الكلي أو التسامح في القوارض محدوده. نموذج زرع الكلي في الفئران هو من الناحية الفنية صعبه للغاية ويتطلب فتره تدريب طويلة لتحقيق معدلات البقاء علي قيد الحياة من > 80%20. ومن القيود الأخرى علي نموذج الماوس القبول العفوي لكسب الطعم الكلوي دون الحاجة إلى كبت المناعة في حوالي 30% من المتلقيين. ومع ذلك ، يتم رفض عمليات زرع الأعضاء الأخرى في الفئران ، مثل الجلد والقلب ، في غضون 10 أيام ، مما يوحي بان رفض خلط الكلي في الفئران غير متطابقة تماما MHC ضعيفه وليس ممثلا للوضع السريري21. ومع ذلك ، إذا كان يمكن التغلب علي التحدي التقني ، ويفضل نماذج الفئران لدراسات اليه لرفض الكسب غير المزروع بسبب توافر الفئران المعدلة وراثيا أو ضرب الخروج.

KT في الفئران يمكن ان يؤديها في عدد من الطرق. وسوف نناقش بعض المزايا والمساوئ لهذه الأساليب المختلفة. بغض الفضل عن التقنية المفضلة ، من المهم دائما تقليل وقت نقص التروية الدافئ وتجنب الاصابه التي لا رجعه فيها في الطعم والمتلقي.

اليمين مقابل الكلية اليسرى
التشريح البطني للفئران مشابه جدا لذلك الذي يصيب البشر. تقع الكلية اليسرى متفوقة مقارنه بالكلية اليمني بسبب الوضع التشريحي للكبد. واحده من مزايا استخدام الكلي الأيسر هو طول الاوعيه. عموما ، الشريان الكلوي الأيسر والوريد هي ضعف طول الاوعيه الكلوية اليمني. وهذا مفيد بشكل خاص عند القيام بالانسمام عندما لا يكون طول الاوعيه عاملا مقيدا. ومع ذلك ، توجد تقارير عن الجهات المانحة من الجانب الأيمن لاستخراج الكلي وزرع22،23. كما تم وصف المقاربات التي تستخدم كليهما للزرع24.

تنظيف الكلي المتبرع عن طريق الوريد المدخل
واحده من الخطوات الرئيسية لهذا الاجراء هو perfusion الكلي المتبرع. Perfusion ضروري لأزاله جميع الدم المتبرع من الاوعيه والكلي وتهدئه الجهاز وصولا إلى إبطاء تدهور البيولوجية. هناك طرق مختلفه وصفت ل النبض الكلي. لقد جربنا مع بيغ الكلي بطرق مختلفه وخلصت إلى ان تنظيف الكلي من خلال الوريد المدخل يوفر مزايا ويؤدي باستمرار إلى الانصهار الكامل للكلي والاوعيه. النهج التقليدية الموصوفة في الأدبيات تستتبع تنظيف الكلي المتبرع بعد ربط الشريان الكلوي والوريد أو الوراء من خلال الابهر المتعدي24,25,26,27 , 28-وقد تؤدي هذه النهج إلى تلف البطانيات وتضيق الاوعيه الكلوية بسبب الضغوط المحلية المتزايدة أو لنقص التروية بسبب انخفاض ضغط التروية29,30.

عن طريق تنظيف الكلي من خلال الوريد المدخل ، يتم أداره الضغط من قبل القلب. خلال الانصهار ، لا يزال القلب نشطا ويضخ السائل المنصهر بطريقه طبيعيه إلى الشريان الابهر والكلي مع تدفق اللب ، مما يمنع تلف الشعيرات الدموية كبيبات بسبب تدفق ضغط القص. عند زرع الكلي في كتله أو استخدام الكلية الصحيحة للزرع ، وهذا الأسلوب هو مناسبه لتحقيق ترويه موحده وحصاد كل من الكلي في نفس الوقت.

الشرايين والاورده الوريدية
واحده من الخطوات الأكثر اهميه في نموذج KT الفئران هو أداء الوعائية المجهرية موثوق بها في طريقه فعاله من حيث الوقت. يمكن ان يكون الشريان الكلوي المتبرع في الشريان الكلوي للمستلم أو الابهر. ان الاوعيه المانحة للاوعيه الدموية إلى الشريان الابهر والوريد الأجوف السفلي تتسبب في أصابه أعضاء المتلقي بالنقص في التروية. في هذا البروتوكول ، ونحن نظهر النهاية إلى النهاية الانسمام من الشرايين الكلوية ، كما انه يتجنب الاصابه الدماغية للأعضاء الأخرى. خلال انسمام الشرايين ، من المهم عدم الاضرار السطح البطانية من التجويف عند التعامل مع السفينة. بالنسبة إلى الوريد الوريدي ، نستخدم تقنيه الكفة لتقليل الوقت الدافئ للاقفار وتقصير الاجراء الجراحي. وقد ثبت ان هذا هو وسيله موثوقه جدا ودائمة لضمان تدفق الوريدية الكافية. لضمان تدفق الوريدية الكافية ، فمن المحتم ان لا تكون الاورده أو الملتوية عندما يتم تامين هذه معا. بدلا من ذلك ، من الممكن نهاية إلى نهاية أو الوريد الوريدي من النهاية إلى الجانب ، اعتمادا علي تفضيل الجراح. ومن الناحية المثالية ، فان الشرايين والاورده الوريدية الوعائية يجب ان تستغرق ما بين 20 – 30 دقيقه.

ولخص باهلافان وآخرون مضاعفات كل نوع من أنواع التقنيات استنادا إلى الفحص الأدبي31. واحده من المضاعفات الرئيسية التي قد تحدث بعد اي الاوعيه الجراحية المجهرية هو تخثر. الربط والتنظيف الكافي للسفن المتلقية يقلل بشكل كبير من تشكيل تجلط التخثر ، ومن المؤكد انه ليس من المضاعفات التي لوحظت في كثير من الأحيان. المضاعفات الأخرى هي التسرب أو تمزق الانسمام بعد ضخه. ويرتبط ذلك بعدم كفاية الجراحة المجهرية أو المناولة غير الكافية للسفن.

حالب انسموسيس
يجب التعامل مع الحالب باقصي قدر من العناية ، وخاصه اثناء عزله الحالب في المتبرع. ويمكن ان تسبب الإصابات التي تلحق بالهياكل المحيطة بالتهاب الحالب الاسكيميه التي تؤدي إلى التضيق والانسداد ، وفي اسوا الحالات ، حالب نخر. تقارير الأدب طرق مختلفه لحالب انسموسيس. من النهاية إلى النهاية ، والكفة المساعدة من النهاية إلى النهاية ، والمثانة التصحيح ، والادراج المثانة هي الأكثر شيوعا19،32،33. في الدراسات السابقة ، استخدمنا صفعه مع حواف مائله علي كلا الطرفين لتسهيل الدخول إلى الحالب علي كلا الطرفين. لم نلاحظ اي تسرب البول أو تشكيلات تجلط الدم. ومع ذلك ، والمضاعفات علي المدى الطويل (> 30 يوما) من هذه التقنية تشمل موه وأحيانا تحص كلوي ، والتي يمكن تفسيرها بواسطة تشكيل التضيق ، والخلع ، أو عرقله الكفة بسبب الحجارة الحالبه. هذا الاستنتاج يتسق مع التقارير الأخرى والنتائج الخاصة بنا من أداء حالب انسموسيس مع صفعه. وغالبا ما تلاحظ مضاعفات حالب بعد الجراحة بعد أصابه كبيره في الكلي ، واطلانطيس ، وتتطلب ان يكون الرحيم الحيوانية.

الرعاية بعد الجراحة والبقاء
تتطلب الرعاية بعد العملية الجراحية للحيوانات المزروعة أداره الم الكافية والملاحظات التفصيلية للنشاط العام للحيوانات ، وملاحظات الوزن ، وإنتاج البول. تشمل المضاعفات الشائعة لما بعد العملية الجراحية نزيفا من الشرايين أو الاورده الوريدية ، أو تسرب البول ، أو انسداد حالب ، أو وظيفة الكسب المتاخر بسبب نقص التروية لفترات طويلة. تظهر الكائنات التي لديها هذه المضاعفات نشاطا متواضعا وعاده ما تبقي في وضعيه الظهر بدون إخراج المسالك البولية وتناول المغذيات. عموما ، فمن مواتيه لأداره ما يصل إلى 1-5 مل من المحلول الملحي للحيوانات بعد الجراحة لتسريع شفائهم ومنع الجفاف. يمكن للحيوانات التي تتلقي اي كبت المناعة البقاء علي قيد الحياة بين 7 إلى 10 أيام ، والذي يسمح لنافذه علاجيه كافيه لاختبار المخدرات الرواية أو غيرها من الطرق. إذا كانت الحيوانية المناعية بشكل كاف (1.0 مغ/كغ/يوم FK506 جلد) أو متسامحة ، ويمكن رصدها علي المدى الطويل الماضية 6 أشهر كما ذكرت سابقا13. سمح نموذج زراعه الكلي الفئران تعريف أليات التسامح المستحثة باستخدام نهج فريد من نوعه لتعبئة الخلايا الجذعية قبل التاكد من هذه الظاهرة فيال34الكبيرة الحيوانية. وقد قدمت الجرذ KT معلومات حاسمه للمحققين علي مدي عقود ، ستواصل القيام بذلك في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل هديه سخية من الحوزة الاسره Bombeck.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buprenorphine HCL Reckitt Benckiser Healthcare UK NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved Zhenbang, China 11cm Flat handle 
Heparin sodium injection USP Sagent Pharmaceuticals  NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth Jingzhong, China WA3010
Micro needle holder Jingzhong, China WA2010
Micro vessel clamps Jingzhong, China WA40120
Micro spring sciccor 1 ROBOZ RS-5620
Micro spring sciccor 2 F.S.T. 91501-09
Micro spring sciccor 3 Zhenbang, China 8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506) Astellas
Rats Charles River & Taconic Biosciences  LEW/Crl & DA-M 
Shaver Wahl 79600-2101
Suture 4-0 Ethicon J304H
Suture, 4-0  Ethicon 683G
Suture, 10-0  Ethicon 2820G
Syringes & Needles BD
Thread, 8-0 Ashaway 75290
Ureteral cuff Microlumen 160-1 Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm 
Venous cuff Intramedic BD 7441 PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
  2. Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plastic and Reconstructive Surgery. 47 (5), 425-431 (1971).
  3. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (6), e238 (2007).
  4. Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplant Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
  5. Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (65), e4143 (2012).
  6. Lang, K. S., et al. Immunoprivileged status of the liver is controlled by Toll-like receptor 3 signaling. Journal of Clinical Investigation. 116 (9), 2456-2463 (2006).
  7. Sun, Z., et al. Recruitment of host progenitor cells in rat liver transplants. Hepatology. 49 (2), 587-597 (2009).
  8. Orlando, G., Soker, S., Wood, K. Operational tolerance after liver transplantation. Journal of Hepatolgy. 50 (6), 1247-1257 (2009).
  9. Lodhi, S. A., Lamb, K. E., Meier-Kriesche, H. U. Solid organ allograft survival improvement in the United States: the long-term does not mirror the dramatic short-term success. American Journal of Transplantation. 11 (6), 1226-1235 (2011).
  10. Engels, E. A., et al. Spectrum of cancer risk among US solid organ transplant recipients. Journal of the American Medical Association. 306 (17), 1891-1901 (2011).
  11. Kasiske, B. L., Snyder, J. J., Gilbertson, D., Matas, A. J. Diabetes mellitus after kidney transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 3 (2), 178-185 (2003).
  12. de Mattos, A. M., Olyaei, A. J., Bennett, W. M. Nephrotoxicity of immunosuppressive drugs: long-term consequences and challenges for the future. American Journal of Kidney Diseases. 35 (2), 333-346 (2000).
  13. Hu, X., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell-Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: A Study in Rats. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2055-2065 (2016).
  14. Shrestha, B., Haylor, J. Experimental rat models of chronic allograft nephropathy: a review. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 7, 315-322 (2014).
  15. Fu, Y., et al. Successful transplantation of kidney allografts in sensitized rats after syngeneic hematopoietic stem cell transplantation and fludarabine. American Journal of Transplantation. 14 (10), 2375-2383 (2014).
  16. Grau, V., et al. Immune Complex-Type Deposits in the Fischer-344 to Lewis Rat Model of Renal Transplantation and a Subset of Human Transplant Glomerulopathy. Transplantation. 100 (5), 1004-1014 (2016).
  17. Vogelbacher, R., et al. Bortezomib and sirolimus inhibit the chronic active antibody-mediated rejection in experimental renal transplantation in the rat. Nephrology Dialysis Transplantation. 25 (11), 3764-3773 (2010).
  18. Fisher, B., Lee, S. Microvascular surgical techniques in research, with special reference to renal transplantation in the rat. Surgery. 58 (5), 904-914 (1965).
  19. Mahabir, R. N., Guttmann, R. D., Lindquist, R. R. Renal transplantation in the inbred rat. X. A model of "weak histoincompatibility" by major locus matching. Transplantation. 8 (4), 369-378 (1969).
  20. Wang, J. J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine renal transplantation procedure. Journal of Visualized Experiments. (29), e1150 (2009).
  21. Bickerstaff, A. A., Wang, J. J., Pelletier, R. P., Orosz, C. G. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
  22. Silber, S. J., Crudop, J. Kidney transplantation in inbred rats. American Journal of Surgery. 125 (5), 551-553 (1973).
  23. D'Silva, M., et al. Rat kidney transplantation update with special reference to vesical calculi. Microsurgery. 11 (2), 169-176 (1990).
  24. Yin, M., Booster, M. H., Bogaard, A. E. J. M., Kootstra, G. A simple technique to harvest two kidneys from one donor rat for transplantation. Lab Animal. 28 (4), 387-390 (1994).
  25. Lopez-Neblina, F., Toledo-Pereyra, L. H., Suzuki, S. Ultrarapid orthotopic technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 15 (4), 274-278 (1994).
  26. Blom, D., Orloff, M. S. A more versatile and reliable method for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 18 (4), 267-269 (1998).
  27. Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
  28. Kline, R., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A., Schwartz, M. High osmolality-low pH flush solutions improve renal transplant function in rats. Urology Research. 19 (2), 81-86 (1991).
  29. Fray, J. C. Mechanism by which renin secretion from perfused rat kidneys is stimulated by isoprenaline and inhibited by high perfusion pressure. The Journal of Physiology. 308, 1-13 (1980).
  30. Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
  31. Pahlavan, P. S., Smallegange, C., Adams, M. A., Schumacher, M. Kidney transplantation procedures in rats: assessments, complications, and management. Microsurgery. 26 (5), 404-411 (2006).
  32. Savas, C. P., et al. Renal transplantation in the rat--a new simple, non-suture technique. Urology Research. 13 (2), 91-93 (1985).
  33. Fabre, J., Lim, S. H., Morris, P. J. Renal transplantation in the rat: details of a technique. The Austalian and New Zealand Journal of Surgery. 41 (1), 69-75 (1971).
  34. Cameron, A. M., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: II, Study in Miniature Swine. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2066-2076 (2016).

Tags

الطب ، العدد 147 ، الكلي ، زرع ، الهجاء ، الفئران ، البقاء علي قيد الحياة ، الرفض ، التسامح
زرع الكلي الفئران العظام: نهج الجراحية الجديدة والمبسطة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmadi, A. R., Qi, L., Iwasaki, K.,… More

Ahmadi, A. R., Qi, L., Iwasaki, K., Wang, W., Wesson, R. N., Cameron, A. M., Sun, Z. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. J. Vis. Exp. (147), e59403, doi:10.3791/59403 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter